CN110237305A - 一种填充制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种填充制剂及其制备方法，制备方法包括以下步骤：取外周血，离心得富血小板血浆，将其冻存，然后取出冻融，继续离心去除底部的膜碎片，得富血小板因子血浆，备用；取自体皮下脂肪，制得脂肪颗粒，取脂肪颗粒，向其中加入DMSO冷冻液进行冻存，然后复苏，向其中加入无菌生理盐水，得脂肪颗粒混悬液，最后向脂肪颗粒混悬液中加入胰岛素，摇匀备用；将脂肪颗粒离心，弃去上层油脂，得脂肪细胞，将脂肪细胞扩增培养至P4代，得脂肪干细胞重悬液，备用；将富血小板因子血浆、脂肪颗粒混悬液和脂肪干细胞重悬液按照一定体积比混匀，制得。该填充制剂可有效解决现有的填充材料存在的成活率低、移植后维持时间短以及填充效果差的问题。

Description

一种填充制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及填充制剂技术领域，具体涉及一种填充制剂及其制备方法。
背景技术
随着年龄的增长，面部会逐渐出现凹陷、皱纹、皮肤老化等情况，这对于天生爱美的人来说是个不小的打击，如何使自己的面部和肌肤恢复到年轻状态，也成了他们孜孜以求的目标，随之诞生了各种面部填充材料和技术，其中自体脂肪已成为组织填充的理想材料之一。
脂肪组织是一个理想的自体组织细胞来源，通过较小创伤的外科吸脂即可大量获得，在过去的20余年中，自体脂肪组织移植已大量用于填充外科和组织的重建，这些不只限于创伤后面部或身体的缺损，如发育障碍、半侧颜面萎缩、放射损伤后遗症的治疗，还包括其他的填充治疗，如面部皱纹的填充等。
移植需指定详细的计划，包括脂肪的获取方式、保存方法和脂肪移植的全过程，由于有不可预测的吸收率，为了达到最好的治疗效果常需要多次重复移植，现有的脂肪移植手术一般存在脂肪移植成活率低、移植后维持周期短以及填充效果差等弊端。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种填充制剂及其制备方法，该填充制剂可有效解决现有的填充材料存在的成活率低、移植后维持时间短以及填充效果差的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种填充制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)采取外周血，用800～2000g/min的离心力离心6～12min，吸取中间部分，得富血小板血浆，将富血小板血浆置于-40～-80℃条件下冻存3～8h后取出冻融，然后将富血小板血浆于2000～4000rpm/min的离心力下离心6～10min，去除底部固体碎片，得富血小板因子血浆，备用；
(2)吸取自体皮下脂肪，静置，弃去上层油脂后用无菌生理盐水洗涤2～3次，得脂肪颗粒，取一半脂肪颗粒，向其中加入1-4倍脂肪颗粒体积的DMSO冷冻液，将脂肪颗粒进行梯度降温冻存，然后复苏脂肪颗粒并洗去脂肪颗粒内的DMSO冷冻液，再向其中加入无菌生理盐水，摇匀得脂肪颗粒混悬液，最后向脂肪颗粒混悬液中加入胰岛素，控制脂肪颗粒混悬液中胰岛素浓度为100～400mU/L，摇匀备用；
(3)取步骤(2)中剩余的脂肪颗粒，在2000～4000rpm/min的离心力下离心10-20min，弃去上层油脂，得脂肪细胞，然后按照2～3mL/瓶的比例将脂肪细胞接种到培养瓶中培养，每3～5天进行换液处理，长至50～70％融合度时用胰蛋白酶进行消化得原代脂肪细胞，将原代脂肪细胞按照5000-8000个/cm2的比例接种到新的培养瓶中进行传代培养，对传代所得细胞进行消化和重悬，得脂肪干细胞重悬液；
(4)取步骤(1)中的富血小板因子血浆、步骤(2)中的脂肪颗粒混悬液和步骤(3)中的脂肪干细胞重悬液按体积比为1～2:3～7:3～7混匀，制得。
进一步地，步骤(1)中将采取的外周血用1500g/min的离心力离心10min，弃去上段贫血小板血浆和下段红细胞，得富血小板血浆，将富血小板血浆置于-80℃条件下冻存6h后取出冻融，然后将富血小板血浆于3000rpm/min的离心力下离心8min，去除底部的膜碎片，得富血小板因子血浆，备用。
进一步地，步骤(2)中DMSO冷冻液由无血清培养基和DMSO混合制成，其中无血清培养基和DMSO的体积比为9:1。
进一步地，步骤(2)中梯度降温冻存的过程如下：先将脂肪颗粒置于4℃条件下冻存2-8h，然后置于-20℃条件下冻存8～20h，最后置于-80℃条件下冻存20～48h。
进一步地，步骤(2)中，脂肪颗粒中的胰岛素浓度为300mU/L。
进一步地，步骤(2)中脂肪颗粒悬液中脂肪颗粒的浓度为1×106～1×108个/mL。
进一步地，步骤(3)中将脂肪细胞扩增至P4代，将P4代脂肪细胞用0.25wt％胰蛋白酶消化清洗后，向其中加入生理盐水，得脂肪干细胞重悬液，备用。
进一步地，步骤(3)中制得的脂肪干细胞密度为1×106～1×108个/mL。
进一步地，步骤(4)中富血小板因子血浆、脂肪颗粒混悬液和脂肪干细胞重悬液的体积比为1:5:5。
采用上述填充制剂的制备方法制得填充制剂。
采取上述方案所产生的有益效果为：
1、本发明中将脂肪颗粒、脂肪干细胞和富血小板因子血浆配合使用，填充前期，脂肪颗粒为脂肪干细胞提供3D生物支架，提高填充效果，提高脂肪干细胞成活率，填充后期，脂肪干细胞通过正常分化生长成自体脂肪组织，分化过程中逐渐替代死去的脂肪颗粒，维持填充的效果；脂肪干细胞和脂肪颗粒按一定比例混合后可最大程度的还原体内细胞生长的微环境，提高填充后细胞成活率；富血小板因子血浆中含有大量的细胞因子、生长因子、趋化因子、免疫调节因子和激素等物质，可刺激脂肪干细胞增殖，刺激新生血管生成，增加受损组织供血，促进组织再生、创面修复和细胞运作等，进一步提高移植成活率，延长填充物维持时间。
2、制备脂肪颗粒时加入一定浓度的胰岛素，填充后，胰岛素一方面可刺激脂肪干细胞分泌VEGF和HGF，另一方面还可促进脂肪干细胞发育，促进微血管生长，增加填充部位的血液循环，进一步提高细胞移植的成活率，提高填充效果。
3、脂肪颗粒制备过程中采用梯度降温冻存的操作，实现细胞的优化，提高移植的细胞质量，进而提高填充效果以及保持时间。
3、本发明的填充制剂的原材料均来源于自体，具有使用安全系数高，填充效果好，排斥反应小的优点。
具体实施方式
实施例1
一种填充制剂，其制备方法包括以下步骤：
(1)采取外周血，用800g/min的离心力离心6min，弃去上段贫血小板血浆和下段红细胞，将中段的富血小板血浆置于-40℃条件下冻存3h取出冻融，然后将富血小板血浆于2000rpm/min的离心力下离心6min，去除底部的膜碎片，得富血小板因子血浆，备用；
(2)吸取自体皮下脂肪，静置，弃去上层油脂后用无菌生理盐水洗涤2次，得脂肪颗粒，取一半脂肪颗粒，向其中加入1倍脂肪颗粒体积的DMSO冷冻液，将脂肪颗粒进行梯度降温冻存，然后复苏脂肪颗粒并洗去脂肪颗粒内的DMSO冷冻液，再向其中加入无菌生理盐水，摇匀得浓度为1×106个/mL的脂肪颗粒混悬液，最后向脂肪颗粒混悬液中加入胰岛素，控制脂肪颗粒混悬液中胰岛素浓度为100mU/L，摇匀备用；其中，DMSO冷冻液由无血清培养基和DMSO混合制成，无血清培养基和DMSO的体积比为9:1；梯度降温冻存的过程如下：先将脂肪颗粒置于4℃条件下冻存2h，然后置于-20℃条件下冻存8h，最后置于-80℃条件下冻存20h。
(3)取步骤(2)中剩余的脂肪颗粒，在2000rpm/min的离心力下离心10min，弃去上层油脂，得脂肪细胞，将脂肪细胞按照2mL/瓶的比例接种于T-175培养瓶中，并在35℃，4％二氧化碳浓度以及饱和湿度条件下培养，每3天进行换液处理，长至50％融合度时用0.25wt％胰蛋白酶进行消化得原代脂肪细胞，将原代脂肪细胞按照5000个/cm2的比例接种到新的T-175培养瓶中进行传代培养，重复上述操作，传代至P3时停止，将P3代脂肪细胞用0.25wt％胰蛋白酶消化清洗后，向其中加入生理盐水，得浓度为1×106个/mL脂肪干细胞重悬液，备用；
(4)取步骤(1)中的富血小板因子血浆、步骤(2)中的脂肪颗粒混悬液和步骤(3)中的脂肪干细胞重悬液按体积比为1:3:3混匀，制得。
实施例2
一种填充制剂，其制备方法包括以下步骤：
(1)采取外周血，用2000g/min的离心力离心12min，弃去上段贫血小板血浆和下段红细胞，将中段的富血小板血浆置于-80℃条件下冻存8h取出冻融，然后将富血小板血浆于4000rpm/min的离心力下离心10min，去除底部的膜碎片，得富血小板因子血浆，备用；
(2)吸取自体皮下脂肪，静置，弃去上层油脂后用无菌生理盐水洗涤3次，得脂肪颗粒，取一半脂肪颗粒，向其中加入4倍脂肪颗粒体积的DMSO冷冻液，将脂肪颗粒进行梯度降温冻存，然后复苏脂肪颗粒并洗去脂肪颗粒内的DMSO冷冻液，再向其中加入无菌生理盐水，摇匀得1×108个/mL脂肪颗粒混悬液，最后向脂肪颗粒混悬液中加入胰岛素，控制脂肪颗粒混悬液中胰岛素浓度为400mU/L，摇匀备用；其中，DMSO冷冻液由无血清培养基和DMSO混合制成，无血清培养基和DMSO的体积比为9:1；梯度降温冻存的过程如下：先将脂肪颗粒置于4℃条件下冻存8h，然后置于-20℃条件下冻存20h，最后置于-80℃条件下冻存48h；
(3)取步骤(2)中剩余的脂肪颗粒，在4000rpm/min的离心力下离心20min，弃去上层油脂，得脂肪细胞，将脂肪细胞按照3mL/瓶的比例接种于T-175培养瓶中，并在38℃，6％二氧化碳浓度以及饱和湿度条件下培养，每5天进行换液处理，长至70％融合度时用0.25wt％胰蛋白酶进行消化得原代脂肪细胞，将原代脂肪细胞按照8000个/cm2的比例接种到新的T-175培养瓶中进行传代培养，重复上述操作，传代至P6时停止，将P6代脂肪细胞用0.25wt％胰蛋白酶消化清洗后，向其中加入生理盐水，得浓度为1×108个/mL脂肪干细胞重悬液，备用；
(4)取步骤(1)中的富血小板因子血浆、步骤(2)中的脂肪颗粒混悬液和步骤(3)中的脂肪干细胞重悬液按体积比为2:7:7混匀，制得。
实施例3
一种填充制剂，其制备方法包括以下步骤：
(1)采取外周血，用1200g/min的离心力离心8min，弃去上段贫血小板血浆和下段红细胞，将中段的富血小板血浆置于-60℃条件下冻存5h取出冻融，然后将富血小板血浆于2500rpm/min的离心力下离心8min，去除底部的膜碎片，得富血小板因子血浆，备用；
(2)吸取自体皮下脂肪，静置，弃去上层油脂后用无菌生理盐水洗涤3次，得脂肪颗粒，取一半脂肪颗粒，向其中加入2倍脂肪颗粒体积的DMSO冷冻液，将脂肪颗粒进行梯度降温冻存，然后复苏脂肪颗粒并洗去脂肪颗粒内的DMSO冷冻液，再向其中加入无菌生理盐水，摇匀得浓度为1×107个/mL脂肪颗粒混悬液，最后向脂肪颗粒混悬液中加入胰岛素，控制脂肪颗粒混悬液中胰岛素浓度为250mU/L，摇匀备用；其中，DMSO冷冻液由无血清培养基和DMSO混合制成，无血清培养基和DMSO的体积比为9:1；梯度降温冻存的过程如下：先将脂肪颗粒置于4℃条件下冻存4h，然后置于-20℃条件下冻存12h，最后置于-80℃条件下冻存40h；
(3)取步骤(2)中剩余的脂肪颗粒，在2500rpm/min的离心力下离心15min，弃去上层油脂，得脂肪细胞，将脂肪细胞按照2mL/瓶的比例接种于T-175培养瓶中，并在36℃，4％二氧化碳浓度以及饱和湿度条件下培养，每3天进行换液处理，长至60％融合度时用0.25wt％胰蛋白酶进行消化得原代脂肪细胞，将原代脂肪细胞按照6000个/cm2比例接种到新的T-175培养瓶中进行传代培养，重复上述操作，传代至P5时停止，将P5代脂肪细胞用0.25wt％胰蛋白酶消化清洗后，向其中加入生理盐水，得浓度为1×107个/mL脂肪干细胞重悬液，备用；
(4)取步骤(1)中的富血小板因子血浆、步骤(2)中的脂肪颗粒混悬液和步骤(3)中的脂肪干细胞重悬液按体积比为1:4:5混匀，制得。
实施例4
一种填充制剂，其制备方法包括以下步骤：
(1)采取外周血，用1800g/min的离心力离心10min，弃去上段贫血小板血浆和下段红细胞，将中段的富血小板血浆置于-60℃条件下冻存7h取出冻融，然后将富血小板血浆于3500rpm/min的离心力下离心7min，去除底部的膜碎片，得富血小板因子血浆，备用；
(2)吸取自体皮下脂肪，静置，弃去上层油脂后用无菌生理盐水洗涤2次，得脂肪颗粒，取一半脂肪颗粒，向其中加入3倍脂肪颗粒体积的DMSO冷冻液，将脂肪颗粒进行梯度降温冻存，然后复苏脂肪颗粒并洗去脂肪颗粒内的DMSO冷冻液，再向其中加入无菌生理盐水，摇匀得浓度为1×108个/mL脂肪颗粒混悬液，最后向脂肪颗粒混悬液中加入胰岛素，控制脂肪颗粒混悬液中胰岛素浓度为350mU/L，摇匀备用；其中，DMSO冷冻液由无血清培养基和DMSO混匀制成，无血清培养基和DMSO的体积比为9:1；梯度降温冻存的过程如下：先将脂肪颗粒置于4℃条件下冻存6h，然后置于-20℃条件下冻存14h，最后置于-80℃条件下冻存30h；
(3)取步骤(2)中剩余的脂肪颗粒，在2000～4000rpm/min的离心力下离心12min，弃去上层油脂，得脂肪细胞，将脂肪细胞按照3mL/瓶的比例接种于T-175培养瓶中，并在37℃，5％二氧化碳浓度以及饱和湿度条件下培养，每4天进行换液处理，长至65％融合度时用0.25wt％胰蛋白酶进行消化得原代脂肪细胞，将原代脂肪细胞按照7000个/cm2比例接种到新的T-175培养瓶中进行传代培养，重复上述操作，传代至P6时停止，将P6代脂肪细胞用0.25wt％胰蛋白酶消化清洗后，向其中加入生理盐水，得浓度为1×108个/mL脂肪干细胞重悬液，备用；
(4)取步骤(1)中的富血小板因子血浆、步骤(2)中的脂肪颗粒混悬液和步骤(3)中的脂肪干细胞重悬液按体积比为2:4:3混匀，制得。
实施例5
一种填充制剂，其制备方法包括以下步骤：
(1)采取外周血，用1500g/min的离心力离心10min，弃去上段贫血小板血浆和下段红细胞，将中段的富血小板血浆置于-80℃条件下冻存6h取出冻融，然后将富血小板血浆于3000rpm/min的离心力下离心8min，去除底部的膜碎片，得富血小板因子血浆，备用；
(2)吸取自体皮下脂肪，静置，弃去上层油脂后用无菌生理盐水洗涤3次，得脂肪颗粒，取一半脂肪颗粒，向其中加入1倍脂肪颗粒体积的DMSO冷冻液，将脂肪颗粒进行梯度降温冻存，然后复苏脂肪颗粒并洗去脂肪颗粒内的DMSO冷冻液，再向其中加入无菌生理盐水，摇匀得浓度为1×107个/mL脂肪颗粒混悬液，最后向脂肪颗粒混悬液中加入胰岛素，控制脂肪颗粒混悬液中胰岛素浓度为300mU/L，摇匀备用；其中，DMSO冷冻液由无血清培养基和DMSO混合制成，无血清培养基和DMSO的体积比为9:1；梯度降温冻存的过程如下：先将脂肪颗粒置于4℃条件下冻存4h，然后置于-20℃条件下冻存10h，最后置于-80℃条件下冻存36h；
(3)取步骤(2)中剩余的脂肪颗粒，在3000rpm/min的离心力下离心20min，弃去上层油脂，得脂肪细胞，将脂肪细胞按照3mL/瓶的比例接种于T-175培养瓶中，并在37℃，5％二氧化碳浓度以及饱和湿度条件下培养，每3天进行换液处理，长至70％融合度时用0.25wt％胰蛋白酶进行消化得原代脂肪细胞，将原代脂肪细胞按照6500个/cm2比例接种到新的T-175培养瓶中进行传代培养，重复上述操作，传代至P4时停止，将P4代脂肪细胞用0.25wt％胰蛋白酶消化清洗后，向其中加入生理盐水，得浓度为1×108个/mL的脂肪干细胞重悬液，备用；
(4)取步骤(1)中的富血小板因子血浆、步骤(2)中的脂肪颗粒混悬液和步骤(3)中的脂肪干细胞重悬液按体积比为1:5:5混匀，制得。
对比例1
一种填充制剂，其制备方法包括以下步骤：
(1)采取外周血，用1500g/min的离心力离心10min，弃去上段贫血小板血浆和下段红细胞，得富血小板血浆，备用；
(2)吸取自体皮下脂肪，静置，弃去上层油脂后用无菌生理盐水洗涤3次，得脂肪颗粒，取一半脂肪颗粒，向其中加入1倍脂肪颗粒体积的DMSO冷冻液，将脂肪颗粒进行梯度降温冻存，然后复苏脂肪颗粒并洗去脂肪颗粒内的DMSO冷冻液，再向其中加入无菌生理盐水，摇匀得浓度为1×107个/mL脂肪颗粒混悬液，最后向脂肪颗粒混悬液中加入胰岛素，控制脂肪颗粒混悬液中胰岛素浓度为300mU/L，摇匀备用；其中，DMSO冷冻液由无血清培养基和DMSO混合制成，无血清培养基和DMSO的体积比为9:1；梯度降温冻存的过程如下：先将脂肪颗粒置于4℃条件下冻存4h，然后置于-20℃条件下冻存10h，最后置于-80℃条件下冻存36h；
(3)取步骤(2)中剩余的脂肪颗粒，在3000rpm/min的离心力下离心20min，弃去上层油脂，得脂肪细胞，将脂肪细胞按照3mL/瓶的比例接种于T-175培养瓶中，并在37℃，5％二氧化碳浓度以及饱和湿度条件下培养，每3天进行换液处理，长至70％融合度时用0.25wt％胰蛋白酶进行消化得原代脂肪细胞，将原代脂肪细胞按照6500个/cm2比例接种到新的T-175培养瓶中进行传代培养，重复上述操作，传代至P4时停止，将P4代脂肪细胞用0.25wt％胰蛋白酶消化清洗后，向其中加入生理盐水，得浓度为1×108个/mL的脂肪干细胞重悬液，备用；
(4)取步骤(1)中的富血小板因子血浆、步骤(2)中的脂肪颗粒混悬液和步骤(3)中的脂肪干细胞重悬液按体积比为1:5:5混匀，制得。
对比例2
一种填充制剂，其制备方法包括以下步骤：
(1)采取外周血，用1500g/min的离心力离心10min，弃去上段贫血小板血浆和下段红细胞，将中段的富血小板血浆置于-80℃条件下冻存6h取出冻融，然后将富血小板血浆于3000rpm/min的离心力下离心8min，去除底部的膜碎片，得富血小板因子血浆，备用；
(2)吸取自体皮下脂肪，静置，弃去上层油脂后用无菌生理盐水洗涤3次，得脂肪颗粒，取一半脂肪颗粒，向其中加入1倍脂肪颗粒体积的DMSO冷冻液，将脂肪颗粒在-80℃条件下冻存3h，然后复苏脂肪颗粒并洗去脂肪颗粒内的DMSO冷冻液，再向其中加入无菌生理盐水，摇匀得浓度为1×107个/mL脂肪颗粒混悬液，最后向脂肪颗粒混悬液中加入胰岛素，控制脂肪颗粒混悬液中胰岛素浓度为300mU/L，摇匀备用；其中，DMSO冷冻液由无血清培养基和DMSO制成，无血清培养基和DMSO的体积比为9:1；
(3)取步骤(2)中剩余的脂肪颗粒，在3000rpm/min的离心力下离心20min，弃去上层油脂，得脂肪细胞，将脂肪细胞按照3mL/瓶的比例接种于T-175培养瓶中，并在37℃，5％二氧化碳浓度以及饱和湿度条件下培养，每3天进行换液处理，长至70％融合度时用0.25wt％胰蛋白酶进行消化得原代脂肪细胞，将原代脂肪细胞按照6500个/cm2的比例接种到新的T-175培养瓶中进行传代培养，重复上述操作，传代至P4时停止，将P4代脂肪细胞用0.25wt％胰蛋白酶消化清洗后，向其中加入生理盐水，得浓度为1×108个/mL的脂肪干细胞重悬液，备用；
(4)取步骤(1)中的富血小板因子血浆、步骤(2)中的脂肪颗粒混悬液和步骤(3)中的脂肪干细胞重悬液按体积比为1:5:5混匀，制得。
对比例3
一种填充制剂，其制备方法包括以下步骤：
(1)采取外周血，用1500g/min的离心力离心10min，弃去上段贫血小板血浆和下段红细胞，将中段的富血小板血浆置于-80℃条件下冻存6h取出冻融，然后将富血小板血浆于3000rpm/min的离心力下离心8min，去除底部的膜碎片，得富血小板因子血浆，备用；
(2)吸取自体皮下脂肪，静置，弃去上层油脂后用无菌生理盐水洗涤3次，得脂肪颗粒，取一半脂肪颗粒，向其中加入1倍脂肪颗粒体积的DMSO冷冻液，将脂肪颗粒进行梯度降温冻存，然后复苏脂肪颗粒并洗去脂肪颗粒内的DMSO冷冻液，再向其中加入无菌生理盐水，摇匀得浓度为1×107个/mL脂肪颗粒混悬液，最后向脂肪颗粒混悬液中加入胰岛素，控制脂肪颗粒混悬液中胰岛素浓度为300mU/L，摇匀备用；其中，DMSO冷冻液由无血清培养基和DMSO制成，无血清培养基和DMSO的体积比为9:1；梯度降温冻存的过程如下：先将脂肪颗粒置于4℃条件下冻存4h，然后置于-20℃条件下冻存10h，最后置于-80℃条件下冻存36h；
(3)取步骤(2)中剩余的脂肪颗粒，在3000rpm/min的离心力下离心20min，弃去上层油脂，得脂肪细胞，将脂肪细胞按照3mL/瓶的比例接种于T-175培养瓶中，并在37℃，5％二氧化碳浓度以及饱和湿度条件下培养，每3天进行换液处理，长至70％融合度时用0.25wt％胰蛋白酶进行消化得原代脂肪细胞，将原代脂肪细胞按照6500个/cm2比例接种到新的T-175培养瓶中进行传代培养，重复上述操作，传代至P4时停止，将P4代脂肪细胞用0.25wt％胰蛋白酶消化清洗后，向其中加入生理盐水，得浓度为1×108个/mL的脂肪干细胞重悬液，备用；
(4)取步骤(1)中的富血小板因子血浆、步骤(2)中的脂肪颗粒混悬液和步骤(3)中的脂肪干细胞重悬液按体积比为1:1:1混匀，制得。
试验例
随机选取48名受试者，男女各24名，年龄均在30-60岁之间，平均年龄为45岁，将受试者随机分成8组，每组个2名女性，2名男性，分别按照实施例1-5和对比例1-3中的制备方法制备填充制剂并注射在受试者面部，注入方式为点注式，每个部位的最大注入量为2mL，注入1天、30天、12个月、18个月和24个月后，观察并记录患者的面部变化，具体结果见表1。
通过上表得知，按照本发明实施例1-5的制备方法制得的填充制剂，填充后面部的皮肤饱满、光滑、弹润、自然，手触无硬结，对于眼角的干纹、细纹等均有显著改善，填充18个月以后皮肤的饱满度开始下降，但依然比注射之前好，尤其是实施例5中制得的填充制剂，填充后维持的时间最长，效果最好；按照对比例1-3的方法制备得到的填充制剂填充，填充后短时间内面部的皮肤状态较好，但是填充12个月以后就出现饱满度下降的问题，其填充效果差于实施例1-5中的填充制剂。

Claims (10)

1.一种填充制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采取外周血，用800～2000g/min的离心力离心6～12min，吸取中间部分，得富血小板血浆，将富血小板血浆置于-40～-80℃条件下冻存3～8h后取出冻融，然后将富血小板血浆于2000～4000rpm/min的离心力下离心6～10min，去除底部固体碎片，得富血小板因子血浆，备用；
(2)吸取自体皮下脂肪，静置，弃去上层油脂后用无菌生理盐水洗涤2～3次，得脂肪颗粒，取一半脂肪颗粒，向其中加入1-4倍脂肪颗粒体积的DMSO冷冻液，将脂肪颗粒进行梯度降温冻存，然后复苏脂肪颗粒并洗去脂肪颗粒内的DMSO冷冻液，再向其中加入无菌生理盐水，摇匀得脂肪颗粒混悬液，最后向脂肪颗粒混悬液中加入胰岛素，控制脂肪颗粒混悬液中胰岛素浓度为100～400mU/L，摇匀备用；
(3)取步骤(2)中剩余的脂肪颗粒，在2000～4000rpm/min的离心力下离心10-20min，弃去上层油脂，得脂肪细胞，然后按照2～3mL/瓶的比例将脂肪细胞接种到培养瓶中培养，每3～5天进行换液处理，长至50～70％融合度时用胰蛋白酶进行消化得原代脂肪细胞，将原代脂肪细胞按照5000-8000个/cm2的比例接种到新的培养瓶中进行传代培养，对传代所得细胞进行消化和重悬，得脂肪干细胞重悬液；
(4)取步骤(1)中的富血小板因子血浆、步骤(2)中的脂肪颗粒混悬液和步骤(3)中的脂肪干细胞重悬液按体积比为1～2:3～7:3～7混匀，制得。
2.如权利要求1所述的填充制剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中将采取的外周血用1500g/min的离心力离心10min，弃去上段贫血小板血浆和下段红细胞，得富血小板血浆，将富血小板血浆置于-80℃条件下冻存6h后取出冻融，然后将富血小板血浆于3000rpm/min的离心力下离心8min，去除底部的膜碎片，得富血小板因子血浆，备用。
3.如权利要求1所述的填充制剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中DMSO冷冻液由无血清培养基和DMSO混合制成，其中无血清培养基和DMSO的体积比为9:1。
4.如权利要求1或3所述的填充制剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中梯度降温冻存的过程如下：先将脂肪颗粒置于4℃条件下冻存2-8h，然后置于-20℃条件下冻存8～20h，最后置于-80℃条件下冻存20～48h。
5.如权利要求4所述的填充制剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，脂肪颗粒中的胰岛素浓度为300mU/L。
6.如权利要求5所述的填充制剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中脂肪颗粒悬液中脂肪颗粒的浓度为1×106～1×108个/mL。
7.如权利要求1所述的填充制剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中将脂肪细胞扩增至P4代，将P4代脂肪细胞用0.25wt％胰蛋白酶消化清洗后，向其中加入生理盐水，得脂肪干细胞重悬液，备用。
8.如权利要求7所述的填充制剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中制得的脂肪干细胞密度为1×106～1×108个/mL。
9.如权利要求1所述的填充制剂的制备方法，其特征在于，步骤(4)中富血小板因子血浆、脂肪颗粒混悬液和脂肪干细胞重悬液的体积比为1:5:5。
10.采用利要求1-9任一项所述的填充制剂的制备方法制得填充制剂。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102058905A (zh) * 2009-11-18 2011-05-18 四川大学 一种复合脂肪颗粒及其制备方法
CN103071191A (zh) * 2013-02-04 2013-05-01 成都清科生物科技有限公司 一种自体富血小板因子血浆pfrp制剂的制备方法
CN104548204A (zh) * 2013-10-25 2015-04-29 西安莲湖美立方医院有限公司 脂肪颗粒填充物的制备方法
US20160287855A1 (en) * 2015-04-06 2016-10-06 Alvaro Pacifici Surgical methods/devices for tissue injury removal by tattooing of autologous stem cells
CN108704164A (zh) * 2018-05-17 2018-10-26 广东芙金干细胞再生医学有限公司 一种注射用细胞辅助自体脂肪移植物及其制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102058905A (zh) * 2009-11-18 2011-05-18 四川大学 一种复合脂肪颗粒及其制备方法
CN103071191A (zh) * 2013-02-04 2013-05-01 成都清科生物科技有限公司 一种自体富血小板因子血浆pfrp制剂的制备方法
CN104548204A (zh) * 2013-10-25 2015-04-29 西安莲湖美立方医院有限公司 脂肪颗粒填充物的制备方法
US20160287855A1 (en) * 2015-04-06 2016-10-06 Alvaro Pacifici Surgical methods/devices for tissue injury removal by tattooing of autologous stem cells
CN108704164A (zh) * 2018-05-17 2018-10-26 广东芙金干细胞再生医学有限公司 一种注射用细胞辅助自体脂肪移植物及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
艾玉峰: "《面部轮廓整形美容外科学》", 30 April 2015 *

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