KR20060099232A - 지방조직 치료제의 조성, 이들 제조방법 및 그의 전달방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 지방조직 치료제의 조성, 이들 치료제의 제조방법 및 그의 전달방법에 관한 것으로, 이를 보다 상세하게 서술하면, 콜라지네이즈(collagenase)와 같은 효소처리 없이 체외에서 하이드로젤(hydrogel)을 이용하여 3차원환경에서(3-D)배양한 후 지방세포에서부터 이동, 성장하여 증폭 배양된 지방줄기세포(adipose- derived stem cells, ASCs)를 포함한 지방조직 기원의 세포들과, 이러한 세포에서 생성하여 분비한 혈관성장인자를 포함한 성장인자 및 세포외기질, 지방조직 그리고 하이드로젤(hydrogel)로 구성되어지는 특성을 지니고 있는 지방조직 치료제의 조성, 이들 치료제의 제조방법 및 그의 전달방법에 관한 것이다.

지방조직, 치료제의 조성, 치료제의 제조방법, 치료제의 전달방법, 지방기원 성 세포

Description

지방조직 치료제의 조성, 이들 제조방법 및 그의 전달 방법{Manufacturing method and it's delivery method of creation and it's remedy of fatty tissue therapeutics}

도 1은 종래의 collagenase 처리 후 2차원 배양하여 지방줄기세포를 분리하는 방법의 모식도

도 2는 잘게 썬 지방조직을 생체에 적합한 하이드로젤(hydrogel)인 피브린 혹은 콜라겐 겔에 함입시켜 배양하면 지방조직에서부터 지방줄기세포(ASCs)가 이동 성장하는 것을 나타낸 사진

도 3는 본 발명에 따른 지방조직의 3-D(3차원)배양을 통한 지방줄기세포의 성장을 나타낸 그림으로,

그림 A는 지방조직을 배양 한 후, MTT 염색을 한 사진

그림 B는 지방조직을 배양 한 후, 2일째부터 세포의 성장사진

그림 C는 지방조직을 배양 한 후, 2주일정도 배양하면 이동, 성장한 지방줄기세포

(ASCs)가 높은 밀도로 젤(gel)내로 꽉 차게 된 사진

도 4은 지방조직의 3-D(3차원)배양을 통한 지방줄기세포의 회수 효율을 표시

도 5는 지방조직의 3-D(3차원)배양으로 이동 증식된 세포는 섬유모세포와 같은 방추상 모양과 세포질 내 미세한 공포가 다수 함유된 사진

도 6은 3-D(3차원)배양으로 분리된 세포는 Nile red O에 양성으로 지방을 함유하는 것을 확인, 즉 미분화 지방세포 (preadipocyte 혹은 ASCs)의 형태학적 특성에 부합을 보인 사진

도 7은 지방조직의 3차원 배양을 통한 지방줄기세포의 특성 및 분화 능력을 나타낸 것으로, 지방세포로의 분화 특이 표적자인 GPDH 활성도 비교도

도 8은 지방조직의 3차원 배양을 통한 세포 내 중성지방함량, GPDH와 동일한 경향 으로 중성지방(triglyceride)이 합성되는 것을 확인

도 9는 지방조직의 3차원 배양을 통한 지방조직으로 분화 유도 후 세포질 내로 지방질의 침착되는 사진

도 10은 지방조직의 3차원 배양을 통한 지방조직으로 분화 유도 후 세포질 내로 렙틴(leptin)이 미만성으로 발현되는 사진

본 발명은 지방조직 치료제의 조성, 이들 제조방법 및 그의 전달 방법에 관한 것으로, 이를 보다 상세하게 서술하면, 콜라지네이즈(collagenase)와 같은 효소처리 없이 체외에서 하이드로젤(hydrogel)을 이용하여 3차원환경에서(3-D) 배양한 후 지방세포에서부터 이동, 성장하여 증폭 배양된 지방줄기세포 (adipose-derived stem cells, 이하 ASCs로 명함)를 포함한 지방조직 기원의 세포들과, 이러한 세포에서 생성하여 분비한 혈관성장인자를 포함한 성장인자 및 세포외기질, 지방조직 그리고 하이드로젤(hydrogel)로 구성되어지는 특성을 지니고 있는 지방조직 치료제의 조성, 이들 제조방법 및 그의 전달 방법에 관한 것이다.

이러한 형태의 조직재생 치료제는 손상된 조직과 장기에 전달하여 손상된 조직과 장기의 신생혈관을 생성하고, 조직 및 장기를 구성하는 세포를 재생 혹은 복원시키고, 그 조직 및 장기의 고유기능을 담당하는 조직을 재생시켜 그 기능을 복원하는 치료제로 사용되어지고 있다.

일반적으로 사고나 질병에 의한 조직 및 장기의 손상과 결손은 해당 조직과 장기가 동일한 세포와 조직으로 복원 되지 않으면 해당 조직과 장기는 기능 저하에 따른 이차적인 합병증을 초래하며, 이를 치료하기 위하여 해당 조직과 장기를 자기 신체의 일부 혹은 타가 조직과 장기를 전달하여 그 기능을 복원시켜야만 치료될 수 있는 것으로 알려져 있다.

따라서, 사고나 질병 등으로 인하여 조직 및 장기가 필요한 경우에는 자기 신체의 일부에서 전달할 수 있는 조직(자가)과 장기가 제한적이기 때문이 공여된 다른 생물체 조직 및 장기를 이용할 수밖에 없는 실정이다.

그러나, 이와 같은 경우에는 수요에 비하여 턱없이 부족한 공급상의 문제와 다른 생물체(타가 조직)를 구할 수 있다 하더라도 타가 조직에 대한 면역거부 반응, 질환의 전염, 윤리적인 문제 그리고 사회적인 문제 등을 야기함으로 하여 많은 문제가 대두되어져 왔다.

세계적으로 세포치료제 관련 분야 연구개발이 본격적으로 시작된 것은 1990년대 초반이며 1998년에 미국에서 배양 인공 피부가 판매허가를 받았고 본격적인 시장은 2003년부터 형성된 것으로 생각된다. 연구투자로 누적된 지출액은 세계적으로 30-40억 불에 달하는 것으로 추산되며 민간기업의 투자만 1998년에 약 10억불, 2005년에는 약 800억불에 이를 것으로 예상되고 있다 (강계원. 생체조직기술 동향. 한국과학기술정보연구원 기술동향분석보고서. 2004.12). 국내 세포치료제 연구는 1990년대 후반에 시작되었으며 인공피부, 연골, 줄기세포 연구가 중심이 되고 있다. 국내 연구 개발비 투자 규모는 집계된 자료는 없으나 현재 약 20개의 벤처기업이 연구에 참여하고 있고, 한 기업 당 연간 4-5억원의 연구비를 지출한다고 가정할 때 연간 80-100 억원정도로 추산할 수 있다. 줄기세포, 바이오인공장기, 세포치료제와 관련하여 정부에서 차세대지원 사업으로 지정되어 년 수백억 원 규모의 연구비를 집중 지원하고 있다.

최근 들어 주변과학의 발달로 인하여 생명공학분야의 발전이 거듭되고 있는 가운데, 줄기세포를 이용하여 조직 및 장기를 재생시켜 그 기능을 복원하기 위한 방법들이 시도되고 있다. 줄기세포는 기원세포에 따라 배아줄기세포와 성체줄기세포로 구분되어지며, 배아줄기세포는 만능으로 분화할 수 있는 능력이 있지만 목적하는 세포 및 조직으로 완벽히 분화를 제어하지 못하며, 또한 배아줄기세포는 종양을 유발할 수 있는 위험성, 윤리적 법률적 한계로 인하여 빠른 시간 내에 치료목적으로 사용되기 어려운 문제점을 가지고 있다.

반면에 성체줄기세포는 자가 조직에서 분리하여 체외에서 배양가능하기 때문에 배아줄기세포의 한계를 극복할 수 있을 뿐만 아니라 자기 자신의 조직에서 분리, 배양, 증폭하여 자기 자신에게 다시 전달하기 때문에 생리적이고 이상적인 방법이다.

자가 혹은 타가 성체줄기세포를 전달하여 질환을 치료하는 방법 중에서 30년 전부터 현재까지 널리 사용되고 있는 치료법 중 골수세포전달, 즉 조혈모세포전달이 가장 대표적이며, 백혈병, 재생 불량성 빈혈, 고형 암의 방사선과 항암치료 후 저하된 골수기능을 복원하기 위해 일반적으로 널리 사용되고 있다.

조혈모세포 이외에도 여러 장기와 조직에서 다양한 기원의 성체줄기세포들이 발견되었고, 특히 골수조직에서 발견된 중간엽계 줄기세포(mesenchymal stem cells, 이하 MSCs로 명함)는 중배엽 기원의 세포와 조직으로 분화하는 능력이 있을 뿐만 아니라 신경세포와 같은 외배엽 기원의 세포와 조직, 그리고 심장 근육세포로도 분화할 수 있는 다능(multipotent) 줄기세포이며, MSCs는 조혈모세포와는 달리 체외 배양과 증폭이 가능한 장점을 가지고 있어 세포치료제로서의 그 가능성이 아주 높다. MSCs는 골세포, 연골세포, 반월판세포, 심장근육세포, 신경세포 등으로 분화할 수 있는 능력과 해당 결손 조직을 재건할 수 있는 능력이 실험적으로 밝혀져 이런 조직과 장기의 기능을 재건하기 위한 세포치료제로 사용되거나 혹은 임상시험을 진행 중에 있다. 즉 골다공증, 골절, 관절염, 심근경색, 울혈성 심부전, 퇴행성 및 외상성 뇌질환을 치료할 수 있는 세포치료제로 개발되고 있으며, MSCs는 골수에서 자가 골수조직을 취득하여 줄기세포를 분리하고 체외에서 확대 배양하여지며, 치료용으로는 최소 500백만 개 이상의 세포가 요구되나, 골수조직 내 MSCs는 나이에 따른 편차는 있지만 약 10억 분의 1에 해당하는 세포만이 줄기세포인 것으로 알려져 있고, 또한 MSCs는 체외 증폭 배양이 용이하지 않은 단점이 있다.

따라서, 세포치료제 수준까지 MSCs를 배양하려면 최소 100cc 이상의 골수조직이 필 요하나, 다량의 골수조직을 취득해야하는 위험성을 지니고 있을 뿐만 아니라 체내에 자원이 풍부한 조직이 아니라는 문제점이 있다. 그러므로 MSCs는 세포치료제로서 안정적인 생물학적 유용성을 유지하고 범용화를 위해서는 체외 배양 기술의 개발과 조직수급 상의 한계점을 극복하여야만 이와 같은 문제점이 해결될 것이다.

또한, MSCs의 대안으로 신생아의 태반과 탯줄에서 추출한 줄기세포를 이용하려는 연구가 진행되었으나 MSCs와 필적할만한 유용성과 경제성을 제시하지는 못하는 등 많은 문제점을 야기 시켰다.

그러나. 2001년 Zuk (Zuk et al., 2001)등은 지방조직에서부터 자가 재생능력이 뛰어나고 간, 골, 연골, 지방, 혈관, 심장, 신경계 등 다능 분화능력을 가지는 성체줄기세포인 지방줄기세포(adipose-derived stem cells, ASCs)를 발견 되었으며, ASCs는 MSCs와 비교하여 자가 재생능력이 뛰어나고 체외 배양이 용이하다는 점과, ASCs를 분리할 수 있는 지방조직이 풍부하고 채취방법이 간단하며, 안전하다는 장 점을 가지고 있으며, 기능적인 측면에서의 ASCs는 MSCs와 비교하였을 때도 분화능력, 세포학적 특성, 면역학적 특성, 조직재생능력과 특성이 거의 동일한 것으로 밝혀졌다, 즉 ASCs는 MSCs를 대체할 수 있는 높은 가능성을 지닌 줄기세포로서 의학적 유용성이 아주 크게 나타났다.

또한, ASCs는 MSCs와 비교하여 조직 취득과정이 용이하고 안전하며, 조직수급상의 제한이 없는 장점과 체외배양이 용이하여 조직 접근성, 안정성, 유효성, 그리고 경제적 측면에서 MSCs 보다 우위에 있다.

성체줄기세포 중 ASCs의 특징적인 기능 중 하나가 일반적인 상처를 치유할 수 있는 능력을 가지고 있는 것으로, ASCs와 성숙한 지방세포(adipocyte)는 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)를 다량 생성하여 분비할 수 있는 세포이며, 또한 이런 세포를 체내에 전달 시 혈관을 생성하고 분화를 촉진할 수 있는 탁월한 기능을 가진다. 또한 ASCs 자체가 혈관내피세포로 직접 분화할 수 있는 특징을 지닌다.

모든 상처수복(wound healing)의 시작은 혈관의 생성부터이며, 손상 부위 내 혈관의 생성 없이는 손상된 조직이 재생되지 않고 손상된 조직과 장기는 그 기능을 다시 회복할 수 없게 되어진다. 손상 받은 장기 혹은 조직 주위로 ASCs를 주입한 결과 손상된 조직주위로 새로운 혈관이 생성되고 장기 및 조직의 기능이 단기간 내에 복원되는 결과가 동물실험을 통하여 밝혀지면서, 이러한 ASCs의 생물학적 특성을 기반으로 심근경색, 뇌경색, 말초혈관성질환 등의 상처수복 및 조직 재생의 목적으로 ASCs를 세포치료제로 적용하는 임상시험이 진행되고 있다.

지방줄기세포의 분리배양 방법

이는 2001년 Zuk (Zuk et al., 2001)등에 의해 ASCs의 존재가 밝혀지고, 그 이후 ASCs에 관한 연구들은 모두 이 방법을 이용하여 ASCs를 분리하고 배양하고 있는 것 으로, 기존에 사용되는 ASCs 분리, 배양법은 흡입된 또는 절제된 지방을 다시 잘게 부수어 콜라지네이즈(collagenase)로 조직을 분해한 후, 원심분리 과정을 거치면 침전되어 분리되는 혈관간질(vascular stromal) 획분(fraction)에서 분리한 세포를 배양하는 방법으로, 이 방법은 콜라지네이즈(collagenase)를 처리 후, 약 100cc의 흡입지방조직으로부터 통상 50만개의 세포를 분리할 수 있는 것으로 알려져 있으며, 이는 전체 세포 수의 백만분의 1에 해당하는 세포만을 획득할 수 있는 비효율적인 방법이다.

또한, Clostridium histiolyticum 추출물인 콜라지네이즈(collagenase)는 제조회사와 제조된 batch에 따라 상당한 활성도 차이를 보이며, 결과적으로 효소의 반응온도, 반응시간 등의 분해조건에 따라 최종 획득할 수 있는 세포 수는 상당한 편차를 보이는 등 표준화하기 어려운 단점이 있다.

피부조직에서 섬유모세포(fibroblast)를 분리 배양하는 방법 중 피부를 잘게 부수어 배양용기에 옮겨서 배양하면 진피조직 내에 위치하는 섬유모세포가 배양용기로 이동하여 성장한다. 즉 생물체의 조직을 콜라지네이즈(collagenase)와 같은 조직분해효소를 사용하지 않고 조직단위로 배양하여 특정한 세포를 분리 배양하는 방법을 외식방법(explant method)이라고 한다. 단순하며 효율이 좋은 방법으로 섬유모세포를 분리 배양하는 경우에 가장 널리 이용되는 방법이다.

그러나, 지방조직은 조직 내 지방성분이 90% 이상을 차지하는 물리적, 생화학적 특성 때문에 지방조직에 배양액과 같은 수분을 첨가하였을 때 수면위로 상승하는 문제가 발생하여 외식방법(explant method)을 사용할 수 없다. 또한 지방조직을 콜라지네이즈(collagenase)로 분해한 후 원심 분리하면 세포질 내에 지방을 많이 함유하는 성숙한 지방세포 역시 수면위로 상승하는 결과를 초래하여, 많은 조직을 효소로 처리하여 단일 세포를 분리하였어도 일반적인 제조방법으로 배양할 수 있는 세포 수가 제한적인 이유이다.

지방조직의 3차원 배양방법을 통한 지방줄기세포의 배양법

ASCs는 MSCs와 같이 지지의존성(anchorage-dependent) 특성을 가지는 세포이며, 세포가 부착할 수 있는 기질(substratum)이 없이는 세포가 성장할 수 없다. 왜냐하면, 지방조직의 특성 상 배지를 첨가하면 지방조직이 배지 위로 뜨기 때문에 간엽성 세포의 배양에 흔히 이용되는 "외식(explant)"과 같은 방법은 적용할 수가 없기 때문이다.

1989년 일본의 Sugihara는 배양용기에 배양액을 가득 채워 지방조직이 배양용기의 천장과 물리적으로 접촉할 수 있는 방법을 고안하였고, 배양용기와 물리적으로 접촉한 지방조직에서 지방전구세포(preadipocyte)가 이동하여 성장할 수 있는 배양방법을 발표하였으며, Sugihara는 이 방법을 "천장방법(ceiling method)"으로 명명하였고(J Lipid Res 1989; 30:1987), Shugihara의 방법은 일종의 변형된 외식방법(explant method)이라 할 수 있다.

1987년 Sugihara는 지방조직으로부터 콜라지네이즈(collagenase)로 처리하여 성숙 지방세포를 분리한 후 콜라겐 겔 내에서 지방세포를 콜라겐 겔(collagen gel) 내에서 3-D배양하였을 때(그림 A-D), 지방전구세포(preadipocyte)가 분열, 증식하는 사실을 발표하였으며(J Lipid Res 1987;28:1038), 2001년 Zuk등의 연구결과 발표 이전에는 ASCs가 다양한 이름으로 명명되었고, 그 중 지방전구세포도 이에 포함되었다.

Sugihara의 연구결과는 지방조직과 성숙 지방세포를 공간적으로 지지하고 부착할 수 있는 기질만 제공한다면 지방조직과 성숙 지방세포를 콜라지네이즈(collagenase) 처리 없이 ASCs를 분리, 증폭 배양할 수 있다는 사실을 반영하고 있으며,

MSCs 혹은 ASCs를 체내에 전달하는 과정과 방법은 통상적인 배양을 통하여 목적하는 세포수 만큼 체외 증식한 다음 단백질 분해 효소를 처리하여 배양용기에서부터 분리하여 단일세포성 현탁액(monocellular suspension)을 제조하며, 단일세포 현탁액 형태로 가공된 줄기세포는 환부에 직접 주입하거나 하이드로젤(hydrogel), 생체에 적합한 3차원 구조의 담체 (scaffold), implant와 같이 체내에 전달하며, 동물 세포를 3차원 구조의 담체에 파종하여 일정기간 배양하여 제조한 세포성 인공조직, 대표적으로 세포성 인공피부 형태로 제조하여 전달하기도 한다.

젤(gel) 내로 성장한 세포를 콜라지네이즈(collagenase)와 트립신(trypsin)으로 처리하여 분리한 후, 2차원 환경에서 배양하여 분리된 세포의 특성을 생화학적, 분자생물학적, 면역학적, 그리고 동물실험을 통하여 분석하였을 때 분화능력, 성장능력 그리고 세포학적 특성이 ASCs 정의에 부합하는 결과를 확인 하였으며, 지방조직을 3차원 배양(3-D organotypic culture)을 통하는 방법은 소량의 조직, 냉장 및 냉동된 조직에도 적용할 수 있고, 간단한 과정과 신속성 등의 장점이 있으며, 무엇보다 1cc 지방으로부터 2주 내에 500만개의 ASCs를 배양할 수 있는 높은 효율성을 가지는 특성을 가지고 있으며, 또한 불필요한 과정을 생략할 수 있음으로 체외배양 중에 발생할 수 있는 위험성을 최소화하므로 경제성을 높일 수 있다.

또한, 원하는 세포 수만큼 확대 증폭한 후 배양한 세포를 체내로 전달하기 위하여 배양용기에서부터 세포를 분리하는 과정이 필요하며, 이런 분리과정에서 트립신(trypsin)과 같은 단백질 분해효소를 이용한다. 돼지췌장에서 추출한 트립신(trypsin)을 가장 많이 사용하며, 트립신(trypsin)은 세포와 세포간의 접합과 세포와 배양용기 사이의 접합에 관계하는 integrin과 같은 접합인자를 분해함으로써 세포를 배양용기에서 분리하고 단일세포성 현탁액을 제조한다.

트립신(trypsin) 분해 과정 중에 세포 간 그리고 세포와 배양용기 사이에 관여하는 단백질뿐만 아니라 세포막과 세포질을 구성하는 단백질에도 손상을 받는다. 즉 과도한 트립신(trypsin) 처리의 결과로 비가역적 세포손상을 초래하여 세포가 죽음에 이르는 결과를 낳는 것이다. 또한, 트립신(trypsin) 처리 후 원심분리 과정을 통하여 손상 받지 않은 세포를 다시 분리하여, 이렇게 분리한 세포를 배양용기에 다시 파종하였을 때 배양용기에 부착할 수 있는 세포 수 즉, 세포접착률(cell attachment rate)은 다양한 편차를 보인다. 이는 트립신(trypsin)에 대한 세포의 민감성과 세포의 분화 정도 등 세포특성에 따라 많은 차이를 초래하고, 사용한 트립신(trypsin)의 농도, 반응시간 및 반응온도에 따라 동일한 기원, 세포주라도 많은 차이를 나타내며, 또한 트립신(trypsin)처리 후 단일세포성 현탁액은 냉장상태에서 보관하고 운반하며, 이 과정 중에도 세포 손상은 지속되며 그 손상 정도도 증가된다.

세포치료제로서 배양된 ASCs의 전달방법

기존의 모든 방법은 MSCs와 ASCs을 포함한 모든 종류의 세포치료제를 2차원 배양환경에서 치료수준의 수까지 증폭한 후 트립신(trypsin)을 처리하여 단일세포 현탁액을 얻는다. 이후 줄기세포를 부유 상태에서 바로 전달하거나 하이드로젤(hydrogel)혹은 3차원 기질등의 운반체를 통하여 손상부위에 전달한다.

트립신(trypsin) 처리과정은 일정부분 줄기세포에 손상을 줄 수밖에 없고, 손상정도의 차이에 따라 전달 후 세포의 생존율, 성장, 분화 그리고 손상된 조직의 재건의 정도는 차이가 날 수 있다. 또한 줄기세포의 이식 시 필요한 운반체의 종류와 특성에 따라 이식결과 즉 조직재생과 생착률에 많은 영향을 미치게 되며, 통상 전달한 세포 중 약 10%만이 생존하여 전달한 부위에서 특성 조직을 형성하는 것으로 알려져 있다.

단일세포성 현탁액을 만들기 위한 효소 처리과정에서 주위조직과 그리고 세포간 부착할 수 있는 세포간 접합인자의 손상이 동반되어 있으며, 세포전달의 성공률을 높이기 위해서는 세포간 접합인자의 손상이 없이 세포를 전달할 수 있는 방법이 필요하다.

건강상 혹은 미용 상의 문제 때문에 자기 신체에서 지방을 흡입하여 과다한 체지방 을 제거하거나 혹은 제거된 흡입지방을 미용성형 목적으로 다시 주입하는 시술이 이용되어지고 있으나, 흡입된 지방조직을 다시 자기 신체에 다시 주입하여 전달하는 경우에는 흡입된 지방조직의 손상정도, 크기에 따라 전달 성공률이 영향을 받게 된다.

전달한 흡입 지방조직이 완전히 생착되기 위해서는 주위조직에 존재하는 혈관과 전달한 지방조직 내에 있는 혈관과의 융합이 필요하며, 특히 지방조직은 대사과정이 활발하고 산소의존성이 높은 조직으로, 주위조직과의 혈관 연결이 없으면 전달된 지방조직은 저산소증으로 인한 허혈성 괴사에 빠져 전달편이 모두 소실되어 버리고 염증을 유발한다. 즉 주위조직과 주입한 조직에서 양방향으로 혈관이 생성되고 서로 연결되어야만 전달된 조직이 안정적으로 생존과 그 조직기능을 유지할 수 있다.

지방조직 주입(전달)술의 성공률을 높이기 위하여 지방 흡입 시 조직 손상을 최소화 하며 지방을 흡입하기 위한 여러 가지 방법과 기구들이 개발되고 있다. 그러나 지방조직을 채취 후 전달하기 전에 전달 성공률을 높이기 위한 전달방법, 전달 형태, 전달 전의 체외조작과 같은 기술과 방법은 부족한 실정이다.

체외에서 배양한 ASCs를 지방조직과 혼합하여 동시에 전달한 경우 전달 성공률이 높아진다는 연구결과가 보고 되었다. 이러한 연구결과는 세포단위의 치료제 형태가 조직단위의 단점인 조직으로부터의 세포이동성을 보완하여 전달한 조직과 주위조직과의 융합을 촉진할 수 있는 가교역할을 담당하는 가능성과 또한 ASCs의 VEGF 분비에 따른 혈관생성 촉진에 의한 가능성을 고려할 수 있다.

본 발명은 지방조직을 콜라지네이즈(collagenase)와 같은 효소처리 없이 체외에서 하이드로젤(hydrogel)을 이용하여 3차원 배양한 후 지방세포에서부터 이동, 성장하여 증폭 배양된 ASCs를 포함한 지방조직 기원의 세포들과, 이러한 세포에서 생성하여 분비한 혈관성장인자를 포함한 성장인자 및 세포외기질, 지방조직 그리고 하이드로젤(hydrogel)로 구성된 치료제를 이차적인 효소처리 없이 손상된 부위에 직 접 전달하거나 주입하는 것이다.

배양 증폭된 ASCs에서 기질분해효소(Matrix Metalloproteinase, MMPs)가 분비된다. 따라서 MMPs에 의하여 분해되는 하이드로젤(hydrogel)을 사용한 경우는 하이드로젤(hydrogel)을 구성하는 생체재료의 종류 및 사용 농도, 배양기간 및 증폭 배양하는 세포의 밀도 등을 조절함으로써 전달방법에 맞도록 지방조직 치료제를 막과 같은 전달편 구조나 주사기로 흡입하여 손상된 조직 부위에 주입할 수 있는 젤(gel)의 형태로 제조할 수 있다.

이러한 지방조직 치료제의 조성과 전달방법은 지방조직과 지방조직으로부터 증폭 배양한 세포를 체내에 전달하기 위하여 필요한 모든 2차적 과정을 생략할 수 있다. 즉 신속함과 불필요한 과정을 제거함으로 얻어지는 안전성, 그리고 경제성을 가질 수 있다.

본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위해서 발명한 것으로, 생물체의 지방조직을 체내에 전달하였을 때 전달 성공률을 높이고 손상된 조직의 혈관생성을 증가시키며 조직의 재생을 촉진할 수 있는 지방조직 치료제에 관한 것으로 지방조직 치료제의 조성, 제조 방법과 공정, 그리고 전달방법을 개발함으로서 본 발명이 완성된다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지방조직을 콜라지네이즈(collagenase)와 같은 효소처리 없이 체외에서 하이드로젤(hydrogel)을 이용하여 3차원 배양한 후 지방세포에서부터 이동, 성장하여 증폭 배양된 ASCs를 포함한 지방조직 기원의 세포들과, 이러한 세포에서 생성하여 분비한 혈관성장인자를 포함한 성장인자 및 세포외기질, 지방조직 그리고 지방조직의 배양을 위하여 사용하는 하이드로젤(hydrogel)은 생체에 무해하며 세포의 이동, 성장과 분화를 지지할 수 있 는 생체에 적합한 재질은 모두 사용할 수 있는 하이드로젤(hydrogel)로 구성되어지는 특성을 지니고 있는 지방조직 치료제의 조성, 이들 제조방법 및 그의 전달 방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 지방조직에서 콜라지네이즈(collagenase) 처리 없이 지방조직으로부터 ASCs를 분리 배양하고, 이 방법으로 배양 증폭된 ASCs로부터 세포외기질, 혈관성장인자를 포함한 기타 성장인자, 그리고 하이드로젤로 구성된 지방조직 치료제의 제조방법과 그 전달방법을 제시하고자 한다. 또한 지방조직의 3차원 배양으로 증폭 분리한 ASCs의 재생력, 노화정도, 분화능을 기존 콜라지네이즈(collagenase)방법으로 분리한 ASCs와 비교하여 그 유효성을 입증하여, 지방치료제를 구성하는 ASCs의 생물학적 유효성을 제시하고자 한다.

보다 상세히 설명하면,

1. 효소의 처리과정 없이 지방조직의 3차원 배양방법 :

콜라지네이즈(collagenase) 처리 없이 지방조직을 생체적합성 하이드로젤(hydrogel) 내에 함입시켜 배양하는 3차원 조직배양법을 통하여 ASCs를 분리 배양하는 방법을 이용한 것으로, 3차원 방법으로 분리한 ASCs를 기존 효소처리 방법으로 분리한 ASCs와 분자생물학적, 세포학적 특성들과 조직 재생능력을 비교하고자 한다.

2. 지방조직의 형태와 근원 :

기존 방법은 신선한 지방조직을 이용하여 ASCs를 분리하나, 본 발명에서는 신선(fresh), 냉장보존(cold preserved), 동결보존(cryopreserved)한 지방조직에서 ASCs를 각각 분리, 배양하여, 연령, 성별, 그리고 호르몬 상태 (폐경기 등)에 따라 ASCs를 분리하고자 한다. 즉 생명체의 상태와 조직의 종류에 관계없이 지방조직 치료제의 재료로 사용될 수 있음을 규명하고자 한다.

비효소적 3차원 배양법은 극히 소량의 조직으로도 ASCs를 분리 배양할 수 있고, 수기가 아주 간단하고 단순하기 때문에 재료의 제한점이 없이 균일한 지방조직 치료제를 제조할 수 있는 장점이 있으며, 이러한 방법을 이용하여 조직의 특성에 따른 ASCs의 분포와 수에 대한 기초적인 치료제의 특성을 제시하고자 한다.

3. 3차원 배양법을 통하여 분리한 세포의 지방조직으로의 재생능 :

분리 배양한 ASCs의 조직 재생능을 판정하기 위하여 2차원 배양을 통하여 특정 분화조건에서 특정 세포 혹은 조직으로의 분화를 유도한다.

통상적인 이런 방법은 세포의 분리, 증폭, 다시 분리하여 배양하는 번거로운 과정과 시간이 요구된다. 본 발명에서는 지방조직으로부터 3차원 배양을 통하여 ASCs를 분리, 배양한 후 일정한 세포밀도에 도달되면 3차원 상태에서 바로 특정 분화조건 (주로 분화 유도 인자를 배지에 첨가) 에 노출시킴으로써 분화능을 판정하는 시스 템을 개발하한 것으로, 기존의 2차원 방법으로 분화능을 조사하여 본 연구의 3차원 모델의 유용성을 검증하여 조직치료제의 재생능을 판정하고자 한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 설명한다.

[1] 지방조직

본 발명에서 지방조직은 동물성 조직을 말하며, 지방조직은 신선한 조직뿐만 아니라, 이송 및 처리 과정에 조직손상을 최소화하기 위하여 단기간 동안 냉장보관, 빙점 이하, 더 구체적으로 영하 80℃ 이하에서 반영구적으로 동결 보관된 조직을 모두 포함하며, 지방조직이란 성숙한 지방세포와 이를 둘러싸는 결체조직으로 구성된 것을 말하며, 지방조직은 체내 위치에 상관없이 모두 포함하며, 피부하지방(subcutaneous fat), 위장간에 위치하는 지방조직(omentum, mesentery), 골수지방조직(bone marrow fat tissue), 후복강 지방조직(retroperitoneal fat)등 모두를 포함한다.

또한, 본 발명에 사용한 지방조직은 지방을 채취할 때 사용되는 모든 방법들에 의하여 얻어지는 모든 지방조직을 포함하는 것으로, 흡입된 지방, 부분적 절개된 지방, 위장간 지방조직처럼 부분 혹은 완전 절제된 지방조직을 모두 포함된다.

절재 혹은 흡입한 지방조직은 직경이 0.1~ 5 mm 크기로 잘게 썰어 사용하며, 섬유막, 혈관, 응고된 혈액, 괴사된 조직 등 비지방성 조직은 제거한다.

생리적 용액을 이용하여 지방조직을 반복 세척하고 세척과정에서 생리적 용액 밑으로 침전되는 모든 조직은 반복하여 제거한다. 생리적 용액이 깨끗하고 투명해 질 때까지 세척을 반복한다. 생리적 용액이 깨끗해지면 상층에 뜨는 지방조직만을 수거하여 무균 용기에 옮긴다.

사용한 생리적 용액은 생리적 식염수, PBS (phosphate buffered saline), 혈청을 포함하지 않는 것으로, 예를 들어 DMEM, RPMI, DMEM:F12, F12과 같은 동물세포를 배양할 때 사용할 수 있는 배양액을 사용할 수 있다. 세척 및 하이드로젤(hydrogel)제조과정에서 지방조직의 보존을 위하여 플락토스, 글루코스, 콘드로이틴, 폴리페놀(fructose, glucose, chondroitin, polyphenol) 등 조직 보존제 및 항생제를 포함하여 사용할 수 있다.

[2] 하이드로젤(hydrogel)의 제조과정

본 발명에 사용한 하이드로젤(hydrogel)은 85% 이상 수분과 0.01 ~ 15 중량%의 젤을 형성할 수 있는 생체에 적합한 고분자로 구성되며, 이러한 고분자는 천연 고분자인 콜라겐 (collagen), 젤라틴 (gelatin), 콘드로이틴 (chondroitin), 하알루로닉산 (hyaluronic acid, hyaluronan), 알지닌산 (alginic acid), 메트리젤 (MatrigelTM), 키토산 (chitosan), 피브린 (fibrin)등을 포함하는 생체 고분자들 뿐만 아니라, 합성 고분자로 구성된 하이드로젤(hydrogel)은 PGA (polyglycolic acid), PLA (polylactic acid), PEG (poly ethyleneglycol), 폴리아크릴아마이드 (polyacrylamide) 등이 있으며, 또한, 하이드로젤 (hydrogel)은 VEGF (vascular endothelial growth factor), bFGF (basic fibroblastic growth factor), EGF (epithelial growth factor), IGF (insulin-like growth factor), PDGF(platelet-derived growth factor), TGF(transforming growth factor)등 성장촉진인자, 호르몬, 항생제를 포함하여 제조하여 사용할 수도 있다.

이상과 같은 이러한 모든 천연, 합성, 혹은 혼합 고분자로 구성된 하이드로젤(hydrogel)은 천연 혹은 합성 고분자 단독 혹은 혼합하여 사용할 수도 있으며, 조직에 독성이 없어야 되며 조직에서 세포의 이동과 성장, 분화를 지지할 수 있어야 된다.

본 발명에서는 다음과 같은 대표적인 고분자를 이용하여 하이드로젤을 제조하여 3 차원 배양에 사용하는 것을 예시한다.

- 콜라겐

콜라겐 젤은 인체기원, 동물 기원성 콜라겐을 모두 포함하는 것으로, 콜라겐은 0.1 ~ 3 중량%로 사용한다. 젤을 형성하기 위하여 화학적 가교제(cross-linker)를 사용하거나 온도 및 pH를 중성으로 조합하여 젤을 제조할 수 있다.

- 피브린

피브린은 동물 혹은 인간 기원의 피브리노젠 (fibrinogen)과 트롬빈을 사용하여 제조한다. 피브리노겐은 0.01 ~ 10 중량%에서 사용될 수 있으나, 세포의 이동과 성장에 적합한 0.1 ~ 1 중량% 사이가 가장 적합하다. 트롬빈은 ml당 0.01 ~100 unit을 사용할 수 있으나, 안전적이고 균일한 하이드로젤(hydrogel)을 만들기 위하여 ml당 0.1 ~ 10 unit가 적당하며. 또한 트롬빈과 더불어 혈액응고인자인 Factor XIII을 첨가하여 사용할 수 있다.

[3] 지방조직의 배양방법

1) 지방조직의 분산 및 혼합 과정

상기 지방조직에서와 같이, 지방조직을 직경이 0.1~ 5 mm 크기로 잘게 썰어 사용하며, 섬유막, 혈관, 응고된 혈액, 괴사된 조직 등 비지방성 조직은 생리적 용액으로 세척하여 제거한다.

생리적 용액을 이용하여 지방조직을 반복 세척하고 세척과정에서 생리적 용액 밑으로 침전되는 모든 조직은 반복하여 제거한다. 생리적 용액이 깨끗하고 투명해 질 때까지 세척을 반복한다. 생리적 용액이 깨끗해지면 상층에 뜨는 지방조직만을 수거하여 무균 용기에 옮긴다.

잘게 썬 지방조직을 일정한 부피로 생리적 용액과 혼합하여 지방조직이 골고루 분산되도록 하고, 하이드로젤(hydrogel)을 형성하는 가교제는 지방조직이 분산된 용 액 혹은 하이드로젤(hydrogel)을 형성할 수 있는 천연 혹은 고분자 용액에 첨가한다. 지방조직, 고분자, 가교제를 한 용기에 같이 담아 골고루 혼합한다.

혼합의 정도는 저온에서 시행하거나 혹은 가교제 농도를 조정해서 젤의 형성속도를 조정한다.

2) 지방조직 치료제의 구성물

상기의 혼합된 고분자, 가교제, 지방조직을 배양용기에다 옮긴다.

하이드로젤(hydrogel) 내로 지방조직이 완전히 감싸도록 하이드로젤(hydrogel) 용량을 결정한다.

예를들면, 지방조직 1 gm 당 1cc에서 100 cc로 사용할 수 있으나, 통상 1gm 지방 조직 당 5 ~20 cc 용량의 하이드로젤(hydrogel)이 적합하다. 또한, 지방조직을 포함한 하이드로젤(hydrogel)의 두께는 0.1 ~ 5 cm까지 제조할 수 있으나, 0.2 ~ 0.5 cm 사이가 적합하다.

배양용기는 세포배양을 위하여 사용되는 폴리스타일렌 (polyethylene), 유리로 구 성된 용기 등 동물 세포 및 세균을 배양할 때 사용될 수 있는 모든 용기를 포함하며, 또한 특정한 모양을 만들기 위해 제작된 배양 용기도 모두 포함한다.

3) 중합과정

하이드로젤(hydrogel)에 포함된 지방조직은 실온 내지 37℃ 사이에서 완전히 중합하여 겔을 형성한다.

하이드로젤(hydrogel)을 구성하는 고분자와 가교제의 농도에 따라 중합되어 겔을 형성하는 시간이 결정되지만 1 ~2 시간 사이, 보통 10 ~30 분 사이에 중합되도록 고분자, 가교제의 농도와 반응온도 및 반응시간을 결정한다.

하이드로젤(hydrogel)을 만들기 위하여 사용하는 용액은 생리적 용액이면 모두 사용 가능하다. 생리적 용액은 생리적 식염수, PBS (phosphate buffered saline), 혈청을 포함하지 않는 예를 들면 DMEM, RPMI, DMEM:F12, F12과 같은 동물 세포를 배양할 때 사용할 수 있는 배양액을 사용할 수 있다. 그러나 이런 생리적 용액에 국 한된 것은 아니다.

4) 3차원 지방조직 배양

지방조직이 움직이지 않고 배양액을 첨가 했을 때 수면위로 뜨지 않을 정도로 하이드로젤(hydrogel)이 중합되면 세포 배양액을 첨가한다.

세포 배양액은 DMEM, RPMI, alpha-MEM, F12, F10, DMEM:F12 배지에 무혈청 혹은 1 ~30 부피% 동물성 혹은 인간 혈청을 첨가하여 사용한다. 세포 배양액에는 gentamicin, penicillin, streptomycin, ciprobay 등의 세균의 성장을 억제할 수 있는 항생제를 포함할 수 있다. 예시된 배양액의 조성에 국한된 것은 아니며, 동물 세포를 배양할 때 사용하는 모든 배양액과 혈청을 포함한 첨가물은 모두 사용될 수 있으며,

본 발명에 사용한 세포 배양액은 VEGF(vascular endothelial growth factor), bFGF (basic fibroblastic growth factor), EGF(epithelial growth factor), IGF(insulin-like growth factor), PDGF(platelet-derived growth factor), TGF(transforming growth factor)등 성장촉진인자, 호르몬, 항생제를 첨가하여 사용할 수도 있다.

하이드로젤(hydrogel)에 포함된 지방조직 내에 지방조직이 충분히 세포 배양액에 잠길 정도로 세포 배양액을 첨가한다. 배양액은 3일 간격으로 신선한 배양액으로 교체한다.

5) 배양조건

세포 배양액을 첨가한 후,

하이드로젤(hydrogel)내에 포함된 지방조직은 37℃ 인큐베이터에 넣어 배양하며, 이때 세포 배양액이 건조되지 않도록 습도의 조건을 50 ~90 부피% 정도의 습기를 제공되도록 한다. 또한, 배양 중에 pH를 유지하기 위하여서는 5 부피% 이산화탄소를 제공하여야 하며, 85 ~ 95 부피%는 실내 공기 혹은 0 ~ 10 부피% 산소를 제공한다. 세포 배양액은 통상 1 ~ 5일에 한번씩 신선한 세포 배양액으로 교체한다.

6) 지방조직 배양기간

배양기간은 3일에서 3달 동안 배양할 수 있으나, 지방조직으로부터 ASCs의 성장에 따라 결정하나. 통상 ASCs가 지방조직으로부터 성장 증식하여 하이드로젤의 10~100 면적%을 차지할 때까지 배양한다.

7) 세척과정

배양이 끝난 후 제조되는 지방조직 치료제는 하이드로젤(hydrogel)내에 포함된 세포 배양액을 생리적 용액을 이용하여 반복하여 세척한다. 특히 동물성 혈청을 사용한 경우에는 혈청에 의한 염증 및 면역 반응을 유발할 수 있으므로 이러한 혈청이 완전히 제거될 때까지 철저히 반복하여 세척한다. 그러나 생물체의 자가 혈청을 사용한 경우는 이 과정을 생략할 수 있다.

8) 지방조직 치료제

세척과정이 종료된 후,

지방조직, 지방조직에서 성장한 ASCs를 포함한 세포, 세포외기질, 성장인자, 그리고 하이드로젤(hydrogel)로 구성된 지방조직 치료제를 배양용기로부터 때어낸다.

9) 전달방법

때어 낸 지방조직 치료제는 원하는 크기대로 자르거나 혹은 주사기로 전달한다.

이러한 지방조직 치료제는 결손된 조직 예를 들면 피부결손, 피부궤양에 판 혹은 막 형태로 바로 전달에 사용할 수 있다. 또한 주사기로 흡입한 지방조직 치료제는 조직이 결손 된 부위 혹은 미용성형 목적으로 비 침습적 방법으로 주입할 수 있다.

본 발명을 요약정리하면,

콜라지네이즈(collagenase)와 같은 효소 처리 없이 3차원배양방법으로 지방조직을 생체적합성 하이드로젤(hydrogel) 내에 함입시켜 배양하는 3차원 조직배양법을 통하여 ASCs를 하이드로젤 내로 분리 증폭시키고, ASCs로부터 성장인자와 세포외기질이 생성되어 하이드로젤 내로 축적되어 지방조직 치료제의 조성과 제조방법에 관한 것이다. 또한 3차원 방법으로 분리한 ASCs를 기존 효소처리 방법으로 분리한 ASCs와 분자생물학적, 세포학적 특성들과 조직 재생능력을 비교하여, 본 발명에서 개시된 지방조직 치료제의 조성물인 ASCs의 생물학적특성과 유효성을 개시하고자 한다.

상기 결과를 도1 내지 도11에 나타내었다.

도 1은 종래의 collagenase 처리 후 2차원 배양하여 ASCs를 분리하는 방법의 모식도이며,

도 2는 잘게 썬 지방조직을 생체에 적합한 하이드로젤(hydrogel)인 피브린과 콜라겐 젤에 함입시켜 3차원 배양을 하면 지방조직에서 ASCs가 이동 성장하는 것을 나 타낸 사진이며,

도 3는 본 발명에 따른 지방조직의 3차원 배양을 통한 ASCs의 성장을 나타낸 그림으로 상세하게 설명하면, 잘게 자른 지방조직을 fibrin과 collagen gel 내에서 3차원(3-D) 배양을 하였다.

- 그림 A는 지방조직을 배양 한 후, MTT 염색을 한 사진으로 진한염색은 지방조직(★)이고

연한 눈송이 같이 염색된 부분 (arrow)이 ASCs가 성장하는 부분이며,

- 그림 B는 지방조직을 배양 한 후, 2일째부터 ASCs의 성장을 관찰한 사진이고,

- 그림 C는 지방조직을 배양 한 후, 2주일정도 배양하면 이동, 성장한 ASCs가 높은 밀도로

젤(gel)내로 꽉 차게 된 사진을 나타낸 것이다.

지방조직을 3차원배양 하는 방법은 소량의 조직, 냉장 및 냉동된 조직에도 적용할 수 있고, 간단한 과정과 신속성 등의 장점이 있으며, 무엇보다 1cc 지방으로부터 2주 내에 500만개의 ASCs를 배양할 수 있는 높은 효율성을 가진다. 또한 불필요한 과정을 생략할 수 있음으로 체외배양 중에 발생할 수 있는 위험성을 최소화하고 경제성을 높일 수 있었다.

도 4은 지방조직의 3차원 배양을 통한 ASCs의 회수 효율을 나타낸 것으로, 배양 2일째부터 세포의 성장이 관찰되며, 지방조직 1gm을 피브린(fibrin)과 콜라겐(collagen)에 함입시켜 2주간 3차원 배양한 후, trypsin과 collagenase를 처리하여 지방조직에서 이동, 성장한 ASCs 수를 산정한 것으로, 그 결과 0.3중량% fibrinogen/0.5 U/㎖ thrombin으로 제조한 피브린(fibrin)에서 배양한 조건에서 450만개의 세포를 회수할 수 있었으며, 0.3% collagen 젤에서는 370만개의 세포, collagenase로 처리한 경우는 약 2~5만개의 세포를 회수할 수 있어 3차원 배양법의 유용성을 일차적으로 검증할 수 있었다.

도 5는 지방조직의 3차원 배양으로 지방조직에서 이동 증식된 세포는 섬유모세포와 같은 긴 방추상 모양과 세포질 내 미세한 공포가 다수 함유된 사진(phase-contrast)이며,

도 6은 3차원 배양으로 분리된 세포는 Nile red O에 양성으로 지방을 함유하는 것을 확인할 수 있었으며, 즉 미분화 지방세포 (preadipocyte)의 형태학적 특성에 부합(Nile red O staining with DAPI nuclear staining) 하는 것이 확인되었다.

도 7은 지방조직의 3차원 배양을 통한 지방줄기세포의 특성 및 분화 능력을 나타낸 것으로,

이를 상세히 설명하면,

기존 collagenase 처리 후 2차원 배양하여 분리한 세포와 3차원 배양법을 이용하여 배양한 세포간의 지방조직으로의 분화능력 비교 연구한 것으로, 이들 각 방법에 따 라 분리한 세포를 지방세포로 분화를 1주간 유도하였으며, 지방세포로의 분화 특이 표적자인 GPDH 활성도 비교 (도 7))하였고, Collagenase 처리 후 분리한 세포와 비교하여 동등한 지방세포로의 분화 능력을 확인할 수 있었다.

지방세포로의 분화 특이 표적자인 GPDH 활성도 비교를 보이고 있는 것으로 3차원 방법으로 배양한 세포를 2차원 환경에서 지방으로의 분화능을 생화학적, 면역학적 방법으로 분석하였으며, 세포 내 triglyceride (TG) 생성 정도를 생화학적방법으로 측정하였다.

도 8은 지방조직의 3차원 배양을 통한 세포 내 중성지방함량, GPDH와 동일한 경향으로 TG가 합성되는 것을 확인할 수 있으며,

도 9는 지방조직의 3차원 배양을 통한 지방조직으로 분화 유도 후 세포질 내로 지방질의 침착을 나타낸 것으로, 이는 Sudan Black 염색법으로 세포 내 TG의 생성 ( 도 9)을 확인하고,

도 10은 지방조직의 3차원 배양을 통한 지방조직으로 분화 유도 후 세포질 내로 렙틴(leptin)의 발현을 나타낸 것으로, 이는 형광면역염색을 통하여 지방세포의 specific marker인 렙틴(leptin)의 분비 (도 10)를 확인하였으며, 도 9와 도 10을 통하여 지방세포로의 분화능을 검증할 수 있었다.

본 발명의 3차원 배양법을 통하여 지방조직에서 분리 배양한 세포가 ASCs임을 확인할 수 있었으며, 또한 효율적 측면에서도 collagenase 처리 후 분리하는 방법보다 콜라지네이즈(collagenase)와 같은 효소의 처리 없이 즉, 비효소적 처리로 배양한 것이 보다 우수한 것으로 사료된다.

결과적으로 본 발명의 특징을 요약정리하면,

1) 본 발명은 collagenase 처리 없이 3차원 배양법을 이용하여 다양한 종류의 지방조직으로부터 ASCs를 분리 배양하여, ASCs로서의 세포학적 특성과 분화능을 사전 실험을 통하여 검증하였다.

ASCs를 분리 배양하기 위한 3차원 방법은 세계 최초로 시도되는 방법이며, 본 발명을 통하여 기존 collagenase 방법과 비교하여 3차원 배양방법의 유효성과 효율성을 입증하는 것으로 사료된다.

2) 본 발명의 3차원 배양방법으로 분리한 ASCs의 특성을 규명함으로서 결손조직을 재건하고 퇴행성 질환 및 창상을 치료하기 위한 세포치료제를 만들기 위한 주요한 방법을 제시할 수 있다.

3) 본 발명의 3차원 배양방법은 국내외 연구자에게 보다 단순하고 명확한 배양 및 분화연구를 위한 모델로 제공될 수 있다.

이상에서와 같이 본 발명은 비록 상기의 실시예에 한하여 설명하였지만 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다.

이상으로 살펴본 바와 같이, 본 발명은 지방조직을 콜라지네이즈(collagenase)와 같은 효소처리 없이 체외에서 하이드로젤(hydrogel)을 이용하여 3차원 배양한 후 지방세포에서부터 이동, 성장하여 증폭 배양된 ASCs를 포함한 지방조직 기원의 세포들과, 이러한 세포에서 생성하여 분비한 혈관성장인자를 포함한 성장인자 및 세포외기질, 지방조직 그리고 하이드로젤(hydrogel)로 구성된 치료제를 이차적인 효소처리 없이 손상된 부위에 직접 전달하거나 주입하는 것으로, ASCs의 경우 MSCs와 적용분야가 동일하며 더불어 상처치유효과가 높고 미용성형용도로 적용할 수 있다.

특히 ASCs는 신생혈관 생성능력이 타 줄기세포 및 성체세포보다 탁월한 것으 로 밝혀졌다. 즉 ASCs는 세포치료제로서 그 가능성은 아주 높다고 판단되며, ASCs를 효율적 그리고 안정적으로 분리 배양할 수 있는 방법의 개발과 이 방법의 유효성을 검증하는 연구는 의학적, 그리고 경제적 파장효과는 아주 높다고 사료되며, 향후 세포치료제의 가치가 높아지고, 그 중요성은 점차 부각될 것으로 확신한다. 즉 제품의 용이성, 경제성, 유효성을 갖춘다면 짧은 기간 내에 자가 세포치료제의 성공 가능성은 아주 높다고 판단되며, 효과 또한 높을 것이다.

Claims (24)

1. 지방조직, 지방조직에서 이동하여 성장한 세포, 하이드로겔(hydrogel)로 구성되어짐을 특징으로 하는 지방조직 치료제
2. 제 1항에 있어서, 지방조직은 지방조직이 존재하는 위치와 관계없는 동물체의 지방조직으로, 피하지방조직, 장간막 지방조직, 위장 지방조직, 후복막 지방조직, 골수지방조직 들을 포함하는 것을 특징으로 하는 지방조직 치료제
3. 제 1항에 있어서, 지방조직은 콜라지네이즈(collagenase)와 같은 효소의 처리 없이, 0.1~10mm 크기로 절편한 지방조직임을 특징으로 하는 지방조직 치료제
4. 제 1항에 있어서, 하이드로젤(hydrogel)은 하이드로젤(hydrogel)을 제조할 수 있는 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 콘드로이틴 (chondroitin), 하알루로 닉산(hyaluronic acid, hyaluronan), 알지닌 (alginic acid), 메트리젤 (MatrigelTM), 키토산(chitosan), 피브린(fibrin) 등의 천연 재질과, PGA(polyglycolic acid), PLA(polylactic acid), PEG(polyethylene glycol), polyacrylamide 등의 합성 재질로 만들어진 천연 혹은 합성 재질로 구성되어 선택되어짐을 특징으로 하는 지방조직 치료제.
5. 제4항에 있어서, 하이드로젤(hydrogel)의 재질은 천연 재질 또는 합성 재질로, 이들 재질의 단독 혹은 공중합된 형태의 하이드로젤(hydrogel)을 선택적으로 이용하며, 이런 재질은 하이드로젤(hydrogel) 내에 0.1 ~ 15 중량%로 사용할 수 있음을 특징으로 하는 지방조직 치료제.
6. 제 1항에 있어서, 지방조직에서 이동, 성장한 세포는 지방줄기세포, 혈관내피세포, 혈관내피전구세포, 섬유모세포, 지방세포들 중에 선택적으로 사용할 수 있음을 특징으로 하는 지방조직 치료제.
7. 제 1항에 있어서, 지방조직에서 이동, 성장한 세포는 특정 세포로 분화 유도한 세포를 사용할 수 있음을 특징으로 하는 지방조직 치료제.
8. 제 7항에 있어서, 특정 세포는 골세포, 연골세포, 혈관세포, 심장세포, 신경세포, 혈관세포 들을 선택적으로 사용할 수 있음을 특징으로 하는 지방조직 치료제.
9. 제 1항에 있어서, 지방조직으로부터 이동, 성장한 세포는 하이드로젤(hydrogel)의 10 ~100 부피%까지 차지한 것을 특징으로 하는 지방조직 치료제.
10. 제 9항에 있어서, 하이드로젤(hydrogel)의 배양구성 총부피에서, 10 ~ 95% 부피란 2차원 및 3차원 면적과 부피가 포함되어짐을 특징으로 하는 지방조직 치료제.
11. 제 1항에서 지방조직, 지방조직에서 이동하여 성장한 세포, 하이드로젤(hydrogel)로 구성되어진 지방조직 치료제를 제조하는 과정에 있어서,

    지방조직을 직경이 0.1~ 5 mm 크기로 잘게 썰어 사용하며, 섬유막, 혈관, 응고된 혈액, 괴사된 조직 등 비지방성 조직은 생리적 용액으로 세척하여 제거하는 과정과,

    세척후, 생리적 용액의 상층액에 뜨는 지방조직만을 수거하여, 생리적 용액과 혼합하여 지방조직이 골고루 분산되도록 하는 분산과정과,

    하이드로젤(hydrogel)을 형성하는 가교제는 지방조직이 분산된 용액 혹은 하이드로젤(hydrogel)을 형성할 수 있는 천연 혹은 고분자 용액에 첨가하며, 지방조직, 고분자, 가교제를 한 용기에 같이 담아 골고루 혼합하는 과정과,

    상기의 혼합된 고분자, 가교제, 지방조직을 배양용기에 옮겨, 하이드로젤(hydrogel) 내로 지방조직이 완전히 감싸도록 배양하는 배양과정과.

    하이드로젤(hydrogel)에 포함된 지방조직은 실온에서 완전히 중합하여 젤을 형성하 는 중합과정과

    배양액을 첨가 했을 때, 지방조직이 움직이지 않고 수면위로 뜨지 않을 정도로 하이드로젤(hydrogel)이 중합되면 하이드로젤(hydrogel)에 포함된 지방조직 내에 지방조직이 충분히 세포 배양액에 잠길 정도로 세포 배양액을 첨가하는 세포배양액 첨가과정과.

    세포가 지방조직으로부터 이동하여 성장하기 시작하면 전체 하이드로젤(hydrogel)이 차지하는 면적이 10 ~ 100 면적%로 세포가 성장할 때까지 배양하는 세포배양의 성장과정과,

    배양이 끝난 후, 하이드로젤(hydrogel)내에 포함된 세포 배양액을 생리적 용액을 이용하여 반복하여 세척하는 세척과정과,

    세척과정이 종료된 후, 지방조직에서 성장한 지방줄기세포(adipose-derived stem cells, ASCs)를 포함한 세포, 그리고 하이드로젤(hydrogel)로 구성된 지방조직 치료제를 배양용기로부터 때어내어 사용 목적에 따라 일정한 크기로 사용되어지는 것을 특징으로 하는 지방조직 치료제의 제조방법.
12. 제 11항에 있어서, 하이드로젤(hydrogel)을 형성하는 가교제는 지방조직 1 gm당 5 ~20 cc 용량의 하이드로젤(hydrogel)이 적합하며, 지방조직을 포함한 하이드로젤(hydrogel)의 두께는 0.1 ~ 5 cm까지 제조할 수 있는 것을 특징으로 하는 지방조직 치료제의 제조방법.
13. 제 11항에 있어서, 하이드로젤(hydrogel)에 포함된 지방조직은 실온에서 완전히 중합하여 젤을 형성하는 중합시간은 10 ~240 분 사이에 중합되도록 고분자, 가교제의 농도와 반응온도 및 반응시간을 결정하는 것을 특징으로 하는 지방조직 치료제의 제조방법.
14. 제 11항에 있어서, 하이드로젤(hydrogel)이 중합되면 세포 배양액을 첨가하는데 사용되는 세포배양액은 VEGF(vascular endothelial growth factor), bFGF(basic fibroblastic growth factor), EGF(epithelial growth factor), IGF(insulin-like growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor), TGF(transforming growth factor)등 성장촉진인자, 호르몬, 항생제를 첨가하여 사용하는 것을 특징으로 하는 지방조직 치료제의 제조방법.
15. 제 11항에 있어서, 세포 배양액을 첨가한 후, 하이드로젤(hydrogel)내에 포함된 지방조직은 37℃ 인큐베이터에 넣어 배양하며, 세포 배양액이 건조되지 않도록 습도의 조건을 50 ~90 부피% 정도로 제공하며, 배양 중에 pH를 유지하기 위해 5 부피% 이산화탄소를 제공하여야 하며, 85 ~ 95 부피%는 실내 공기 혹은 0.1 ~ 10 부피% 산소를 제공하며, 세포 배양액은 통상 1 ~ 5일에 한번씩 신선한 세포 배양액으로 교체함을 특징으로 하는 지방조직 치료제의 제조방법.
16. 지방조직 치료제는 체외에서 배양 후, 효소를 처리하지 않고 지방조직 치료제를 배양용기에서 바로 물리적으로 때어 내어 사용 목적물에 지방조직 치료제의 전달 방법.
17. 제16항에 있어서, 지방조직 치료제는 배양 후, 효소를 처리하지 않고 지방조직 치료제를 주사기로 흡입하여 사용 목적물에 지방조직 치료제의 전달 방법.
18. 제16항에 있어서, 지방조직 치료제는 배양한 후, 지방조직을 물리적으로 제거한 후 하이드로젤(hydrogel)과 지방조직에서 이동, 분리, 성장한 세포를 사용 목적물에 지방조직 치료제의 전달 방법.
19. 제16항에 있어서, 지방조직 치료제는 제조 후, 지방조직을 물리적으로 제거한 후 하이드로젤(hydrogel)과 지방조직에서 이동, 분리, 성장한 세포를 주사기로 흡입하여 사용 목적물에 지방조직 치료제의 전달 방법.
20. 제 16, 17, 18, 19항에 있어서, 지방조직 치료제는 당뇨병성, 욕창, 정맥류성 등 만성피부궤양환자에게 전달 또는 주입하는 지방조직 치료제의 전달 방법
21. 제16, 17, 18, 19항에 있어서, 지방조직 치료제는 심근경색, 심부전 질환자에게 전달 또는 주입하는 지방조직 치료제의 전달 방법
22. 제16, 17, 18, 19항에 있어서, 지방조직 치료제는 혈관성 뇌질환자에게 전달 또는 주입하는 지방조직 치료제의 전달 방법
23. 제16, 17, 18, 19항에 있어서 지방조직 치료제는 골절 및 골결손, 대사성, 선천성 골질환자에게 전달 또는 주입하는 지방조직 치료제의 전달방법
24. 제16, 17, 18, 19항에 있어서, 지방조직 치료제는 미용성형을 위한 자에게 전달 혹은 주입하는 지방조직 치료제의 전달 방법

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