CN111073847A - 人类输卵管上皮细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人类输卵管上皮细胞的培养方法，包括如下步骤：获取壶腹部输卵管组织，置于消化液中消化；消化终止后，置于加有10％FBS的基础培养基中预贴壁培养3‑5h；预贴壁培养后，将上皮细胞转移至完全培养基中培养至细胞长密，然后进行饥饿处理培养2天收取细胞。本申请通过特定的消化液对输卵管组织进行完全消化，而且消化比较温和，不会破坏细胞的形态，此外，在培养过程中对培养基进行了优化。本发明通过上述培养方法，获得了大量的输卵管上皮细胞，而且纤毛分化比例高，为相关的研究提供了很大的便利。

Description

人类输卵管上皮细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种人类输卵管上皮细胞的培养方法。
背景技术
输卵管一直被认为是被动的生殖，作为受精的场所和运输配子和着床前胚胎的通道。越来越多的证据表明，输卵管还调节精子的功能，并促进着床前胚胎的发育。输卵管的后几种功能是由其上皮细胞介导的。输卵管的管腔内衬有由分泌细胞和纤毛细胞组成的柱状上皮，分泌细胞和纤毛细胞在调节异种生殖的上皮表面方面都具有关键作用。分泌细胞产生的粘液、纤毛的摆动促进配子的运输。这些细胞类型在输卵管不同区域的比例在生殖周期中发生变化。尤其是壶腹区的上皮细胞正在积极合成和分泌各种分子到输卵管的腔内，包括补体蛋白-3和半月形细胞和腮腺蛋白，已知这些分子可以刺激着床前胚胎的发育。此外，最近的研究表明，一些浆液性卵巢癌可能来自输卵管上皮。
原位输卵管壶腹部上皮中以纤毛上皮细胞为主，另一种类型的上皮细胞为分泌型上皮细胞。已经有人提出，输卵管纤毛细胞是由分泌样表型的细胞分化而来的。众所周知，体外培养的输卵管上皮细胞失去了与原位上皮相关的形态学特征，包括纤毛。目前尚不清楚在原代培养中缺乏纤毛细胞是由于这些细胞未能粘附和存活，还是由于体外衰退或去分化的过程。对于纤毛细胞和分泌细胞分化的分子机制，气管具有与输卵管相似的上皮结构，是具有代表性的模型。一些研究表明，Notch信号控制纤毛细胞和分泌细胞的平衡。在发育中的气道中，Notch激活成功地以牺牲纤毛细胞为代价来驱动分泌细胞的形成，而Notch信号的抑制导致纤毛细胞数量的增加和伴随的分泌细胞生成的减少。Rachel W.S.关于人生殖系统上皮细胞培养，其结果中并未明显展示输卵管原代上皮细胞中发现纤毛。HisaoAndo等人建立了永生化的输卵管上皮细胞系，命名为NT/T-S，根据其结果可发现纤毛与微绒毛，但其纤毛细胞分化比例较低。Maobi Zhu等人根据气管上皮培养模型提出了关于猪输卵管原代上皮细胞培养方法，但由于培养皿限制，其细胞数量较少。
我们根据上述培养方法存在的不足，拟提供一种人类输卵管上皮细胞的培养方法，对输卵管原代上皮细胞的培养方法进行改良。
发明内容
本发明为解决现有技术中的上述问题提出的一种人类输卵管上皮细胞的培养方法，改良了关于输卵管原代上皮细胞步骤，纤毛分化比例高，更利于后续实验及研究。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一个方面是提供一种人类输卵管上皮细胞的培养方法，包括如下步骤：
步骤一，将手术切下来的输卵管纵向剖开，置于Ham F12缓冲液中去除输卵管侧面多余的肉；
步骤二，将步骤一处理后的输卵管置于消化液中消化14-20h；
步骤三，终止消化后，颠倒，吸取上层液体，离心，置于加有10％FBS的基础培养基中预贴壁培养3-5h；
步骤四，预贴壁培养后，将上皮细胞转移至完全培养基中培养至细胞长密；
步骤五，对步骤四中长密的细胞进行饥饿处理培养分化纤毛；
步骤六，收取样品；
其中，所述消化液2700ul Ham F12培养基(+左旋谷氨酰胺+青霉素+链霉素)+300ul蛋白酶E+9ul DNA酶I；
进一步地，蛋白酶E的终浓度为0.15％，DNA酶I的终浓度为0.1mg/ml；
所述完全培养基包括基础培养基、胰岛素、铁传递蛋白、霍乱毒素、上皮细胞生长因子(EGF)、牛垂体提取物、胚牛血清(FBS)、视黄酸(RA)和原代细胞抗生素(primocin)。
进一步地，胰岛素的浓度为10μg/ml，铁传递蛋白的浓度为5μg/ml，霍乱毒素的浓度为0.1μg/ml，EGF的浓度为25ng/ml，牛垂体提取物的浓度为30μg/ml。
进一步地，所述基础培养基的配制方法为在含有15mM HEPES和L-谷氨酰胺的DMEM-Ham's F-12培养基中加入0.072mol/l NaHCO3、0.08mol/l L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素。
进一步地，步骤一中的输卵管主要取自壶腹部。
进一步地，步骤二中的消化时间为16-18h。
进一步地，步骤三中培养至原纤维细胞贴壁。
进一步地，步骤四中细胞长密的状态为细胞与细胞间挤得紧紧的，呈现方型，而且细胞很小。
进一步地，步骤五中的饥饿处理培养时间为1-2天，所使用的培养基为基础培养基加入体积占比为2％的血清替代品和0.08mol/l L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本申请提供了一种人类输卵管上皮细胞的培养方法，通过特定的消化液对输卵管组织进行完全消化，而且消化比较温和，不会破坏细胞的形态，对输卵管在培养过程中对培养基进行了优化。通过上述培养方法，获得了大量的输卵管上皮细胞，而且纤毛分化比例高，为相关的研究提供了很大的便利。
附图说明
图1为本发明一实施例中细胞鉴定的免疫荧光图谱(其中，第一排为本发明实施例的结果，第二排为对比例的结果，分别染ace-tublin和DAP；ace-tublin为纤毛细胞标志物，DAPI为细胞核标志物)；
图2为本发明一实施例中纤毛细胞分化比例统计图；
图3为本发明一实施例中培养过程中的细胞生长曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种人类输卵管上皮细胞的培养方法。
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
以下过程中使用的试剂及其来源、浓度和保存温度如下：
原代细胞抗生素(1000x)：anti-pm-2(InvivoGen)，保存浓度为50mg/ml，保存温度为-20℃。
蛋白酶E(10x)：P6911-1G(Sigma)以15mg/ml的浓度溶解在F-12/GPS中，保存温度为-70℃，溶解温度为4℃。
DNase I(1000x)：保存浓度为1mg/ml(溶解溶液为酸盐缓冲液)，保存温度为-20℃。
胰岛素：I6634(Sigma)，保存浓度为2mg/ml(溶解在pH 2-3，1mM盐酸溶液中)，保存温度为-20℃。
铁传递蛋白：T8158(Sigma)，保存浓度为5mg/ml(溶解在无菌水中)，保存温度为-20℃。
霍乱毒素：C8052(Sigma)，保存浓度为1mg/ml(溶解在无菌水中)，保存温度为-20℃。
EGF：E4127(Sigma)，保存浓度为0.1mg/ml(溶解在含有0.1％BSA的PBS溶液中)，保存温度为-20℃。
BPE(牛垂体提取物)：P1167(Sigma)354123(BD)，保存浓度为1mg/ml或者1.5mg/ml(溶解在MTEC基础培养液中)，保存温度为-20℃。
视黄酸(RA)：R2625(Sigma)，保存温度为-80℃。
F-12K：货号21127-075(Invitrogen)。
实施例一
本实施例提供人类输卵管上皮细胞的培养方法，包括如下步骤：
步骤一，配制培养基和消化液
1.基础培养基(250ml)：DMEM与Ham's F-12按照体积比1：1混合，添加15mM HEPES、4mM L-谷氨酰胺、3.6mM NaHCO3、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。
2.完全培养基(50ml)：向基础培养基中加入10μg/ml胰岛素、5μg/ml铁传递蛋白、0.1μg/ml霍乱毒素、25ng/ml EGF、30μg/ml牛垂体提取物、5％的胚牛血清、0.05μM视黄酸和原代细胞抗生素。
3.无血清培养基(50ml)：向基础培养基中加入5μg/ml胰岛素、5μg/ml铁传递蛋白、0.025μg/ml霍乱毒素、5ng/ml EGF、30μg/ml牛垂体提取物。
4.血清替代培养基(50ml)：向基础培养基中加入2％血清替代品。
5.消化液：2700ul Ham F12(+左旋谷氨酰胺+青霉素+链霉素)+300ul蛋白酶E+9ulDNA酶I，其中，蛋白酶E(0.15％终浓度)，DNA酶I(0.1mg/ml终浓度)。
步骤二，将手术切下来的壶腹部的输卵管(3cm)用剪刀纵向剖开，置于Ham F12缓冲液中去除输卵管侧面多余的肉。
步骤三，将步骤一处理后的输卵管置于消化液中，4℃条件下消化16-18h；
步骤四，加入300ul的FBS(终止消化)；上下颠倒20次，吸出上面的液体，至干净的15ml离心管中。加入3ml的培养液(国产的F12即可)，上下颠倒20次，吸出上面的液体，至刚才的15ml离心管中。重复上面的操作得到共计液体9ml，将15ml管用parafilm膜封口，1200rpm 25℃离心2min。小心吸去上清，沉淀用2ml、37℃的基础培养基+10％FBS重悬(轻轻吹打2-3次，)，转移至小皿，再用2ml刷洗底部(轻轻吹打2-3次)，转移至60mm细胞培养皿中。37℃培养箱内培养4h，使纤维原细胞贴壁。
步骤五，预贴壁培养后，预热含有10％FBS的基础培养基，取出60mm的小皿，用小枪插上枪头(普通灭菌)，挑去大块，打掉枪头。用滴管将小皿中的含有细胞的培液，移入干净15ml离心管中。用预热的基础培养基+10％胎牛血清培液涮2次，每次3ml，移入15ml离心管中。前后收集液体共计10ml，将15ml管用parafilm膜封口，1200rpm，25℃离心2min。小心移去上清，加入1ml预热的完全培养基培液重悬，吹打不超过6次。用大枪，Axgen枪头，吸500ul，加入活体皿中，补完全培养基培液至1ml。置于37℃培养箱培养至完全培养基中培养约4天至细胞长密，期间隔一天换一次培养液。
步骤六，对步骤五中长密的细胞进行饥饿处理培养：预热血清替代品培养液，并加入GPS和RA，取出细胞，弃掉培养液，用PBS洗两遍，加入配制好的培养液，置于37℃保温箱中培养2天，然后收取细胞。
培养过程中，对细胞进行计数，得到了细胞的生长曲线图(如图2)。培养完成后利用免疫荧光观察和鉴定纤毛细胞比例(如图1和图2)。
对比例1
对照组实验方法按照Rachel W.S.Chan[1]提供的实验方法操作，具体步骤如下：
培养基：在450mL Dulbecco’s modified Eagle’s medium Nutrient MixtureHam F-12(DMEM/F121:1,v/v；
Figure BDA0002342394470000061
)，加入50mL FBS及左旋谷氨酰胺(0.1％,w/v)，青霉素(50IU/mL)，和链霉素(50IU/mL)。
实验步骤：
1.人输卵管取自因妇科良性疾病入院行输卵管结扎术或子宫切除术的妇女。
2.将新鲜的人输卵管保存在PBS中。
3.纵向切开输卵管，用无菌钳子将输卵管粘膜剥离。用一把剪刀在最少量的PBS中切碎上皮。
4.用0.05％胰蛋白酶/EDTA溶液5mL，37℃振荡45min消化上皮。室温下300×g离心2min收集细胞。
5.将分散的输卵管细胞用输卵管细胞培养液冲洗2次。
6.在相同的培养基中培养5×105个细胞，培养温度为37℃，空气中CO2浓度为5％。
7.用相差显微镜每天监测细胞的生长情况。每48小时更换一次培养液，上皮细胞一般需要4-6天才能分化。培养完成后利用免疫荧光观察和鉴定纤毛细胞比例(如图1和图2)。
[1]Chan RW,Mak AS,Yeung WS,Lee KF,Cheung AN,Ngan HY,Wong AS:Humanfemale reproductive tract epithelial cell culture.Methods Mol Biol 2013,945:347-363.
结合图1和图2可知，相对于对比例，实施例一采用的方法可以获得大量的输卵管上皮细胞，而且纤毛分化比例高，而且由图3可知，细胞增殖较快，饥饿培养后可分化纤毛。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (8)

1.人类输卵管上皮细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，将手术切下来的输卵管纵向剖开，置于Ham F12缓冲液中去除输卵管侧面多余的肉；
步骤二，将步骤一处理后的输卵管置于消化液中消化14-20h；
步骤三，终止消化后，颠倒，吸取上层液体，离心，置于加有10％FBS的基础培养基中预贴壁培养3-5h；
步骤四，预贴壁培养后，将上皮细胞转移至完全培养基中培养至细胞长密；
步骤五，对步骤四中长密的细胞进行饥饿处理培养分化纤毛；
步骤六，收取样品；
其中，所述消化液为包含左旋谷氨酰胺、青霉素和链霉素的Ham F12培养基、蛋白酶E以及DNA酶I；
所述完全培养基包括基础培养基、胰岛素、转铁蛋白、霍乱毒素、上皮细胞生长因子(EGF)、牛脑垂体提取物、胚牛血清(FBS)、视黄酸(RA)和原代细胞抗生素。
2.根据权利要求1所述的人类输卵管上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述胰岛素的浓度为10μg/ml，所述转铁蛋白的浓度为5μg/ml，所述霍乱毒素的浓度为0.1μg/ml，所述EGF的浓度为25ng/ml，所述牛脑垂体提取物的浓度为30μg/ml。
3.根据权利要求1所述的人类输卵管上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述基础培养基的配制方法为在含有15mM HEPES和L-谷氨酰胺的DMEM/Ham's F-12培养基中加入0.072mol/l NaHCO3、0.08mol/l L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素。
4.根据权利要求1所述的人类输卵管上皮细胞的培养方法，其特征在于，步骤一中的所述输卵管主要取自壶腹部。
5.根据权利要求1所述的人类输卵管上皮细胞的培养方法，其特征在于，步骤二所述消化的时间为16-18h。
6.根据权利要求1所述的人类输卵管上皮细胞的培养方法，其特征在于，步骤三中培养至原纤维细胞贴壁。
7.根据权利要求1所述的人类输卵管上皮细胞的培养方法，其特征在于，步骤四所述细胞长密的状态为细胞与细胞间挤得紧紧的，呈现方型，而且细胞很小。
8.根据权利要求1所述的人类输卵管上皮细胞的培养方法，其特征在于，步骤五中所述饥饿处理培养的时间为1-2天，所使用的培养基为基础培养基加入体积占比为2％的血清替代品和.08mol/l L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素。
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