CN116942904A - 一种适用于软骨的温敏可注射性组织工程支架及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适用于软骨再生或修复的温敏可注射性组织工程支架及制备方法，所述支架材料是由丝胶蛋白、胶原蛋白、壳聚糖、β‑甘油磷酸钠、碳酸氢钠复合交联而成，其以壳聚糖/β‑甘油磷酸钠温敏性体系为基底，加入蚕丝胶蛋白质和胶原蛋白，再以碳酸氢钠为体系交联剂，形成体外小于30℃环境下呈流动性溶胶状态，体温37℃左右时转换为凝胶，转换过程中体系内的碳酸氢钠起到了进一步交联和增强力学性能的作用，使支架达成具有近似人体软骨的力学性能和适宜细胞生长的孔隙。本发明所制备的天然高分子材料支架，结构稳定，具有近似人体软骨的力学性能和适宜细胞生长的孔隙，能够模拟三维细胞生长微环境维持细胞表型，有助于细胞外基质成分的积累；该支架具有低免疫原性和良好的细胞相容性，可促进细胞的黏附及增殖，加快软骨组织再生进程。本发明制备工艺简单，易于操作和控制，在软骨缺损再生修复方面具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程支架技术研究领域，特别的涉及一种用于软骨缺损修复的高分子材料支架。
背景技术
随着老龄化社会的到来，创伤、损伤或病理(如骨关节炎)等引起的软骨损伤现象愈发普遍，严重影响患者的日常生活活动。关节软骨与其他组织相比，需要承受更高强度的作用力，因此更容易发生软骨损伤。且由于血管、神经和淋巴管缺乏，关节软骨组织在受伤后难以进行自我修复。多年来人们一直努力致力于修复或重建受损后的软骨组织的研究,主流治疗方法如关节镜技术、软骨移植术、软骨细胞移植术和组织工程技术都有不同程度的缺陷和不足。因此，利用具有募集诱导修复能力的组织工程支架技术备受期待。
研究表明，部分高分子材料可激发细胞生长和分化以及组织形态发生协调的过程，刺激组织再生。其主要是通过与体内环境的相互作用，通过调节炎症反应和新组织生成阶段的免疫细胞、内源性祖细胞及间充质干细胞募集，来改变局部组织微环境，对细胞迁移、分化和组织重塑起诱导和支持作用。因此，选择合适的支架材料和制备工艺，可以对关节软骨损伤原位诱导再生起到积极作用。这其中，高分子水凝胶材料最为引人注目。高分子水凝胶的特点是含水量高、柔软、具有橡胶般的粘稠性和良好的生物相容性等。人体活体组织一般由细胞和细胞外基质组成,从材料学观点看,水凝胶更接近活体组织,在性质上相当于细胞外基质部分,材料吸水后,可减少材料对周围组织的摩擦和机械作用,对细胞友好。
可注射水凝胶是在体内原位形成,可避免外科手术中的高度创伤性,加速愈合、减少病人痛苦、降低费用。特别是当用于修复复杂形状的软骨组织时,可注射水凝胶具有自适应性,可体温固化,这是一般水凝胶不可比拟的。目前有很多方法用于制备可注射水凝胶,如光聚合、交联剂交联高分子等。然而光聚合需要光敏剂,延长凝胶化时间；化学交联的交联剂,具有一定的细胞毒性。温敏性水凝胶以体温温度为溶胶-凝胶转换条件，无外部条件和交联剂的毒性问题，是可注射性原位诱导修复水凝胶支架的最优材料之一。
壳聚糖是自然界唯一大量存在的碱性多糖,来源广泛,具有很好的生物相容性,但单一的壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏凝胶体系强度较低且降解较快。丝胶蛋白是蚕茧中的一种天然球状蛋白质，有研究发现其具有对软骨组织非常有价值的生物活性，包括生物降解性、生物相容性和细胞粘附性；丝胶蛋白本身还可以作为营养源，促进某些类型细胞的存活和增殖。有研究还发现丝胶蛋白蛋白具有抑菌性，同时还可以通过阻碍炎性因子释放使其表现出低免疫原性。但也有研究发现，在壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏性体系中加入丝胶蛋白蛋白会导致成胶速度和力学性能降低，力学性能低会无法支撑软骨正常生长，成胶速度慢则会造成手术不可控。胶原蛋白胶原蛋白是生物高分子，动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％～30％，某些生物体甚至高达80％以上，有相关研究表明，胶原蛋白能够促进软骨修复的作用。但丝胶蛋白和胶原蛋白加入壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏性体系会使成胶速度减慢，且力学性能下降。软骨因其特殊的功能位置，需要一定的力学支撑，如发明专利ZL201110377452.8提供了一种温敏性溶胶凝胶转化材料的制备方法，其制备的温敏性凝胶力学性能很差，与人体关节软骨的力学性能差异过大。有研究发现提高β-甘油磷酸钠温敏性浓度可以弥补成胶速度慢的缺点，但低浓度的β-甘油磷酸钠温敏性对干细胞成骨有催化作用，高浓度的β-甘油磷酸钠温敏性却存在细胞毒性。因此，如何在增强凝胶力学性能的同时，减轻β-甘油磷酸钠温敏性用量的方面是现有的难点之一。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种用于软骨缺损再生或修复的温敏可注射性组织工程支架，解决自体软骨移植来源匮乏，供体损伤，缺损部位营养供给不足，手术造成的二次损伤等问题。即以壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏性体系、丝胶蛋白和胶原蛋白为主要原材料，将无细胞毒性的碳酸氢钠作为交联剂引入体系，通过碳酸氢钠调低β-甘油磷酸钠温敏性用量，又因双交联而增强了力学性能。研究结果表明，丝胶蛋白、胶原蛋白和碳酸氢钠加入壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏性体系后，明显提升了力学性能，增强了凝胶的稳定性，为软骨组织工程支架提供了新的思路。本发明制备的组织工程支架，具有良好的生物相容性，低免疫原性和能与软骨修复匹配的良好的力学性能，其力学性能近似人体软骨的力学性能。
为了解决上述问题，本发明采用了如下技术方案：
(同权利要求，暂时省略)
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明制备的一种适用于软骨的组织工程支架综合了丝胶蛋白、胶原蛋白两者的优点，其中丝胶蛋白是蚕茧中的一种天然蛋白，有利于细胞黏附，并对软骨细胞增殖有促进作用，因此更有利于软骨组织再生，同时丝胶蛋白具有低免疫原性和抗氧化活性，能够促进软骨组织再生和功能恢复的作用；胶原蛋白是胶原蛋白是生物高分子，动物结缔组织中的主要成分，骨骼有机物中有70％～86％是胶原蛋白。胶原蛋白的添加有利于软骨细胞的增殖，从而起到促进软骨再生的效果,且胶原蛋白紧密的螺旋结构，能够在一定条件下，延长凝胶的降解速率，有助于同步软骨再生速率。丝胶蛋白和胶原蛋白的添加有利于结构的稳定，能够模拟三维细胞生长微环境维持细胞表型，有助于细胞外基质成分的积累；该支架具有低免疫原性和良好的细胞相容性，可促进细胞的黏附及增殖，加快软骨组织工程再生进程。
2.本方法制备的支架材料，可在低于30℃的室温下保持溶胶状态，在37℃左右的体温条件下，可快速(2-10分钟)成胶，并在后续时间内不断增强力学性能，直至达到近似人体软骨的力学性能，适合注射使用。
3.本发明以丝胶蛋白和胶原蛋白为主要材料，通过静电作用融入壳聚糖温敏凝胶体系，再辅以碳酸氢钠交联剂增强交联作用，通过将碳酸氢钠同β-甘油磷酸钠与壳聚糖交联起来，起到了双交联的作用，改善了壳聚糖与β-甘油磷酸钠原有缺点，使得该基地材料具有优异的力学性能，以此调节了仿人体软骨的力学性能，使成胶后的支架具有优异的结构稳定性和良好的仿生力学性能。
4.本发明以碳酸氢钠交联剂降低了甘油磷酸钠用量，使制备的支架更加无毒无害，降解产物易于人体吸收，具有优秀的生物相容性。
5.本发明中原材料成本低廉，来源广泛，制备方法简单，具有较好的利用价值。
本方法简单易行，原料来源广泛，价格低廉，所得产品力学性能优异，结构稳定，成胶速度快，可望作为注射型组织工程支架材料使用。
附图说明
图1为对比例1～3与实施例1制备的软骨温敏可注射性组织工程支架宏观图(从左至右)。
图2为对比例1～3与实施例1制备的软骨温敏可注射性组织工程支架应力应变曲线图。
图3为对比例1～3与实施例1制备的软骨温敏可注射性组织工程支架材料的红外光谱图。
图4为对比例1～3与实施例1制备的软骨温敏可注射性组织工程支架细胞生长情况。
图5为对比例1～3与实施例1制备的软骨温敏可注射性组织工程支架体外细胞毒性评价。
图6为对比例1～3与实施例1制备的软骨温敏可注射性组织工程支架血液相容性评价。
图7为对比例1～3与实施例1制备的软骨温敏可注射性组织工程支架体内降解图及曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中所用试剂未特别说明均市售可得。一、一种适用于软骨的温敏可注射性组织工程支架的制备方法
实施例1
1)将壳聚糖粉末溶解于含1％冰醋酸的溶液中，配成浓度为4％(W/V)的壳聚糖溶液；
2)将碳酸氢钠溶解或分散于蒸馏水中，配成浓度为0.6mol/L的碳酸氢钠溶液；
3)将β-甘油磷酸钠溶解或分散于上述中的碳酸氢钠溶液中，配成浓度为50％(W/V)的碳酸氢钠/β-甘油磷酸钠混合溶液；
4)在冰浴条件下搅拌壳聚糖溶液，并逐步滴加碳酸氢钠/β-甘油磷酸钠混合溶液(壳聚糖溶液:碳酸氢钠/β-甘油磷酸钠混合溶液比30：100)，混合搅拌15分钟左右；
5)上述混合均匀后，继续搅拌，并倒入丝胶蛋白(丝胶蛋白：壳聚糖质量比分数为25：100)和胶原蛋白(胶原蛋白：壳聚糖质量比分数为25：100)粉末于混合溶液中,并继续搅拌10分钟左右，最终得到本温敏性溶胶-凝胶转化材料。
对比例1～3与实施例1的操作步骤相同，仅丝胶蛋白和胶原蛋白的含量不同，具体见表1所示。
表1
二、性能检测
1、图1为对比例1～3与实施例1软骨温敏可注射性组织工程支架形成凝胶支架后的宏观形貌图，形态整体规整。
2、使用长春机械科学研究院有限公司的微机控制力学试验机(DNS20型)对比例1～3与实施例1得到的四组软骨温敏可注射性组织工程支架材料进行力学性能检测，结果如图2所示。
从图中可以看出，加入碳酸氢钠后的温敏凝胶力学性能已经得到了一定的提升，但是到了50KPa左右就发生了断裂，但是加了丝胶蛋白和胶原蛋白的水凝胶支架在60％时，都有超过80KPa的力学性能，说明丝胶蛋白和胶原蛋白的添加都可以通过静电作用或者氢键的相互作用使温敏凝胶力学性能增加。
3、利用美国Perkin Elmer公司的傅立叶变换红外光谱仪对实施例1制得的软骨温敏可注射性组织工程支架进行红外光谱分析，结果如图3所示。
傅立叶红外光谱图中，可通过红外光谱吸收峰的位置变化，鉴定基团的变化，通过吸收峰强弱的变化鉴定化学基团组分之间的相互作用。如图3，凝胶支架材料及其各组分丝胶蛋白、胶原蛋白、β-甘油磷酸钠、壳聚糖、碳酸氢钠的傅立叶红外光谱扫描结果显：在3600cm-1和3000cm-1附近均表现出较宽的吸收带。这些条带表明组织中存在O-H拉伸和N-H拉伸。峰值在1569cm-1附近归因于酰胺I中的C＝O拉伸。在974cm-1处观察到PO4 3-基团无机相的峰值。在凝胶形成后，由于N-H和O-H的拉伸，壳聚糖中的峰值发生了偏移。这可能说明β-甘油磷酸钠温敏性中壳聚糖中N-H基团与O-H基团之间成键，或β-甘油磷酸钠温敏性中壳聚糖中C＝O基团与O-H基团之间形成氢键。此外，由于壳聚糖或丝胶蛋白、胶原蛋白中的氨基与β-甘油磷酸钠温敏性中的OH和PO4 3-基团之间形成氢键和化学络合物，壳聚糖和丝胶蛋白中的酰胺引起的峰降低。此外，水凝胶的C–CH3对称变形导致的峰值光谱降低，这表明可能形成了氢键。显然，壳聚糖与β-甘油磷酸钠温敏性之间存在氢键和静电相互作用。
4、将对比例1～3与实施例1得到的软骨温敏可注射性组织工程支架材料体外细胞增殖检测，结果如图4所示。
采用FDA染色，对支架材料内L929细胞(小鼠上皮样成纤维细胞)的生长情况进行直观观察，结果如图4所示：在第1、3天的培养过程中，具有活力的细胞被染成绿色，表明支架材料内部均有细胞的渗透且呈球状。值得注意的是，在第3天时细胞的数量明显多余第一天，且细胞数量更多分布更广。
5、将对比例1～3与实施例1得到的软骨温敏可注射性组织工程支架材料体外细胞毒性评价，结果如图5所示。
图5是L-929细胞在含有支架材料不同浓度浸提液的孔板中生长3天内，ODλ＝490nm处的吸光度值和毒性评分等级表。从图中可以看出，实验组的吸光度值与对照组的吸光度值在培养后具有一定的差异性，在第实施例4中尤为明显，在第三天时，实施例1的细胞相对增值率为111.3，明显高于对照组，这证明丝胶蛋白和胶原蛋白的联用可以明显促进细胞的增殖。且由表可得，3天内，不同支架材料的不同浓度浸提液对L-929细胞的毒性分级基本为0级或1级，证明无细胞毒性，满足生物材料的生物安全性规范。
6、将对比例1～3与实施例1得到的软骨温敏可注射性组织工程支架材料血液相容性评价，结果如图6所示。
由图6溶血实验照片可得：四组的溶血率依次为1.2737±0.7568、2.3351±0.7923、0.8016±0.6623、1.3244±0.2788，丝胶蛋白的溶血率略高于胶原蛋白。但随着两者的结合，实施4中的溶血率明显低于第二组，说明胶原蛋白和丝胶蛋白的结合可以相对减轻溶血程度，降低了对红细胞的破坏程度。且支架材料的溶血率均小于5％，根据国标标准，满足医用生物材料的要求。图6中BCI值也可以看出加了丝胶蛋白的对比例2的BCI值更低，具有一定的凝血效果，但是加了胶原蛋白以后丝胶蛋白引起的凝血效果将会消失。BCI值越高，表明溶液中游离的血红蛋白、红细胞和血小板的数量血多，材料的抗凝血效果越好，在体内发生血栓的可能性越低。说明材料在人体血液内是安全的。
7、将对比例1～3与实施例1得到的软骨温敏可注射性组织工程支架材料体内降解图及曲线图，结果如图7所示。
由图7可得：四组的第四周降解率依次为11.67％±3.30％、2.13％±1.8％、8.80％±4.09％、28.07％±5.38％，丝胶蛋白和胶原蛋白的结合有利于增强凝胶的结构稳定性，使其降解速率更慢。软骨损伤的修复时间都比较漫长，一般都需要一到三个月左右的恢复时间，所以相对更慢的降解速度有利于匹配软骨修复再生的时间。实施例1的降解速率更慢，在植入大鼠后背四周的时间，材料的降解率为28.07％±5.38％，与不加胶原蛋白的对比例2相比降解性能有了明显的提升，更加匹配临床软骨损伤患者的再生速率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种适用于软骨的温敏可注射性组织工程支架，其特征在于，所述支架由丝胶蛋白、胶原蛋白、壳聚糖、β-甘油磷酸钠、碳酸氢钠复合交联而成。
2.一种适用于软骨的温敏可注射性组织工程支架的制备方法，其特征在于，采用以下方法制得：
1)将壳聚糖粉末溶解于稀酸溶液(稀盐酸、烯乙酸等)中，配成浓度为2％～8％(W/V)的壳聚糖溶液；
2)将碳酸氢钠溶解或分散于蒸馏水中，配成浓度为0.4mol～0.6mol/L的碳酸氢钠溶液；
3)将β-甘油磷酸钠溶解或分散于上述中的碳酸氢钠溶液中，配成β-甘油磷酸钠浓度为50％±5％(W/V)的碳酸氢钠/β-甘油磷酸钠混合溶液；
4)在冰浴条件下搅拌壳聚糖溶液，并逐步滴加碳酸氢钠/β-甘油磷酸钠混合溶液，混合搅拌不低于15分钟；
5)上述混合均匀后，继续搅拌，并倒入丝胶蛋白和胶原蛋白粉末于混合溶液中,并继续搅拌不低于10分钟，最终得到本温敏可注射性组织工程支架材料，其可以发生温敏性溶胶-凝胶转化，在37℃±5℃时转换为凝胶支架。
3.根据权利要求2所述的温敏可注射性组织工程支架材料，其特征在于，步骤4)中壳聚糖溶液：碳酸氢钠/β-甘油磷酸钠混合溶液比15：100～30：100。
4.根据权利要求2所述的温敏可注射性组织工程支架材料，其特征在于,步骤5)中丝胶蛋白不含蜡质等杂质，丝胶蛋白：壳聚糖质量比分数为10：100～100：100。
5.根据权利要求2所述的温敏可注射性组织工程支架材料，其特征在于，步骤5)中胶原蛋白：壳聚糖质量比分数为10：100～100：100。
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