CN113842506B - 用于3d生物打印的生物墨水及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于3D生物打印的生物墨水，其包括水凝胶、生物活性细胞和固化剂溶液；所述水凝胶包括以下重量份的组分：海藻酸钠0.2～1份，明胶0.3～1份，纤维素0.15～0.5份，缓冲液120～150份；所述生物活性细胞的数量为1×107～2×107个/mL；所述固化剂溶液包括以下重量份的组分：CaCl2 2～10份，缓冲液90～98份。本发明还公开了该生物墨水的制备方法及其应用，以及基于该生物墨水的打印方法。实施本发明，可得到具有可控制的生物降解能力、机械强度和载药性能的生物墨水。

Description

用于3D生物打印的生物墨水及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物墨水技术领域，尤其涉及一种用于3D生物打印的生物墨水及其制备方法与应用。
背景技术
皮肤作为人体最大的组织起着至关重要的作用，由烧伤或创伤引起的严重皮肤损伤往往无法自行愈合，需要使用皮肤组织替代物。一般临床上使用的是自体分层皮肤移植，但如果伤口广泛，供体部位的数量和大小有限，不能满足临床应用。另一方面，同种异体移植虽然能够避免来源不充足，但往往免疫排斥较大，成功率相对较低。
细胞化移植物样产品是组织工程快速发展的产物，其是以高分子材料聚合物联合人成纤维细胞的形式提供的一种支架贴片。疗效有所提高但价格昂贵，且无法避免上述相同的免疫学缺陷。
生物打印可构建器官或组织，具有可规模化、快速生产的优势，其应用有望降低细胞化移植物样产品的成本。生物打印的原理是使用计算机控制的打印设备将生物墨水(即细胞和生物材料)准确地沉积到精确的三维几何形状中，以创建解剖学上正确的结构，故获得有效的生物墨水是实现生物打印临床疗效的关键。现有的生物墨水，往往需要加入光敏树脂，一者成本较高，二者其安全性相对较差。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种用于3D生物打印的生物墨水，其成本低，安全性高，且具有可控制的生物降解能力、机械强度和载药性能。
本发明还要解决的技术问题在于，提供一种用于3D生物打印的生物墨水的制备方法。
本发明还要解决的技术问题在于，提供一种上述的生物墨水在制备生物活性支架中的应用。
本发明还要解决的技术问题在于，提供一种基于上述生物墨水的打印方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于3D生物打印的生物墨水，其包括水凝胶、生物活性细胞和固化剂溶液；
所述水凝胶包括以下重量份的组分：海藻酸钠0.2～1份，明胶0.3～1份，纤维素0.15～0.5份，缓冲液120～150份；
所述生物活性细胞的数量为1×107～2×107个/mL；
所述固化剂溶液包括以下重量份的组分：CaCl2 2～10份，缓冲液90～98份。
作为上述技术方案的改进，所述生物活性细胞为羊水间充质干细胞和/或人皮肤成纤维细胞。
作为上述技术方案的改进，所述缓冲液为PBS缓冲液，其浓度为 0.005～0.05mol/L，pH为7.2～7.3。
作为上述技术方案的改进，所述羊水间充质干细胞的制备方法为：
(1)离心分离羊水组织中的干细胞，去除上清液，清洗沉淀，再次离心去上清，得到羊水间充质干细胞；
(2)用羊水间充质干细胞无血清增殖培养基培养羊水间充质干细胞；
(3)将羊水间充质干细胞原代细胞传代至P3代羊水间充质干细胞；
(4)继续培养至P3代细胞80％融合度时，使用胰酶消化离心，即得到羊水间充质干细胞单细胞成品。
作为上述技术方案的改进，所述人皮肤成纤维细胞的制备方法为：
(1)采集耳后皮肤组织，分离真皮层组织，用组织清洗液清洗干净后剪碎成组织碎块；
(2)将组织碎块与组织消化液I混合，消化，消化后加入组织清洗液清洗并离心，去除上清液，保留沉淀；其中，组织消化液I为包含中性蛋白酶和DNA 酶的生理盐水，
(3)将第一次消化后保留的沉淀和组织消化液II混合，消化，加入胰蛋白酶，继续消化；其中，组织消化液II为包含I型胶原酶和DNA酶的DNEM培养基；
(4)加入终止液终止消化，筛去组织块，离心，去除上清液，保留沉淀；
(5)用选择性培养基重悬沉淀，分装培养，即得人皮肤成纤维细胞。
相应的，本发明还公开了一种上述的用于3D生物打印的生物墨水，其包括：
制备生物活性细胞；
取0.2～1份海藻酸钠，0.3～1份明胶和0.15～0.5份纤维素和120～150份缓冲液，混合均匀即得水凝胶；
取2～10份CaCl2，90～98份缓冲液，混合均匀得到固化剂溶液。
相应的，本发明还公开了一种上述的生物墨水在制备生物活性支架中的应用。
作为上述技术方案的改进，包括以下步骤：
(1)制备上述的生物墨水；
(2)利用3D生物打印机将所述水凝胶和生物活性细胞按照预设的模型打印，得到中间物；
(3)将所述中间物浸泡于固化剂溶液中，交联固化后得到生物活性支架。
相应的，本发明还公开了一种基于上述的生物墨水的皮肤组织替代物打印方法，其包括：
(1)分别制备水凝胶、生物活性细胞和固化剂溶液；
(2)将水凝胶、生物活性细胞和固化剂溶液分别装载至生物打印机的墨盒中；
(3)生物打印机选用固化剂溶液，打印形成第一固化剂层；
(4)生物打印机选用水凝胶和生物活性细胞，在第一固化剂层上打印形成第一凝胶层；
(5)生物打印机选用固化剂溶液，在第一凝胶层上打印第二固化剂层。
作为上述技术方案的改进，还包括：
(6)生物打印机选用水凝胶和生物活性细胞，在第一固化剂层上打印形成第二凝胶层；
(7)生物打印机选用固化剂溶液，在第二凝胶层上打印第三固化剂层。
实施本发明，具有如下有益效果：
1，本发明中的生物墨水，采用海藻酸钠、纤维素和明胶形成水凝胶，该水凝胶具有三维网状立体结构，既能吸收创面渗液，又能保持创面湿润，且柔韧性好，可与创面无缝隙贴合，不形成死腔；同时具有可控制的生物降解能力、机械强度和载药性能。
2，本发明生物墨水所采用的羊水间充质细胞具有高增殖能力、多能性、免疫调节活性和无显著的免疫原性，且安全性高，可为3D生物打印的低成本推广提供有力支撑。
附图说明
图1是本发明试验例中不同治疗组治疗后不同时间点伤口未闭合百分比图；
图2为本发明试验例中不同治疗组治疗后不同时间点伤口收缩百分比图；
图3是本发明试验例中不同治疗组治疗后不同时间点角质细胞再上皮化百分比图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施方式对本发明作进一步地详细描述。
本发明提供一种用于3D生物打印的生物墨水，其包括水凝胶、生物活性细胞和固化剂溶液；
具体的，水凝胶包括以下重量份的组分：海藻酸钠0.2～1份，明胶0.3～1份，纤维素0.15～0.5份，缓冲液120～150份。
其中，海藻酸钠具有化学交联性质，其可有效提升生物墨水的稳定性。海藻酸钠的用量为0.2～1份，示例性的为0.2份、0.25份、0.3份、0.35份、0.5份、 0.75份或0.9份，但不限于此。
其中，明胶具有温敏性，可保障打印时水凝胶结构的稳定。明胶的用量为 0.3～1份，示例性的为0.35份、0.4份、0.5份、0.6份、0.8份或0.9份，但不限于此。
其中，纤维素可调节水凝胶的粘度，并提高生物墨水整体的力学性能。在本发明的一个实施例中，纤维素为纳米纤维素，但不限于此。纤维素的用量为 0.15～0.5份，示例性的为0.2份、0.25份、0.3份、0.35份或0.4份，但不限于此。
其中，缓冲液可选用PBS缓冲液，但不限于此。其中，PBS缓冲液的浓度为0.005～0.05mol/L，pH为7.2～7.3。
基于上述配方结构的水凝胶，可形成三维网状立体结构。当3D生物打印到创面后，既可以吸收创面渗液，又能保持创面湿润，且柔韧性好，可与创面无缝隙贴合，不形成死腔；同时具有可控制的生物降解能力、机械强度和载药性能，且安全性良好。
具体的，生物活性细胞可选用羊水间充质干细胞和/或人皮肤成纤维细胞，其数量为1×107～2×107个/mL，示例性的为1.2×107个/mL、1.4×107个/mL、1.6×107个/mL、1.8×107个/mL、2×107个/mL，但不限于此。
其中，人皮肤成纤维细胞的制备方法为：
(1)采集耳后皮肤组织，分离真皮层组织，用组织清洗液清洗干净后剪碎成组织碎块；
(2)将组织碎块与组织消化液I混合，消化，消化后加入组织清洗液清洗并离心，去除上清液，保留沉淀；
其中，组织消化液I为包含中性蛋白酶和DNA酶的生理盐水；消化时间为 25～35min，组织消化液I的加入量为0.5～3.0mL/g组织碎块；所述组织消化液 I中，中性蛋白酶的浓度为90～110mg/mL，DNA酶的浓度为8～12mg/mL；
(3)将第一次消化后保留的沉淀和组织消化液II混合，消化，加入胰蛋白酶，继续消化；
其中，组织消化液II为包含I型胶原酶和DNA酶的DNEM培养基；所述组织消化酶II中，I型胶原酶的浓度为2.5～3.5mg/mL，DNA酶的浓度为0.2～ 0.4mg/mL；
(4)加入终止液终止消化，过100μm滤网去除组织块，收集细胞悬液，，离心，去除上清液，保留沉淀；
具体的，将细胞悬液离心4～6min，离心转速为900～1100rpm，去除上清液，保留沉淀，加入RPMI1640清洗沉淀，离心4～6min，去除上清液，保留沉淀；
(5)用选择性培养基将第二次消化后的沉淀重悬，分装培养即得。
具体的，将沉淀分装至培养瓶中，培养至融合度为75％～85％，进行传代培养，其后每2.5～3.5天传代一次，传代比例为1:(3.5～4.5)；其中，选择性培养基为包含bFGF和EGF的RPMI1640培养基。
采用上述方法得到的人皮肤成纤维细胞(Fbs细胞)，纯度高，活性高，对烧伤、创伤引起的皮肤损伤具有良好的替代作用。
其中，羊水间充质干细胞通过以下方法制备得到：
(1)离心分离羊水组织中的干细胞，去除上清液，清洗沉淀，再次离心去上清，得到羊水间充质干细胞；
(2)用羊水间充质干细胞无血清增殖培养基培养羊水间充质干细胞；
具体的，羊水间充质干细胞以5000/cm2的密度接种于T25培养瓶中，每瓶加入5mL羊水间充质干细胞无血清增殖培养基；
(3)将羊水间充质干细胞原代细胞传代至P3代羊水间充质干细胞；
具体的，当原代细胞长至80％融合度时，按1：4体积比例传代，直至P3 代羊水间充质干细胞；
(4)继续培养至P3代细胞80％融合度时，使用胰酶消化离心，即得。
具体的，采用0.25％的胰酶消化，并在离心前计数。
其中，羊水间充质干细胞(AFS细胞)具有高增殖能力、多能性、免疫调节活性和无显著的免疫原性，是良好的再生医学的细胞来源。研究显示，AFS 细胞在注射到免疫缺陷小鼠体内时不会形成畸胎瘤，其安全性高于胚胎干细胞。此外，AFS细胞保持稳定并且在培养中没有显示出分化的迹象。AFS细胞的分离比人皮肤成纤维细胞(Fbs)的分离过程更简单，可以从少至2ml的羊水中分离和扩增大量AFS细胞，这些细胞增殖迅速且可避免应用人成纤维细胞而出现的免疫排斥，可实现规模化生产。
具体的，本发明中的固化剂溶液包括以下重量份的组分：CaCl2 2～10份，缓冲液90～98份。其中，缓冲液为PBS缓冲液。
相应的，本发明还公开了上述生物墨水的制备方法，其包括以下步骤：
(1)制备生物活性细胞；
(2)取0.2～1份海藻酸钠，0.3～1份明胶和0.15～0.5份纤维素和120～150 份缓冲液，混合均匀即得水凝胶；
具体的，在本发明的一个实施例之中，将海藻酸钠、明胶、纤维素、缓冲液同时混合。在本发明的另一实施例中，依次将海藻酸钠、明胶、纤维素与部分缓冲液混合，再将得到的溶液充分混合，即得到水凝胶。
具体的，在本发明的一个实施例之中，将生物活性细胞悬浮在水凝胶中，得到生物墨水本体；然后打印生物墨水本体。在本发明的另一个实施例之中，水凝胶与生物墨水单独提供，在打印时混合即可。
(3)取2～10份CaCl2，90～98份缓冲液，混合均匀得到固化剂溶液。
具体的，在实际制备过程中，步骤(1)、(2)、(3)不分先后。
相应的，本发明还提供了上述生物墨水在制备生物活性支架中的应用。具体的，其制备方法为：
(1)制备上述的生物墨水；
(2)利用3D生物打印机将所述水凝胶和生物活性细胞按照预设的模型打印，得到中间物；
(3)将所述中间物浸泡于固化剂溶液中，交联固化后得到生物活性支架。
具体的，将中间物完整浸泡在固化剂溶液中5～10min，即可交联固化得到生物活性支架
相应的，本发明还提供了上述生物墨水在制备皮肤替代物中的应用。具体的，皮肤替代物的打印方法为：
(1)分别制备水凝胶、生物活性细胞和固化剂溶液；
(2)将水凝胶、生物活性细胞和固化剂溶液分别装载至生物打印机的墨盒中；
(3)生物打印机选用固化剂溶液，打印形成第一固化剂层；
(4)生物打印机选用水凝胶和生物活性细胞，在第一固化剂层上打印形成第一凝胶层；
(5)生物打印机选用固化剂溶液，在第一凝胶层上打印第二固化剂层。
(6)生物打印机选用水凝胶和生物活性细胞，在第一固化剂层上打印形成第二凝胶层；
(7)生物打印机选用固化剂溶液，在第二凝胶层上打印第三固化剂层；即得。
具体的，在打印完成后，采用绷带等进行固定，固定预设时间即可。
下面以具体实施例对本发明进行说明：
实施例1
本实施例提供一种生物墨水，其包括水凝胶、生物活性细胞和固化剂溶液；
其中，水凝胶包括以下重量百分比的组分：
海藻酸钠0.3份，明胶0.35份，纳米纤维素0.15份，1×PBS缓冲液125份。
固化剂溶液包括以下重量百分比的组分：
CaCl2 5份，1×PBS缓冲液95份。
生物墨水中生物活性细胞为羊水间充质干细胞(AFS细胞)，其数量为1.7 ×107个/mL。
生物墨水的制备方法为：
(1)制备羊水间充质干细胞；
具体的参见专利CN201811148883.5。
(2)制备水凝胶，具体如下：
1)称取300mg的海藻酸钠粉末溶解于100ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，放入磁子在40℃的水浴中进行磁力搅拌4小时，使海藻酸钠完全溶解，制成海藻酸钠浓度为3mg/ml的海藻酸钠溶液，贮存于4℃冰箱中备用。
2)称取350mg的明胶粉末加入10mLPBS中，在40℃的水浴中进行磁力搅拌，持续2小时至完全溶解，制成浓度为35mg/ml的明胶溶液，贮存于4℃冰箱中备用。
3)分别称取150mg纳米纤维素，分别依次倒入小烧杯中，向烧杯中均加入 15ml的PBS，在40℃的水浴中进行磁力持续1小时至完全溶解，制成浓度分别为10mg/ml的纳米纤维素溶液。
4)将海藻酸钠溶液、明胶溶液和纳米纤维素溶液混合，搅拌均匀，在37℃水浴锅中磁力搅拌30min(使水凝胶溶液表面无气泡)。室温下用0.45nm注射器式滤器过滤，贮存于-20℃冰箱中备用。
(2)制备固化剂溶液，具体如下：
称取5g无水氯化钙白色粉末，将其溶解于100ml的PBS中，即得。
实施例2
本实施例提供一种生物墨水，其与实施例1的区别在于，生物活性细胞采用人皮肤成纤维细胞(Fbs细胞)，其具体制备方法参见专利CN201910777323.4。
实施例3
本实施例提供一种基于生物墨水的皮肤组织替代物的打印方法，具体包括：
(1)分别制备水凝胶、生物活性细胞和固化剂溶液；
具体如实施例1、实施例2；
(2)将水凝胶、生物活性细胞和固化剂溶液分别装载至生物打印机的墨盒中；
(3)生物打印机选用固化剂溶液，打印形成第一固化剂层；
其中，固化剂溶液的用量为0.075mL/cm2。
(4)生物打印机选用水凝胶和生物活性细胞，在第一固化剂层上打印形成第一凝胶层；
其中，水凝胶的用量为0.075mL/cm2，生物活性细胞的用量为1.275×107个/cm2；
(5)生物打印机选用固化剂溶液，在第一凝胶层上打印第二固化剂层。
其中，固化剂溶液的用量为0.075mL/cm2；
(6)生物打印机选用水凝胶和生物活性细胞，在第一固化剂层上打印形成第二凝胶层；
其中，水凝胶的用量为0.075mL/cm2，生物活性细胞的用量为1.275×107个/cm2；
(7)生物打印机选用固化剂溶液，在第二凝胶层上打印第三固化剂层。
其中，固化剂溶液的用量为0.075mL/cm2。
对比例
本对比例提供一种生物墨水，其与实施例1的区别在于，生物墨水中不包括生物活性细胞。
试验例
在麻醉状态下，用剪刀在小鼠的中背部区域手术创建一个全层皮肤伤口 (2.0×2.0cm)。将实施例1、实施例2、对比例1的水凝胶、生物活性细胞、固化剂溶液分别置于3D生物打印机的墨盒中。依次在皮肤伤口沉积一层CaCl2、一层水凝胶(0.3mL)，第二层CaCl2、水凝胶和最后一层CaCl2。其中，对比例 1中不含有生物活性细胞，在凝胶化后使用三联抗生素(杆菌肽锌、硫酸新霉素、多粘菌素B硫酸盐)涂于每个伤口，然后使用绷带缝合到位。
试验例1伤口闭合率效果验证
小鼠放入气体麻醉机中用异氟烷进行麻醉，然后用脱毛膏涂抹背部并用剃刀退毛。用酒精消毒后，用手术剪在背部造成2.0×2.0cm的全皮层切除伤口。对伤口拍照以供后续处理。采用实施例3的方法进行打印，并随机分组如下：1. 用AFS细胞联合水凝胶(AFS和Gel，实施例1)生物打印覆盖伤口并用医用胶带固定、包裹伤口；2用Fbs细胞联合水凝胶(Fbs和Gel，实施例2)生物打印覆盖伤口，并用医用胶带固定、包裹伤口；3.仅用水凝胶(Gelonly，对比例1) 生物打印覆盖伤口，并用医用胶带固定、包裹伤口。在0，7，14天用异氟烷将小鼠麻醉，对伤口拍照用以计算面积。伤口闭合百分比：各时间点对足背创面拍照，Image-ProPlus6.0软件计算其面积，并按照公式计算伤口闭合百分比。原始伤口面积定义为A，剩余未闭合伤口定义为B。伤口闭合百分比定义为 B/A×100％。伤口闭合百分比结果如图1所示。从图中可以看出，在第一周，AFS 和凝胶联合治疗组治疗的小鼠未闭合伤口百分比和Fbs联合凝胶治疗组治疗的小鼠未闭合伤口差异显著(p<0.05)，且显著低于仅用凝胶处理的小鼠的值 (p<0.01)，即此生物打印材料可以促进伤口愈合且AFS细胞联合水凝胶处理效果好。在第二周，AFS联合水凝胶治疗组治疗的小鼠未闭合伤口率和第一周有同样的结果。
试验例2伤口收缩率效果验证
小鼠放入气体麻醉机中用异氟烷进行麻醉，然后用脱毛膏涂抹背部并用剃刀退毛。用酒精消毒后，用手术剪在背部造成2.0×2.0cm的全皮层切除伤口。对伤口拍照以供后续处理。打印方法及分组如试验例1，在0，7，14天用异氟烷将小鼠麻醉，对伤口拍照用以计算面积。各时间点对足背创面拍照， Image-ProPlus6.0软件计算其面积，并按照公式计算伤口收缩百分比。原始伤口面积定义为A，清晰重新上皮化(但较薄)的皮肤面积定义为B。伤口收缩百分比定义为(A-B)/A×100％。伤口收缩百分比结果如图2所示。从图中可以看出，在第一周，AFS细胞和Fbs治疗的伤口收缩明显高于在仅凝胶治疗的伤口的收缩率(p<0.01)同时AFS细胞组处理的伤口收缩率高于Fbs处理组(p<0.01)，即此生物打印材料可以促进伤口愈合且AFS细胞联合水凝胶处理效果好。在第二周，AFS联合水凝胶治疗组治疗的小鼠伤口收缩率和第一周有同样的结果。
试验例3角质形成细胞再上皮化
小鼠放入气体麻醉机中用异氟烷进行麻醉，然后用脱毛膏涂抹背部并用剃刀退毛。用酒精消毒后，用手术剪在背部造成2.0×2.0cm的全皮层切除伤口。对伤口拍照以供后续处理。打印方法及分组如试验例1，在0，7，14天用异氟烷将小鼠麻醉，对伤口拍照用以计算面积。各时间点对足背创面拍照， Image-ProPlus6.0软件计算其面积，并按照公式计算角质细胞再上皮化程度。清晰重新上皮化(但较薄)的皮肤面积定义为B，剩余未闭合伤口定义为C。再上皮化的百分比定义为(B-C)/B×100％。角质细胞再上皮化百分比结果如图3所示。从图中看出：AFS细胞、Fbs细胞联合水凝胶组在第一周都具有更大的再上皮化，第二周AFS处理的伤口再上皮化程度显著高于Fbs处理组和对照组，具有更好的效果。即此生物打印材料可以促进伤口愈合且AFS细胞联合水凝胶处理效果好。
以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种皮肤组织替代物的打印方法，其特征在于，包括：
(1)分别制备水凝胶、生物活性细胞和固化剂溶液；其中，所述水凝胶包括以下重量份的组分：海藻酸钠0.2～1份，明胶0.3～1份，纤维素0.15～0.5份，缓冲液120～150份；所述生物活性细胞的数量为1×107～2×107个/mL；所述生物活性细胞为羊水间充质干细胞；所述固化剂溶液包括以下重量份的组分：CaCl22～10份，缓冲液90～98份；
(2)将水凝胶、生物活性细胞和固化剂溶液分别装载至生物打印机的墨盒中；
(3)生物打印机选用固化剂溶液，打印形成第一固化剂层；
(4)生物打印机选用水凝胶和生物活性细胞，在第一固化剂层上打印形成第一凝胶层；
(5)生物打印机选用固化剂溶液，在第一凝胶层上打印第二固化剂层；
(6)生物打印机选用水凝胶和生物活性细胞，在第二固化剂层上打印形成第二凝胶层；
(7)生物打印机选用固化剂溶液，在第二凝胶层上打印第三固化剂层。
2.如权利要求1所述的皮肤组织替代物的打印方法，其特征在于，所述缓冲液为PBS缓冲液，其浓度为0.005～0.05mol/L，pH为7.2～7.3。
3.如权利要求1所述的皮肤组织替代物的打印方法，其特征在于，所述羊水间充质干细胞的制备方法为：
(1)离心分离羊水组织中的干细胞，去除上清液，清洗沉淀，再次离心去上清，得到羊水间充质干细胞；
(2)用羊水间充质干细胞无血清增殖培养基培养羊水间充质干细胞；
(3)将羊水间充质干细胞原代细胞传代至P3代羊水间充质干细胞；
(4)继续培养至P3代细胞80％融合度时，使用胰酶消化离心，即得到羊水间充质干细胞单细胞成品。
4.如权利要求1所述的皮肤组织替代物的打印方法，其特征在于，所述水凝胶的制备方法为：取0.2～1份海藻酸钠，0.3～1份明胶和0.15～0.5份纤维素和120～150份缓冲液，混合均匀即得水凝胶；
所述固化剂溶液的制备方法为：取2～10份CaCl2，90～98份缓冲液，混合均匀得到固化剂溶液。
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