CN113604421B - 基于3d打印的血管化双层工程皮肤及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了基于3D打印的血管化双层工程皮肤,包括有真皮层皮肤组织和表皮层皮肤组织,所述真皮层皮肤组织通过基于牵张力控制的3D打印方式得到;所述表皮层皮肤组织接种于真皮层皮肤组织表面;还提供了其制备方法。本发明提供的基于3D打印的血管化双层工程皮肤,通过3D生物打印的方式构建了真皮层皮肤组织及接种于真皮层皮肤组织表面的表皮层皮肤组织,此构建方式可通过改变3D打印的框架结构间距控制牵张力的大小,不仅能够有效促进表皮层皮肤组织中细胞的增殖,同时还可精确控制血管分支形成,为构建具有类似正常双层皮肤组织的组织工程皮肤提供了有效支撑,扩展了组织工程皮肤在创面修复方面的临床应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域,具体涉及基于3D打印的血管化双层工程皮肤及其制备方法。
背景技术
创伤是临床外科常见病、多发病。随着交通事故、机械伤的增多,创伤病人数在逐年增加。对于创伤的治疗,及早地覆盖创面,一方面能够减少创面污染,另一方面能够保护创面,防止创伤程度加重,对于降低治疗成本,减少死亡率具有重要意义。
目前临床上用于覆盖创面的组织为自体组织、异体组织、异种组织和组织工程学皮肤。自体组织主要是皮片及皮瓣,来源于患者自体组织,切取时,会产生二次损伤;供区常常伴有疼痛、创面不愈合、瘢痕形成影响外观及功能等并发症。另外,若损伤面积过大,很难从患者自体获得足够的、高质量的自体组织来覆盖创面;常用的异体组织为异种皮(如猪皮)、异体皮(如尸体皮),但因为移植后很快会发生免疫排斥反应,所以仅能起到暂时覆盖作用。而组织工程皮肤具有来源丰富、低免疫原性等优点,是修复创面的理想材料之一,也是目前创面修复领域研究的热点。
目前商品化的组织工程皮肤主要有表皮替代物(如Epidex、安体肤)、真皮替代物(如Integra、Dermagraft)和表皮-真皮替代物(如Apligraf),并且已经应用于临床,但并没有获得满意的临床效果,大部分的病例虽经历了初期成功的移植,但后期这些皮肤替代物都会丢失。失败的主要原因是这些组织的功能持久性较差。而移植皮肤组织的功能持久性取决于体外培养的表皮干细胞的增殖潜能是否能够维持。组织工程皮肤防止干细胞丢失的解决方式就是选用纯度较高的表皮干细胞,并在皮肤组织制备过程中保持干细胞的数目。在制备组织工程皮肤的过程中,表皮干细胞相对于分化的角质细胞的优势越来越被认可。Pellegrini等将表皮细胞分离得到的细胞分为干细胞和增殖细胞两组,分别接种到含有成纤维细胞的I型胶原内制成双层皮肤替代物,培养2月后,发现前者(干细胞组)仍保持正常上皮组织的形态,而后者(增殖细胞组)失去了上皮形态。因此,制备组织工程皮肤时如何维持表皮干细胞的增殖潜能是至关重要的技术点。
目前的研究人员认为,选择合适的培养条件是减少组织工程皮肤制备过程中干细胞丢失的重要手段。Dunnwald等将表皮干细胞接种到含有成纤维细胞的I型胶原上,培养6个月后,制作的组织仍能保持正常的表皮形态。Trappmann等将表皮干细胞接种在不同弹性模量的聚丙烯酰胺 (Polyacrylamide PAAm)的水凝胶中,结果发现强度越大的水凝胶中表皮干细胞分化的比例越少。Choi等采用ACQ(Alanine-cysteine-glutamine)培养表皮细胞,发现具有增殖能力的表皮干细胞比对照组明显增多。Zhan 等通过细胞增殖和DNA合成检测,发现一氧化氮能够促进表皮干细胞的增殖,并且FOXG1-c-Myc信号通路在其中起到了一定作用。至目前位置,促进表皮干细胞增殖的研究并不多,且大多集中在机制研究中,而以表皮干细胞为种子细胞构建组织工程皮肤的应用报道更不多见。
另外,组织工程皮肤本身未建立血管系统。若受区血管床条件差,不能为移植组织提供足够的营养时,移植组织也易发生缺血坏死。故此解决组织工程皮肤移植后的血液循环问题是组织工程产品推广到临床应用的首要前提。组织或器官的血管化是解决移植后组织或器官缺血问题较为可靠的方式,再生的组织或器官预先形成微血管,移植后与受区血管网迅速建立血液循环,从而为移植的组织或器官提供足够的营养物质,排出废物。因此,当前的技术背景下,皮肤组织的血管化研究是目前皮肤组织工程的重要方向之一。
血管分支结构的构建对于组织工程皮肤的血管化具有重要意义。正常皮肤的血管网是一种层级有序的分支网络。为此,人工构建组织或器官的血管网络应尽可能的仿效该结构特性,也应当具有层次分明的分支结构,即大血管分支形成小血管,小血管进一步分支至终末支,遍布于细胞周围,且所有细胞离血管的距离应小于200μm。因此,在组织工程皮肤制备过程中,通过特定方式构建有序的层级血管网络,且不同位置的血管携带有不同数目的分支,以增进血管网与皮肤细胞的联系,将有效促进血管床条件较差情况下,组织工程皮肤在创面修复方面的临床应用。
公开号为CN104013999的《组织工程皮肤及其制备方法》专利,公开了一种组织工程皮肤,包括种子细胞和脱细胞异体真皮基质,种子细胞与脱细胞异体真皮基质形成皮肤附属器,种子细胞通过3D打印机按正常皮肤的解剖结构排列平铺打印在脱细胞异体真皮基质正面的相应位置中。
但此技术文献中,只是针对组织工程皮肤本身进行了调整,而并未涉及血管分支结构的构建,这也是现有技术中较难克服的技术难题之一。
公开号为CN108525021的《基于3D打印的含血管及毛囊结构组织工程皮肤及其制备方法》专利,公开了一种由表皮层、脱细胞真皮支架和真皮层构成的组织工程皮肤,表皮层以表皮干细胞作为种子细胞,与载体水凝胶复合后,通过3D打印机打印在脱细胞真皮支架的上表面,分化形成正常表皮结构,真皮层以骨髓间充质干细胞、血管内皮细胞、毛乳头细胞和脂肪干细胞作为种子细胞,与载体水凝胶复合,通过3D打印机在脱细胞真皮支架的下表面打印复合有细胞因子的明胶缓释微球,同时将种子细胞的水凝胶复合物打印在明胶缓释微球中,形成具有三维立体空间结构的真皮结构。
虽然此技术文献中,对组织工程皮肤本身进行了调整,也涉及到了血管分支结构的构建,但其构建的血管和毛囊,均是采用现有的“血管内皮细胞及毛乳头细胞”做为种子细胞构建得到的,无法实现构建的精确控制;并且其表皮干细胞也只是做为种子细胞进行正常生长增殖,生长增殖效果完全取决于所取用的表皮干细胞活性,而无法实现相应的人为促进和调控。
公开号为CN110253876的《基于3D打印框架控制的牵张力调控组织血管分支的方法》专利(同一申请人),公开了基于3D打印框架控制的牵张力调控组织血管分支的方法,目的是通过对组织工程组织或器官的微血管化进行控制,从而构建预血管化的组织工程组织或器官,解决组织工程组织和器官的缺血问题。
虽然此技术文献中,也提供了采用牵张力调控血管分支的方法,但其所制备得到的组织工程皮肤为单层皮肤,即只有真皮层组织而没有表皮层组织,单真皮层组织无法单独使用,其缺陷较大,即便采用其它方式覆盖表皮层组织,也难以实现二者的契合。
发明内容
本发明的目的是通过牵张力促进表皮干细胞增殖,增加表皮层厚度,从而构建高质量的双层皮肤组织,解决临床创面修复所需皮肤来源不足的问题。
本发明的上述目的可采用下列技术方案来实现:
本发明提供了基于3D打印的血管化双层工程皮肤,所述血管化双层工程皮肤包括有真皮层皮肤组织和表皮层皮肤组织,所述真皮层皮肤组织通过基于牵张力控制的3D打印方式得到;所述表皮层皮肤组织接种于真皮层皮肤组织表面。
进一步的,上述的基于3D打印的血管化双层工程皮肤,所述真皮层皮肤组织是以GelMA-纤维蛋白-内皮细胞和成纤维细胞的复合物通过3D 打印后培养得到的。
牵张力通过影响内皮细胞的微环境调控血管形成。为了在3D打印组织或器官中实现类似的调控作用,申请人采用聚己内酯PCL构建了稳定的框架结构,以GelMA-纤维蛋白为支架材料打印含成纤维细胞和血管内皮细胞的组织条带,条带之间以明胶做填充物。GelMA-纤维蛋白材料相对于单纯的纤维蛋白,能够明显增加机械强度及韧性。
进一步的,上述的基于3D打印的血管化双层工程皮肤,所述内皮细胞包括但不限于脂肪干细胞诱导分化形成的内皮细胞或人脐静脉内皮细胞,优选为人脐静脉内皮细胞;其中,纤维蛋白浓度为5-10mg/ml,优选为7.5mg/ml。
3D生物打印机构建血管的技术手段主要有仿生学和自组装。虽然根据仿生学原理采用3D生物打印机得到的血管结构外形与正常的组织血管非常相似,但因为未对单个的血管内皮细胞进行控制,故其血管内皮细胞的贴壁及血管化程度很难控制,并不能保证内皮细胞生长方向完全按照支架结构的方向生长。自组装技术以细胞作为组织发生的主要初始因素,通过调节细胞微环境,驱动生物打印组织按照胚胎机制发育来实现组织的发育和成熟,自组装原理对血管生成的调控是由改变人脐静脉内皮细胞HUVEC微环境实现的,形成的血管是人脐静脉内皮细胞 HUVEC自发形成的血管结构,符合生命的发展过程,血管网的结构和功能更为可靠,与实体细胞的联系也更为紧密。
本发明中选用人脐静脉内皮细胞(HUVECs),而不直接采用静脉血管内皮细胞或动脉血管内皮细胞的原因在于,人脐静脉内皮细胞具有干细胞的潜能,理论上可以传代50-60次,从组织学上考虑更接近于真实的人体皮肤组成和功能。
进一步的,上述的基于3D打印的血管化双层工程皮肤,所述表皮层皮肤组织是将表皮干细胞或角质形成细胞接种于真皮层皮肤组织表面后培养得到的;优选为表皮干细胞。
进一步的,上述的基于3D打印的血管化双层工程皮肤,所述表皮干细胞为1-3代来源于皮肤组织的表皮干细胞;优选为2代来源于皮肤组织的表皮干细胞。
表皮干细胞属于成体干细胞,成瘤的风险很低,具有很强的分裂增殖能力,能够特异性的向角质细胞分化,促进组织表皮层的构建。在本双层工程皮肤中,由于牵张力的作用,更有利于表皮干细胞的增殖,获得的皮肤质量更好。
进一步的,上述的基于3D打印的血管化双层工程皮肤,所述角质形成细胞的细胞总量为1.5×104cells/cm2-2.5×104cells/cm2,细胞纯度为80%以上。
进一步的,上述的基于3D打印的血管化双层工程皮肤,所述牵张力是由成纤维细胞的张力产生的,用于促进表皮干细胞的增殖、增加表皮层组织的厚度以及调控血管化的分支形成。
3D打印组织的牵张力在培养早期由纤维蛋白支架材料形成,在培养后期主要由成纤维细胞骨架和成纤维细胞分泌的胶原形成。通过对牵张力作用下3D打印组织所形成的血管进行分析,发现血管的生长方向与牵张力一致,所形成的血管具有管腔。
纤维蛋白浓度可选择5-10mg/ml,其中,5mg/ml、7.5mg/ml和10mg/ml 都可以实施,故此发明人在不同的改进模型中选择了不同浓度的纤维蛋白,并发现以7.5mg/ml纤维蛋白作为支架材料打印的组织,其血管的生长情况相对更好一些。
发明人进一步发现,3D打印牵张力可能通过Rho/ROCK信号通路直接作用于人脐静脉内皮细胞,调控其血管化。
本发明的第二个发明点是提供了上述的基于3D打印的血管化双层工程皮肤的制备方法,包括以下步骤:
S1.建立3D的聚己内酯PCL凹槽框架结构;凹槽深度为90-110μm,宽度为8-10mm;PCL框架的间距根据血管分支的需求分别设定为5-7mm 和9-11mm;优选为,凹槽的深度100μm,宽度为9mm,PCL框架的间距根据血管分支的需求分别设定为6mm和10mm;
S2.组织底部填充明胶,凹槽内打印一层GelMA-纤维蛋白-内皮细胞和成纤维细胞的复合物,再继续覆盖一层聚己内酯PCL框架,此PCL覆盖层的厚度为400μm,宽度和底部一致,分别为6mm或10mm;内皮细胞为脂肪干细胞诱导分化形成的内皮细胞或人脐静脉内皮细胞,优选为人脐静脉内皮细胞;GelMA-纤维蛋白-内皮细胞的打印浓度为 4×106/ml-6×106/ml,优选为5×106/ml;成纤维细胞的打印浓度为 0.5×106/ml-1.5×106/ml,优选为1×106/ml;其中,纤维蛋白的浓度为 5-10mg/ml,优选为7.5mg/ml;
S3.打印组织加入凝血酶后孵育,再加入真皮层培养基后培养;
孵育条件为温度20-30℃,时间25-35分钟,优选为温度25℃(室温),时间30分钟;
培养条件为含4-6%CO2、35-39℃的培养箱中培养4-6天,优选为含 5%CO2、37℃的培养箱中培养5天;
打印的成纤维细胞在牵张力控制下培养4-6天(优选5天),形成真皮层,为后续表皮干细胞生长提供微环境和力学刺激;
S4.移除真皮层培养基,将表皮干细胞悬液接种至真皮层组织表面孵育,再加入表皮层培养基悬浮培养;
表皮干细胞悬液的制备方法为:将离心后的表皮干细胞加入至 450-550μl的角质化细胞生长培养基KGM-2中制备得到浓度为 7×106/ml-9×106/ml的表皮干细胞悬液;优选为500μl角质化细胞生长培养基KGM-2,表皮干细胞悬液浓度为8×106/ml;
按照每个接种点接种1.3-1.7μl表皮干细胞悬液、每个真皮层组织8-10 个接种点的接种量将表皮干细胞悬液接种至真皮层组织表面;优选为接种1.5μl,9个接种点;
孵育条件为:于含4-6%CO2、35-39℃的培养箱中孵育1.5-2.5小时,优选为于含5%CO2、37℃的培养箱中孵育2小时;
悬浮培养条件为:悬浮培养6-8天,表皮干细胞为1-3代来源于皮肤组织的表皮干细胞;优选为悬浮培养7天,表皮干细胞为2代来源于皮肤组织的表皮干细胞;
S5.降低培养基平面至真皮层组织,构建气液培养平面,继续培养即可;培养时间为1-3周,优选为2周。
上述的细胞打印浓度单位全称为cells/ml。
进一步的,上述的基于3D打印的血管化双层工程皮肤的制备方法,所述步骤S1的聚己内酯PCL凹槽框架结构,还连接有控制牵引结构,控制牵引结构用于控制聚己内酯PCL凹槽框架结构的牵引位移及牵引- 收缩频次。
本发明技术中所提供的牵张力来源于成纤维细胞的张力,但此种牵张力取决于细胞本身,难以控制,无法精确调控,同时,持续的牵引促使细胞增殖也有可能导致细胞分化力度降低;故此本发明中还加入了用于控制牵引-收缩频次的控制牵引结构,具体如图2或图3所示。此结构为弹性结构,可利用弹力和收缩力精确控制牵张力。
利用此结构,可在细胞生长过程中,产生牵张力不够的情况下,施以一定的外在/人为干预的牵张力;或在牵张力过大的情况下,施以一定的外在/人为干预的收缩力。
也可利用此结构,在细胞牵引一段时间后短暂收缩,使细胞本身恢复分化能力,然后再次进行持续牵引,此种反复牵引-收缩的过程相较于持续牵引会带来更好的效果。
控制牵引结构,通常情况下是如图2或图3所示,包括有至少1个 (通常为2个)固定点5-1,用于固定控制牵引结构本身,还包括有至少 2个弧形弹性部件5-2以及至少1个“Z”形弹性部件5-3,所述2个弧形弹性部件5-2的一端相互连接,连接点再与“Z”形弹性部件5-3的一端连接,所述2个弧形弹性部件5-2的另一端分别连接于固定点5-1上,“Z”形弹性部件5-3的另一端固定于可移动PCL部件5-4上;通过施加于弧形弹性部件5-2上J点的力,压缩弧形弹性部件5-2使其形变,随之使“Z”形弹性部件5-3产生弹性力,从而可使可移动PCL部件5-4从位置a位移至位置b。
进一步的,上述的基于3D打印的血管化双层工程皮肤的制备方法,所述步骤S3中的真皮层培养基为:内皮细胞生长培养基EGM-2和胎牛血清-DMEM高糖培养基的混合培养基;所述步骤S4中的表皮层培养基为:角质化细胞生长培养基KGM-2和内皮细胞生长培养基EGM-2的混合培养基;
真皮层培养基中,胎牛血清-DMEM高糖培养基为按体积百分比加入了8-12%胎牛血清的DMEM高糖培养基;内皮细胞生长培养基EGM-2 和胎牛血清-DMEM高糖培养基的混合比例按照体积比计为(3-5):1;优选为,按体积百分比加入了10%胎牛血清的DMEM高糖培养基,混合比例按照体积比计为4:1;
表皮层培养中,角质化细胞生长培养基KGM-2和内皮细胞生长培养基EGM-2的混合比例按照体积比计为(0.5-1.5):1;优选为1:1;胎牛血清的含量为1%。
KGM-2、EGM-2的混合及既有利于表皮干细胞的生长,又利于血管的形成。
聚己内酯多元醇(Polycaprolactone,PCL)是一种作为打印组织支撑结构的人工合成聚合物,是由s-己内酯在催化剂四苯基锡等金属有机化合物作用下,由二羟基或三羟基引发开环聚合而成,属于聚合型聚酯。在体内随着时间的延长会降解,具有相对低的熔点(60℃左右),热塑性良好,易成型加工,有很好的机械性能和耐水性,是一种柔性的材料。具有良好的生物相容性,细胞可在其基架上正常生长。常被用作打印结构的成分,制作移植后长期存在的结构,但不能非特异性的结合细胞,因其不具有天然的肽键序列来结合细胞,会影响打印组织的整合。由于这个限制,PCL常与其他功能化或自然派生的材料如水凝胶来完整复杂结构的打印。借助于PCL上述特性,可实现打印组织框架结构的构建。
明胶是一种从小动物的结缔组织或表皮组织中的胶原部分水解出来的蛋白质,在酸、碱、或高温下的变性产物,其由18种氨基酸组成的不均一的蛋白质,平均相对分子量为50000-70000。明胶产品呈无色或淡黄色的透明薄片或微粒,不溶于冷水,在冷水中可缓慢吸水而膨胀,能吸收比自身重5-10倍以上的水分,形成坚固而有弹性的凝胶。与天然的胶原不一样,它能够溶解在PH中性的水溶液中,在低温的疏水性交联作用下仍能形成胶状。它的熔点在30-35℃之间。明胶对生物组织具有高安全性,在食品、医药卫生、组织工程、感光化学等方面都有重要的应用价值。
纤维蛋自原(Fibrinogen,Fg)是一种由肝细胞产生的类急性糖基化蛋白,相对分子量为340KDa,游离于血浆中,占血浆总蛋白的2%-3%。在体内,它在血液凝固、伤口愈合及肿瘤生长都起重要作用。在凝血酶的作用下,Fg降解为纤维蛋白。纤维蛋白是纤维蛋白原的初级降解产物。纤维蛋白凝胶由纤维蛋白原通过凝血酶酶切作用后形成纤维蛋白,通过相互之间的交联锁住液体形成纤维蛋白凝胶。近来纤维蛋白被广泛应用于再生医学领域正是因为其快速交联、牢靠的机械性能。纤维蛋白在凝胶中性质稳定,其内环境有利于细胞的粘附和增殖,另外体外研究证实纤维蛋白能够直接引导HUVECS形成主要的血管网络并向更多的血管分支发展,并且在纤维蛋白降解后,这些微血管的结构仍能保持完整性。
本发明的特点及优点是:
本发明提供的基于3D打印的血管化双层工程皮肤,通过3D生物打印的方式构建了真皮层皮肤组织及接种于真皮层皮肤组织表面的表皮层皮肤组织,此构建方式可通过改变3D打印的框架结构间距控制牵张力的大小,不仅能够有效促进表皮层皮肤组织中细胞的增殖,同时还可精确控制血管分支形成,为构建具有类似正常双层皮肤组织的组织工程皮肤提供了有效支撑,扩展了组织工程皮肤在创面修复方面的临床应用。
真皮层皮肤组织由纤维蛋白-内皮细胞和成纤维细胞的复合物3D打印后培养得到,由于支架材料回缩和细胞张力所产生的牵张力,更为精准的改变了3D打印框架的结构间距,从而实现了牵张力的精准控制,能够有效促进后续接种表皮干细胞的增殖且同时能够精确控制血管分支的形成。
双层皮肤结构包括有表皮层和真皮层,更符合人体正常皮肤结构,不仅具有表皮层的抗感染、防止水分丢失等屏障功能,也具有真皮层支撑、防皱缩的重要功能。单一的真皮层覆盖创面后,后期还需要表皮覆盖创面。牵张力作用下的构建的双层皮肤组织,其表皮层和真皮层结合紧密,不会出现分离的情况;在牵张力的作用下,双层皮肤组织具有良好的机械性能,抗挛缩的能力也相对更强。所构建的最终双层工程皮肤组织含有血管网络,移植到受区创面后,能够迅速从受区获得营养物质,移植的成活率高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1显示为本发明实施例3-5提供的基于3D打印的血管化双层工程皮肤的构建过程示意图。
其中,图标1为固定PCL,2为明胶支架材料,3为GelMA-纤维蛋白-内皮细胞和成纤维细胞的复合物,4为表皮干细胞,5为可移动PCL 结构;
步骤A为设置PCL层,高度为400μm以上,虚线部分的PCL为可移动部分,可施加一定拉力;
步骤B为设置PCL凹槽,凹槽深度100μm,宽度为9mm,PCL边框间距为6mm;
步骤C为填充明胶水凝胶;
步骤D为凹槽内填充GelMA-纤维蛋白-内皮细胞和成纤维细胞的复合物;
步骤E为PCL框架固定GelMA-纤维蛋白-内皮细胞和成纤维细胞的复合物;
步骤F为加入培养基培养;
步骤G为培养5天后,移除培养基,接种表皮干细胞或角质细胞;
步骤H为培养箱孵育2小时后,加入培养基,继续培养7天。
图2显示为图1中图标5控制牵引结构(可移动PCL结构)的具体结构示意图。
其中,图2A为初始位置示意图,图2B为终止位置示意图,其中图标5-1为固定点,5-2为弧形弹性部件,5-3为“Z”形弹性部件,5-4为可移动PCL部件,图标J显示为施力方向,图标a为PCL的位移前位置,图标b为PCL的位移后位置。
图3显示为图1中图标5可移动PCL结构的实物图片。
图4显示为在具有牵张力情况下本发明实施例5构建的双层皮肤组织与对照组中无牵张力情况下构建的皮肤组织的苏木精-伊红(H&E)染色结果对比。
其中,虚线显示为表皮和真皮层分界线,牵张力组表皮层的明显厚于对照组,标尺均为50μm;图4A显示为实施例5构建的双层皮肤组织微观图(有牵张力作用);图4B显示为对比例6构建的皮肤组织微观图 (无牵张力作用)。
图5显示为3D打印的不同宽度框架结果下组织中真皮层血管形成情况对比。
其中,图5A显示为对照组无框架结构的组织中血管分支多,生长无次序;图5B显示为宽度为6mm的血管分支减少,生长方向具有一定趋向性;图5C显示为宽度为10mm的血管分支最少,生长方向基本与牵张力方向一致。
图6显示为不同浓度下的GelMA打印组织的机械性能对比图。
图7显示为以Ki67荧光检测表皮干细胞增殖活性的打印组和对照组对比图片。
其中,Ki67是检测表皮干细胞增殖活性的标记物,具有牵张力的打印组的组织中Ki67的阳性细胞数量明显高于对照组;
DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料,其可以透过完整的细胞膜,用于活细胞和固定细胞的染色,图7中的DAPI染色对比图能够显示细胞存活数量;图7中的Merged图为Ki67标记和DAPI染色的结合图。
图8显示为以Ki67荧光检测表皮干细胞增殖活性的打印组和对照组对比统计数据图。
其中,横坐标分别显示对照组和打印组,纵坐标显示为Ki67阳性细胞率。可以明显看出,具有牵张力的打印组的组织中Ki67的阳性细胞率明显高于对照组。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明所用材料来源:
KGM-2:角质化细胞生长培养基,购自瑞士Lonza公司。
EGM-2:内皮细胞生长培养基,购自瑞士Lonza公司。
人脐静脉内皮细胞,HUVEC,Human Umbilical Vein Endothelial Cells,购自美国Zenbio公司。
人成纤维细胞,购自瑞士Lonza公司。
DMEM高糖培养基,Dulbecco's Modified Eagle Medium,为Dulbecco 改良的Eagle培养基,购自美国Thermo Fisher Scientific公司。
胎牛血清,购自美国Thermo Fisher Scientific公司。
胰酶/EDTA消化液,购自美国Thermo Fisher Scientific公司。
聚己内酯PCL,购自美国Polysciences公司。
纤维蛋白原,购自美国Sigma-Aldrich公司。
明胶,购自美国Sigma-Aldrich公司。
甲基丙烯酸酐化明胶(甲基丙烯酸化水凝胶)(GelMA),购自苏州永沁泉智能设备有限公司。
Petri培养皿的直径为10cm,打印过程中工程皮肤组织打印在Petri 培养皿中,随后加入培养基进行培养。
GelMA-纤维蛋白-人脐静脉内皮细胞-成纤维细胞凝胶的制备方法为:
将含有10%甘油和3mg/ml透明质酸的DMEM高糖培养基移至离心管中,然后加入纤维蛋白和明胶,其中纤维蛋白的加入量为7.5mg/ml,明胶的加入量为35mg/ml,GelMA的加入量为30mg/ml,成纤维细胞的浓度为1×106cells/ml,人脐静脉内皮细胞的浓度为5×106cells/ml,将此离心管标记为GelMA-纤维蛋白-人脐静脉内皮细胞-成纤维细胞凝胶。
实施例1:
基于3D打印的血管化双层工程皮肤,血管化双层工程皮肤包括有真皮层皮肤组织和表皮层皮肤组织,真皮层皮肤组织通过基于牵张力控制的3D打印方式得到;表皮层皮肤组织接种于真皮层皮肤组织表面。
此血管化双层工程皮肤,构建过程中可通过改变3D打印的框架结构间距控制牵张力的大小,不仅能够有效促进表皮层皮肤组织中细胞的增殖,同时还可精确控制血管分支形成,为构建具有类似正常双层皮肤组织的组织工程皮肤提供了有效支撑,扩展了组织工程皮肤在创面修复方面的临床应用。
实施例2:
基于3D打印的血管化双层工程皮肤,包括有真皮层皮肤组织和表皮层皮肤组织,真皮层皮肤组织是以GelMA-纤维蛋白-内皮细胞和成纤维细胞的复合物通过基于牵张力控制的3D打印方式得到;表皮层皮肤组织接种于真皮层皮肤组织表面;
内皮细胞包括脂肪干细胞诱导分化形成的内皮细胞或人脐静脉内皮细胞,优选为人脐静脉内皮细胞;其中,纤维蛋白浓度为5-10mg/ml,可选择为5.5mg/ml,6mg/ml,6.5mg/ml,7mg/ml,7.5mg/ml,8mg/ml, 8.5mg/ml,9mg/ml,9.5mg/ml,优选为7.5mg/ml;
表皮层皮肤组织是将表皮干细胞或角质形成细胞接种于真皮层皮肤组织表面后培养得到的;优选为表皮干细胞;
表皮干细胞为1-3代来源于皮肤组织的表皮干细胞;优选为2代来源于皮肤组织的表皮干细胞;
角质形成细胞的细胞总量为1.5×104cells/cm2-2.5×104cells/cm2,细胞纯度为80%以上;可选择为1.8×104cells/cm2,2×104cells/cm2, 2.2×104cells/cm2,优选为细胞总量2×104cells/cm2,细胞纯度为90%。
牵张力是由成纤维细胞的张力产生的,用于促进表皮干细胞的增殖、增加表皮层组织的厚度以及调控血管化的分支形成。
本发明还提供了基于3D打印的血管化双层工程皮肤的制备方法,包括以下步骤:
S1.建立3D的聚己内酯PCL凹槽框架结构;凹槽深度为90-110μm,宽度为8-10mm,可选择为凹槽深度95μm,100μm,105μm,宽度为8.5mm, 9mm,9.5mm;PCL框架的间距根据血管分支的需求分别设定为5-7mm 和9-11mm,可选择为5.5mm,6mm,6.5mm和9.5mm,10mm,10.5mm;优选为,凹槽的深度100μm,宽度为9mm,PCL框架的间距根据血管分支的需求分别设定为6mm和10mm;
S2.组织底部填充明胶,凹槽内打印一层GelMA-纤维蛋白-内皮细胞和成纤维细胞的复合物,再继续覆盖一层聚己内酯PCL框架;内皮细胞为脂肪干细胞诱导分化形成的内皮细胞或人脐静脉内皮细胞,优选为人脐静脉内皮细胞;GelMa浓度为25-35mg/ml,优选为mg/ml,30GelMA- 纤维蛋白-内皮细胞的打印浓度为4×106/ml-6×106/ml,可选择为 4.5×106/ml,5×106/ml,5.5×106/ml,优选为5×106/ml;成纤维细胞的打印浓度为0.5×106/ml-1.5×106/ml,可选择为0.8×106/ml,1×106/ml,1.2×106/ml,优选为1×106/ml;其中,纤维蛋白的浓度为5-10mg/ml,可选择为5.5 mg/ml,6mg/ml,6.5mg/ml,7mg/ml,7.5mg/ml,8mg/ml,8.5mg/ml,9mg/ml,9.5mg/ml,优选为7.5mg/ml;
S3.打印组织加入凝血酶后孵育,再加入真皮层培养基后培养;
孵育条件为温度20-30℃,时间25-35分钟,可选择为22℃,25℃, 28℃,28分钟,30分钟,32分钟,优选为温度25℃(室温),时间30 分钟;
培养条件为含4-6%CO2、35-39℃的培养箱中培养4-6天,可选择为 4.5%CO2,5%CO2,5.5%CO2,36℃,37℃,38℃,优选为含5%CO2、 37℃的培养箱中培养5天;
打印的成纤维细胞在牵张力控制下培养4-6天(优选5天),形成真皮层,为后续表皮干细胞生长提供微环境和力学刺激;
S4.移除真皮层培养基,将表皮干细胞悬液接种至真皮层组织表面孵育,再加入表皮层培养基悬浮培养;
表皮干细胞悬液的制备方法为:将离心后的表皮干细胞加入至 450-550μl的角质化细胞生长培养基KGM-2中制备得到浓度为 7×106/ml-9×106/ml的表皮干细胞悬液;可选择为480μl,500μl,530μl,浓度为7.5×106/ml,8×106/ml,8.5×106/ml;优选为500μl角质化细胞生长培养基KGM-2,表皮干细胞悬液浓度为8×106/ml;
按照每个接种点接种1.3-1.7μl表皮干细胞悬液、每个真皮层组织8-10 个接种点的接种量将表皮干细胞悬液接种至真皮层组织表面;可选择为接种1.4μl,1.5μl,1.6μl,;优选为接种1.5μl,9个接种点;
孵育条件为:于含4-6%CO2、35-39℃的培养箱中孵育1.5-2.5小时;可选择为4.5%CO2,5%CO2,5.5%CO2,36℃,37℃,38℃,孵育1.8小时,2小时,2.2小时,优选为于含5%CO2、37℃的培养箱中孵育2小时;
悬浮培养条件为:悬浮培养6-8天,表皮干细胞为1-3代来源于皮肤组织的表皮干细胞;优选为悬浮培养7天,表皮干细胞为2代来源于皮肤组织的表皮干细胞;
S5.降低培养基平面至真皮层组织,构建气液培养平面,继续培养即可;培养时间为1-3周,优选为2周。
制备方法中,步骤S1的聚己内酯PCL凹槽框架结构,还连接有自动控制牵引装置,自动控制牵引装置用于控制聚己内酯PCL凹槽框架结构的牵引位移及牵引-收缩频次。
制备方法中,步骤S3中的真皮层培养基为:内皮细胞生长培养基 EGM-2和胎牛血清-DMEM高糖培养基的混合培养基;所述步骤S4中的表皮层培养基为:角质化细胞生长培养基KGM-2和内皮细胞生长培养基 EGM-2的混合培养基;
真皮层培养基中,胎牛血清-DMEM高糖培养基为按体积百分比加入了8-12%胎牛血清的DMEM高糖培养基,可选择为9%胎牛血清,10%胎牛血清,11%胎牛血清;内皮细胞生长培养基EGM-2和胎牛血清 -DMEM高糖培养基的混合比例按照体积比计为(3-5):1,可选择为3.5: 1,4:1,4.5:1;优选为,按体积百分比加入了10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基,混合比例按照体积比计为4:1;
表皮层培养中,角质化细胞生长培养基KGM-2和内皮细胞生长培养基EGM-2的混合比例按照体积比计为(0.5-1.5):1;可选择为0.8:1, 1:1,1.2:1,优选为1:1;胎牛血清的含量为1%。
3D打印过程为:
装载PCL注射器,移至3D生物打印机的第一打印架上,将明胶支架材料加入到第二注射器内,移至打印机第二打印架上,将GelMA-纤维蛋白凝胶、人脐静脉内皮细胞、成纤维细胞混合物加入到第三注射器内,移至打印机第三打印架上,调整软件和PCL注射器,使用3D生物打印平台构建PCL框架,并在PCL框架上建立凹槽,将明胶支架材料打印填充至PCL框架内,打印GelMA-纤维蛋白凝胶与人脐静脉内皮细胞和成纤维细胞混合物并固定于PCL框架上形成真皮组织,然后悬浮于培养基中培养5天,再将表皮干细胞接种到真皮组织的表面,通过真皮层的细胞张力所产生的牵张力一方面促进表皮干细胞的增殖,增加表皮厚度,另一方面调控血管化分支形成,从而制备得到高质量的血管化双层皮肤组织。
本实施例通过3D生物打印平台构建方形框架结构,将GelMA-纤维蛋白-内皮细胞-成纤维细胞复合物条带固定于PCL框架的凹槽上,在 GelMA-纤维蛋白-内皮细胞-成纤维细胞复合物条带之间及底层均填充明胶支架材料,然后浸没于组织培养基中,明胶支架材料发生溶解,GelMA- 纤维蛋白-内皮细胞-成纤维细胞复合物条带固定于PCL框架上并悬浮于培养基中,由于支架材料回缩和细胞张力所产生的牵张力,改变PCL两框架的结构间距(6mm,10mm)可控制牵张力的大小,一方面促进后续接种的表皮干细胞的增殖,另一方面精确控制血管分支形成。本发明提出的精细控制3D打印框架结构,可以实现对牵张力的控制,促进3D打印皮肤表皮层的增殖和控制血管分支形成,为构建具有类似正常的双层皮肤组织提供了可靠的途径。
本发明克服了现有技术中的以下技术难题:
1)以往采用角质细胞为种子细胞构建表皮层,内含的表皮干细胞数量少,表皮干细胞的增殖能力低;
2)组织的血管网络的形成是杂乱无章的,没有实现调控;
3)需要特殊的培养皿(如Transwell系统)构建一个表皮层所需的气液平面。
为了克服以上技术难题,本发明做出了以下技术改进:
1)本发明构建的3D打印系统,其控制的牵张力能够促进表皮干细胞增殖,增加组织表皮层的厚度;
2)本发明通过改变聚己内酯PCL框架结构,实现了对工程皮肤组织所受的牵张力大小的控制,能够对血管的分支、生长方向及管腔大小实现控制,为构建正常皮肤的血管网络提供了相应的技术手段;
3)由于聚己内酯PCL框架结构将打印组织固定,可牺牲的降解材料在培养基中溶解后,使得打印组织能够悬浮在培养基中,通过减少培养基的量,可实现气液平面的构建,无需其他特殊设备。
实施例3:
基于3D打印的血管化双层工程皮肤的制备方法,如图1所示,包括以下步骤:
步骤一(图1A):建立聚己内酯PCL框架结构,高度400μm,虚线部分PCL为如图2、图3所示的可移动PCL结构,可施加拉力;
步骤二(图1B):在聚己内酯PCL框架结构上设置凹槽,凹槽深度为90μm,宽度为8mm;PCL框架的间距根据血管分支的需求分别设定为5mm和9mm;
步骤三(图1C):组织底部填充明胶水凝胶;
步骤四(图1D):凹槽内打印(填充)一层GelMA-纤维蛋白-脂肪干细胞诱导分化形成的内皮细胞和成纤维细胞的复合物;
其中,GelMa浓度为25mg/ml,纤维蛋白浓度为5mg/ml;GelMA- 纤维蛋白-脂肪干细胞诱导分化形成的内皮细胞的打印浓度为4×106/ml;成纤维细胞的打印浓度为0.5×106/m;如图6所示,GelMA-纤维蛋白材料相对于单纯的纤维蛋白,能够明显增加机械强度及韧性;
步骤五(图1E):在GelMA-纤维蛋白-脂肪干细胞诱导分化形成的内皮细胞和成纤维细胞的复合物上继续覆盖一层PCL框架,以PCL框架固定复合物;
步骤六(图1F):打印组织加入凝血酶后孵育,再加入至真皮层培养基后,移至培养箱中培养;
其中,真皮层培养基为:内皮细胞生长培养基EGM-2和胎牛血清 -DMEM高糖培养基的混合培养基;
真皮层培养基中,胎牛血清-DMEM高糖培养基为按体积百分比加入了8%胎牛血清的DMEM高糖培养基;内皮细胞生长培养基EGM-2和胎牛血清-DMEM高糖培养基的混合比例按照体积比计为3:1;
孵育条件为温度20℃,时间25分钟;
培养条件为在含4%CO2、35℃的培养箱中培养4天;
步骤七(图1G):培养4天后,移除真皮层皮肤组织培养基,将消化、离心后的角质细胞加入培养基中制备角质细胞悬液,将角质细胞悬液接种至真皮组织表面孵育;
其中,角质形成细胞的细胞总量2×104cells/cm2,细胞纯度为90%;
角质细胞悬液的制备方法为:将离心后的角质细胞加入至450μl的角质化细胞生长培养基KGM-2中制备得到浓度为7×106/ml的角质细胞悬液;
接种量为:按照每个接种点接种1.3μl角质细胞悬液、每个真皮层组织8个接种点的接种量将角质细胞悬液接种至真皮层组织表面;
孵育条件为:于含4%CO2、35℃的培养箱中孵育1.5小时;
步骤八(图1H):加入表皮层培养基中继续悬浮培养;
表皮层培养基为:角质化细胞生长培养基KGM-2和内皮细胞生长培养基EGM-2的混合培养基;
表皮层培养基中,角质化细胞生长培养基KGM-2和内皮细胞生长培养基EGM-2的混合比例按照体积比计为0.5:1;胎牛血清的含量为1%;
悬浮培养条件为:悬浮培养6天;
步骤九:降低培养基平面至真皮层,构建气液培养平面,继续培养;培养时间为1周。
实施例4:
基于3D打印的血管化双层工程皮肤的制备方法,包括以下步骤:
步骤一(图1A):建立聚己内酯PCL框架结构,高度600μm,虚线部分PCL为如图2、图3所示的可移动PCL结构,可施加拉力;
步骤二(图1B):在聚己内酯PCL框架结构上设置凹槽,凹槽深度为110μm,宽度为10mm;PCL框架的间距根据血管分支的需求分别设定为7mm和11mm;
步骤三(图1C):组织底部填充明胶水凝胶;
步骤四(图1D):凹槽内打印(填充)一层GelMA-纤维蛋白-人脐静脉内皮细胞和成纤维细胞的复合物;
其中,GelMa浓度为35mg/ml,纤维蛋白浓度为10mg/ml;GelMA- 纤维蛋白-人脐静脉内皮细胞的打印浓度为6×106/ml;成纤维细胞的打印浓度为1.5×106/ml;如图6所示,GelMA-纤维蛋白材料相对于单纯的纤维蛋白,能够明显增加机械强度及韧性;
步骤五(图1E):在GelMA-纤维蛋白-人脐静脉内皮细胞和成纤维细胞的复合物上继续覆盖一层PCL框架,以PCL框架固定复合物;
步骤六(图1F):打印组织加入凝血酶后孵育,再加入至真皮层培养基后,移至培养箱中培养;
其中,真皮层培养基为:内皮细胞生长培养基EGM-2和胎牛血清 -DMEM高糖培养基的混合培养基;
真皮层培养基中,胎牛血清-DMEM高糖培养基为按体积百分比加入了12%胎牛血清的DMEM高糖培养基;内皮细胞生长培养基EGM-2和胎牛血清-DMEM高糖培养基的混合比例按照体积比计为5:1;
孵育条件为温度30℃,时间35分钟;
培养条件为在含6%CO2、39℃的培养箱中培养6天;
步骤七(图1G):培养6天后,移除真皮层皮肤组织培养基,将消化、离心后的表皮干细胞加入培养基中制备表皮干细胞悬液,将表皮干细胞悬液接种至真皮组织表面孵育;
其中,表皮干细胞为3代来源于皮肤组织的表皮干细胞;
表皮干细胞悬液的制备方法为:将离心后的表皮干细胞加入至550μl 的角质化细胞生长培养基KGM-2中制备得到浓度为9×106/ml的表皮干细胞悬液;
接种量为:按照每个接种点接种1.7μl表皮干细胞悬液、每个真皮层组织10个接种点的接种量将表皮干细胞悬液接种至真皮层组织表面;
孵育条件为:于含6%CO2、39℃的培养箱中孵育2.5小时;
步骤八(图1H):加入表皮层培养基中继续悬浮培养;
表皮层培养基为:角质化细胞生长培养基KGM-2和内皮细胞生长培养基EGM-2的混合培养基;
表皮层培养基中,角质化细胞生长培养基KGM-2和内皮细胞生长培养基EGM-2的混合比例按照体积比计为1.5:1;胎牛血清的含量为1%;
悬浮培养条件为:悬浮培养8天;
步骤九:降低培养基平面至真皮层,构建气液培养平面,继续培养;培养时间为3周。
实施例5:
基于3D打印的血管化双层工程皮肤的制备方法,包括以下步骤:
步骤一(图1A):建立聚己内酯PCL框架结构,高度500μm,虚线部分PCL为如图2、图3所示的可移动PCL结构,可施加拉力;
步骤二(图1B):在聚己内酯PCL框架结构上设置凹槽,凹槽的深度100μm,宽度为9mm,PCL框架的间距根据血管分支的需求分别设定为6mm和10mm,不同宽度框架结果下组织中真皮层血管形成情况如图5所示;
步骤三(图1C):组织底部填充明胶水凝胶;
步骤四(图1D):凹槽内打印(填充)一层GelMA-纤维蛋白-人脐静脉内皮细胞和成纤维细胞的复合物;
其中,GelMa浓度为30mg/ml,纤维蛋白浓度为7.5mg/ml;GelMA- 纤维蛋白-人脐静脉内皮细胞的打印浓度为5×106/ml;成纤维细胞的打印浓度为1×106/ml;如图6所示,GelMA-纤维蛋白材料相对于单纯的纤维蛋白,能够明显增加机械强度及韧性;
步骤五(图1E):在GelMA-纤维蛋白-人脐静脉内皮细胞和成纤维细胞的复合物上继续覆盖一层PCL框架;
步骤六(图1F):打印组织加入凝血酶后孵育,再加入至真皮层培养基后,移至培养箱中培养;
其中,真皮层培养基为:内皮细胞生长培养基EGM-2和胎牛血清 -DMEM高糖培养基的混合培养基;
真皮层培养基中,胎牛血清-DMEM高糖培养基为按体积百分比加入了10%胎牛血清的DMEM高糖培养基;内皮细胞生长培养基EGM-2和胎牛血清-DMEM高糖培养基的混合比例按照体积比计为4:1;
孵育条件为温度25℃(室温),时间30分钟;
培养条件为在含5%CO2、37℃的培养箱中培养5天;
步骤七(图1G):培养5天后,移除真皮层皮肤组织培养基,将消化、离心后的表皮干细胞加入培养基中制备表皮干细胞悬液,将表皮干细胞悬液接种至真皮组织表面孵育;
其中,表皮干细胞为2代来源于皮肤组织的表皮干细胞;
表皮干细胞悬液的制备方法为:将离心后的表皮干细胞加入至500μl 的角质化细胞生长培养基KGM-2中制备得到浓度为8×106/ml的表皮干细胞悬液;
接种量为:按照每个接种点接种1.5μl表皮干细胞悬液、每个真皮层组织9个接种点的接种量将表皮干细胞悬液接种至真皮层组织表面;
孵育条件为:于含5%CO2、37℃的培养箱中孵育2小时;
步骤八(图1H):加入表皮层培养基中继续悬浮培养;
表皮层培养基为:角质化细胞生长培养基KGM-2和内皮细胞生长培养基EGM-2的混合培养基;
表皮层培养基中,角质化细胞生长培养基KGM-2和内皮细胞生长培养基EGM-2的混合比例按照体积比计为1:1;胎牛血清的含量为1%;
悬浮培养条件为:悬浮培养7天;
步骤九:降低培养基平面至真皮层,构建气液培养平面,继续培养;培养时间为2周。
聚己内酯PCL凹槽框架结构,还可以连接有自动控制牵引装置,自动控制牵引装置用于控制聚己内酯PCL凹槽框架结构的牵引位移及牵引 -收缩频次。
对比例6:
按照公开号为CN104013999的《组织工程皮肤及其制备方法》专利制备得到的组织工程皮肤。
对比例7:
按照公开号为CN108525021的《基于3D打印的含血管及毛囊结构组织工程皮肤及其制备方法》专利制备得到的组织工程皮肤。
对比例8:
按照公开号为CN110253876的《基于3D打印框架控制的牵张力调控组织血管分支的方法》专利(同一申请人)制备得到的单层组织工程皮肤。
将本发明最优技术方案的实施例5与现有技术中与本发明最相似的对比例8的技术参数进行了对比。
表1显示为本发明技术(实施例5)与现有技术(对比例8)的技术特性对比及技术特性所带来的效果说明,具体如下表1所示。
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如图4所示为在具有牵张力情况下本发明实施例5构建的双层皮肤组织与对照组(对比例6)中无牵张力情况下构建的皮肤组织的苏木精- 伊红(H&E)染色结果对比,从对比可以看出,牵张力组表皮层的明显厚于对照组。
本发明实施例3-5相对于对比例6-8,具有如下技术优势:
1)本发明能够根据需求调整PCL框架结构,获取不同大小的牵张力,继而实现对血管的分支、生长方向和管腔的控制(图5);
2)本发明所提供的双层工程皮肤,符合正常皮肤的生理结构,能够一次性完成创面修复,临床意义重大;
3)如图7、图8所示的以Ki67荧光检测表皮干细胞增殖活性的打印组和对照组对比图片和统计数据图,表明本发明所使用的表皮干细胞增殖能力强,特异性的向角质细胞分化,促进表皮层的构建;而表皮干细胞是干细胞,其能够分化为角质细胞,故此本发明优选采用表皮干细胞,其增殖能力更是要强于角质细胞;
4)本发明所采用的KGM-2、EGM-2混合培养基,能够有效保障三种细胞同时成活;
5)本发明采用的GelMA-纤维蛋白支架材料,增加了支架材料的机械强度,制备得到的双层皮肤组织具有更强的韧性,有利于组织移植的实施。
6)本发明在原有支架基础上,为了提高牵张力的调控,在支架结构中还加入了用于控制牵引-收缩频次的控制牵引结构,具体如图2或图3 所示;利用此结构,可在细胞生长过程中,产生牵张力不够的情况下,施以一定的外在/人为干预的牵张力;或在牵张力过大的情况下,施以一定的外在/人为干预的收缩力。也可利用此结构,在细胞牵引一段时间后短暂收缩,使细胞本身恢复分化能力,然后再次进行持续牵引,此种反复牵引-收缩的过程相较于持续牵引会带来更好的效果。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (3)
1.基于3D打印的血管化双层工程皮肤,其特征在于,所述血管化双层工程皮肤包括有真皮层皮肤组织和表皮层皮肤组织,所述真皮层皮肤组织是以GelMA-纤维蛋白-内皮细胞和成纤维细胞的复合物通过基于牵张力控制的3D打印后培养得到的;所述牵张力是由成纤维细胞的张力产生的,用于促进表皮干细胞的增殖、增加表皮层组织的厚度以及调控血管化的分支形成;所述内皮细胞包括脂肪干细胞诱导分化形成的内皮细胞或人脐静脉内皮细胞;所述表皮层皮肤组织是将表皮干细胞或角质形成细胞接种于真皮层皮肤组织表面后培养得到的;所述表皮干细胞为1-3代来源于皮肤组织的表皮干细胞,所述角质形成细胞的细胞量为1.5×104cells/cm2-2.5×104cells/cm2,细胞纯度为80%以上;所述基于3D打印的血管化双层工程皮肤的制备方法包括以下步骤:
S1.建立3D的聚己内酯PCL凹槽框架结构;所述聚己内酯PCL凹槽框架结构,还连接有控制牵引结构,控制牵引结构用于控制聚己内酯PCL凹槽框架结构的牵引位移及牵引-收缩频次;
所述控制牵引结构,包括有至少1个固定点,用于固定控制牵引结构本身,还包括有至少2个弧形弹性部件以及至少1个“Z”形弹性部件,所述2个弧形弹性部件的一端相互连接,连接点再与“Z”形弹性部件的一端连接,所述2个弧形弹性部件的另一端分别连接于固定点上,“Z”形弹性部件的另一端固定于可移动PCL部件上;
S2.组织底部填充明胶,凹槽内打印一层GelMA-纤维蛋白-内皮细胞和成纤维细胞的复合物,再继续覆盖一层聚己内酯PCL框架;
S3.打印组织加入凝血酶后孵育,再加入至真皮层培养基培养;
S4.移除真皮层培养基,将表皮干细胞悬液接种至真皮层组织表面孵育,再加入表皮层培养基悬浮培养;
S5.降低培养基平面至真皮层,构建气液培养平面,继续培养即可。
2.基于3D打印的血管化双层工程皮肤的制备方法,其特征在于,所述双层工程皮肤为根据权利要求1所述的基于3D打印的血管化双层工程皮肤,其制备方法包括以下步骤:
S1.建立3D的聚己内酯PCL凹槽框架结构;所述步骤S1的聚己内酯PCL凹槽框架结构,还连接有控制牵引结构,控制牵引结构用于控制聚己内酯PCL凹槽框架结构的牵引位移及牵引-收缩频次;
所述控制牵引结构,包括有至少1个固定点,用于固定控制牵引结构本身,还包括有至少2个弧形弹性部件以及至少1个“Z”形弹性部件,所述2个弧形弹性部件的一端相互连接,连接点再与“Z”形弹性部件的一端连接,所述2个弧形弹性部件的另一端分别连接于固定点上,“Z”形弹性部件的另一端固定于可移动PCL部件上;
S2.组织底部填充明胶,凹槽内打印一层GelMA-纤维蛋白-内皮细胞和成纤维细胞的复合物,再继续覆盖一层聚己内酯PCL框架;
S3.打印组织加入凝血酶后孵育,再加入至真皮层培养基培养;
S4.移除真皮层培养基,将表皮干细胞悬液接种至真皮层组织表面孵育,再加入表皮层培养基悬浮培养;
S5.降低培养基平面至真皮层,构建气液培养平面,继续培养即可。
3.根据权利要求2所述的基于3D打印的血管化双层工程皮肤的制备方法,其特征在于,所述步骤S3中的真皮层培养基为:内皮细胞生长培养基EGM-2和胎牛血清-DMEM高糖培养基的混合培养基;所述步骤S4中的表皮层培养基为:角质化细胞生长培养基KGM-2和内皮细胞生长培养基EGM-2的混合培养基。
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