CN107174590A - 用于小型宠物的含高浓度间人充质干细胞提取物的修复喷雾剂及其制备方法 - Google Patents

用于小型宠物的含高浓度间人充质干细胞提取物的修复喷雾剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于小型宠物的含高浓度人间充质干细胞提取物的修复喷雾剂及其制备方法，其中主要成分为高浓度的间充质干细胞提取物。间充质干细胞在培养过程中会分泌多种细胞因子，这些细胞因子能够深入内膜基底层，促进内膜组织分化、血管新生、肉芽组织生长，促使损伤皮肤组织结构再生修复，减少疤痕结缔组织的产生，调节皮肤免疫微环境，减少创面组织的细菌感染及炎症反应。本发明采用连续饥饿间充质干细胞的方法,在较短时间内就能得到高浓度的人脐带间充质提取物。本发明含高浓度间充质干细胞提取物的修复喷雾剂适用于湿疹、体表慢性溃疡和各种皮肤损伤的修复。

Description

用于小型宠物的含高浓度间人充质干细胞提取物的修复喷雾 剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及干细胞提取物，尤其是一种用于小型宠物的含高浓度人间充质干细胞提取物的修复喷雾剂及其制备方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是一组源于基质的异质细胞群，可以从人体大多数组织获取。它们具有自我更新能力、组织修复、免疫调节能力，可以向中胚层谱系分化，例如：脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等，此外还能够向及其它胚层谱系细胞分化，例如向表皮细胞、血管内皮细胞分化。
间充质干细胞培养体系中含有多种大量的活性成分，如：干细胞生长因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、内皮细胞生长因子(VEGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、细胞集落刺激因子、白细胞介素(IL)、胶原蛋白、透明质酸等80余种活性物质。目前，已经有将间充质干细胞应用于损伤修复的报道,但是由于活性细胞的存活条件比较苛刻，很容易死亡，因此由活细胞所起的作用也会大打折扣。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种用于小型宠物的含高浓度人间充质干细胞提取物的修复喷雾剂及其制备方法，利用高浓度的间充质干细胞分泌的多种细胞因子，为治疗湿疹、体表慢性溃疡和各种皮肤损伤的修复提供了安全、有效、使用方便的治疗药物。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于小型宠物的含高浓度人间充质干细胞提取物的修复喷雾剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)人间充质干细胞培养：从细胞库中选取P2-P6的人间充质干细胞复苏，接种批次记为第一批次、第二批次、第三批次，接种密度分别为最大融合度的50％-60％、35％-45％、20％-30％；培养细胞所用完全培养基为无酚红DMEM/DF12和体积比浓度为10％胎牛血清；细胞接种完成，放于二氧化碳培养箱培养，温度37℃，二氧化碳体积比浓度5％；
(2)第一批次细胞融合度达到70％-80％时，以生理盐水清洗细胞2次，用复方电解质注射液进行饥饿培养；
(3)饥饿培养12-24小时后，第一批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；
(4)取培养的第二批次细胞，当细胞融合度达到70％-80％，以生理盐水清洗第二批次细胞2次，用步骤(3)中细胞培养上清进行饥饿培养；
(5)饥饿培养12-24小时后，第二批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；
(6)取培养的第三批次细胞，当细胞融合度达到70％-80％，以生理盐水清洗第三批次细胞2次，用步骤(5)中细胞培养上清进行饥饿培养；
(7)饥饿培养12-24小时后，第三批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；
(8)连续饥饿三次后将收集的步骤(7)上清以0.22um滤膜过滤，并向过滤的上清液中加入水溶性壳聚糖，配置壳聚糖质量浓度为0.05％-0.1％的干细胞提取物溶液，混合均匀后分装到无菌的喷雾瓶中，放于4℃冰箱中保存待用。
所述人间充质干细胞为人脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或牙髓间充质干细胞。
上述制备方法制得的用于小型宠物的含高浓度人间充质干细胞提取物的修复喷雾剂。
本发明有益效果：将细胞进行饥饿培养，使得细胞分泌的各种活性成分的浓度都得到了提高，并且在短时间内使用饥饿上清重复饥饿间充质干细胞，使细胞提取物浓度进一步增加。而高浓度的间充质干细胞提取物可促进内膜组织分化、血管新生、肉芽组织生长，促使损伤皮肤组织结构再生修复，减少疤痕结缔组织的产生，调节皮肤免疫微环境，减少创面组织的细菌感染及炎症反应。
附图说明
图1为本发明的方法培养的间充质干细胞图；
图2为不同饥饿次数人脐带间充质干细胞提取物中有效因子分泌量比较图；
图3为不同饥饿次数人脐带间充质干细胞喷雾效果对比图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
本发明的用于小型宠物的含高浓度人间充质干细胞提取物的修复喷雾剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)人间充质干细胞培养：从细胞库中选取P2-P6的人间充质干细胞复苏，接种批次记为第一批次、第二批次、第三批次，接种密度分别为最大融合度的50％-60％、35％-45％、20％-30％；培养细胞所用完全培养基为无酚红DMEM/DF12和体积比浓度为10％胎牛血清；细胞接种完成，放于二氧化碳培养箱培养，温度37℃，二氧化碳体积比浓度5％；
(2)第一批次细胞融合度达到70％-80％时，以生理盐水清洗细胞2次，用复方电解质注射液进行饥饿培养；
(3)饥饿培养12-24小时后，第一批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；
(4)取培养的第二批次细胞，当细胞融合度达到70％-80％，以生理盐水清洗第二批次细胞2次，用步骤(3)中细胞培养上清进行饥饿培养；
(5)饥饿培养12-24小时后，第二批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；
(6)取培养的第三批次细胞，当细胞融合度达到70％-80％，以生理盐水清洗第三批次细胞2次，用步骤(5)中细胞培养上清进行饥饿培养；
(7)饥饿培养12-24小时后，第三批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；
(8)连续饥饿三次后将收集的步骤(7)上清以0.22um滤膜过滤，并向过滤的上清液中加入水溶性壳聚糖，配置壳聚糖质量浓度为0.05％-0.1％的干细胞提取物溶液，混合均匀后分装到无菌的喷雾瓶中，放于4℃冰箱中保存待用。
所述人间充质干细胞为人脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或牙髓间充质干细胞。
上述制备方法制得的用于小型宠物的含高浓度人间充质干细胞提取物的修复喷雾剂。
本发明的培养间充质干细胞，在间充质干细胞生长融合度达到70％-80％时进行及饥饿处理，使细胞分泌大量的因子，并使用饥饿上清多次饥饿细胞，短时间大幅度的增加了细胞因子浓度。加入水溶性壳聚糖，质量浓度为0.05％-0.1％，能有效的抑制微生物对创面的感染,缓释有效成分,促进吸收。
制备的修复喷雾剂用于家庭小型宠物(犬、猫)的湿疹、体表慢性溃疡和各种皮肤损伤的修复。
实施例1
(1)人脐带间充质干细胞培养：从细胞库中选取P4的人脐带间充质干细胞复苏，细胞总数8.4*107。接种批次记为第一批次、第二批次、第三批次，接种密度分别为最大融合度的60％(每瓶接种细胞数：9*106,接种细胞六瓶)、40％(每瓶接种细胞数：6*106，接种细胞四瓶)、20％(接种细胞数：3*106，接种细胞两瓶),培养体系均为40ml。培养细胞所用完全培养基为无酚红DMEM/DF12和体积比浓度为10％胎牛血清，接种细胞瓶为T-175培养瓶。细胞接种完成，放于二氧化碳培养箱培养，温度37℃，二氧化碳体积比浓度5％；
(2)培养30小时,此时第一批次细胞融合度达到75％时，见(图1)，以生理盐水清洗细胞2次，每瓶用40ml复方电解质注射液(中国大冢制药有限公司生产的复方电解质葡萄糖MG3注射液)进行饥饿培养；
(3)饥饿培养18小时后，第一批次细胞融合度达95％，收取细胞培养上清，4000g条件下离心8min除去沉淀，取离心后上清放于4℃备用；
(4)取培养的第二批次细胞，此时细胞融合度达到70％，以生理盐水清洗第二批次细胞2次，每瓶用步骤(3)中细胞培养上清40ml进行饥饿培养；
(5)饥饿培养18小时后，第二批次细胞融合度达95％，收取细胞培养上清，4000g条件下离心8min除去沉淀，取离心后上清放于4℃备用；
(6)取培养的第三批次细胞，此时细胞融合度达到70％，以生理盐水清洗第三批次细胞2次，每瓶用步骤(5)中细胞培养上清40ml进行饥饿培养；
(7)饥饿培养24小时后，第三批次细胞融合度达90％，收取细胞培养上清，4000g条件下离心8min除去沉淀，取离心后上清放于4℃备用。
(8)检测步骤(3)、步骤(5)和步骤(7)中的备用上清细胞因子含量，见(图2)。
(9)将步骤(3)、步骤(5)和步骤(7)中的备用上清分别以0.22um滤膜过滤，并取过滤的上清70g,分别加入水溶性壳聚糖0.052g，配制成质量浓度为0.075％的壳聚糖饥饿上清喷雾原液，混合均匀后将饥饿上清原液分别分装到无菌的喷雾瓶中，放于4℃冰箱中保存待用,即分别得到饥饿一次、饥饿二次和饥饿三次间充质干细胞提取物的修复喷雾剂。
(10)选取小型香猪8只,体重18-22kg，氯胺酮(8mg/kg)和速眠新(1.5ml/支)混合肌肉注射麻醉，背部剃毛，消毒后，在背部中线两侧旁1.5cm处，由前至后制备8个全厚皮肤创面(每侧4个)，大小为2.5cm×2.5cm。创面随机分为①阴性对照组、②饥饿一次喷雾治疗组、③饥饿二次喷雾治疗组和④饥饿三次喷雾治疗组。
(10)喷雾治疗②③④组第0、3、6、9、12天分别给予饥饿一次喷雾制剂、饥饿二次喷雾制剂和饥饿三次喷雾制剂；①阴性对照组不予处理，分别在给药后的第0、3、6、9、12、15天对各组实验动物的各项指标进行检测，并统计。
(11)数据分析喷雾制剂作用。见(表1，P<0.05)为动物实验数据统计表。饥饿三次喷雾治疗组创面逐渐缩小，形成新生表皮明显快于其余各组，见(图3)。
表1动物实验数据统计表(创面面积cm2，n＝16)
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (3)

1.一种用于小型宠物的含高浓度人间充质干细胞提取物的修复喷雾剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)人间充质干细胞培养：从细胞库中选取P2-P6的人间充质干细胞复苏，接种批次记为第一批次、第二批次、第三批次，接种密度分别为最大融合度的50％-60％、35％-45％、20％-30％；培养细胞所用完全培养基为无酚红DMEM/DF12和体积比浓度为10％胎牛血清；细胞接种完成，放于二氧化碳培养箱培养，温度37℃，二氧化碳体积比浓度5％；
(2)第一批次细胞融合度达到70％-80％时，以生理盐水清洗细胞2次，用复方电解质注射液进行饥饿培养；
(3)饥饿培养12-24小时后，第一批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；
(4)取培养的第二批次细胞，当细胞融合度达到70％-80％，以生理盐水清洗第二批次细胞2次，用步骤(3)中细胞培养上清进行饥饿培养；
(5)饥饿培养12-24小时后，第二批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；
(6)取培养的第三批次细胞，当细胞融合度达到70％-80％，以生理盐水清洗第三批次细胞2次，用步骤(5)中细胞培养上清进行饥饿培养；
(7)饥饿培养12-24小时后，第三批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；
(8)连续饥饿三次后将收集的步骤(7)上清以0.22um滤膜过滤，并向过滤的上清液中加入水溶性壳聚糖，配置壳聚糖质量浓度为0.05％-0.1％的干细胞提取物溶液，混合均匀后分装到无菌的喷雾瓶中，放于4℃冰箱中保存待用。
2.根据权利要求1所述用于小型宠物的含高浓度人间充质干细胞提取物的修复喷雾剂的制备方法，其特征在于，所述人间充质干细胞为人脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或牙髓间充质干细胞。
3.如权利要求1或2所述制备方法制得的用于小型宠物的含高浓度人间充质干细胞提取物的修复喷雾剂。
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