KR20130057640A - 수불용성 겔 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 수용성 다당류, 에폭시 가교제, 염기성 화합물 및 용매를 혼합하는 단계; 및 상기 혼합액을 1 내지 30℃에서 진공건조하여 용매를 제거하는 단계;를 포함하는 수불용성 겔 조성물의 제조방법 및 수불용성 겔 조성물을 제공한다.

Description

수불용성 겔 조성물 및 그 제조방법{WATER-INSOLUBLE GEL COMPOSITION AND MANUFACTURING METHOD OF THE SAME}
본 발명은 수불용성 겔 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 수용성 다당류, 에폭시 가교제, 염기성 화합물 및 용매를 혼합하고 저온 진공건조하여 수불용성 겔 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
다당류는 당류가 구성하는 반복단위인 천연 수용성 고분자로서, 수용액이 되었을 때 발현되는 높은 점도로 인해 로션, 연고, 크림, 용액 등의 조성물 내에 포함되는 다당류의 함량을 높게 유지하기 어렵다. 높은 점도는 조성물 내 혼합물의 혼합균일성을 확보하기 어렵게 한다. 또한 생체조직 내에 이식되는 조성물의 경우는 생분해성 속도가 매우 중요하다. 생체조직에 이식되는 물질은 독성이 없어야 하고, 요구되는 기능을 완료한 후에는 생체 내 대사활동에 의해 분해 및 대출되는 것이 요구된다. 대표적인 다당류인 히알루론산은 인체 내에서 삽입 또는 이식된 후, 히알루론산의 분자량, 조성물 히알루론산의 농도에 무관하게 길어야 3일에서 4일이면 대사 후 배출되는 것으로 알려져 있다. 이러한 히알루론산의 짧은 인체 내 대사기간은 수개월 이상의 인체 내 유지기간을 요구하는 생체수복용 재료로서는 물론이고, 7일에서 10일정도의 유지기간을 요구하는 수술 후 조직유착 방지제로서도 부적합하다.
다당류를 고농도로 포함하는 조성물을 만들고자 할 경우 해결해야 할 문제로 지적된 것이 물에 다당류를 녹였을 때 발생하는 높은 점도이다. 이러한 문제를 해결하기 위해 다당류의 분자량을 낮게 하는 방법, 수용액 내 삼투압을 높이는 방법, 다당류를 미세한 분말상태로 만들어 분산시키는 방법 등이 개발되어 왔다.
수용성 고분자인 다당류를 수불용성 겔로 전환하기 위해 개발된 가교기술들은 가교제 신규 발굴, 다당류의 분자량 조절, 가교반응용액 내 다당류의 농도 조절, 가교밀도조절, 가교밀도 불균일성 유도, 그리고 다당류와 가교제 간에 생성되는 화학결합 종류를 조절하는 기술로 분류할 수 있다.
히알루론산을 수불용성 겔로 전환하기 위해 사용되는 일반적인 방법은 히알루론산과 에폭시 계열 가교제를 pH를 12 이상으로 조절한 물과 혼합하고, 40에서 60℃ 정도의 온도를 수 시간 동안 유지시키는 것이다. 이러한 가교공정은 에폭시 계열 가교제와 히알루론산의 반응을 촉진하는 장점은 있지만, 강염기 용액과 가열에 의해 히알루론산의 분자량이 감소하여 최종적으로 얻어지는 수불용성 겔의 기계적 강도가 너무 낮다는 단점이 있다. 강염기 용액과 가열에 의해 발생하는 히알루론산의 분자량 저하를 보완하기 위해, 통상 사용되는 100만 달톤 수준의 히알루론산 대신 300만 달톤 정도의 고분자량 히알루론산을 적용하기도 하는데, 경제성이라는 측면에서 바람직하지 못하다. 강염기 용액과 가열로 인해 발생하는 문제점을 해결하기 위한 방법으로는 히알루론산이 녹아있는 용액의 pH를 12이하로 낮추거나, 반응온도를 40℃ 보다 낮게 하는 것이 있다. 그러나, pH 또는 반응온도를 낮추게 되면 가교반응에 필요한 시간이 너무 길어지거나, 가교제 사용량이 증가하는 단점이 발생한다. 용액상에서 진행되는 히알루론산 가교반응의 단점을 극복하기 위해 고체상태인 히알루론산을 에폭시 가교제를 녹인 유기용매에 함침시키는 기술이 개발되기도 했다. 그러나, 이 기술을 통해 얻어지는 수불용성 겔의 표면은 가교밀도가 높고, 내부는 가교밀도가 낮거나 가교가 전혀 이루어지지 않는 단점이 있다. 강염기인 용액상에서 진행되는 가교반응의 단점인 히알루론산과 같은 다당류 분자량 저하를 극복하기 위한 또 다른 방법으로 pH 9 이하인 약염기성 또는 증류수 또는 산성으로 조절된 물에 히알루론산과 에폭시 계열 가교제를 용해시킨 후 실온에서 건조시키는 기술이 소개되기도 했다. 이 기술을 통해 극소량의 가교제만으로도 건조중량 대비 완전팽윤 중량이 2배 이하인 히알루론산 겔을 얻을 수 있었다. 그러나, 이 기술을 통해 얻어진 수불용성인 히알루론산 겔을 살아있는 쥐의 조직에 이식한 후, 7일 만에 이식된 수불용성 겔의 30%가 분해되었다. 이러한 생분해특성은 수 개월 이상 장기간 생체조직 내에 수불용성 겔 상태를 유지해야 하는 분야에는 적용하기 어렵다.
국제공개특허 제2010-097993호
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은 본 발명은 가교공정 중 다당류의 분자량 저하를 최소화하면서 가교밀도는 극대화하는 신규 수불용성 겔 조성물의 제조방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 해결하기 위하여 본 발명은 수용성 다당류, 에폭시 가교제, 염기성 화합물 및 용매를 혼합하는 단계; 및
상기 혼합액을 1 내지 30℃에서 진공건조하여 용매를 제거하는 단계;를 포함하는 수불용성 겔 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 진공건조는 1 내지 30mmHg 하에서 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 용매 제거하는 단계는 수용성 다당류의 농도를 50 내지 99중량%로 농축하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 수용성 다당류는 분자량이 50만 내지 500만 달톤인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 수용성 다당류는 용매 중량 100부에 대하여 1 내지 100중량부인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 수용성 다당류는 히아루론산(hyaluronic acid), 히아루론산염, 폴리감마글루탐산(poly-γ-glutamic acid), 폴리감마글루탐산염, 한천(agar), 알진산(alginic acid), 알진산염(alginate), 카라기난(carrageenan), 퍼셀라란(furcellaran), 펙틴(pectin), 아라비아 고무(arabic gum), 카라야 고무(karaya gum), 트라가칸스 고무(tragacanth gum), 가티 고무(ghatti gum), 구아 고무(guar gum), 메뚜기콩 고무(locust bean gum), 사이리엄 고무(psyllium seed gum), 젤라틴(gleatin), 키틴(chitin), 덱스트란(dextran), 잔탄 고무(xanthane gum), 키토산(chitosan), 콘드로이친-4-설페이트(chondroitin-4-sulfate), 콘드로이친-6-설페이트(chondroitin-6-sulfate) 및 녹말(starch)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 에폭시 가교제는 수용성 다당류 내의 히드록시기 1몰에 대하여 0.01 내지 60몰부인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 에폭시 가교제는 에피클로로히드린(epichlorohydrin), 에피브로모히드린(epibromohydrin), 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리에틸렌글리콘디글리시딜에테르(polyethylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether), 폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르(polytetramethylene glycol diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르(neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르(polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세롤폴리그리시딜에테르(diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤폴리글리시딜에테르(glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르(trimethlypropane polyglycidyl ether), 비스에폭시프로폭시에틸렌(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리쓰리톨폴리글리시딜에테르(pentaerythritol polyglycidyl ether) 및 소르비톨폴리글리시딜에테르(sorbitol polyglycidyl ether)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 염기성 화합물은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 리튬을 포함하는 알칼리 금속을 포함하는 화합물인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 수용성 다당류, 에폭시 가교제, 염기성 화합물 및 용매를 포함하는 수불용성 겔 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 수용성 다당류는 분자량이 50만 내지 500만 달톤인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 수용성 다당류는 용매 중량 100부에 대하여 1 내지 100중량부인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 에폭시 가교제는 수용성 다당류 내의 히드록시기를 기준으로 0.01 내지 60몰부인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 수불용성 겔을 조성물 총 중량에 대하여 1 내지 20중량% 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 수불용성 겔의 팽윤도가 30 내지 200이면 투명, 팽윤도가 10 내지 30이면 반투명 유백색 및 팽윤도가 2 내지 10이면 불투명 백색인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물을 pH 6.5 내지 7.5인 인산염 완충용액에 넣고 팽윤 및 가압멸균하였을 때, 최초 투입된 조성물 중량에 대하여 70 내지 99중량%가 불수용성 겔로서 잔존하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물의 팽윤중량은 가압멸균 후 잔존하는 불수용성 겔의 건조중량의 2 내지 200배인 것일 수 있다.
본 발명의 수불용성 겔 조성물의 제조방법에 따르면, 소량의 가교제를 사용하면서 다당류의 분자량 저하를 최소화하고 가교밀도는 극대화하여 뛰어난 강도 및 안정성을 가지는 수불용성 겔을 얻을 수 있고, 이러한 수불용성 겔을 이용하여 조성물을 제조할 경우, 조성물 내 다당류의 함량을 높이더라도 조성물의 흐름성을 확보할 수 있다. 따라서, 화장품, 건강식품, 의약품 등에서 다당류를 2에서 3 중량% 이상과 같이 다량을 혼합할 경우 발생하는 조성물 제조공정 중 혼합불균일, 조성물 사용 시 발생하는 흐름성 소실로 인한 사용감 저하를 극복할 수 있다. 또한, 다당류로 구성된 조성물을 생채 내에 이식할 경우 최소 10일에서 수개월 이상 안정적으로 체류하도록 하여, 조직수복용 조성물, 수술 후 유착방지제, 관절 내 활액 대체제 등의 용도로 사용할 수 있다. 또한 생체 내 이식물로 사용하고자 할 때 반드시 거쳐야 하는 가압 멸균에도 안정하며, 경제성 또한 뛰어나다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 조성물의 부피유지기간을 나타내는 그래프이다.
이하에서는, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 하기 위하여, 본 발명의 바람직한 실시예들에 관하여 상세히 설명하기로 한다.
본 발명은 수용성 다당류, 에폭시 가교제, 염기성 화합물 및 용매를 혼합하는 단계; 및 상기 혼합액을 1 내지 30℃에서 진공건조하여 용매를 제거하는 단계;를 포함하는 수불용성 겔 조성물의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 수불용성 겔 조성물의 제조방법을 보다 구체적으로 설명한다.
먼저, 수용성 다당류, 에폭시 가교제, 염기성 화합물 및 용매를 혼합한다.
본 발명에서 수용성 다당류는 당류를 반복단위로 하고, 분자량이 50만 달톤 (dalton, Da) 내지 500만 달톤인 수용성 고분자이다. 분자량이 50만 달톤 미만이면 수불용성 겔이 형성되지 않거나, 형성되더라도 가압멸균과정에서 수불용성 겔이 소멸되며, 500만 달톤 초과이면 수용성 다당류를 녹인 용액의 점도가 지나치게 높아 혼합균일성을 얻기 어렵다. 수용성 다당류는 열, pH 및 미생물 오염 등에 의해 분자량이 쉽게 감소하는 특성을 갖는 고분자이다. 따라서, 가교 및 세척, 원료로서 투입된 분자량, 즉 초기분자량 보다는 가교를 위해 수행되는 공정이 완료된 후에 확정되는 분자량, 즉 최종분자량을 변수로 고려해야 한다. 따라서 본 발명에서는 가교공정에 의해 수용성 다당류의 분자량이 달라지는 것을 점도측정을 통해 확인하였다. 이를 후술할 실험예에서 확인할 수 있다.
통상적으로 고분자를 가교함에 있어, 동일한 가교밀도를 부여할 경우 고분자의 분자량이 증가하면 팽윤도는 감소하고, 가교된 겔의 기계적 강도는 증가한다. 다당류의 가교반응 역시 동일한 결과를 보인다. 따라서, 동일한 가교밀도를 만들어내는 가교공정에 동일량의 다당류를 사용할 경우, 분자량이 높은 다당류를 적용하는 것이 수불용성 겔을 높은 수율로 얻어내는 방법 중 하나이다.
상기 수용성 다당류는 특별히 제한되는 것은 아니나, 히아루론산(hyaluronic acid), 히아루론산염, 폴리감마글루탐산(poly-γ-glutamic acid), 폴리감마글루탐산염, 한천(agar), 알진산(alginic acid), 알진산염(alginate), 카라기난(carrageenan), 퍼셀라란(furcellaran), 펙틴(pectin), 아라비아 고무(arabic gum), 카라야 고무(karaya gum), 트라가칸스 고무(tragacanth gum), 가티 고무(ghatti gum), 구아 고무(guar gum), 메뚜기콩 고무(locust bean gum), 사이리엄 고무(psyllium seed gum), 젤라틴(gleatin), 키틴(chitin), 덱스트란(dextran), 잔탄 고무(xanthane gum), 키토산(chitosan), 콘드로이친-4-설페이트(chondroitin-4-sulfate), 콘드로이친-6-설페이트(chondroitin-6-sulfate) 및 녹말(starch)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다. 특히 히아루론산인 것이 바람직하다.
상기 수용성 다당류는 용매 중량 100부에 대하여 1 내지 100중량부인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 5 내지 40중량부일 수 있다. 수용성 다당류가 1중량부 미만으로 포함되면 진공조건에서 건조할 때 범핑(bumping)이 쉽게 발생하여 산업적 이용이 어렵고, 100중량부 초과로 포함되면 수용성 다당류가 녹아있는 용액의 점도가 높아져 혼합균일성을 얻기 어렵다.
본 발명에서 에폭시 가교제라 함은 에폭시 관능기를 2개 이상 포함하는 화합물을 말한다.
상기 에폭시 가교제는 특별히 제한되는 것은 아니나, 에폭시 에피클로로히드린(epichlorohydrin), 에피브로모히드린(epibromohydrin), 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리에틸렌글리콘디글리시딜에테르(polyethylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether), 폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르(polytetramethylene glycol diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르(neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르(polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세롤폴리그리시딜에테르(diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤폴리글리시딜에테르(glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르(trimethlypropane polyglycidyl ether), 비스에폭시프로폭시에틸렌(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리쓰리톨폴리글리시딜에테르(pentaerythritol polyglycidyl ether) 및 소르비톨폴리글리시딜에테르(sorbitol polyglycidyl ether)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 특히 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether, BDDE)인 것이 바람직하다.
상기 에폭시 가교제는 수용성 다당류 내의 히드록시(hydroxy)기 1몰에 대하여 0.01 내지 60몰부인 것일 수 있고, 바람직하게는 0.05 내지 40몰부, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 20몰부일 수 있다. 즉, 수용성 다당류를 구성하는 반복단위 내에 존재하는 가교가능한 히드록시 관능기 몰수에 대하여 함량이 정해진다. 가교반응을 통해 확보되는 다당류의 수불용성 겔의 물성을 조절하기 위해서는 가교반응을 수행하기 위해 투입되는 에폭시 가교제의 투입량 보다는 가교공정 중에 에폭시 가교제와 다당류간의 실제 반응량이 중요하다. 아무리 많은 가교제를 투입하더라도, 가교반응에 참여하지 못한다면 미반응 가교제를 제거하는 세척공정을 통해 제거되어야 한다. 따라서 상기 범위에 해당하는 양의 가교제를 사용하는 경우 실제 가교반응에 참여하는 최적량의 가교제를 사용할 수 있게 된다.
즉, 에폭시 가교제가 0.01몰부 미만으로 포함되면 가교가 충분히 이루어지지 않아 수불용성 겔을 얻기 어렵고, 60몰부 초과로 포함되면 가교를 통한 수용성 다당류의 물성 개선 효과는 높아지지 않고, 미반응 가교제로 인한 위험성과 세척비용 증가로 인한 경제적 손실만이 증가한다.
본 발명에서 염기성 화합물은 pH 조절제로서 pH를 12 이상이 되도록 하는 통상적인 염기성 화합물이다. 상기 염기성 화합물은 수용성이고, 물과 혼합된 후 pH 12 이상이 된다. 다당류와 에폭시 계열 가교제가 녹아있는 용액의 pH가 4 이하인 경우는 히알루론산과 에폭시 계열 가교제 간에 에스터 (ester) 결합이 주로 생성되며, 이 용액의 pH가 12 이상인 경우는 히알루론산과 에폭시 계열 가교제 간에 에테르 (ether) 결합이 주로 생성되며, 이 용액의 pH가 4에서 12이면, 히알루론산과 에폭시 계열 가교제 간에 에스터결합과 에테르결합이 혼재된 상태가 되기 때문에, pH를 조절함으로서 가교결합의 종류를 제어할 수 있다. 본 발명의 경우 염기성 상태에서 가교결합을 진행시키므로 에테르 결합이 생성된다. 후술할 실험예에서 확인할 수 있듯이, 에테르 가교결합이 가압멸균 공정을 거치는 경우 더욱 안정적이다.
상기 염기성 화합물은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 리튬을 포함하는 알칼리 금속을 포함하는 화합물인 것일 수 있다. 예를 들어, 수산화나트륨이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용매는 물인 것이 바람직하다.
그 다음, 상기 혼합액을 1 내지 30℃에서 진공건조하여 용매를 제거한다.
이 단계는 혼합액을 저온진공건조하는 것으로, 본 발명에서 저온건조라 함은 물의 비등점을 고려하여 압력을 조절한 진공건조로서, 건조물의 온도가 1 내지 30℃가 되도록 유지하는 것이 바람직하고, 1에서 30℃에서 물의 비등점이 되는 압력, 즉 1 내지 30 mmHg 이내의 압력을 유지하고, 건조를 통해 가교반응용 혼합물로부터 증발되는 물을 지속적으로 제거하는 공정이다. 상기 용매 제거하는 단계를 통하여 수용성 다당류의 농도가 50 내지 99중량%로, 바람직하게는 50 내지 90중량%로 농축된다.
온도가 1℃ 미만이면 조성물이 진공건조 중에 동결되어 건조공정이 완료된 후 얻어지는 조성물은 다공성의 스폰지 (sponge)가 되어 본 발명에서 추구하고자 하는 생분해 저항성 개선을 얻을 수 없고, 30℃ 초과이면 강염기 조건에서 발현되는 분자량 저하가 급격하게 빨라져서 본 발명에서 추구하고자 하는 생분해 저항성 개선을 확보하는 것이 어렵다.
또한, 압력이 1mmHg 미만이면 증발잠열로 인해 건조되는 조성물의 온도가 빙점 이하가 되어 얼게 되고, 결과적으로 다공성의 스펀지 구조가 되어 생분해 저항성 개선 효과를 얻기 어려우며, 30mmHg 초과이면 수분제거속도가 너무 느려 신속한 건조가 이루어지지 않아 공정시간이 너무 길어져 경제적 실익이 적어진다.
상기 진공건조에 의하여 용매가 제거되면서 수용성 다당류 및 에폭시 가교제간 가교결합이 일어나게 되고, 수불용성 겔이 형성된다. 30℃ 이하의 저온진공 건조 공정을 통하여 강염기 수용액 상태에서 발생하는 수용성 다당류의 분자량 저하를 억제할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 수불용성 겔이라 함은, 선형 구조, 주쇄에 가지가 달린 가지구조, 또는 방사형의 구조를 갖는 수용성 다당류를 가교하여 3차원 그물망 구조로 만든 것으로, 물에 대한 용해성은 없고 물에서 팽윤만이 되는 것이다. 이러한 수불용성 겔의 물성을 좌우하는 주요 변수는 가교반응에 사용된 고분자의 분자구조와 분자량, 가교밀도, 그리고 가교결합의 종류이다.
본 발명의 제조방법에 따르면, 가교공정 중에 발생하는 다당류의 분자량 저하를 최소화하고, 다당류와 에폭시 가교제 간의 가교반응 반응효율을 극대화하며, 가교반응을 통해 얻어지는 수불용성 겔들이 완충용액과 혼합되어 가압멸균되는 조건에서도 안정적으로 수불용성 겔 상태를 유지할 수 있다는 특징이 있다.
또한, 본 발명은 수용성 다당류, 에폭시 가교제, 염기성 화합물 및 용매를 포함하는 수불용성 겔 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 수불용성 겔을 조성물 총 중량에 대하여 1 내지 20중량% 포함하는 것이 바람직하다. 수불용성 겔이 1중량% 미만이면 흐름성이 너무 커서 조직 내에 주입된 후 조직 내에 고정되어 있지 못하여 실용성이 떨어지고, 20중량% 초과이면 흐름성이 너무 나빠서 주사바늘 등을 이용하여 주입하는 것이 불가능하다.
본 발명에 따른 수불용성 겔 조성물은 수불용성 겔의 팽윤도가 30 내지 200이면 투명, 팽윤도가 10 내지 30이면 반투명 유백색 및 팽윤도가 2 내지 10이면 불투명 백색일 수 있다. 종래 상품화되어 팔리고 있는 히알루론산 수불용성 겔을 포함하는 조성물은 통상 완전 투명한 상태이다. 그러나, 본 발명을 통해 얻어지는 수불용성 겔을 포함하는 조성물은 조성물 내 히알루론산 수불용성 겔의 팽윤도에 따라 외관이 상이하게 나타난다. 이는 팽윤도가 낮을수록 빛의 산란도가 달라져 투명도가 낮아지는 데에서 기인한다.
본 발명에 따른 수불용성 겔 조성물을 pH 6.5 내지 7.5인 인산염 완충용액에 넣고 팽윤 및 가압멸균하였을 때, 최초 투입된 조성물 중량에 대하여 70 내지 99중량%가 불수용성 겔로서 잔존하는 것일 수 있다. 상기 인삼염 완충용액은 인산 농도가 0.001M 이상인 것이 바람직하다.
본 발명에서 가압멸균은 일반적으로 알려진 가압멸균이면 제한되는 것은 아니고, 예를 들어 약 121℃에서 20분간 가압멸균을 실시하는 것일 수 있다.
또한, 상기 조성물의 팽윤중량은 가압멸균 후 잔존하는 불수용성 겔의 건조중량의 2 내지 200배인 것일 수 있다. 즉, 가압멸균 후 잔존하는 불수용성 겔을 등장액에 넣고 팽윤시킨 팽윤중량이 가압멸균 후 잔존하는 불수용성 겔의 건조중량의 2 내지 200배인 것이다. 팽윤중량이 2배 미만이면 수불용성 겔의 강도가 너무 강해서 미세입자로 제조하는 것이 어렵고, 200배 초과이면 생분해 저항성을 개선하고 했던 본 발명의 목적을 달성할 수 없다.
가교제에 존재하는 가교반응이 가능한 관능기 중 하나라도 미반응 상태, 즉 불완전 가교반응 상태가 되면, 생체 조직 내에 이식되는 조성물의 원료로서 수불용성 겔을 사용할 경우 이식된 조성물의 안전성에 부정적인 영향을 미친다. 따라서, 본 발명에서는 가교반응 후에 얻어지는 가교된 수불용성 겔 내에는 불완전 가교된 가교제를 최소화하기 위하여 가교공정을 거친 수불용성 겔을 세척한 후 재건조하여 세척 후 얻어진 수불용성 겔의 팽윤도와 재건조 후 얻어진 수불용성 겔의 팽윤도를 비교하는 것으로, 불완전 가교된 가교제가 최소화되는 가교조건을 최적화하였다.
본 발명에 따른 수불용성 겔 조성물의 제조방법 및 수불용성 겔 조성물에 따르면, 소량의 가교제를 이용하여 고분자량의 수용성 다당류가 균일하게 혼합된 수불용성 겔 조성물을 얻을 수 있고, 이러한 수불용성 겔 조성물은 고함량의 다당류를 함유하면서도 주사침을 통해 주사가 가능할 정도로 흐름성이 우수하고 인체 내 삽입물로 사용하고자 할 때 반드시 거쳐야 하는 가압멸균에도 안정하여, 낮은 팽윤도를 유지하며, 경제성 및 품질 또한 뛰어나다. 따라서 본 발명의 수불용성 겔 조성물은 식품, 화장품, 의약품, 의료기기용도로서, 안정화제, 보습제, 분산보조제, 점도조절제, 약물전달용담체, 조직수복용 충진물, 수술 후 유착방지막 형성물 등으로 사용할 수 있다. 더욱 구체적으로는 주사 약물 담체용 조성물, 점막 및 경피 흡수 약물 담체용 조성물, 경구용 약물 담체용 조성물, 생체 조직 수복용 조성물, 수술 후 생체 조직 유착 방지용 조성물, 성형용 충진 조성물, 관절 삽입용 조성물, 패치형 상처 치료 드레싱용 조성물, 골 관절염 치료용 조성물, 안구 수술 보조 주사용 조성물, 안구 건조증 치료용 조성물, 주름 치료 주사용 조성물, 잇몸 치료용 조성물, 고막 천공 치료용 조성물, 건강 식품 조성물 또는 화장품 조성물로 사용될 수 있다.
이하의 실시를 통하여 본 발명이 더욱 상세하게 설명된다. 단, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 이들만으로 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
[비교예 1]
마개가 달린 50 ㎖ 튜브 (tube) 에 분자량이 140만인 히알루론산 나트륨 (sodium hyaluronate, 이하 HA-Na) 1 g을 넣고, PBS 7.0을 더 하여 HA-Na의 농도가 0.5% 가 되도록 한 후, 투명한 용액이 될 때까지 교반하였다.
[비교예 2]
마개가 달린 50 ㎖ 튜브 (tube) 에 수산화나트륨 수용액 (pH 13) 9 g에 분자량이 140만인 HA-Na 1 g을 넣고, 투명한 용액이 될 때까지 교반하였다. 교반이 완료되면 40℃ 수조에서 4시간 동안 보관한 후에서 PBS 7.0에 20배 희석하여 HA-Na 농도가 0.5% 가 되도록 하였다.
[비교예 3]
마개가 달린 50 ㎖ 튜브 (tube) 에 수산화나트륨 수용액 (pH 13) 9 g에 분자량이 140만인 HA-Na 1 g을 넣고, 투명한 용액이 될 때까지 교반하였다. 교반이 완료되면, 제조된 HA-Na용액을 폴리에틸렌 판 위에 올리고 두께 2mm가 되도록 눌러펴서 40℃로 설정된 가열오븐에 넣고 24시간 동안 건조 시키고, PBS 7.0에 희석하여 HA-Na 농도가 0.5% 가 되도록 하였다.
[비교예 4]
마개가 달린 50 ㎖ 튜브 (tube) 에 수산화나트륨 수용액 (pH 13) 9 g에 분자량이 140만인 HA-Na 1 g을 넣고, 투명한 용액이 될 때까지 교반하였다. 교반이 완료되면, 제조된 HA-Na 용액을 폴리에틸렌 판 위에 올리고 두께 2mm가 되도록 눌러펴서 실온에서 4일간 동안 건조 시키고, PBS 7.0에 희석하여 HA-Na 농도가 0.5% 가 되도록 하였다.
[비교예 5]
마개가 달린 50 ㎖ 튜브 (tube) 에 수산화나트륨 수용액 (pH 13) 9 g에 분자량이 140만인 HA-Na 1 g을 넣고, 투명한 용액이 될 때까지 교반하였다. 교반이 완료되면, 제조된 HA-Na 용액을 폴리에틸렌 판 위에 올리고 두께 2mm가 되도록 눌러펴서 40℃로 설정한 진공오븐에 넣고, 10 mmHg 이하가 되도록 압력을 조절하여 24시간 동안 건조시킨 후, PBS 7.0에 희석하여 HA-Na 농도가 0.5% 가 되도록 하였다.
[실시예 1]
마개가 달린 50 ㎖ 튜브 (tube) 에 수산화나트륨 수용액 (pH 13) 9 g에 분자량이 140만인 HA-Na 1 g을 넣고, 투명한 용액이 될 때까지 교반하였다. 교반이 완료되면, 제조된 HA-Na 용액을 폴리에틸렌 판 위에 올리고 두께 2mm가 되도록 눌러펴서 30℃로 설정한 진공오븐에 넣고, 10 mmHg 이하가 되도록 압력을 조절하여 24시간 동안 건조시킨 후, PBS 7.0에 희석하여 HA-Na 농도가 0.5% 가 되도록 하였다.
[실험예 1] 원판점도계를 이용한 점도측정
상기 비교예 1 내지 5 및 실시예 1에 의한 조성물의 점도를 측정하는 실험을 실시하였다. Brook filed 원판점도계를 이용하여 0.02M 인산염완충용액 (pH 7.0, NaCl 0.8 중량%, 이하 PBS 7.0) 에 히알루론산 나트륨 (분자량 140만) 의 농도가 0.5중량%가 되도록 한 용액의 점도를 측정하였다. 점도측정 온도는 25℃, 원판 규격은 #62, 원판 회전 속도는 30rpm이었다.
그 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 비교예 1과 비교예 2에서 5, 실시예 1을 통해 강염기를 적용하는 조건에서 히알루론산의 분자량은 급격히 감소함을 확인하였다. 그리고 강염기 수용액상태에서 발생하는 히알루론산의 분자량 저하를 30℃이하의 저온진공공정을 통해 억제할 수 있음을 확인하였다.
구분 가교공정 점도측정 시 히알루론산 농도
(중량%)		 점도
(cp)
비교예 1 가교공정 거치지 않음 0.5 중량% 152
비교예 2 용액상 가교/40℃/4시간 0.5 중량% 12.5
비교예 3 가열건조/40℃/24 시간 0.5 중량% 10.8
비교예 4 실온건조/4일 0.5 중량% 10.7
비교예 5 진공건조/40℃/24시간 0.5 중량% 22.4
실시예 1 진공건조/30℃/24시간 0.5 중량% 47.5
[비교예 6]
마개가 달린 50 ㎖ 튜브 (tube) 에 수산화나트륨 수용액 (pH 13) 9 g에 분자량이 140만인 HA-Na 1 g, BDDE 200 mg을 넣고, 투명한 용액이 될 때까지 교반하였다. 교반이 완료되면 40℃ 수조에서 4시간 동안 보관한 후에, 1 mm의 눈 크기를 갖는 체를 통하여 분쇄하였다. 가교반응을 수행하고, 분쇄된 시료 중 1 g을 PBS 7.0에 1000 g에 넣고 24시간 동안 교반을 실시하였다.
[실시예 2]
마개가 달린 50 ㎖ 튜브 (tube) 에 수산화나트륨 수용액 (pH 13) 9 g에 분자량이 140만인 HA-Na 1 g, BDDE 200 mg 을 넣고, 투명한 용액이 될 때까지 교반하여 가교용 혼합물을 제조하였다. 준비된 가교용 혼합물에 대하여 실시예 1에서 실시한 진공건조를 24시간 실시한 후, 건조된 가교용 혼합물 중 0.1 g을 PBS 7.0 1 kg에 넣어 24시간 동안 교반하였다.
[실험예 2] 가교반응율 측정
상기 비교예 2 및 실시예 2에 의한 조성물의 가교공정에 따라 투입된 가교제가 가교반응에 참여하는 비율, 즉 가교반응율을 평가하였다. 각 조성물의 교반을 완료하고, 상층액을 취하여 미반응 BDDE를 측정하였다. 가교반응공정을 거친 가교용 혼합물을 PBS 7.0에서 세척한 후, 세척에 사용된 PBS 7.0내에 포함된 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether, 이하 BDDE)를 가스크로마토그라피(gas chromatography, 이하 GC)를 통해 측정하였다. 내부표준물질로는 네오펜틸다이글리시딜 에테르(neopentyl diglycidyl ether, 이하 NPDGE)를 사용하였다. 세부적인 측정조건은 아래와 같다.
<미반응 BDDE측정조건>
1) 장비: Agilent 6890 GC - 5975B MSD
2) 가스크로마토그래피 파라미터 (GC parameters)
(1) 컬럼 (column): DB-5MS (내경 0.25 mm, 길이 30 m, 코팅 필름두께 0.25 ㎛)
(2) 주입구 온도 (Injector temp.): 260 ℃
(3) 주입방식 (Injection mode): He, splitless, purge in 1 min.
(4) 이동상 속도 (Flow rate): 1.0 ml/min
(5) 주입부피 (Injection volume): 1㎕
(6) 오븐 온도 (Oven temp.): 80℃, 2분 → 10℃/분으로 승온 → 200℃, 0분 → 25℃/분으로 승온 →250℃, 0 분
3) 질량분석기 파라미터 (MS parameters)
(1) 용매머무름시간 (Solvent delay): 8분
(2) 쿼드 온도 (Quad temp.): 150 ℃
(3) 소스 온도 (Source temp.): 250 ℃
SIM 파라미터 (parameters)
Ions (m/z) 57 71 85 100 127
Dwell time (msec) 50 50 50 50 50
측정 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 표 3에서 볼 수 있듯이, 비교예 6과 실시예 2를 비교한 결과, 통상적으로 다당류 가교를 위해 사용되는 용액상 가교반응보다, 진공건조 공정이 더 높은 가교반응율을 보인다는 것을 확인하였다. 가교공정에서 가교반응이 높다는 것은 가교제 투입량을 적게하여도 충분히 가교된 수불용성 겔을 얻을 수 있다는 것을 의미한다.
구분 가교공정 GC측정용 시료 내 이론적 BDDE 함류량
(mg)		 미반응 가교제량
(mg)		 가교반응 참여율
(%)
비교예 6 용액상 가교 20 15.4 23
실시예 2 진공건조/30℃/24시간 200 9.5 52.5
[비교예 7 내지 9]
마개가 달린 50 ㎖ 튜브 (tube) 3개에 분자량이 140만인 HA-Na 1 g씩을 각각 넣고, 증류수, 염화수소를 이용하여 pH를 1로 조정한 염화수소수용액, 그리고 수산화나트륨을 이용하여 pH를 12로 조정한 수산화나트륨 수용액을 각각 9 g씩 넣은 후, 가교제로서 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether, 이하 BDDE) 를 50mg 각각 첨가하였다. BDDE를 첨가한 후, 투명한 용액이 될 때까지 교반하여 가교용 혼합물을 제조하였다. 교반이 완료된 후, 실시예 1과 동일한 방법의 진공건조를 24시간 동안 실시하였다.
[실시예 3 내지 5]
마개가 달린 50 ㎖ 튜브 (tube) 3개에 분자량이 140만인 HA-Na 1 g씩을 각각 넣고, 수산화나트륨을 이용하여 pH를 12.5, 13, 14로 조정한 수산화나트륨 수용액을 각각 9 g씩 넣은 후, 가교제로서 BDDE를 50 mg씩을 각각 첨가하였다. BDDE를 첨가한 후, 투명한 용액이 될 때까지 교반하여 가교용 혼합물을 완성하였다. 교반이 완료된 후, 가교용 혼합물의 pH를 측정하고 실시예 1과 동일한 방법의 진공건조를 24시간 동안 실시하였다.
[실험예 3] 가압멸균시 안정성 측정
다당류로 구성된 수불용성 겔을 활용함에 있어 반드시 거쳐야 하는 가압멸균공정에서 안정적인지 여부를 상기 비교예 7 내지 9 및 실시예 3 내지 5의 조성물을 통해 확인하고자 하였다.
건조된 상기 비교예 7 내지 9 및 실시예 3 내지 5의 각 조성물을 200 g의 PBS 7.0에 넣고 24시간 동안 보관 한 후, PBS 7.0에 담궈진 상태로 121℃에서 15분간 가압멸균하였다. 가압멸균 시 수불용성 겔을 인산염 완충용액 내에서 완전히 팽윤되도록 한 후 가압멸균을 실시하였다. 수불용성 겔의 안정성을 확인하기 위해 가압멸균된 수불용성 겔을 증류수로 추가 세척 후 건조하여 중량을 측정하였다. 또한, 상기 비교예 7 내지 9 및 실시예 3 내지 5의 조성물의 pH를 pH 측정기를 이용하여 측정하였다. 멸균안정성은 하기 수학식 1을 통하여 계산하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
[수학식 1]
멸균안정성 (%) = (가압멸균 후 수불용성 겔 건조중량/가압멸균 전 수불용성 겔 건조 중량)×100
에폭시 계열 가교제는 다당류가 용해된 용액의 pH에 따라, pH가 산성이면 에스터(ester), pH가 염기성이면 에테르(ether) 결합을 가교결합으로 생성한다. 표 4에서 볼 수 있듯이, 가압멸균 공정 후에도 수불용성 겔을 유지하기 위해서는 다당류와 에폭시 가교제, 증류수, 그리고 pH 조절제를 혼합하여 제조한 가교용 혼합물의 pH가 12 이상이 되어, 에테르(ether) 결합을 충분히 생성해야 함을 확인하였다.
구분 가교용 혼합물의 pH 멸균안정성 (%)
비교예 7 1.04 0
비교예 8 6.4 0
비교예 9 11.6 0
실시예 3 12.1 91
실시예 4 12.8 95
실시예 5 13.5 96
[비교예 10 및 11]
마개가 달린 50 ㎖ 튜브 (tube) 2개에 분자량이 140만 달톤인 HA-Na 1 g씩을 각각 넣고, 수산화나트륨을 이용하여 pH를 13으로 조정한 수산화나트륨 수용액을 각각 9 g씩 넣은 후, 가교제로서 BDDE를 0.1 mg (0.02 몰%), 300 mg (60 몰%) 을 각각 첨가하였다. BDDE를 첨가한 후, 투명한 용액이 될 때까지 교반하여 가교용 혼합물을 완성하였다. 교반이 완료된 후, 실시예 1과 동일한 방법의 진공건조를 24시간 동안 실시하였다. 건조된 가교용 혼합물을 200 g의 PBS 7.0에 넣고 24시간 동안 보관한 후, 수불용성 겔의 존재 유무를 확인하였다.
[실시예 6 내지 9]
마개가 달린 50 ㎖ 튜브 (tube) 4개에 분자량이 140만 달톤인 HA-Na 1 g씩을 각각 넣고, 수산화나트륨을 이용하여 pH를 13으로 조정한 수산화나트륨 수용액을 각각 9g씩 넣은 후, 가교제로서 BDDE를 0.25 mg (0.05 몰%), 0.5 mg (0.1 몰%), 50 mg (10 몰%), 200 mg (40 몰%) 을 각각 첨가하였다. BDDE를 첨가한 후, 투명한 용액이 될 때까지 교반하여 가교용 혼합물을 완성하였다. 실시예 1과 동일한 방법의 진공건조를 24시간 동안 실시하였다. 건조된 가교용 혼합물을 200 g의 PBS 7.0에 넣고 24시간 동안 보관한 후, PBS 7.0에 넣어둔 상태로 121℃에서 15분간 가압멸균하였다. 수불용성 겔의 안정성을 확인하기 위해 가압멸균된 수불용성 겔을 증류수로 추가 세척 후 건조하여 중량을 측정하였다.
[실험예 4] 가교제 투입량에 따른 물성 측정
가교제 투입량 하한 및 상한을 확인하기 위해 비교예 10 및 11, 실시예 6 내지 9를 비교하였다. 가교제 투입량 및 겔 수율은 각각 하기 수학식 2 및 3에 의하여 계산하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 그 결과 에폭시 계열 가교제는 가교밀도를 기준으로 0.05내지 40몰%를 투입하는 것이 저온진공건조공정을 실시에 적합하다는 것을 확인하였다. 가교제 투입량이 늘어나면서 겔 수율이 오히려 감소하고, 수불용성 겔의 기계적 강도가 감소하는 것은 에폭시 계열 가교제가 가교결합을 만들기도 하지만, 동시에 다당류의 분자사슬을 절단하는 효과가 있음을 보여주었다.
[수학식 2]
가교제 투입량 (몰%) = [(가교제 내 에폭시 관능기 수ⅹ가교제 투입량(g)/가교제 분자량(g/mol))/(수용성 고분자 반복단위 내 결합 가능한 히드록시 관능기 수 ⅹ다당류 투입량(g)/다당류 반복단위 분자량(g/mol))]ⅹ100
[수학식 3]
겔 수율 (%) = (투입된 다당류의 중량/수득된 수불용성 겔 내 다당류의 중량)ⅹ100
구분 가교제 투입량
(몰%)		 겔 수율
(%)		 멸균안정성 (%) 가압멸균 후 팽윤도
비교예 10 0.02 0 0 0
비교예 11 60 0 0 0
실시예 6 0.05 5 0 0
실시예 7 0.1 24 50 측정불가(*)
실시예 8 10 98 94 6.2
실시예 9 40 25 측정불가 측정불가
(*): 수불용설 겔의 기계적 강도가 너무 낮아 가압멸균저항성 측정과 팽윤도 측정이 불가능함.
[비교예 12 내지 15]
마개가 달린 50 ㎖ 튜브 (tube) 4개에 분자량이 140만인 HA-Na 1 g씩을 각각 넣고, 수산화나트륨을 이용하여 pH를 13으로 조정한 수산화나트륨 수용액을 9 g과 가교제로서 BDDE를 10 mg (2 몰%) 을 4개의 튜브에 각각 넣고 투명한 용액이 될 때까지 교반하여 가교용 혼합물을 완성하였다. 교반이 완료된 후, 서로 다른 튜브에 담긴 가교용 혼합물 각각에 대해 실시예 1과 동일한 방법의 진공건조를 실시하되, 건조시작 시작으로부터 1시간 단위로 건조 중인 가교용 혼합물을 하나씩 차례로 꺼내어 둘로 나누었다. 한쪽은 수분함량을 측정용으로 사용하였고, 다른 한 쪽은 50 g의 PBS 7.0에 넣고 24 시간 동안 보관 하였다. PBS 7.0에 넣은 시료를 육안으로 관찰하여 수불용성 겔이 생성되었는지 확인하고, PBS 7.0에 넣어둔 상태로 121℃에서 15분간 가압멸균하였다. 수불용성 겔의 안정성을 확인하기 위해 가압멸균 된 수불용성 겔을 증류수로 추가 세척 후 건조하여 중량을 측정하였다.
[실시예 10 내지 15]
마개가 달린 50 ㎖ 튜브 (tube) 6개에 분자량이 140만인 HA-Na 1 g씩을 각각 넣고, 수산화나트륨을 이용하여 pH를 13으로 조정한 수산화나트륨 수용액을 9 g과 가교제로서 BDDE를 10 mg (2 몰%) 을 4개의 튜브에 각각 넣고 투명한 용액이 될 때까지 교반하여 가교용 혼합물을 완성하였다. 교반이 완료된 후, 실시예 1과 동일한 방법의 진공건조를 실시하였다. 진공건조를 실시하되 건조시작 시작으로부터 5시간 째부터 1시간 단위로 시료를 하나씩 꺼내어 둘로 나누었다. 한쪽은 수분함량을 측정용으로 사용하였고, 다른 한 쪽은 50 g의 PBS 7.0에 넣고 24 시간 동안 보관하였다. PBS 7.0에 넣은 시료를 육안으로 관찰하여 수불용성 겔이 생성되었는지 육안으로 확인하고, PBS 7.0에 넣어둔 상태로 121℃에서 15분간 가압멸균하였다. 수불용성 겔의 안정성을 확인하기 위해 가압멸균 된 수불용성 겔을 증류수로 추가 세척 후 건조하여 중량을 측정하였다.
[실험예 5] 건조 시간에 따른 수분함량 측정
상기 비교예 12 내지 15 및 실시예 10 내지 15에 따른 조성물을 저온진공건조를 통해 가교반응을 수행할 때, 적합한 가교시간을 결정하기 위해 가교시간에 따른 가교효율을 평가하였다. 이를 위해, 저온진공건조 시간별로 준비된 시료를 감열잔량측정기에 넣고 수분함량을 측정하였다. 측정은 105℃에서 3시간 동안 5분 간격으로 중량변화를 측정하는 조건으로 실시하였다. 측정 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
그 결과 저온진공건조 공정에서 가교시간 보다는 가교용 혼합물 내에 포함된 물의 함량이 더 중요한 요소임을 확인하였고, 물의 함량이 가교용 혼합물 내에 20% 이하가 된 이후부터 1시간 이상을 유지하는 것이 적정함을 확인하였다.
구분 건조시간 수분함량
(%)		 겔수율
(%)		 멸균안정성
(%)		 가압멸균 후 팽윤도
비교예 12 1 87 0 0 -
비교예 13 2 61 0 0 -
비교예 14 3 42 0 0 -
비교예 15 4 24 0 0 -
실시예 10 5 15 65 74 25
실시예 11 6 12 88 85 15
실시예 12 7 8 94 94 9.5
실시예 13 8 8 95 95 8.9
실시예 14 9 7 96 95 9.2
실시예 15 10 6 97 96 9.0
[비교예 17 및 18]
마개가 달린 50 ㎖ 튜브 (tube) 2개에 수산화나트륨을 이용하여 pH를 13으로 조정한 수산화나트륨 수용액 4g을 넣고, 분자량이 140만인 HA-Na를 각각 20 mg, 6 g씩 추가하였다. HA-Na가 20 mg 투입된 쪽은 가교제를 투입하지 않았으며, 6 g이 혼합된 쪽 (비교예 18) 에는 가교제인 BDDE를 60 mg (2 몰%) 을 투입하고 교반하였다. 6HA-Na 4g을 투입한 경우 투명한 용액을 얻는 것이 불가능하였다. 교반이 완료된 후, 실시예 1과 동일한 방법의 진공건조를 실시하고, 진공건조 후 PBS 7.0에 넣고 24시간 동안 보관하였다.
[실시예 16 및 22]
마개가 달린 50 ㎖ 튜브 (tube) 6개에 수산화나트륨을 이용하여 pH를 13으로 조정한 수산화나트륨 수용액 4g을 넣고, 분자량이 140만인 HA-Na를 각각 40 mg, 200 mg, 400 mg, 600 mg, 800 mg, 1.6 g, 그리고 4 g을 추가한 후 교반하였다. 교반이 완료된 후, 실시예 1과 동일한 방법의 진공건조를 실시하고, 진공건조 후 PBS 7.0에 넣어 HA-Na의 농도가 0.5 중량%가 되도록 한 후, HA-Na가 완전히 녹으면 점도측정을 원판점도계를 이용하여 실시하였다. 실시예 22는 건조가 완료된 후, PBS 7.0에 넣고 24 시간동안 교반을 실시한 후, 121℃에서 15분간 가압멸균하고, 다시 증류수로 세척하여 재건조하였다.
[실험예 6] 수용성 다당류의 투입량에 따른 물성 측정
상기 비교예 17 및 18 및 실시예 16 내지 22에 따른 조성물의 수용성 다당류 투입량을 측정하였다. 다당류를 가교하여 수불용성 겔을 얻는 공정에서 다당류의 농도를 초기부터 높게 유지하면, 가교용 혼합물 내 수분함량을 줄일 수 있어 가교반응속도를 증대할 수 있다.
결과를 하기 표 7에 나타내었다. 비교예 18에서 보듯이 가교용 혼합물 내 다당류 함량을 극단적으로 높이면 수불용성 겔 수율이 오히려 낮아지는 것을 볼 수 있었다. 이러한 결과는 지나치게 높은 농도의 다당류를 혼합하여 가교용 혼합물 내 다당류와 가교제의 혼합균일성이 나빠지면서 나타나는 결과로 보여진다. 반면에 혼합물의 균일성를 쉽게 하기 위해 가교용 혼합물 내 다당류의 농도를 낮게 하는 것 역시 단점이 있었다. 비교예 17에서 보듯이 저점도의 가교용 혼합물을 얻고자 하여 다당류 첨가량을 극단적으로 낮게 하면, 통상적으로 사용하는 용액상 가교공정을 통해 나타나는 HA-Na 분자량 저하와 유사한 결과를 보인다. 실시예 16 내지 22와 같이, 다당류 반응시에는 다당류를 용해하기 위한 용매인 강염기 수용액 중량 100부에 대하여 다당류가 1에서 100 중량부, 실질적으로는 5에서 66 중량부가 적합하다는 것을 확인하였다.
구분 가교용 혼합물 내HA농도
(중량부*)		 가교제 투입량
(몰%)		 저온진공건조공정을 거친 후 점도
(0.5 중량%, cp)		 겔 수율
(%)
비교예 17 0.5 0 12.5 측정불가
실시예 16 1 0 18
실시예 17 5 0 25
실시예 18 10 0 47.5
실시예 19 15 0 55
실시예 20 20 0 66
실시예 21 40 0 72
실시예 22 100 0 77
비교예 18 150 2 측정불가 34
[비교예 19 내지 23]
마개가 달린 50 ㎖ 튜브 (tube) 에 분자량이 수평균 분자량을 기준으로 7,100 Da, 83,000 Da, 42만 Da, 그리고 140만 Da인 HA-Na를 하기 표 8과 같이 넣고, 수산화나트륨 1 g을 이용하여 pH를 13으로 조정한 수산화나트륨 수용액 9g, BDDE 10 mg (2 몰%) 를 혼합 및 교반하였다. 교반이 완료된 후, 가교용 혼합물이 완전히 투명한 상태가 되면, 실시예 1과 동일한 방법의 진공건조를 24시간 동안 실시하고, 진공건조 후 PBS 7.0에 넣어 24시간 동안 교반하였다. 24시간 PBS 7.0 세척 후 수불용성 겔이 존재하는지 육안으로 확인하고, 121℃에서 15분간 가압멸균하고, 다시 증류수로 세척하여 재건조하였다.
[실시예 23]
마개가 달린 50 ㎖ 튜브 (tube) 에 분자량이 수평균 분자량을 기준으로 42만 Da HA-Na 0.5 g, 그리고 140만 Da인 HA-Na 0.5g, 수산화나트륨을 이용하여 pH를 13으로 조정한 수산화나트륨 수용액 9g, BDDE 10 mg (2 몰%)를 혼합하고, 교반하였다. 가교용 혼합물이 완전히 투명한 상태가 되면, 실시예 1과 동일한 방법의 진공건조를 실시하고, 건조가 완료된 후 완전히 투명해질 때까지 교반하였다. 교반이 완료된 후, 가교용 혼합물이 완전히 투명한 상태가 되면, 실시예 1과 동일한 방법의 진공건조를 24시간 동안 실시하고, 진공건조 후 PBS 7.0에 넣어 24시간 동안 교반하였다. 24시간 PBS 7.0 세척 후 수불용성 겔이 존재하는지 육안으로 확인하고, 121℃에서 15분간 가압멸균하고, 다시 증류수로 세척하여 재건조하였다.
[실험예 7] 수용성 다당류의 분자량에 따른 물성 측정
상기 비교예 19 내지 23 및 실시예 23에 따른 조성물의 다당류의 분자량에 다른 겔 수율을 측정하였다.
히알루론산의 경우 분자량이 백만 Da 정도인 것을 가교반응에 적용하는 것이 일반적인데, 가교공정 중 발생하는 분자량 저하에 대응하기 위해 수백만 Da 이상의 분자량을 갖는 히알루론산을 가교반응에 적용하기도 한다. 하지만, 이러한 방법은 비용증가와 함께 가교용 혼합물 제조 시 높은 점도로 인한 혼합균이성 확보문제가 발생한다.
반면에 낮은 분자량의 다당류에 대해서는 수불용성 겔을 얻는데 적합한 분자량 범위가 밝혀진 바가 없다. 본 발명에서는 비교예 19와 23과 실시예 23을 통해 가교용 혼합물을 제조할 때, HA-Na는 수평균 분자량을 기준으로 42만 Da 이하는 가교반응을 거치더라도 수불용성 겔을 얻을 수 없거나, 가압멸균과정 중에 수불용성 겔이 소멸되어 사용범위가 제한적임을 알 수 있었다. 따라서, 저온진공건조 공정을 사용하여 다당류를 가교할 경우, 다당류의 수평균 분자량이 50만 Da 이상이 되어야 함을 확인하였다.
구분 수평균 분자량으로 구분된 HA-Na 투입량 (g) 겔 수율
(%)		 멸균안정성 (%) 멸균 후 팽윤도
7,100 Da 83,000 Da 42만 Da 140만 Da
비교예 19 1.0 0 0 0 0 0 측정불가
비교예 20 0 1.0 0 0 0 0 측정불가
비교예 21 0 0 1.0 0 85 0 측정불가
비교예 22 0.5 0 0 0.5 81.6 0 측정불가
비교예 23 0 0.5 0 0.5 85.3 0 측정불가
실시예 23 0 0 0.5 0.5 96 75 180배 이상
[실험예 8] 수용성 다당류의 분자량에 따른 물성 측정
상기 실시예 11에 의한 조성물을 사용하되, 저온진공건조 공정 후 PBS 7.0과 증류수를 이용하여 미반응 가교제와 NaOH를 제거하고, 재건조하였다. 비교를 위한 비교예로서, 기존제품인 히아루론산 가교물을 함유한 제품으로 Q-med 사의 Perlane [기존제품 1(P)], Allergane 사의 Juvederm-Ultra [기존제품 2(J-U)], Antheis 사의 Esthelis Basic [기존제품 3(E-B)], PFDC 사의 Glytone-2 [기존제품 4(G-2)]을 사용하였으며, 각 제품은 연구용으로 병원을 통해 구입하여 사용하였다.
재건조된 수불용성 겔을 분쇄하여 100㎛ 이하의 분말로 만들었다. 분말로 제조된 수불용성 겔과 PBS 7.0을 혼합하여 수불용성 겔의 함량이 5 w/v% 가 되도록 하였다. 내부 용적 1 ml인 유리재질 주사기 (prefilled syringe) 에 PBS 7.0과 수불용성 겔을 혼합한 조성물을 담고, 고무재질의 흡자 (stopper) 로 밀봉한 후, 121℃에서 15분간 가압멸균을 실시하였다. 가압멸균된 조성물을 27 1/2G의 규격을 갖는 주사침을 통해 사출할 때 걸리는 압력과 멸균 후 효소분해 저항성을 관찰하였다.
8-1. 주사성능 측정
인장력 측정기를 압축강도 측정 모드(mode)로 설정하고서, 주사성능을 측정하였다. 히알루론산 겔을 포함하는 조성물을 내용물로 담은 주사기의 마개 (cap)을 제거하고 27 1/2G의 규격을 갖는 주사침을 장착한 후, 주사기를 인장력 측정기 측정판에 주사침이 아래쪽이 되도록 수직으로 고정하였다. 인장력 측정기를 가동하여 1 mm/sec의 속도로 주사기에 장착된 밀대 (plunger) 를 밀면서, 사기 내에 담긴 내용물이 완전히 비워질 때까지 압축에 따른 힘을 측정하였다.
8-2. 효소분해 저항성 측정
가압멸균된 히아루론산 조성물을 히아루론산으로서 5 mg과 히아루로니다아제를 200 IU/ml로 녹인 용액 0.5 ml을 혼합하여 히알루론산 1 mg 당 히아루로니다제(hyaluronidase) 20 IU가 혼합되도록 하였다. 히아루론산과 히아루로니다제를 혼합한 후, 고서 37℃에서 8시간 동안 보관하였다. 8시간 후 효소반응을 중단시키기 위해 0.1N HCl 용액 4 ml을 추가하여 강하게 교반한 후 증류수를 더하여 총 10 ml이 되도록 하였다. 하룻동안 교반하여 가교되지 않은 히아루론산이 녹아나오도록 한 후, 3000rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 취하였다. 상층액 내에 포함된 히알루론산을 정량하여 효소분해에서 의해 분해되는 정도를 하기 수학식 4에 의하여 계산하여 확인하였다.
[수학식 4]
효소분해 저항성 (%) = {(효소투입 전 가교된 히알루론산 겔 함량 (mg)-효소 투입 후 측정된 상층액 내 히알루론산 농도 (mg/ml)×10 (ml)) / 효소투입 전 가교된 히알루론산 겔 함량 (mg)}×100
그 결과를 하기 표 9에 나타내었다. 표 9에서 볼 수 있듯이 기존 제품의 히알루론산 함량이 2% 임에 비해 본 발명에서 제시하는 조성물은 히알루론산 함량이 5%로 2.5배 더 높지만, 주사성능은 동등하거나 더 우수함을 볼 수 있다. 또한 효소분해 실험에서도 효소분해 저항성이 우수하여, 생체조직에 이식된 이후, 생체조직 내 체류시간이 더 길어질 가능성을 확인하였다.
제품 주사성능 (N) 효소분해 저항성(%)
실시예 11 25 ± 2 68
기존제품 1 (P) 24 ± 1 39.5
기존제품 2 (J-U) 31 ± 2 23.2
기존제품 3 (E-B) 33 ± 5 0
기존제품 4 (G-2) 31 ± 7 0
[실험예 9] 히알루론산 수불용성 겔의 생체조직 내 유지능력
상기 실험예 8과 동일한 조성물을 가지고 무모쥐 등부위에 주입 후 부피유지기간을 관찰하였다. 무모쥐 등 부위에 가압멸균된 히알루론산 수불용성 겔 조성물을 0.2 ml씩 주입하고, 3개월 간 부피변화를 관찰하였다. 그 결과를 도 1에 도시하였다. 도 1에서 볼 수 있듯이, 본 발명을 통해 얻어진 조성물을 무모쥐 등 부위에 주입한 결과 기존 제품에 비해 개선된 부피유지 효과가 있음을 확인하였다.
[실시예 24 내지 29]
마개가 달린 50 ㎖ 튜브 (tube) 에 분자량이 140만인 HA-Na 1 g씩을 각각 넣고, 수산화나트륨을 이용하여 pH를 13으로 조정한 수산화나트륨 수용액을 9 g과 가교제로서 BDDE를 표 10과 같이 투입하고서, 투명한 용액이 될 때까지 교반하여 가교용 혼합물을 완성하였다. 교반이 완료된 후, 실시예 1과 동일한 방법의 진공건조를 실시하였다. 건조된 가교용 혼합물을 PBS 7.0에 넣고 24시간 교반한 후, 다시 증류수에 넣고 교반하는 방법으로 세척 후, 재건조를 실시하였다.
[실험예 10] 조성물의 외관
상기 실시예 11 및 실시예 23 내지 29의 조성물에 관하여 투명도를 관찰하였다. 수불용성 겔들을 건조된 상태로 분쇄하여 100㎛ 이하가 되도록 한 후, PBS 7.0과 혼합하여 완전팽윤상태가 되도록 한 후, 원심분리하여 상층액을 제거하고 남은 수불용성겔을 1 ml 유리 주사관에 충진하여 가압멸균한 후 외관을 육안으로 관찰하였다. 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.
구분 HA-Na 분자량
(수평균/Da)		 가교제 투입량
(몰 %)		 멸균 후 팽윤도 외관
실시예 11 140만 2 180배 이상 투명
실시예 23 90만 2 15 반투명
실시예 24 140만 0.1 75배 이상 투명
실시예 25 140만 0.5 28 반투명
실시예 26 140만 4 8.8 불투명
실시예 27 140만 8 7.1 불투명
실시예 28 140만 16 5.4 불투명
실시예 29 140만 20 3.5 불투명

Claims (14)

  1. 수용성 다당류, 에폭시 가교제, 염기성 화합물 및 용매를 혼합하는 단계; 및
    상기 혼합액을 1 내지 30℃에서 진공건조하여 용매를 제거하는 단계;를 포함하는 수불용성 겔 조성물의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 진공건조는 1 내지 30mmHg 하에서 이루어지는 것인 수불용성 겔 조성물의 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 용매 제거하는 단계는 수용성 다당류의 농도를 50 내지 99중량%로 농축하는 것인 수불용성 겔 조성물의 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 수용성 다당류는 분자량이 50만 내지 500만 달톤인 수불용성 겔 조성물의 제조방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 수용성 다당류는 용매 중량 100부에 대하여 1 내지 100중량부인 수불용성 겔 조성물의 제조방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 수용성 다당류는 히아루론산(hyaluronic acid), 히아루론산염, 폴리감마글루탐산(poly-γ-glutamic acid), 폴리감마글루탐산염, 한천(agar), 알진산(alginic acid), 알진산염(alginate), 카라기난(carrageenan), 퍼셀라란(furcellaran), 펙틴(pectin), 아라비아 고무(arabic gum), 카라야 고무(karaya gum), 트라가칸스 고무(tragacanth gum), 가티 고무(ghatti gum), 구아 고무(guar gum), 메뚜기콩 고무(locust bean gum), 사이리엄 고무(psyllium seed gum), 젤라틴(gleatin), 키틴(chitin), 덱스트란(dextran), 잔탄 고무(xanthane gum), 키토산(chitosan), 콘드로이친-4-설페이트(chondroitin-4-sulfate), 콘드로이친-6-설페이트(chondroitin-6-sulfate) 및 녹말(starch)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 수불용성 겔 조성물의 제조방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 에폭시 가교제는 수용성 다당류 내의 히드록시기 1몰에 대하여 0.01 내지 60몰부인 수불용성 겔 조성물의 제조방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 에폭시 가교제는 에피클로로히드린(epichlorohydrin), 에피브로모히드린(epibromohydrin), 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리에틸렌글리콘디글리시딜에테르(polyethylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether), 폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르(polytetramethylene glycol diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르(neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르(polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세롤폴리그리시딜에테르(diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤폴리글리시딜에테르(glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르(trimethlypropane polyglycidyl ether), 비스에폭시프로폭시에틸렌(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리쓰리톨폴리글리시딜에테르(pentaerythritol polyglycidyl ether) 및 소르비톨폴리글리시딜에테르(sorbitol polyglycidyl ether)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 수불용성 겔 조성물의 제조방법.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 염기성 화합물은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 리튬을 포함하는 알칼리 금속을 포함하는 화합물인 수불용성 겔 조성물의 제조방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9항 중 어느 하나의 제조방법에 의해 제조된 수불용성 겔 조성물.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 조성물은 수불용성 겔을 조성물 총 중량에 대하여 1 내지 20중량% 포함하는 것인 수불용성 겔 조성물.
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 조성물은 수불용성 겔의 팽윤도가 30 내지 200이면 투명, 팽윤도가 10 내지 30이면 반투명 유백색 및 팽윤도가 2 내지 10이면 불투명 백색인 수불용성 겔 조성물.
  13. 제 10항에 있어서,
    상기 조성물을 pH 6.5 내지 7.5인 인산염 완충용액에 넣고 팽윤 및 가압멸균하였을 때, 최초 투입된 조성물 중량에 대하여 70 내지 99중량%가 불수용성 겔로서 잔존하는 것인 수불용성 겔 조성물.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 조성물의 팽윤중량은 가압멸균 후 잔존하는 불수용성 겔의 건조중량의 2 내지 200배인 것인 수불용성 겔 조성물.
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