CN105543230A - 一种基于抑制H3K9me3甲基化的提高猪克隆效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于抑制H3K9me3甲基化的提高猪克隆效率的方法，该方法是通过抑制猪克隆胚胎核移植时供核细胞中Suv39H1和Suv39H2基因的表达及在核移植重构胚中过表达KDM4A？mRNA来抑制H3K9me3甲基化，进而提高猪克隆效率的。具体的，该提高猪克隆效率的方法通过在核移植前先在供核细胞中共转染抗Suv39H1和Suv39H2基因的有效siRNA，来抑制供核细胞中Suv39H1和Suv39H2基因的高表达，从而抑制供核细胞中的H3K9me3高甲基化水平，然后将处理后的供核细胞进行核移植，并在核移植获得的重构胚激活后，进行包浆显微注射KDM4A？mRNA进一步抑制重构胚中组蛋白H3K9me3甲基化，以最终来提高猪的克隆效率。

Description

一种基于抑制H3K9me3甲基化的提高猪克隆效率的方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及转基因工程技术，具体涉及一种提高猪克隆效率的方法。

背景技术

随着克隆动物的大量生产，克隆的基本方法路线趋于定型和规范化，但是目前克隆动物的生产效率依然很低，后代平均出生率不超过5％。低下的克隆效率使得生产克隆动物的一直处于高投入低产出的困境，为研究和应用带来了一系列的问题。猪克隆技术已经建立超过14年时间，多种克隆猪或基因修饰克隆猪已经被生产，但目前克隆猪的效率仍然十分低下，移植的猪克隆胚胎在代孕母猪子宫内发育至出生的效率一般在1％左右。猪的克隆效率低下主要表现在胚胎移植后流产率高，胎儿围产期死亡率高以及出生后的成活率低。影响猪克隆效率的因素有很多，如供体细胞的选择，供体细胞的传代次数，卵母细胞的去核方法，融合、激活方式，供体细胞核与卵质受体的同期化，重构胚的激活，胚胎培养条件优化以及Xist基因异常表达等，但主要还是由于供体细胞核发生了错误或不完全重编程，而重编程过程中主要是表观遗传修饰发生了变化，表观遗传修饰的一个重要方面是组蛋白修饰，而组蛋白甲基化是组蛋白修饰的主要方式之一，是由组蛋白甲基化转移酶(histonemethyltransferase，HMT)完成的。H3组蛋白第9赖氨酸3甲基化(H3K9me3)是众多的染色质组蛋白修饰方式之一。H3K9me3已被证明通过与异染色质蛋白1(HeterochromatinProtein1,HP1)的互作，使H3K9me3所结合的染色质区域的构象改变，从而使该染色质区域内基因的表达沉默。此外，H3K9me3还抑制能激活基因表达的两种染色质组蛋白修饰的建立，包括H3组蛋白第9赖氨酸乙酰化(H3K9ac)和H3组蛋白第9赖氨酸甲基化(H3K9me)。因此，H3K9me3是一种抑制基因表达的表观遗传修饰。

最近一些研究表明，猪体细胞中存在高水平的H3K9me3组蛋白甲基化。这意味着在克隆胚胎中来源于供体细胞的高水平H3K9me3也可能是导致猪克隆效率低下的重要原因，而擦除或抑制H3K9me3甲基化将有可能矫正猪克隆胚胎的基因表达模式，从而显著提高猪克隆胚胎的发育效率。

有报道表明在小鼠上Suv39H1和Suv39H2基因的主要功能是负责建立H3K9me3的组蛋白甲基化酶；人或小鼠KDM4A、KDM4B、KDM4D基因的mRNA主要功能是特异擦除H3K9me3的组蛋白去甲基化酶。但在猪的研究方面未见相关报道，也未有报道表明通过抑制猪Suv39H1和Suv39H2基因及注射KDM4A、KDM4B、KDM4D基因的mRNA来抑制或擦除H3K9me3可以提高猪克隆效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于抑制H3K9me3甲基化的提高猪克隆效率的方法，以提高猪克隆效率。

根据本发明的一个方面，提供了一种基于抑制H3K9me3甲基化的提高猪克隆效率的方法，所述方法是通过抑制猪克隆胚胎核移植时供核细胞中Suv39H1和Suv39H2基因的表达及在核移植重构胚中过表达KDM4AmRNA来抑制H3K9me3甲基化，进而提高猪克隆效率的。具体的，该基于抑制H3K9me3甲基化的提高猪克隆效率的方法通过在核移植前先在供核细胞中共转染抗Suv39H1和Suv39H2基因的有效siRNA，来抑制供核细胞中Suv39H1和Suv39H2基因的高表达，从而抑制供核细胞中的H3K9me3高甲基化水平，然后将处理后的供核细胞进行核移植，并在核移植获得的重构胚激活后，进行包浆显微注射KDM4AmRNA进一步抑制重构胚中组蛋白H3K9me3甲基化，以最终来提高猪的克隆效率。供核细胞中高水平H3K9me3甲基化对克隆效率有很大影响，因此可以通过共转染抗Suv39H1和Suv39H2基因的有效siRNA来抑制Suv39H1和Suv39H2基因的表达，进而实现快速抑制H3K9me3甲基化，但因为siRNA易降解，其对H3K9me3的抑制是有时效性的，因此在核移植过程中，重构胚被激活后，再通过包浆显微注射KDM4AmRNA来进一步抑制H3K9me3甲基化，且KDM4AmRNA不易降解，作用时间更加长久。本发明通过作用机理不同、作用阶段不同的两种方式共同处理核移植过程中不同的时期，以达到更好的抑制H3K9me3甲基化的效果，最终来提高猪克隆效率，其所述方法通过以下步骤实现：

1)构建KDM4A体外转录质粒及获得体外转录KDM4AmRNA：合成含有KDM4A基因的体外表达质粒，并利用体外转录方法获得体外转录KDM4AmRNA；

2)筛选抗Suv39H1和Suv39H2基因的有效siRNA序列：以Suv39H1和Suv39H2基因为模板，设计及合成抗Suv39H1和Suv39H2基因的有效siRNA，并进行定量PCR反应，筛选出有效的抗Suv39H1基因的H1-siRNA1序列和抗Suv39H2基因的H2-siRNA2序列；

3)将筛选出的H1-siRNA1序列和H2-siRNA2序列共转染供核细胞，并将共转染后的所述供核细胞作为核供体进行核移植，形成重构胚；

4)激活所述重构胚，并向所述重构胚显微注射所述的KDM4AmRNA，将处理后的所述重构胚移植至代孕母猪子宫内，待小猪出生。

在一些实施方式中，筛选出的有效H1-siRNA1序列为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2；有效H2-siRNA2序列为SEQIDNO:9和SEQIDNO:10。由此，可以获得最佳的抑制Suv39H1和Suv39H2的效果，进而更好的抑制H3K9me3甲基化。siRNA通过与靶基因相互作用来降解靶基因，达到抑制靶基因表达的目的，而siRNA与靶基因的相互作用与siRNA的序列息息相关，siRNA的序列决定了与靶基因结合作用的位点，也是决定靶基因能否降解的关键。因此包含SEQIDNO:1和SEQIDNO:2序列的H1-siRNA1及包含SEQIDNO:9和SEQIDNO:10序列的H2-siRNA2，是抑制Suv39H1和Suv39H2基因表达，进而抑制H3K9me3甲基化的关键。

在一些实施方式中，抗Suv39H1和Suv39H2基因的H1-siRNA1和H2-siRNA2共转染浓度为20μM，转染体积为0.5μL。在共转染过程中，siRNA的浓度直接影响了转染的效率，siRNA的浓度直接影响了其与转染脂质体结合的效率，也影响了siRNA进入细胞内的效率。siRNA浓度太低，会使转染效率过低，进行影响siRNA的效果；而siRNA浓度太高，会对细胞产生毒性，影响细胞的生长状态，而供核细胞的状态也会直接影响核移植的效率。因此，抗Suv39H1和Suv39H2基因的H1-siRNA1和H2-siRNA2共转染浓度为20μM，转染体积为0.5μL时，可以获得最好的转染效果，且对供核细胞的影响也是最小的，能对提高克隆效率发挥最有益的效果。

在一些实施方式中，KDM4AmRNA包浆显微注射的浓度为2000-5000ng/μL，注射体积为10pL。在核移植过程中包浆显微注射的注射体积为10pL，是由注射针的体积来决定的，但对于KDM4AmRNA的注射浓度的高低会直接影响克隆效率。KDM4AmRNA注射浓度太低的话，会影响其抑制H3K9me3甲基化的效果，而注射浓度过高的话，会对核移植的重构胚产生过重的代谢负担，影响重构胚的生长状态，而本实验表明KDM4AmRNA包浆显微注射的浓度为2000-5000ng/μL时，可获得较好的抑制H3K9me3甲基化的效果，且不影响重构胚的生长状态。

在一些实施方式中，H1-siRNA1和H2-siRNA2共转染次数为一次。H1-siRNA1和H2-siRNA2共转染的次数会影响转染的效果及被转染的供核细胞的生长状态，次数多或少都不能达到实验效果。因此，H1-siRNA1和H2-siRNA2共转染次数为1次。

在一些实施方式中，KDM4AmRNA包浆显微注射的时间为重构胚被激活后5-6小时。KDM4AmRNA显微注射的时间对克隆效率的影响十分重要，显微注射时间过早的话，重构胚在经历核移植融合后尚未达到合适的状态，显微注射只会加重重构胚的生长负担，造成早期不可逆损伤；而若显微注射时间过晚的话，重构胚内基因已经开始表达及发挥功能，此时注射KDM4AmRNA来抑制H3K9me3甲基化效果会受到影响。因此，KDM4AmRNA包浆显微注射的时间为重构胚被激活后5-6小时对提高克隆效率有显著影响。

附图说明

图1为KDM4A、KDM4B、KDM4D体外表达质粒酶切电泳图。

图2为KDM4A、KDM4B、KDM4D体外转录及加尾电泳图。

图3为抗Suv39H1基因的有效siRNA的干扰效果筛选结果图。

图4为抗Suv39H2基因的有效siRNA的干扰效果筛选结果图。

图5为共转染H1-siRNA1和H2-siRNA2第1、2和3次后Suv39H1基因相对表达量的变化结果图。

图6为共转染H1-siRNA1和H2-siRNA2第1和2次后Suv39H2基因相对表达量的变化结果图。

图7为抑制H3K9me3甲基化检测结果图。

图8为猪克隆胚胎体外发育囊胚内细胞染色图片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

本发明所涉及的KDM4A基因序列来源于GenBankaccessionnumber:NM_014663.2；KDM4B基因序列来源于GenBankaccessionnumber:NM_172132.2；KDM4D基因序列来源于GenBankaccessionnumber:NM_173433.2；Suv39H1基因序列来源于GenBankaccessionnumber:NM_003173.3；Suv39H2基因序列来源于GenBankaccessionnumber:NM_001039747.1。

1、构建KDM4A、KDM4B、KDM4D体外表达质粒及获得体外转录mRNA。

根据GenBank提供的KDM4A、KDM4B和KDM4D基因序列，利用质粒分析软件，找到合适的酶切位点，将3条基因序列的编码区序列构建至pcDNA3.1+双核表达载体，人工合成包含KDM4A、KDM4B、KDM4D基因的表达质粒，这三个基因的表达质粒长度分别为8629bp、8695bp、6967bp。将带有这三个基因表达质粒的穿刺菌利用“划线法”，将菌落接种于氨苄抗性(Amp+，200ug/ml)的平板中，置于37℃培养箱中培养12-16小时。24小时后，于每块平板上挑取几个单克隆，将单克隆分别接种于装有500ulLB培养液(含Amp+，200ug/mL)的2mL离心管中。将挑好单克隆的离心管置于37℃，250rpm的摇床中培养16小时左右。然后按照OMEGA公司E.Z.N.ATMMiniPlasmidKit质粒抽提说明书提取质粒，要求获得的质粒浓度不低于500ng/μL，体积不少于50μL，并将获得的质粒进行酶切鉴定，鉴定结果见图1。

鉴定正确的包含KDM4A、KDM4B、KDM4D基因的表达质粒，利用XhoI限制性内切酶线性化，且获得不少于50ug的相应质粒，按照OMEGA公司E.Z.N.ATMDNACyclePureKit的DNA纯化试剂盒说明书纯化回收线性化质粒，纯化后质粒浓度均不低于1μg/μL，体积不少于50μL。并按照Ambion公司mMESSAGET7Kit试剂盒说明书进行体外转录，体外转录体系为：

反应组分	体积
		线性化KDM4A/B/D	1ug(X ul)
2×NTP/CAP	10ul
		Reaction Buffer(10×)	2ul
Enzyme Mix	2ul
		RNase-free water	(6-X)ul
Total	20ul

按上表中转录体系加入相应组分后，混匀并37℃过夜反应，反应结束后加入1μLDNase(37℃，15min)除去DNA模板。并对转录产物进行纯化，纯化过程如下：向上述体系中加入30μLRNase-freewater和25μLLiCl，混匀后-20℃放置30min；然后12000g(4℃)离心15min；除去上清液后加入500μL70％乙醇洗涤，再12000g(4℃)离心15min；除去乙醇，吹干；加入50μLRNase-freewater溶解，要求浓度不低于2μg/μL，电泳无弥散，检测合格后存于-80℃保存备用。此后用E.coliPoly(A)Polymerase(NEB)试剂盒对产物进行加polyA反应，反应体系见下表：

加polyA后的产物进行纯化，纯化过程如下：向上述体系中加入60μLRNase-freewater和50μLLiCl，混匀后-20℃放置30min；然后12000g(4℃)离心15min；除去上清液后加入500μL70％乙醇洗涤，再12000g(4℃)离心15min；除去乙醇，吹干；加入50μLRNase-freewater溶解检测，要求浓度不低于2000ng/μL，电泳无弥散，检测合格后存于-80℃保存备用，电泳结果见图2。

2、抗Suv39H1和Suv39H2基因siRNA的设计合成及有效siRNA的筛选

2.1抗Suv39H1和Suv39H2基因siRNA的设计合成

根据GenBan提供的Suv39H1和Suv39H2基因序列，设计合成抗Suv39H1和Suv39H2基因的siRNA，其序列如下表：

合成的siRNA用无RNA酶的水溶解终浓度至20μM，分装后保存于－20℃备用。

2.2抗Suv39H1和Suv39H2基因有效siRNA的筛选

2.2.1猪胎儿成纤维细胞的培养

(1)细胞的复苏

从液氮罐中取出冻存管，立即投入37℃水浴中不停搅动(时间尽量控制在1min内)。将解冻后的细胞悬液，转移至离心管中，加入3倍DMEM培养液，1000rpm/min，离心5-7min后除去上清，用新鲜的完全培养基悬浮沉淀细胞，将细胞稀释至所需浓度，充分吹打为单层细胞，接种到新的培养皿中培养。次日换液，当细胞汇合度达到90％时可进行传代培养。

(2)待培养的细胞长至80％-90％汇合时，需细胞传代培养。

加入适量的0.25％胰酶消化2-3min，在倒置显微镜下观察。待观察细胞变圆，并且脱壁，立即加入含2％胎牛血清的完全培养液终止反应，将消化后的细胞混合液转入15mL离心管中，1000rpm/min离心5-7min。去上清，加入细胞培养液重悬细胞，调整细胞密度，按1：2-3的比例重新接种到新的细胞培养瓶皿内，并置于39℃，5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养。

(3)细胞的冻存

为避免细胞在体外长期培养而导致老化、污染、丢失，对状态良好的细胞要及时冻存、编号。选择生长至90％左右汇合生长旺盛的细胞，用与传代培养相同的方法消化收集细胞。离心去上清后，加入含10％DMSO的细胞冻存液重悬细胞，将细胞混合液转移到1mL冻存管中，封口，标记，4℃冰箱放置2h后在-20℃冰箱内冷冻30min，然后转入-80℃冰箱过夜保存，第二天取出放入液氮中长期保存。

2.2.2猪胎儿成纤维细胞(PEFs)的转染

将复苏后汇合度达90％的细胞传代至6孔板，待6孔板中的猪胎儿成纤维细胞长到60％—80％的富集度时开始转染。转染过程如下：

(1)将1μLsiRNA(浓度为20μM)加入装有200μLOptimedium的去RNA酶的离心管里混匀；同时将5μLRNAiMAXReagent(Invitrogen公司)加入装有200μLOptimedium的去RNA酶离心管中，轻轻混匀，室温孵育5min。

(2)将含有5μLRNAiMAXReagent的混合液加入含有1μLsiRNA混合液的离心管中，轻轻混匀，室温孵育20min。

(3)将6孔板细胞换液，加入1.6mL培养基，加入孵育的RNAiMAXReagent与siRNA的混合液，使终体积达到2mL。

2.2.3抗Suv39H1和Suv39H2基因有效siRNA的筛选

将转染细胞培养24h后，提取RNA并进行实时定量PCR反应，反应采用Qiagen公司的QuantiFastSYBRGreenPCRKit定量反应试剂盒进行实验，反应体系为10μL，每次3-4个技术重复。PCR反应程序为：95℃预变性、热启动5min；95℃10s、60℃17s、72℃20s(45-50个循环)；溶解曲线95℃15s、55℃15s、95℃15s。基因相对表达数据分析中，各基因Ct值经过内参基因(ACTB)和对照样品正态化处理后，用2^-△△CT方法计算相对表达量。具体做法是将每组样品目的基因Ct均值减去ACTBCt均值得到△Ct值，将其中一组样品△Ct值作为参照，将其它处理样品△Ct值减去参照组样品△Ct值得到各组样品的△△Ct值，最后将每个处理样品相对参照组样品的目的基因表达量用2^-△△CT表示。概率值P<0.05时，平均值显著差异。实验表明，由SEQIDNO:1和SEQIDNO:2序列组成的H1-siRNA1对Suv39H1基因抑制效果最好，而由SEQIDNO:9和SEQIDNO:10序列组成的H2-siRNA2对Suv39H2基因抑制效果最好，结果见图3和图4。

2.2.4H1-siRNA1和H2-siRNA2共转染的最佳条件

将0.5μLH1-siRNA1(浓度为20μM)与0.5μLH2-siRNA2(浓度为20μM)混匀后，按照2.2.2的操作方法进行第一次转染，然后39℃培养24h后换液，继续培养48h后重复2.2.2中的操作(1)-(3)进行第二次转染，再39℃培养24h后换液，继续培养48h后重复2.2.2中的操作(1)-(3)进行第三次转染。实验表明，0.5μLH1-siRNA1与0.5μLH2-siRNA12共转染一次抑制效果最好，结果见图5和图6。

3、抑制H3K9me3甲基化来提高猪克隆胚胎体外发育效率及抑制H3K9me3甲基化效果检测

按照2.2.1的方法培养用于核移植的供核细胞，然后用0.5μLH1-siRNA1与0.5μLH2-siRNA12共转染供核细胞(共转染方法见2.2.2的操作方法)，转染48h后，进行核移植，且在核移植过程中胚胎被激活后5-6小时，通过胞浆显微注射的方法分别将KDM4A、KDM4B、KDM4DmRNA注射进克隆胚胎中获得重构胚，mRNA终浓度为3000ng/μL，每枚胚胎注射10pLmRNA。然后将重构胚置于39℃、5％CO2和饱和湿度的培养箱中进行体外培养。

当各组的重构胚体外培养至囊胚期后，对各组的囊胚期胚胎提取蛋白质并进行WesternBlot检测。实验结果表明，当H1-siRNA1与H2-siRNA2共转染供核细胞及在重构胚被激活后显微注射KDM4AmRNA时，可以明显的抑制克隆胚胎的H3K9me3甲基化水平，实验结果见图7。

进一步地，在重构胚胎体外培养48小时和168小时分别观察的卵裂率及囊胚率等克隆效率相关的数据如下：

实验表明，当采用0.5μLH1-siRNA1与0.5μLH2-siRNA2共转染核移植的供核细胞，并在重构胚被激活后5-6小时时包浆显微注射KDM4AmRNA，浓度3000ng/μL，体积10μL时，可以显著提高猪克隆胚胎的卵裂率、囊胚率和囊胚内平均细胞数，而卵裂率、囊胚率和囊胚内平均细胞数是衡量克隆胚胎体外发育效率及体外发育质量的重要指标。结果说明H1-siRNA1与H2-siRNA2共转染供核细胞及在重构胚被激活后显微注射KDM4AmRNA时可以显著抑制克隆胚胎H3K9me3甲基化水平，进而可显著提高猪克隆胚胎体外发育效率。图8中“A”为对照组囊胚内细胞染色图片，“B”为共转染0.5μLH1-siRNA1与0.5μLH2-siRNA2及包浆显微注射KDM4AmRNA组囊胚内细胞染色图片。

5、抑制H3K9me3甲基化来提高猪克隆效率

按照2.2.1的方法培养用于核移植的供核细胞，然后用0.5μLH1-siRNA1与0.5μLH2-siRNA12共转染供核细胞(共转染方法见2.2.2的操作方法)，转染48h后，进行核移植，且在核移植过程中胚胎被激活后5-6小时，通过胞浆显微注射的方法将KDM4A、KDM4B、KDM4DmRNA注射进克隆胚胎中获得重构胚，注射用的mRNA终浓度为3000ng/μL，每枚胚胎注射10pLmRNA。将处理后的重构胚移植到代孕母猪子宫内，每头母猪平均移植200枚左右重构胚，记录代孕母猪的受孕情况及产仔情况，克隆猪成活率＝出生后成活仔猪数/总产仔数×100％，克隆效率＝总产仔数/重构胚数×100％。实验结果见下表：

实验表明，当采用0.5μLH1-siRNA1与0.5μLH2-siRNA2共转染核移植的供核细胞，并在重构胚被激活5-6小时时包浆显微注射KDM4AmRNA，浓度3000ng/μL，体积10μL时，可以显著提高代孕母猪受孕率、总产仔数、平均产仔数、克隆猪成活率及克隆效率，且可将克隆效率从对照组1.42％提高到4.37％，提高了307.75％倍。实验结果说明采取H1-siRNA1与H2-siRNA2共转染猪核移植的供核细胞及在重构胚被激活后显微注射KDM4AmRNA可以抑制H3K9me3甲基化，进而可显著提高猪克隆效率。

在其他实施例中，KDM4AmRNA包浆显微注射的浓度还可以为2000ng/μL，4000ng/μL和5000ng/μL等其它浓度。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种基于抑制H3K9me3甲基化的提高猪克隆效率的方法，其特征在于，所述方法通过抑制猪克隆胚胎核移植时供核细胞中Suv39H1和Suv39H2基因的表达及在核移植重构胚中过表达KDM4AmRNA来抑制猪克隆胚胎中H3K9me3甲基化进而提高猪克隆效率。

2.根据权利要求1所述的基于抑制H3K9me3甲基化的提高猪克隆效率的方法，其特征在于，所述方法通过以下步骤实现：

1)构建KDM4A体外转录质粒及获得体外转录KDM4AmRNA：合成含有KDM4A基因的体外表达质粒，并利用体外转录方法获得体外转录KDM4AmRNA；

2)筛选抗Suv39H1和Suv39H2基因的有效siRNA序列：以Suv39H1和Suv39H2基因为模板，设计及合成抗Suv39H1和Suv39H2基因的有效siRNA，并进行定量PCR反应，筛选出有效的抗Suv39H1基因的H1-siRNA1序列和抗Suv39H2基因的H2-siRNA2序列；

3)将筛选出的H1-siRNA1序列和H2-siRNA2序列共转染供核细胞，并将共转染后的所述供核细胞作为核供体进行核移植，形成重构胚；

4)激活所述重构胚，并向所述重构胚显微注射所述的KDM4AmRNA，将处理后的所述重构胚移植至代孕母猪子宫内，待小猪出生。

3.根据权利要求2所述的基于抑制H3K9me3甲基化的提高猪克隆效率的方法，其特征在于，所述H1-siRNA1的序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。

4.根据权利要求2所述的基于抑制H3K9me3甲基化的提高猪克隆效率的方法，其特征在于，所述H2-siRNA2的序列如SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示。

5.根据权利要求2所述的基于抑制H3K9me3甲基化的提高猪克隆效率的方法，其特征在于，所述H1-siRNA1和H2-siRNA2共转染浓度分别为20μM，转染体积为0.5μL。

6.根据权利要求2所述的基于抑制H3K9me3甲基化的提高猪克隆效率的方法，其特征在于，所述KDM4AmRNA包浆显微注射的浓度为2000-5000ng/μL，注射体积为10pL。

7.根据权利要求5所述的基于抑制H3K9me3甲基化的提高猪克隆效率的方法，其特征在于，所述H1-siRNA1和H2-siRNA2共转染次数为一次。

8.根据权利要求6所述的基于抑制H3K9me3甲基化的提高猪克隆效率的方法，其特征在于，所述KDM4AmRNA包浆显微注射的时间为重构胚被激活后5-6小时。