CN104285788A - 一种通过体胚发生途径建立翠竹再生体系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过体胚发生途径建立翠竹再生体系的方法，包括：1）取翠竹含腋芽的茎段，先进行消毒处理，然后接种于含有4.0~6.0mg/L6-BA的MS诱导培养基，光培养下诱导出丛芽；2）将丛芽转继代于诱导胚性愈伤组织的培养基上，光照培养直至有胚性愈伤组织产生；3）将诱导的胚性愈伤组织转接于含有1.0~3.0mg/L6-BA，或1.0~2.0mg/L6-BA+1.0~2.0mg/LKT的MS，光培养诱导体胚发生、增殖及体胚苗发生；4）将已发生的体胚苗小芽丛转接于含有1.0~2.0mg/L萘乙酸的MS生根培养基中，光培养诱导生根；5）将已生根的小苗移栽于移栽基质，喷水培养。本发明建立的再生体系可以作为翠竹遗传转化的研究体系，为翠竹组织培养快速繁殖增添了又一条新途径，增殖系数是现有组织培养技术的1.5-2倍，规模化生产开发价值高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和现代林业生物技术领域，具体涉及一种通过体胚发生途径建立翠竹再生体系的方法。
背景技术
翠竹为小型地被类竹种，枝叶茂密，地下鞭根系统庞大，是很好的地被绿化竹种和水土保持竹种，因此目前的应用需求越来越大，其经济价值也越来越高，具有广阔的市场前景。
由于很难得到竹子种子，竹子繁殖主要以埋鞭、埋秆、埋节等传统方法为主，这些方法具有消耗母种竹量多、种苗运输不便、劳动强度大、繁殖系数低等缺点，采用组织培养技术可以高效、快速地对作物品种性状进行遗传改良，从而为翠竹再生植株的培养提供一种方便、快捷和有效的方法。我国的竹子组织培养工作开始于20世纪90年代，阙国宁等以黄竹和印度箣竹2种丛生竹的嫩节作为外植体诱导愈伤组织，最终形成完整植株。张春霞等对翠竹、菲白竹，王光萍等对铺地竹、辣韭矢竹等竹种进行了以芽繁芽的组织培养研究，大多形成完整植株。目前，这种通过以芽繁芽途径来实现竹子植株的再生的技术已趋于成熟，但通过体胚再生途径来实现植株的再生，报道并不多，有关对翠竹通过体胚再生途径来实现植株的再生的研究未见报道。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的一是通过体细胞胚发生途径建立翠竹再生体系，为进一步利用基因工程对其进行遗传改良创建技术平台；二是通过含腋芽的茎段经无菌培养诱导出小芽丛，小芽丛经多次继代培养诱导出胚性愈伤组织，最后通过体细胞胚发生及植株再生诱导培养获得再生植株，为翠竹的快速繁殖提供新途径。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种通过体胚发生途径建立翠竹再生体系的方法，包括以下步骤：
1）取翠竹含腋芽的茎段，先进行消毒处理，然后接种于含有4.0~6.0mg/L 6-BA的MS诱导培养基，光培养下诱导出丛芽；
2）将丛芽转继代于诱导胚性愈伤组织的培养基上，光照培养直至有胚性愈伤组织产生；
3）将诱导的胚性愈伤组织转接于含有1.0~3.0mg/L 6-BA，或1.0~2.0mg/L 6-BA+1.0~2.0mg/L KT的MS，光培养诱导体胚发生、增殖及体胚苗发生；
4）将已发生的体胚苗小芽丛转接于含有1.0~2.0mg/L萘乙酸的MS生根培养基中，光培养诱导生根；
5）将已生根的小苗移栽于移栽基质，喷水培养； 移栽基质是体积比为1：1的珍珠岩与腐殖质的混合基质；
步骤（l）中，消毒处理的具体操作为：用自来水初步冲洗后洗洁精溶液洗涤浸泡，流水冲洗1-2h。采用70%乙醇和0.11 % 升汞的消毒，无菌水冲洗接种到培养基上。
步骤（2）中，所述诱导胚性愈伤组织的培养基为含有1.0~3.0mg/L 6-BA+0.1~0.5mg/L 2,4-D的MS培养基，或含有1.0~3.0mg/L 6-BA+0.01~0.1mg/L NAA的MS培养基。
步骤（3）中，从小芽丛上取出基部产生有胚性愈伤组织的幼嫩小芽，转接到培养基上进行体胚发生、增殖及体胚苗发生诱导。
其中，各步骤中的MS为含有蔗糖和琼脂的常规MS。
有益效果：本发明采用通过含腋芽的茎段经无菌培养诱导出小芽丛，小芽丛经继代培养诱导出胚性愈伤组织，最后通过体细胞胚发生及植株再生诱导培养获得再生植株，建立再生体系的方法，可以作为翠竹遗传转化的研究体系，为进一步利用基因工程对其进行遗传改良奠定了技术平台。与现有技术中的翠竹组培方法相比，本发明为翠竹组织培养快速繁殖增添了又一条新途径；与已有的以芽繁芽的组织培养技术相比，增殖系数高，是后者的1.5-2倍，规模化生产开发价值高，具有很好的经济前景。
附图说明
图1是翠竹外植体接种后1周图；
图2是翠竹外植体接种2月后的小丛芽图；
图3是翠竹新出小芽及其基部白色胚性愈伤组织图；
图4是翠竹含有各个发育阶段（包括胚性和非胚性愈伤组织、胚状体、小芽）的愈伤组织团块图；
图5是翠竹体胚发育形成的芽丛转接至生根培养基图；
图6是翠竹体胚苗生根培养3周时的根图；
图7是翠竹体胚苗再生植株图；
图8是移栽成功的翠竹再生植株图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
一种通过体胚发生途径建立翠竹再生体系的方法，包括以下步骤：
1）选取健康的翠竹含腋芽茎段作为外植体，用洗洁精溶液洗涤表面，自来水冲洗1~2h。采用75%乙醇30sec和0.11%升汞10~15min的消毒，无菌水冲洗4~5次后，接种到已灭菌的芽丛诱导培养基MS+5.0mg/L 6-BA上，光照培养，翠竹外植体接种后1周，如图1所示，接种2月后形成小芽丛，如图2所示。
2）将此小芽丛转继代接种于愈伤组织诱导培养基MS+3.0mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA，或MS+3.0mg/L 6-BA+0.01mg/L 2,4-D上进行愈伤组织的诱导。经4-5次继代后，在新出小芽基部产生白色的胚性愈伤组织，如图3所示。
3）将此基部带有愈伤组织的小芽完整取出，转接于MS+2.0mg/L 6-BA+1.00mg/L KT或MS+1.0~3.0mg/L 6-BA的增殖培养基上光照培养；每隔15天，转继代一次，经2-3次的转继代培养，此胚性愈伤组织分化发育成含有各个发育阶段（包括胚性和非胚性愈伤组织、胚状体、小芽）的愈伤组织块，并大量增殖、分化生长，如图4和图5所示。
4）重复继代2-3次，当由体胚分化发育形成的小芽达到预定高度3-5厘米后，切下芽丛，转接于生根培养基MS+1.0~2.0mg/L NAA+0.5~1.5mg/L 6-BA诱导生根，如图5所示，约2周后有新根产生，3周时最长根长达3厘米，如图6所示，5周后即生长成为健壮丛苗。
5）完成生根的再生植株，去盖置于温室中炼苗，4-5天后取出洗净，如图7所示，移栽于珍珠岩+腐殖质（1：1）的混合基质上，并遮荫，每日喷水2-3次，保持湿度，促进小苗生长，图8为移栽成功的翠竹再生植株。
该实施例中的MS为含有蔗糖30g/L和琼脂6g/L的常规MS。
外植体小丛芽的诱导、胚性愈伤组织的诱导，体胚发生、增殖、分化苗的生长及生根均在光照条件下进行，光照14~16h/d，光照强度1200~1300Lux，温度24～26℃。
本发明的通过体胚发生途径建立翠竹再生植株的繁殖方法为翠竹组织培养快速繁殖增添了又一条新途径。该方法与已有的以芽繁芽的组织培养技术相比，增殖系数高，约是后者的1.5-2倍，规模化生产开发价值高。
实施例2
一种通过体胚发生途径建立翠竹再生体系的方法，包括以下步骤：
1）选取健康的翠竹含腋芽茎段作为外植体，用洗洁精溶液洗涤表面，自来水冲洗1~2h。采用75%乙醇30sec和0.11%升汞10~15min的消毒，无菌水冲洗4~5次后，接种到已灭菌的芽丛诱导培养基MS+5.0mg/L 6-BA上，光照培养，翠竹外植体接种后1周，如图1所示，接种2月后形成小芽丛，如图2所示。
2）将此小芽丛转继代接种于愈伤组织诱导培养基1.0~3.0mg/L 6-BA+0.1~0.5mg/L 2,4-D+MS上进行愈伤组织的诱导。经4-5次继代后，在新出小芽基部产生白色的胚性愈伤组织，如图3所示。
3）将此基部带有愈伤组织的小芽完整取出，转接于1.0~2.0mg/L 6-BA+1.0~2.0mg/L KT+MS的增殖培养基上光照培养；每隔15天，转继代一次，经2-3次的转继代培养，此胚性愈伤组织分化发育成含有各个发育阶段（包括胚性和非胚性愈伤组织、胚状体、小芽）的愈伤组织块，并大量增殖、分化生长。
4）重复继代2-3次，当由体胚分化发育形成的小芽达到预定高度3-5厘米后，切下芽丛，转接于生根培养基MS+1.0~2.0mg/L NAA+0.5~1.5mg/L 6-BA诱导生根，10d后有新根产生，3周时最长根长达3厘米，一个月后即生长成为健壮丛苗。
5）完成生根的再生植株，去盖置于温室中炼苗，4-5天后取出洗净，移栽于珍珠岩+腐殖质（1：1）的混合基质上，并遮荫，每日喷水2-3次，保持湿度，促进小苗生长，即可移栽成功。
该实施例中的MS为含有蔗糖30g/L和琼脂6g/L的常规MS。
Claims (4)
1.一种通过体胚发生途径建立翠竹再生体系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）取翠竹含腋芽的茎段，先进行消毒处理，然后接种于含有4.0~6.0mg/L 6-BA的MS诱导培养基，光培养下诱导出丛芽；
2）将丛芽转继代于诱导胚性愈伤组织的培养基上，光照培养直至有胚性愈伤组织产生；
3）将诱导的胚性愈伤组织转接于含有1.0~3.0mg/L 6-BA，或1.0~2.0mg/L 6-BA+1.0~2.0mg/L KT的MS，光培养诱导体胚发生、增殖及体胚苗发生；
4）将已发生的体胚苗小芽丛转接于含有1.0~2.0mg/LNAA+0.5~1.5mg/L 6-BA+MS生根培养基中，光培养诱导生根；
5）将已生根的小苗移栽于移栽基质，喷水培养； 移栽基质是体积比为1：1的珍珠岩与腐殖质的混合基质。
2.根据权利要求1所述的翠竹的快速繁殖方法，其特征在于：步骤（l）中，消毒处理的具体操作为：用自来水初步冲洗后洗洁精溶液洗涤浸泡，流水冲洗1-2h；采用70%乙醇和0.11 % 升汞的消毒，无菌水冲洗接种到培养基上。
3.根据权利要求1所述的通过体胚发生途径建立翠竹再生体系的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述诱导胚性愈伤组织的培养基为含有1.0~3.0mg/L 6-BA+0.1~0.5mg/L 2,4-D的MS培养基，或含有1.0~3.0mg/L 6-BA+0.01~0.1mg/L NAA的MS培养基。
4.根据权利要求1所述的通过体胚发生途径建立翠竹再生体系的方法，其特征在于：步骤（3）中，从小芽丛上取出基部产生有胚性愈伤组织的幼嫩小芽，转接到培养基上进行体胚发生、增殖及体胚苗发生诱导。
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