CN110075126A - 一种牙龈细胞水凝胶填充剂及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种牙龈细胞水凝胶填充剂及其制备方法、应用，所述牙龈细胞水凝胶填充剂以水溶性壳聚糖材料作为支架，所述支架上附着有自体牙龈成纤维细胞和/或牙龈间充质细胞。本发明的注射用的牙龈细胞水凝胶填充剂，由附着于壳聚糖水凝胶支架上的自体真皮细胞构成，所述的自体成纤维样细胞是来源于患者自体牙龈的成纤维样细胞经体外扩增、培养得到的，治疗效果好，稳定性得到了提升，该支架本身的优点在于：第一、能支持成纤维样细胞的贴附生长；第二，该支架能被吸收；第三，其支架柔软，可注射。第四，有一定的温敏特性，在37℃体温下自动形成水凝胶，因此值得广泛推广应用。

Description

一种牙龈细胞水凝胶填充剂及其制备方法、应用

技术领域

本发明涉及细胞应用领域，具体而言，涉及一种牙龈细胞水凝胶填充剂及其制备方法、应用。

背景技术

随着社会的进步，科技的蓬勃发展，人类对生命质量和预期寿命也有了更高的期望。拥有一个健康、幸福、快乐的生命周期是每一个人的梦想。但如同肿瘤等顽疾，传统的治疗手段已经进入了平台期，所带来的副作用也让很多的患者痛苦不堪。

细胞治疗是近几年兴起的疾病治疗新技术，是指利用某些具有特定功能的细胞的特性，采用生物工程方法获取和/或通过体外扩增、特殊培养等处理后，使这些细胞具有增强免疫、杀死病原体和肿瘤细胞、促进组织器官再生和机体康复等治疗功效，从而达到治疗疾病的目的。

但是细胞治疗应用在牙龈方面发现其细胞的存活率不高，稳定性不好，治疗效果不显著。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种注射用的牙龈细胞水凝胶填充剂，由附着于壳聚糖水凝胶支架上的自体真皮细胞构成，所述的自体成纤维样细胞是来源于患者自体牙龈的成纤维样细胞经体外扩增、培养得到的，治疗效果好，稳定性得到了提升，该支架本身的优点在于：第一、能支持成纤维样细胞的贴附生长；第二，该支架能被吸收；第三，其支架柔软，可注射。第四，有一定的温敏特性，在37℃体温下自动形成水凝胶，因此值得广泛推广应用。

本发明的第二目的在于提供上述牙龈细胞水凝胶填充剂的制备方法，该制备方法操作步骤简单、操作条件温和，前后步骤衔接紧密，绿色环保，制备得到的填充剂应用广泛。

本发明的第三目的在于提供上述牙龈细胞水凝胶填充剂的进一步应用，可以很好地应用在自体复合牙龈，修复牙龈萎缩方面，直接进行注射即可，应用非常方便，创造了良好的经济效益。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明提供了一种牙龈细胞水凝胶填充剂，以水溶性壳聚糖材料作为支架，所述支架上附着有自体牙龈成纤维细胞和/或牙龈间充质细胞。

本发明的牙龈细胞水凝胶填充剂是由附着于壳聚糖水凝胶支架上的自体真皮细胞构成。所述的自体成纤维样细胞是将来源于患者自体牙龈的成纤维样细胞经体外扩增、培养得到的。通过将两者进行结合后，可以增加细胞本身的稳定性，更好的支撑了成纤维细胞的贴附生长，而且使用也非常方便，直接注射到牙龈内构建自体牙龈组织。

本发明所指的水溶性壳聚糖泛指能溶于水的所有壳聚糖物质，比如能溶于水的壳聚糖盐酸盐、能溶于水的羧甲基壳聚糖、能溶于水的低分子甲壳素、能溶于水的低分子壳聚糖等。

优选地，所述自体牙龈成纤维细胞和/或牙龈间充质细胞的密度为(4-6)*10³cell/ml，优选地为5*10³cell/ml。

优选地，所述水溶性壳聚糖材料与细胞培养基混合配制成浓度为1-10wt％的壳聚糖混合溶液。

上述细胞培养基优选地为DMEM培养基。

本发明提供了一种上述牙龈细胞水凝胶填充剂本身的制备方法，具体包括如下步骤：

(A)将自体牙龈成纤维细胞和/或牙龈间充质细胞体外扩增、培养后，添加水溶性壳聚糖材料混合均匀；

(B)反复推匀。

上述制备方法制备过程简单，操作条件可控，具体地构建方法为：采用药用水溶性壳聚糖为材料，加入预冷的细胞培养基配成浓度为1-10wt％，同时加入牙龈成纤维样细胞，室温下混合，立刻置于细胞冻存管内，4-8℃保存备用。

优选地，所述步骤(A)中，壳聚糖材料先与细胞培养基混合，在4-8℃预冷后备用。

优选地，所述步骤(A)中，细胞浓度控制在2-7mg/ml之间。

优选地，所述步骤(A)中，自体牙龈成纤维细胞和/或牙龈间充质细胞与水溶性壳聚糖材料混合的温度控制在20-30℃之间；

优选地，自体牙龈成纤维细胞和/或牙龈间充质细胞与壳聚糖材料混合的时间控制在20-30min。

优选地，所述步骤(B)中，反复推匀后4-8℃保存备用。

通过预冷以及后续低温保存的操作可以保证细胞活力高，后续治疗效果好。

上述制备得到的牙龈细胞水凝胶填充剂在自体复合牙龈，修复牙龈萎缩方面具有很好的应用，这种细胞治疗方法，是采用牙龈填充剂采用真皮细胞在体外扩增后，接种到可降解的壳聚糖水凝胶支架上，在体外构建细胞治疗用牙龈水凝胶填充剂，然后再注射到病人自体萎缩促进缺损的牙龈组织内，牙龈萎缩患者的修复。形成的凝胶填充剂采用患者牙龈自体细胞，不存在免疫排斥反应和传染性疾病的交叉传染问题，是潜在的治疗牙龈萎缩有效的方法。

此外，本发明能在短时间内为患者提供大量牙龈真皮细胞，供移植使用，其优点在于：

1、为自体牙龈细胞构建，因而无排异反应，细胞再形成的组织成活时间长。

2、采用的生物支架粘附性好，移植后成活率高，改善修复快。

3、该细胞治疗用牙龈填充剂既有牙龈间充质细胞，又有构成其牙龈组织的成纤维样细胞，因而其牙龈外观改善效果持久外观正常。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明的牙龈细胞水凝胶填充剂，由附着于壳聚糖水凝胶支架上的自体真皮细胞构成，所述的自体成纤维样细胞是来源于患者自体牙龈的成纤维样细胞经体外扩增、培养得到的，治疗效果好，稳定性得到了提升，该支架本身的优点在于：第一、能支持成纤维样细胞的贴附生长；第二，该支架能被吸收；第三，其支架柔软，可注射。第四，有一定的温敏特性，在37℃体温下自动形成水凝胶，因此值得广泛推广应用；

(2)本发明的牙龈细胞水凝胶填充剂的制备方法，操作步骤简单、操作条件温和，前后步骤衔接紧密，绿色环保，制备得到的填充剂应用广泛；

(3)本发明的牙龈细胞水凝胶填充剂可以很好地应用在自体复合牙龈，修复牙龈萎缩方面，直接进行注射即可，应用非常方便，创造了良好的经济效益。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

一、患者自体牙龈细胞的提取和细胞培养传代：

(一)患者自体牙龈细胞的提取

手术室取材的注意事项：在确定取牙龈组织之前，由具有执业医师资格的医务人员向患者或患者家属解释原因，征得患者或家属同意，牙龈的取材部位由具有执业医师资格的医务人员确定，并按照医院规定的手术原则取材。患者进行体检和化验，包括常规检验、传染病病原(如HIV、肝炎病毒等)的检查。所取的牙龈立即由专业人员放入无菌容器内，并立即冷藏(10℃以下)，然后按规定的标准操作程序处理。

牙龈成纤维样细胞的分离与培养，包括以下步骤：

1.开口器开口，采用碘伏或碘甘油消毒术区。无菌从后牙龈处取一块约0.5cm宽，0.5cm长的牙龈，放入特制的保存液(100u/ml青、链霉素的M199培养液)中，放入预冻有冰的冰壶内，迅速(要求24小时内)送交专业实验室分离。

2.将牙龈取出，放入50mm无菌塑料平皿内，然后用含青、链霉素(100u/ml)的磷酸盐缓冲液洗液(pH7.4 0.01M PBS)漂洗数次，洗去牙龈表面的血污。用无菌眼科剪碎；

3.用2ml预冷的pH7-9Hanks液配制的0.1-1％的蛋白酶4-16℃消化6-24小时。加入预冷的2ml含10％胎牛血清的M199培养液，终止消化反应。

4.消化后的细胞收集至离心管中，离心，25℃，1000转/min，离心5分钟，弃去上清液。

加入1-10％牛血清DMEM液，于细胞培养板中，37C，5％CO₂，(SANYO公司)静置培养。

培养3-7天，待成纤维样细胞生长铺满50-70％孔时，吸弃生长液，磷酸盐缓冲液(pH7.4 0.01M PBS)漂洗一次；加入2ml新的消化液，37℃，消化5-10分钟。吸弃消化液，换7ml新生长液重新悬浮细胞并传入T25cm²细胞培养瓶(Nunc公司)，37℃，5％CO₂，继续静置培养。

视情况3-4天换液一次，一周传代，每次传2-3瓶。

待细胞总数扩至10^5-8，0.85％的生理盐水漂洗1次后，加入2～5ml消化液，37℃，消化10分钟，吸弃消化液，0.85％的生理盐水吹打重悬并离心漂洗4次，最终重悬于2-4ml生理盐水中备用。

5.细胞鉴定：

1)形态学：采用倒置光学显微镜观察，成纤维样细胞质向外伸出2-3个长短不同的突起，呈多角形或长棱形。

2)细胞表型：采用抗人胶原蛋白抗体进行免疫抗体鉴定，结果显示分离得到的细胞可产生分泌人I型胶原蛋白。

3)致癌性：采用裸鼠试验，见《美国FDA关于生物制品生产用细胞株鉴定和指控的考虑要点》，结果显示无致癌性。

4)无菌检测：按《中国生物制品规程》(2000版)通则《生物制品无菌试验规程》A/B项进行，结果符合无菌要求。

5)细胞存活率：采用台盼蓝(Trypan blue)染色法检查，核染色的细胞为死亡细胞，不着色的细胞为活细胞，计数总细胞数和死细胞数，计算细胞存活率。

细胞存活率＝[(总细胞数-死细胞数)/总细胞数]×100％

经测定，存活率超过95％。

(二)牙龈细胞的原代培养与传代

1.原代细胞培养：在离心管中加入加10ml细胞培养液(Sigma公司，美国)吹悬，接种入4×60mm培养皿；Sanyo CO₂培养箱，37℃，5％CO₂，进行培养。

2.传代细胞培养：每隔2～3天换液1次，细胞达到50-70％汇集细胞后传代。

二、构建复合牙龈填充剂：

(一)生物支架的配制：

1.构建附着有自体牙龈成纤维样细胞的生物支架

采用可溶性药用壳聚糖为材料，与DMEM培养基混合配制成浓度为1wt％的壳聚糖混合溶液，按照浓度为1mg/ml，同时加入5*10³cell/ml的成纤维样细胞，室内温下混合，反复推匀，形成附着有自体牙龈成纤维样细胞的生物支架。

(二)生物支架和成品检测：

1.生物支架的检测：

1)pH值测定：取材料支架5g，加入pH7.0的蒸馏水15ml，于37℃下浸泡24小时，测pH，pH值在7.0-7.5之间。

2)牙龈刺激和致敏试验：按GB/T16886.10-2000医疗器械生物评价第10部分：刺激与致敏试验规定进行试验，结果无致敏性。

3)细胞毒性按照GB/T16886.5-1997医疗器械生物评价第5部分：细胞毒性试验的规定进行试验，结果无细胞毒性。

4)遗传毒性试验按照GB/T16886.3-1997医疗器械生物评价第3部分中规定的方法进行试验，结果无毒性。

2.成品检测

1)外观：呈透明水凝胶样胶体。

2)组织学观察：将牙龈注射物进行常规组织学包埋处理，10wt％福尔马林固定、组织处理、石蜡包埋，切片后进行H-E染色，封片后光学显微镜观察。结果：光镜下，未见明显的细菌生长，无明显的成纤维样细胞退变或坏死，无局域性细胞无规则生长；可见体外培养的牙龈细胞注射物中具有大量的真皮细胞。

3)无菌试验：按《中国生物制品规程》(2000版)通则《生物制品无菌试验规程》A/B项进行，结果符合无菌要求。

产品的使用方法：使用前，口腔牙龈粘膜消毒，1ml注射器抽吸水凝胶直接注射。产品的储存和运输应在2℃～10℃、阴凉、干燥、清洁、避免阳光直射、密封，其治疗效果上，可以看出在手术移植本发明的细胞治疗用自体牙龈的部位，新生牙龈生长良好，外观正常，患者的症状得到了改善。

实施例2

其他操作步骤与实施例1一致，只是构建附着有自体牙龈成纤维样细胞的生物支架的方法具体包括如下步骤：

采用可溶性药用壳聚糖为材料，与DMEM培养基混合配制成浓度为10wt％的壳聚糖混合溶液，在4℃预冷后备用，按照浓度为8mg/ml，同时加入4*10³cell/ml的成纤维样细胞，30℃混合30min，反复推匀，形成附着有自体牙龈成纤维样细胞的生物支架，4℃保存备用。

实施例3

其他操作步骤与实施例1一致，只是构建附着有自体牙龈成纤维样细胞的生物支架的方法具体包括如下步骤：

采用可溶性药用壳聚糖为材料，与DMEM培养基混合配制成浓度为7wt％的壳聚糖混合溶液，在8℃预冷后备用，按照浓度为6mg/ml，同时加入6*10³cell/ml的成纤维样细胞，20℃混合20min，反复推匀，形成附着有自体牙龈成纤维样细胞的生物支架，8℃保存备用。

实施例4

其他操作步骤与实施例1一致，只是构建附着有自体牙龈成纤维样细胞的生物支架的方法具体包括如下步骤：

采用可溶性药用壳聚糖为材料，与DMEM培养基混合配制成浓度为6wt％的壳聚糖混合溶液，在6℃预冷后备用，按照浓度为5mg/ml，同时加入5.5*10³cell/ml的成纤维样细胞，25℃混合25min，反复推匀，形成附着有自体牙龈成纤维样细胞的生物支架，6℃保存备用。

实验例1

将上述实施例4的牙龈细胞水凝胶填充剂进行临床试验，具体试验过程按照如下步骤进行：

一.纳入病例标准

1.牙龈萎缩者。

2.牙齿正畸导致的牙龈萎缩者。

属于上述情况患者，且年龄不超过60岁为纳入对象。

二.排除病例标准

1.合并心血管、脑血管、肝、肾、造血系统等严重原发疾病。

2.过敏体质者或自身免疫疾病者。

三.取材

1.术前检查血、尿常规，出凝血时间，传染病五项，肝、肾功能。

2.取材术：视创面大小，在局麻下取正常牙龈1.0cm×0.5cm大小的全层牙龈，必要时供区用5-0丝线直接缝合。牙龈组织置于保存液中。

四.实验室体外培养

牙龈组织取材后立即置于保存液中，放在2℃-10℃的保温箱中运输及保存，于24小时内送达实验室进行培养。

五.剔除病例标准

牙龈干细胞培养失败，培养所得的细胞治疗用牙龈填充剂不符合产品标准者。

六.移植手术

细胞治疗用牙龈细胞移植术：4～8周后，将培养好的自体牙龈干细胞、壳聚糖支架的复合牙龈注射移植到缺损的牙龈或牙龈组织创面。每点注射0.1-0.2ml。

1.萎缩或缺损的牙龈应新鲜，有血运，无坏死，无感染，。

2.将复合牙龈注射移植于受区，必要时用5-0丝线缝合牙龈创面。

七.术后处理

术后保持口腔清洁。无需特殊处理。

八.疗效评定标准

显效：移植复合牙龈细胞三个月牙龈乳头基线生长明显，增长1mm以上。

有效：移植复合牙龈细胞三个月牙龈乳头基线生长2mm以上。

无效：移植复合牙龈细胞三个月牙龈乳头基线生长不明显未及1mm。

结论：经术后三个月观察，显效率100％。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (9)

1.一种牙龈细胞水凝胶填充剂，其特征在于，以水溶性壳聚糖材料作为支架，所述支架上附着有自体牙龈成纤维细胞和/或牙龈间充质细胞。

2.根据权利要求1所述的牙龈细胞水凝胶填充剂，其特征在于，所述自体牙龈成纤维细胞和/或牙龈间充质细胞的密度为(4-6)*10³cell/ml，优选地为5*10³cell/ml。

3.根据权利要求1所述的牙龈细胞水凝胶填充剂，其特征在于，所述水溶性壳聚糖材料与细胞培养基混合配制成浓度为1-10wt％的壳聚糖混合溶液。

4.权利要求1-3任一项所述的牙龈细胞水凝胶填充剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(A)将自体牙龈成纤维细胞和/或牙龈间充质细胞体外扩增、培养后，添加水溶性壳聚糖材料混合均匀；

(B)反复推匀。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(A)中，壳聚糖材料先与细胞培养基混合，在4-8℃预冷后备用。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(A)中，自体牙龈成纤维细胞和/或牙龈间充质细胞与水溶性壳聚糖材料混合的温度控制在20-30℃之间。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(A)中，自体牙龈成纤维细胞和/或牙龈间充质细胞与水溶性壳聚糖材料混合的时间控制在20-30min。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(B)中，反复推匀后4-8℃保存备用。

9.权利要求1-3任一项所述的牙龈细胞水凝胶填充剂在制备自体复合牙龈，自体修复牙龈萎缩方面的药物中的应用。