JP7205928B2

JP7205928B2 - 神経幹細胞の高効率分離培養方法

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Publication number: JP7205928B2
Application number: JP2020549677A
Authority: JP
Inventors: ミンジュ、ギョン; ナム、ヒョン
Original assignee: Medinno Inc
Current assignee: Medinno Inc
Priority date: 2018-03-16
Filing date: 2019-01-30
Publication date: 2023-01-17
Anticipated expiration: 2039-01-30
Also published as: EP3783099A4; JP2021518118A; EP3783099A1; KR101994640B1; WO2019177270A1; CN112154203A; US20220243175A1

Description

本発明は、神経幹細胞を分離培養する方法を単純化して分離培養時間を短縮し、神経幹細胞の獲得歩留まりを増大させることができる神経幹細胞の高効率分離培養方法に関する。

２１世紀の生命工学は、人間の福祉を最終目標として食糧、環境、健康問題に新たな解決策の可能性を提示しており、近年、幹細胞の利用技術は、難病治療の新たな場として浮上している。以前までは人間の難病治療のために臓器移植や遺伝子治療などが提示されたが、免疫拒否と供給臓器の不足、ベクター開発や疾患遺伝子に対する知識不足により効率的な実用化が遅れていた。

これにより、幹細胞研究に対する関心が高まり、増殖と分化を通じて全ての器官を形成する能力を持つ全能性幹細胞が、殆どの疾病治療はもちろん、臓器の毀損を根本的に解決できるものと認識されてきた。幹細胞（ｓｔｅｍｃｅｌｌ）とは、自己複製能力を持ちながら、２つ以上の細胞に分化する能力を持つ細胞をいい、全能性幹細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ）、全分化能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ）、多分化能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ）に分類できる。多くの科学者が、人体のほぼ全ての臓器の再生はもちろん、難病だったパーキンソン病、各種のがん、糖尿病や脊髄損傷などの治療に至るまで、多様に幹細胞の適用可能性を提示してきた。

神経幹細胞は、神経細胞（ｎｅｕｒｏｎ）、星状膠細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）、希突起膠細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）に分化可能な幹細胞であって、げっ歯類であるマウスで初めて発見された。その後、ヒトの脳にも神経幹細胞が存在し、一生の間、脳細胞の再生に関与すると知られている。したがって、近年、退行性神経系疾患の治療のため、神経幹細胞を活用した治療剤の開発が注目されている。

ヒト由来の神経幹細胞の研究の初期には、胎児の脳から神経幹細胞を分離培養した。このような研究に基づいて、近年、脳卒中や脊髄損傷の治療のための臨床研究が進められてきた。また、胚性幹細胞から神経幹細胞を分離培養する研究が進められてきた。胚性幹細胞は、自然に外胚葉に分化すると知られており、神経幹細胞に分化する方法が明らかになった。近年、逆分化幹細胞から神経幹細胞に分化する方法が研究され、自己移植が可能な神経幹細胞の培養への期待が高まっている。

しかし、胎児や胚性幹細胞から由来した神経幹細胞は、倫理的な問題点と腫瘍原性の安全性に対する懸念があった。また、逆分化幹細胞から由来した神経幹細胞も腫瘍原性の安全性に対する問題点を有しているため、このような幹細胞の臨床適用のためには、生物学的安全性に対する検証と根本的な解決策が必要なのが実情であった。

従来の研究では、神経幹細胞分離培養に対して脳組織から単一細胞に分離培養する方法が一般的に使用されてきた。

しかし、パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）を使用する単一細胞分離段階を経る神経幹細胞分離培養方法は、時間がかかりすぎ、神経幹細胞の獲得歩留まりに問題があった。

本発明は、神経幹細胞を分離培養する方法を単純化して分離培養時間を短縮し、神経幹細胞の獲得歩留まりを増大させることができる神経幹細胞の高効率分離培養方法を提供するものである。

しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていないもう一つの課題は、下記の記載から当該技術分野の通常の知識を有する者に明確に理解されるであろう。

本発明の一側面によると、脳組織を酵素溶液に入れて酵素処理する段階と、酵素処理された脳組織から物理的に細胞クランプ（ｃｌｕｍｐ）を分離する段階と、前記細胞クランプをサイズに応じて分離し、不純物を除去する段階と、前記細胞クランプを培養皿に接種して継代培養する段階と、を含む神経幹細胞の高効率分離培養方法が提供される。

そして、前記酵素溶液は、パパイン（ｐａｐａｉｎ）；ＤＮａｓｅＩ；及びＤ、Ｌ－システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）を含んでもよい。

また、前記細胞クランプは、４０～７０ｕｍサイズ、または７０超過～１００ｕｍ以下のサイズであってもよい。

そして、前記脳組織は、成人の脳組織であってもよく、前記神経幹細胞の分離培養方法は、パーコール（ｐｅｒｃｏｌｌ）を用いた単一細胞分離段階を含んでいなくてもよい。

本発明による神経幹細胞の高効率分離培養方法は、神経幹細胞を分離培養する方法を単純化して分離培養時間を短縮し、神経幹細胞の獲得歩留まりを増大させることができる。また、分離培養時間の短縮により細胞の生存率を高めることができ、短時間に多くの細胞数を獲得して神経幹細胞の培養成功率を高めることができるという長所がある。

図１は、パーコールを使用する神経幹細胞の従来の分離培養方法と、本発明による分離培養方法であるクランプ培養（Ｃｌｕｍｐｃｕｌｔｕｒｅ）に対する模式図である。図２ａは、従来の分離培養方法（Ｐｅｒｃｏｌｌ）と本発明の一側面による分離培養方法（Ｃｌｕｍｐｃｕｌｔｕｒｅ）による脳組織の重量(ｇ)あたり細胞の収得率を比較したグラフである。図２ｂは、従来の分離培養方法（Ｐｅｒｃｏｌｌ）と、本発明の一側面による分離培養方法（Ｃｌｕｍｐ）によって獲得した神経幹細胞の継代培養による細胞の成長を確認した結果を示したグラフである。図３ａは、従来の分離培養方法（Ｐｅｒｃｏｌｌ）と、本発明の一側面による分離培養方法（Ｃｌｕｍｐｃｕｌｔｕｒｅ）によって分離培養された神経幹細胞の形態を示したものである。図３ｂは、従来の分離培養方法（Ｐｅｒｃｏｌｌ）と、本発明の一側面による分離培養方法（Ｃｌｕｍｐ）によって分離培養された神経幹細胞の分化条件における分化様相を示したものである。図４ａは、クランプ培養方法において、クランプの最適なサイズの条件を探すためのクランプの分離方法を簡略に示したものである。図４ｂは、４つのタイプのクランプ（クランプＩ～ＩＶ）の形状を顕微鏡で観察したものである。図５ａ及び５ｂは、２名の患者（ＮＳ１８－００７ＴＬ、ＮＳ１８－００８ＴＬ）から由来したクランプタイプＩ～ＩＶを培養した後、３日及び６日後に培養皿の底で観察されるコロニーの数字を測定した結果である。図５ｃは、クランプタイプＩ～ＩＶを培養後、３日及び６日目に培養皿で観察されるコロニーの形状を確認した結果である。図６ａは、クランプタイプＩＩを使用して培養された細胞の成長曲線を、従来のパーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）を用いた単一細胞培養の成長曲線と比較したグラフである。図６ｂは、クランプタイプＩＩを用いた継代培養で細胞の形態を観察したものである。図６ｃは、クランプタイプＩＩを用いて培養した神経幹細胞が神経分化能力を維持しているかを確認するため、分化後に免疫蛍光染色を行った結果である。図７ａは、クランプタイプＩＩ神経幹細胞の新生血管形成能力について実験した結果である。図７ｂは、移植された神経幹細胞の位置を確認するため、α－ＳＭＡ及びＣＤ３１を免疫蛍光染色によって観察した結果である。

発明を行うための最良の形態

本発明は、神経幹細胞を分離培養する方法を単純化して分離培養時間を短縮し、神経幹細胞の獲得歩留まりを増大させることができる神経幹細胞の高効率分離培養方法を提供することを目的としたものである。

本発明の一実施例では、本発明の方法（Ｃｌｕｍｐｃｕｌｔｕｒｅ）によって神経幹細胞を培養した結果、従来のパーコールを用いた場合よりも同一脳組織重量あたり、より多くの神経幹細胞を獲得することができることを確認した（実施例１参照）。

本発明の他の実施例では、本発明の方法（Ｃｌｕｍｐｃｕｌｔｕｒｅ）によって培養された神経幹細胞の場合も神経分化能力が維持されることを確認した（実施例３参照）。

本発明のさらに他の実施例では、クランプのサイズに応じて分離して培養した結果、クランプタイプＩＩ（７０μｍ～１００μｍ）の場合、最も優れた効率を示すことを確認した（実施例４及び５参照）。

本発明のさらに他の実施例では、本発明の方法（Ｃｌｕｍｐｃｕｌｔｕｒｅ）によってクランプタイプＩＩの培養時、最初の継代培養まで所要する時間が短縮され、細胞の形態も正常的であり、神経分化能もやはり正常的で、幹細胞の特性をよく維持することを確認した（実施例６参照）。

本発明のさらに他の実施例では、クランプタイプＩＩに由来する神経幹細胞が新生血管形成能力があることを確認した（実施例７参照）。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、脳組織を酵素溶液に入れて酵素処理する段階と、酵素処理された脳組織から物理的に細胞クランプ（ｃｌｕｍｐ）を分離する段階と、前記細胞クランプをサイズに応じて分離し、不純物を除去する段階と、前記細胞クランプを培養皿に接種して継代培養する段階と、を含む神経幹細胞の高効率分離培養方法を提供する。

従来のパーコールを使用する単一細胞の分離段階を経る神経幹細胞の分離培養方法は、時間がかかりすぎ、神経幹細胞の獲得歩留まりに問題点があった。そこで、本発明者らは、パーコールを使用して、単一細胞を分離する段階を含めず、クランプに分離する段階を導入する場合、分離培養時間を短縮し、神経幹細胞の獲得歩留まりを増大させることができるという点を実験を通じて確認して発明を完成した。

前記酵素溶液は、特に制限されるものではないが、パパイン（ｐａｐａｉｎ）と、ＤＮａｓｅＩと、Ｄ，Ｌ－システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）と、を含んでもよい。

また、前記細胞クランプは、脳組織から分離された後、メッシュを用いてサイズ別に分離する段階をさらに経ることができる。細胞クランプは、４０～７０ｕｍサイズ、または７０超過～１００ｕｍ以下のサイズであってもよい。

そして、前記脳組織は、好ましくは、成人の脳組織であってもよい。

一方、上述したように、本発明による神経幹細胞の分離培養方法は、パーコール（ｐｅｒｃｏｌｌ）を用いた単一細胞の分離段階を含んでいないことを特徴とする。本発明による神経幹細胞の高効率分離培養方法は、パーコールを用いた単一細胞分離段階を省略して神経幹細胞を分離培養する方法を単純化して分離培養時間を短縮し、神経幹細胞の獲得歩留まりを増大させることができ、分離培養時間の短縮により細胞の生存率を高めることができ、短時間で多くの細胞数を獲得して神経幹細胞の培養の成功率を高めることができるという長所がある。

以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、下記の実施例により、本発明の内容が限定されるものではない。

［実施例］

実施例１．神経幹細胞の一次培養
ヒトの脳組織の重量を測定した後、２～３回ＰＢＳを使用してウォッシングを行った。組織を適切なサイズに切り取った後、エンザイム溶液（１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌｏｆｐａｐａｉｎ、０.１ｍｇ／ｍｌｏｆＤＮａｓｅＩ、４ｍｇ／ｍｌｏｆＤ、Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）に入れた後、ブレードと手術用はさみを使用して、物理的に小片に切り取った。３７℃で３０分間処理後、使い捨てピペット（ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅｐｉｐｅｔｔｅ）を使用して組織を細かく破砕した後、７０ｕＭメッシュを使用してろ過した後、ＰＢＳ（ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ）を使用してウォッシングを行った。

パーコールを使用する場合、１０倍の濃縮ＰＢＳとパーコールを１：９の割合で混合してパーコール溶液を準備し、２０ｍＬの細胞懸濁液と１０ｍＬのパーコールを混合した後、２０,０００ｒｐｍで１８℃で遠心分離し、細胞層から細胞を分離した後、再びＰＢＳを使用して２回ウォッシングを行った後、ｐｏｌｙ－Ｌ－Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ（ＰＬＯ）をコーティングしたディッシュで培養した。

７０～８０％コンフルエンシー（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に達すると、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して細胞を剥がした後、継代培養を行った。トリパンブルー（Ｔｒｙｐｈａn ｂｌｕｅ）溶液を使用して細胞の数と生存率を計算し、Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｄｏｕｂｌｉｎｇｌｅｎｇｔｈ（ＰＤＬ）を測定して細胞成長曲線を描いており、分離培養された神経幹細胞の形態を顕微鏡で観察した。

その結果、図２ａに示すように、本発明による分離培養方法（Ｃｌｕｍｐｃｕｌｔｕｒｅ）の場合、パーコールを用いた方法よりも同一の脳組織重量あたり、より多くの神経幹細胞を獲得できることを確認し、図２ｂに示すように、本発明による分離培養方法（Ｃｌｕｍｐｃｕｌｔｕｒｅ）を用いた場合、パーコールを用いた従来の方法よりも細胞の成長効果が全般的に優れていることを確認した。

また、図３ａに示すように培養された細胞を観察した結果、本発明による分離培養方法（Ｃｌｕｍｐｃｕｌｔｕｒｅ）を使用した場合にも、パーコールを用いた従来の方法を用いた場合と細胞の形態が類似していることを確認した。

実施例２．神経分化条件における分化誘導
神経幹細胞を７０～８０％程度のコンフルエンシーで培養した後、ＰＢＳで２回ウォッシングした。神経分化条件であるＤＭＥＭ／Ｆ１２、０.５％ＦＢＳ、Ｂ２７、０.５ｍＭＩＢＭＸ、Ｐ／Ｓを処理した後、４８時間後に細胞を固定した後、免疫染色を行った。

実施例３．免疫染色
神経幹細胞は、ＰＬＯがコーティングされた８ｗｅｌｌｃｈａｍｂｅｒｓｌｉｄｅ（ｔｈｅｒｍｏ）に培養した後、４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）に５分間固定させた。０.１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００が希釈されているＰＢＳ（０.１％ＰＢＳＴ）で水洗した後、ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）溶液（５％ｎｏｒｍａｌｇｏａｔｓｅｒｕｍ、５％ｎｏｒｍａｌｄｏｎｋｅｙｓｅｒｕｍ）で１時間程度処理した後、１次抗体を処理して一晩の間（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）反応させ、翌日、ＰＢＳで２回ウォッシング後、Ａｌｅｘａ４８８またはＡｌｅｘａ５９４が結合された２次抗体を１時間の間処理した。ＤＡＰＩでカウンターステイニング（ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎｉｎｇ）を行った後、マウンティング後に蛍光顕微鏡で観察した。

その結果、図３ｂに示すように、神経幹細胞の分化後には、Ｎｅｓｔｉｎの発現が減少し、神経細胞（Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２）、星状膠細胞（ＧＦＡＰ）の発現が増加することが確認できた。

実施例４．クランプのサイズ別分離及び形態を観察
クランプ培養方法の最適条件を探すために、ヒトの脳組織にエンザイム溶液を処理し、物理的に細かく分割した後、様々なサイズのメッシュ（ｍｅｓｈ）にかけてサイズ別にクランプを獲得した（図４ａ参照）。クランプをサイズ別に下記のようにタイプＩ～タイプＩＶを決めて、その形態を顕微鏡で観察した。

クランプタイプＩ＞１００μｍ
７０μｍ＜クランプタイプＩＩ＜１００μｍ
４０μｍ＜クランプタイプＩＩＩ＜７０μｍ
クランプタイプＩＶ＜４０μｍ

その結果、図４ｂに示すように、各タイプに合わせて均一なサイズのクランプに分離されたことが確認できた。

実施例５．クランプタイプＩ～ＩＶの分離培養時の効果比較
クランプのサイズ別分離培養効果を比較するため、前記実施例１の方法によって２名の患者から由来したクランプタイプＩ～ＩＶを培養してコロニーの数字を確認し、顕微鏡でコロニーの形状などを観察した。

その結果、図５ａ及び図５ｂに示すように、分離培養３日及び６日目に全てクランプタイプＩＩで最も多くのコロニーを観察し、クランプタイプＩＩが最も培養効率が優れていることを確認した。

実施例６．クランプタイプＩＩの継代培養及び神経分化能力を確認
本発明による方法でクランプタイプＩＩを培養した場合とパーコールを用いた単一細胞培養時の効果を比較するため、前記実施例１の方法によって細胞を培養し、培養成長曲線を作成し、クランプタイプＩＩの継代培養による細胞の形態を顕微鏡で観察した。

また、クランプタイプＩＩの方法で培養された神経幹細胞が神経分化能力を維持しているかを確認するため、神経分化後、前記実施例３の方法によって免疫蛍光染色法を用いた。

その結果、図６ａに示すように、クランプタイプＩＩを培養する場合、初めて継代培養まで所要する時間が短縮され、１０^９個の細胞まで到達する時間もやはり短縮され、図６ｂに示すように、クランプタイプＩＩの継代培養時に細胞の形状がよく維持されることが確認できた。

また、免疫蛍光染色の結果、図６ｃに示すように、神経に分化される前には未分化マーカーであるＮｅｓｔｉｎが強く発現するが、分化後には殆ど観察されず、神経細胞のマーカーであるＴｕｊ１とＭａｐ２の発現も分化前には観察されなかったが、分化後には観察され、星状膠細胞マーカーであるＧＦＡＰも分化前には殆ど観察されなかったが、分化後には観察された。

前記結果は、クランプタイプＩＩで培養された神経幹細胞は、幹細胞の特性をよく維持することを意味する。

実施例７．クランプタイプＩＩに由来する神経幹細胞の新生血管形成能力を確認
臍帯由来の血管内皮細胞は、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌから購入し、供給者の専用培地を使用した。２００μＬのＰｈｅｎｏｌｒｅｄ－ｆｒｅｅＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ）に１ｘ１０^６血管内皮細胞と１ｘ１０^６神経幹細胞を混ぜた後、４－６週齢のＢａｌｂｃ－ｎｕマウスの皮下に移植した。３－４日後にＭａｔｒｉｇｅｌ除去した後、４％ＰＦＡで２４時間の間固定した後、ブロックを製作した。組織学的分析のためにヘマトキシリン＆エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を行い、Ｍａｔｒｉｇｅｌ内に生成された新生血管を染色するため、血管内皮細胞と神経幹細胞を区別するためにＣＤ３１とａｌｐｈａ－ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅａｃｔｉｎ（α－ＳＭＡ）で免疫蛍光染色を行った。

その結果、図７ａに示すように、神経幹細胞単独では血管を殆ど形成できなかったが、血管内皮細胞と神経幹細胞をともに混ぜて移植した場合には、血管形成が確認できた。また、図７ｂに示すように、血管周辺に神経幹細胞が位置して血管形成に寄与したことを確認した。

前述の本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることを理解できるであろう。したがって、以上で記述した実施例は、全ての面で例示的なものであり、限定的ではないと理解しなければならない。

本発明による神経幹細胞の高効率分離培養方法は、神経幹細胞を分離培養する方法を単純化して分離培養時間を短縮し、神経幹細胞の獲得歩留まりを増大させることができる。また、本発明は、分離培養時間の短縮により細胞の生存率を高めることができ、短時間に多くの細胞数を獲得して神経幹細胞の培養の成功率を高めることができるという長所があるため、神経幹細胞を使用して直接、間接的な神経再生効果を得ようとする中枢神経系疾患の治療に寄与できるものと期待される。これに加えて、本発明は、神経幹細胞から分泌されるタンパク質または酵素による直接、間接的な神経再生関連分野（条件培地の精製、エクソソームの開発など）にも使用できるものと期待される。

Claims

脳組織を酵素溶液に入れて酵素処理する段階と、
酵素処理された脳組織から物理的に細胞クランプ（ｃｌｕｍｐ）を分離する段階と、
前記細胞クランプをサイズに応じて分離し、不純物を除去する段階と、
前記細胞クランプを培養皿に接種して継代培養する段階と、
を含み、
前記細胞クランプは、７０～１００μｍのサイズを有するものである、
神経幹細胞の高効率分離培養方法。
前記酵素溶液は、パパイン（ｐａｐａｉｎ）と、ＤＮａｓｅＩと、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）と、を含む、請求項１に記載の神経幹細胞の高効率分離培養方法。
前記脳組織は、成人の脳組織である、請求項１に記載の神経幹細胞の高効率分離培養方法。