CN105087736B - 一种海湾扇贝多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物制药领域，具体讲，涉及一种海湾扇贝多肽及其应用。该海湾扇贝多肽的制备方法包括：对新鲜海湾扇贝进行前处理、研磨、超声破碎、酶解、超滤和层析；其中，酶解的先用复合蛋白酶处理，再用碱性蛋白酶处理，再经超滤和层析得到分子量为700～790u的海湾扇贝多肽。本发明还涉及该海湾扇贝多肽在制备预防或治疗癌症的药物、食品或保健品中的应用。本发明的海湾扇贝多肽不仅产率高、纯度高，经人肝癌SMMC‑7721细胞的生长抑制试验，证明具有很强的抑制肿瘤细胞的活性。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体讲，涉及一种海湾扇贝多肽及其应用。
背景技术
海洋肽类因其具有抗肿瘤、抗氧化、抗真菌、抗病毒及免疫调节等生理活性，成为目前海洋性功能成分的研究热点之一。海湾扇贝(argopecten irradias)属瓣鳃纲，异柱目，扇贝科，扇贝属，粗蛋白含量为12％左右，氨基酸组成均衡，因此海湾扇贝是海洋肽类开发利用的理想原料之一，但国内外有关海湾扇贝多肽提取工艺的研究尚无报道。
研究表明，海洋多肽的生理作用与组成多肽的氨基酸序列有关；一些生物活性肽的生理功能还与多肽的结构、疏水性、所带电荷等有关。
恶性肿瘤又称为癌症，是目前严重威胁人类生命和影响人类健康的主要疾病之一。海洋生物来源的抗肿瘤活性物质具有毒副作用小、药效高的特点，现已成为天然抗癌药物极好的潜在资源。扇贝是海洋生物的一种，因其营养价值高且含有多种生理活性成分，在海洋抗癌药物研究中具有很好的应用和开发前景。
关于海洋多肽的研究，已公开一些相关的现有技术。
专利申请200810189188.3公开了文蛤活性多肽在制备抗肺癌药物中的应用，该申请采用盐析醇沉的方法制备得到文蛤活性多肽，采用MTT法和细胞计数法，实验结果显示，文蛤多肽对肺癌细胞A549具有特异的诱导杀死效应，对肺癌细胞A549有明显的抑制作用。
专利ZL201110036545.4公开了一种文蛤多肽及其制备方法，该文蛤多肽N-末端序列为IDEIQNTGGGTNFR，其分子量为15Ku，其制备方法为将文蛤体液经过硫酸铵分级沉淀、超滤、离子交换层析、疏水层析、反相层析后获得一种分子量为15Ku的多肽。用MTT比色法检测其抗肿瘤活性，发现该化合物能显著抑制多种肿瘤细胞的生长，但对正常细胞没有抑制作用。
目前，有关扇贝多肽结构及生理功能的研究多见于栉孔扇贝多肽，而海湾扇贝多肽(polypeptide from argopecten irradias，PAI)的相关研究尚属空白。为次，特提出本发明。
发明内容
本发明的首要发明目的在于提出了一种海湾扇贝多肽。
本发明的第二发明目的在于提出该海湾扇贝多肽的用途。
为了实现本发明的目的，采用的技术方案为：
本发明涉及一种海湾扇贝多肽，其制备方法包括：对新鲜海湾扇贝进行前处理、研磨、超声破碎、酶解、超滤和层析；其中，酶解的步骤为：先用复合蛋白酶处理，再用碱性蛋白酶处理；复合蛋白酶处理的条件为：底物浓度为12％～14％、酶用量1200～1400U/g、pH 5.5～7.0、温度50～55℃、时间1～3h；其中，pH优选为6.5～7.0、温度优选为50～54℃；碱性蛋白酶处理的条件为：底物浓度6％～8％、酶用量600～700U/g、pH 6.0～8.0、温度56～60℃、时间2～3h；其中，pH优选为7.0～8.0。
本发明的海湾扇贝多肽的分子量为700～950u，优选700～790u。
本发明的第一优选技术方案为：超声破碎的条件为：温度50～55℃，功率350w，超声和间歇时间比3∶1、时间20～30min。
本发明的第二优选技术方案为：在复合蛋白酶处理后，经过低温三级超滤后再碱性蛋白酶处理，低温超滤的温度为5～10℃，截留分子量为0～1ku的蛋白水解物。
本发明的第三优选技术方案为：超滤步骤的条件为：将经过两步水解后的海湾扇贝水解液依次进行三级超滤，截留分子量为0～1ku的蛋白水解物。
本发明的第四优选技术方案为：三级超滤的超滤膜为分别经过截留分子量为10ku、5ku和1ku的超滤膜。
本发明的第五优选技术方案为：层析步骤的条件为：采用Spehadex G-15层析柱对分子量为0～1ku的组分进行分离纯化，具体步骤：上样浓度为20～30mg/mL，上样量1～4mL，蒸馏水洗脱流速0.1～0.15mL/min。
本发明的第六优选技术方案为：在水解后还包括一个加热灭酶的步骤，条件为：加热至95～100℃灭酶15～20min。
本发明还涉及该海湾扇贝多肽在制备预防或治疗癌症药物中的应用，以及海湾扇贝多肽在制备预防癌症的食品或保健品中的应用，癌症优选肝癌。
本发明的复合蛋白酶选用丹麦诺维信(Novo)公司生产的复合蛋白酶Protemax(规格2.4AU/g)；碱性蛋白酶选用丹麦诺维信(Novo)公司生产的碱性内切蛋白酶Alcalase(规格1.5AU/g)。
下面对本发明的技术方案做进一步的解释和说明。
本发明以海湾扇贝为原料，对海湾扇贝多肽的制备工艺进行优化，提出了一种产量高、活性高的海湾扇贝多肽制备方法。此外对其抗肿瘤效果进行了研究，研究发现，本发明的海湾扇贝多肽具有较强的抑制肝癌细胞生长的作用。
本发明通过对扇贝多肽的深入研究，提出了一种高活性的海湾扇贝多肽，该多肽具有较小的分子量，经人肝癌SMMC-7721细胞的抑制率试验，表明其具有很强的抑制肿瘤细胞的活性。本发明创新性的使用碱性蛋白酶对扇贝进行水解，克服了酸性水解酶酶切位点不确定的缺陷。为了使扇贝中蛋白质充分水解，本发明使用了两种蛋白酶分别水解，不仅避免了两种水解酶共同作用对蛋白质大分子的共同剪切作用从而造成游离氨基酸含量增加的缺陷，并且最大限度的对蛋白质大分子片段进行了水解，提高了目的多肽的产量，水解率可达到48.10％。
本发明中水解率的计算方式为：
DH(％)＝(氨基酸态氮的质量/样品中总氮的质量)×100％
①总氮含量：样品中总氮含量的测定采用凯氏定氮法。
②氨基酸态氮含量：采用甲醛电位滴定法进行滴定，按如下公式计算。
X-氨基酸态氮含量，g/100mL；
C-NaOH标准溶液的浓度，mol/L；
V1-测定试样稀释液加入甲醛后消耗NaOH标准溶液的体积，mL；
V2-空白滴定加入甲醛后消耗NaOH标准溶液的体积，mL；
V3-试样稀释液取用量，mL；
0.014-与1.00mL NaOH标准滴定溶液相当的氮的质量，g。
本发明涉及一种海湾扇贝多肽的制备方法包括：对新鲜海湾扇贝进行前处理、研磨、超声破碎、酶解、超滤和层析。
本发明选用了在研磨后进行超声破碎的步骤，节约水解的时间，避免游离氨基酸含量增高，可提高水解效率。
本发明创新的采用了两步酶解的方法对海湾扇贝进行水解，先用复合蛋白酶处理，再用碱性蛋白酶处理。并对复合蛋白酶和碱性蛋白酶的酶解处理条件进行了优化选择。在选用复合蛋白酶处理中，选择了高底物浓度、高酶用量的处理方式；在采用碱性蛋白酶处理过程中，选用了低底物浓度和低酶用量的处理条件，并分别对pH值和处理温度进行了优化。单酶法水解存在酶水解度较低、耗时长及多肽得率低等缺点；而将几种酶结合起来使用则可以提高酶解效率。因此，从水解度和多肽得率等方面综合考虑，本发明选用水解度较高的复合蛋白酶和碱性蛋白酶进行分步水解，以求得到水解度高，低分子量的海湾扇贝多肽。经试验发现，本发明采用不同的酶接力水解，所达到的水解度及多肽得率均高于加入单种水解酶水解、以及一次性加入混合酶水解。
通过对蛋白水解产物的进一步纯化，得到了分子量为700～790u的多肽产物，经人肝癌SMMC-7721细胞的生长抑制试验，证明其具有更强的抑制肿瘤细胞的活性。
在对蛋白水解物的纯化过程中，先对经过两步水解的产物进行三级超滤，分别经过截留分子量为10ku、5ku和1ku的超滤膜，获得不同分子质量的滤液组分：＞10ku组分、5ku～10ku组分、1ku～5ku组分、0～1ku组分。然后对含有本发明活性多肽的0～1ku组分进行层析，以获得特定分子量大小的目的多肽。层析采用Spehadex G-15层析柱，该柱依据分子筛效应分离原理，具有稳定性好，分离度高等优点。经层析处理后，目的多肽的纯度可以达到83％。
在本发明的某一优选实施方式中，在复合蛋白酶处理后，可以先经过低温超滤，再进行碱性蛋白酶处理，低温超滤的温度为5～10℃，先把分子量为0～1ku的多肽截留出来，避免在后续的酶处理过程中的过度分解。
以往对活性物质进行体外抑瘤活性检测的报道中，多采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)，与MTT相比，WST-8具有操作简化、结果更加稳定、线性范围更宽、灵敏度更高的优点。为此，本发明选用CCK-8法检测海湾扇贝多肽对人肝癌SMMC-7721细胞的增殖抑制作用，结果表明，不同浓度(4mg/mL、8mg/mL和12mg/mL)的海湾扇贝多肽在24h能显著抑制SMMC-7721细胞的增殖，随着海湾扇贝多肽浓度的提高，抑制效果逐渐增强，12mg/mL海湾扇贝多肽组的效果最明显。说明，本发明的海湾扇贝多肽能够抑制体外培养的SMMC-7721细胞增殖，具有抗肿瘤活性。
在细胞凋亡研究中流式细胞术能够较准确地测出凋亡细胞占所测总细胞的百分含量。本发明用Annexin V-PE/7-AAD双染细胞凋亡试剂盒经流式细胞仪检测SMMC-7721细胞的凋亡情况，结果显示，与对照组相比，不同浓度海湾扇贝多肽处理组的SMMC-7721细胞均出现一定程度的凋亡，且随着海湾扇贝多肽浓度的增加，晚期凋亡率和早期凋亡率明显升高。表明，海湾扇贝多肽对体外培养的人肝癌SMMC-7721细胞的早期凋亡和晚期凋亡均有一定的诱导作用，且呈剂量-效应正相关。经试验证实，本发明制备得到的海湾扇贝多肽能抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，从而发挥其抑瘤作用。通过对比试验证实，本发明的制备得到的海湾扇贝多肽的抗肿瘤活性高于采用其他方法制备得到的海湾扇贝多肽。
本发明的具体实施方式仅限于进一步解释和说明本发明，并不对本发明的内容构成限制。
具体实施方式
实施例1 海湾扇贝多肽的制备：
1、取新鲜海湾扇贝，进行去除内脏、清洗等前处理；
2、将清洗后的扇贝粉碎机研磨：功率为2.2kw，时间为10min；
3、超声波超声制备匀浆液：温度55℃，功率350w，超声和间歇时间比3∶1、时间30min；
4、酶解的步骤为：先用复合蛋白酶处理：底物浓度为12％、酶用量1200U/g、pH6.5、温度50℃、时间2h；再用碱性蛋白酶处理：底物浓度6％、酶用量600U/g、pH 7.5、温度60℃、时间2h；
5、灭酶：加热至95℃灭酶10min；
6、分级超滤：分别经过截留分子量为10ku、5ku和1ku的超滤膜，获得不同分子质量的滤液组分：＞10ku组分、5ku～10ku组分、1ku～5ku组分、0～1ku组分；
7、采用Spehadex G-15层析柱对0～1ku组分的超滤液进行分离纯化：样品质量浓度30mg/mL，上样量2mL，蒸馏水洗脱流速0.15mL/min，经MALDI-TOF-TOF质谱检测得到目的海湾扇贝的分子量为700～790u。
制备得到的海湾扇贝多肽的纯度为83％，水解率为47.70％。
实施例2 海湾扇贝多肽的制备：
1、取新鲜海湾扇贝，进行去除内脏、清洗等前处理；
2、将清洗后的扇贝粉碎机研磨：功率为2.2kw，时间为7min；
3、超声波超声制备匀浆液：温度50℃，功率350w，超声和间歇时间比3∶1、时间25min；
4、酶解的步骤为：先用复合蛋白酶处理，再用碱性蛋白酶处理；其中复合蛋白酶处理的条件为：底物浓度为13％、酶用量1300U/g、pH 7.0、温度55℃、时间3h；
碱性蛋白酶处理的条件为：底物浓度7％、酶用量700U/g、pH7.0、温度60℃、时间2h；
5、灭酶：加热至95～100℃灭酶15～20min；
6、分级超滤：分别经过截留分子量为10ku、5ku和1ku的超滤膜，获得不同分子质量的滤液组分：＞10ku组分、5ku～10ku组分、1ku～5ku组分、0～1ku组分。
7、采用Spehadex G-15层析柱对0～1ku组分的超滤液进行分离纯化：样品质量浓度30mg/mL，上样量2mL，蒸馏水洗脱流速0.15mL/min，经MALDI-TOF-TOF质谱检测得到目的海湾扇贝的分子量为700～790u。
制备得到的海湾扇贝多肽的纯度为82％，水解率为47.85％。
实施例3 海湾扇贝多肽的制备：
1、取新鲜海湾扇贝，进行去除内脏、清洗等前处理；
2、将清洗后的扇贝粉碎机研磨：功率为2.2kw，时间为5～10min；
3、超声波超声制备匀浆液：温度50～55℃，功率350w，超声和间歇时间比3∶1、时间20～30min；
4、酶解的步骤为：先用复合蛋白酶处理，再用碱性蛋白酶处理；其中复合蛋白酶处理的条件为：底物浓度为14％、酶用量1400U/g、pH 6.0、温度54℃、时间1h；碱性蛋白酶处理的条件为：底物浓度8％、酶用量650U/g、pH 8.0、温度58℃、时间2.5h；
5、灭酶：加热至95～100℃灭酶15～20min；
6、分级超滤：分别经过截留分子量为10ku、5ku和1ku的超滤膜，获得不同分子质量的滤液组分：＞10ku组分、5ku～10ku组分、1ku～5ku组分、0～1ku组分。
7、采用Spehadex G-15层析柱对0～1ku组分的超滤液进行分离纯化：样品质量浓度30mg/mL，上样量2mL，蒸馏水洗脱流速0.15mL/min，经MALDI-TOF-TOF质谱检测得到目的海湾扇贝的分子量为700～790u。
制备得到的海湾扇贝多肽的纯度为82％，水解率为48.05％。
实施例4 海湾扇贝多肽的制备：
1、取新鲜海湾扇贝，进行去除内脏、清洗等前处理；
2、将清洗后的扇贝粉碎机研磨：功率为2.2kw，时间为10min；
3、超声波超声制备匀浆液：温度55℃，功率350w，超声和间歇时间比3∶1、时间30min；
4、酶解的步骤为：先用复合蛋白酶处理：底物浓度为12％、酶用量1200U/g、pH6.5、温度50℃、时间2h；分别经过截留分子量为10ku、5ku和1ku的超滤膜，获得不同分子质量的滤液组分：＞10ku组分、5ku～10ku组分、1ku～5ku组分、0～1ku组分；其中对0～1ku组分进行步骤7的层析，其他组分经浓缩后继续用碱性蛋白酶处理：底物浓度6％、酶用量600U/g、pH 7.5、温度60℃、时间2h；
5、灭酶：加热至95℃灭酶10min；
6、分级超滤：分别经过截留分子量为10ku、5ku和1ku的超滤膜，获得不同分子质量的滤液组分：＞10ku组分、5ku～10ku组分、1ku～5ku组分、0～1ku组分；
7、采用Spehadex G-15层析柱对0～1ku组分的超滤液进行分离纯化：样品质量浓度30mg/mL，上样量2mL，蒸馏水洗脱流速0.15mL/min，经MALDI-TOF-TOF质谱检测得到目的海湾扇贝的分子量为700～790u。
制备得到的海湾扇贝多肽的纯度为82％，水解率为48.12％。
实验例1
1实验方法
1.1材料与试剂
人肝癌SMMC-7721细胞由国家细胞资源共享平台购买；RPMI-1640培养基购自美国GIBCO公司；胎牛血清购自天津市川页生化制品有限公司；细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒(CCK-8)购自上海同仁化学公司；庆大霉素购自郑州羚锐制药有限公司；Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；胰蛋白酶和EDTA购自美国GIBCO公司；DMSO购自Sigma公司；实施例1制备得到的海湾扇贝多肽。
1.2主要仪器与设备
FACS-Aria II型流式细胞仪为美国BD公司产品；Ti-U荧光倒置显微镜为日本Nikon公司产品；SpectraMax M2e多功能微孔板检测系统为美国Molecular Devices公司产品；HEPA class 100CO2培养箱为美国Thermo Electron Corporation公司产品；1300SERIES A2生物安全柜为美国Thermo Fisher公司产品；TDL-50B低速台式离心机为上海安亭科学仪器厂产品；D-1型自动蒸汽灭菌锅为北京发展恩科贸有限公司产品。
1.3试验方法
1.3.1人肝癌SMMC-7721细胞培养
在RPMI-1640培养基中加入10％胎牛血清和终浓度为100U/ml的庆大霉素，调整至pH7.4，将人肝癌SMMC-7721细胞复苏后，加入上述RPMI-1640培养基，于37℃、5％CO2培养箱中扩增培养，每24h换液1次，直至对数生长期。取对数生长期细胞用不同浓度海湾扇贝多肽处理。
1.3.2海湾扇贝多肽对肿瘤细胞生长的影响
采用CCK-8法检测。取对数生长期的人肝癌SMMC-7721细胞，经0.25％的胰蛋白酶消化后，配成5×104/mL的单细胞悬液，接种于96孔板中，100μL/孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养过夜，弃培养液。设对照组和试验组，试验组分别加入实施例1制备得到的不同浓度海湾扇贝多肽(4mg/mL、8mg/mL和12mg/mL，用RPMI-1640培养基稀释)，对照组加入等体积RPMI-1640培养基。继续培养，于24h后检测海湾扇贝多肽对细胞增殖的抑制率。检测前4h加入CCK-8试剂(20μL/孔)，继续培养4h后用多功能微孔板检测系统测定吸光度(A490值)，计算细胞增殖抑制率。每组每个时间点设4个重复孔。
1.3.4海湾扇贝多肽对肿瘤细胞凋亡的影响
采用Annexin V-PE/7-AAD双染细胞凋亡试剂盒检测人肝癌SMMC-7721细胞的凋亡。取对数生长期的人肝癌SMMC-7721细胞，经0.25％的胰蛋白酶消化后，配成1×106/mL单细胞悬液，分别接种于6个50mL的培养瓶中，37℃、5％CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后，试验组分别加入不同浓度海湾扇贝多肽(4mg/mL、8mg/mL和12mg/mL，用RPMI-1640培养基稀释)，对照组加入等体积RPMI-1640培养基，继续培养24h后，1500r/min，离心7min收集细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)洗涤2次，用标记缓冲液重悬细胞，调整细胞密度为1×106/mL，吹打混匀后取100μL细胞悬液加入5mL培养管，分别加入5μLPE及5μL AnnexinV-7-AAD，混匀后避光染色20min，加入400μL标记缓冲液，流式细胞仪检测细胞凋亡。
1.3.5统计学处理
采用SAS9.1软件进行数据统计学处理和分析。采用t检验分析两组间差异，方差不齐者采用秩和检验分析，p＜0.05为有统计学意义。
2结果
2.1海湾扇贝多肽对体外培养的人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响
海湾扇贝多肽作用体外培养的人肝癌SMMC-7721细胞24h后，采用CCK-8法检测结果显示各浓度海湾扇贝多肽对SMMC-7721细胞增殖均出现不同程度的抑制作用，结果如表1所示。
表1海湾扇贝多肽对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用(n＝4，)
注：*p＜0.05，**p＜0.01与对照组相比。
由表1可知，3个不同浓度(4mg/mL、8mg/mL和12mg/mL)海湾扇贝多肽作用HepG2细胞24h，对HepG2细胞的生长均具有明显的抑制，并且随着多肽浓度增加，抑制率也随之增加，且与对照组相比均有显著性差异(p＜0.01)。
2.2海湾扇贝多肽对体外培养的人肝癌SMMC-7721细胞早期凋亡的影响
海湾扇贝多肽作用细胞24h后，用Annexin V-PE/7-AAD双染细胞凋亡试剂盒经流式细胞仪检测后，SMMC-7721细胞凋亡情况如表2所示。
表2海湾扇贝多肽对SMMC-7721细胞早期凋亡的影响(n＝4，)
注：※p＜0.05与对照组相比。
由表2可知，与对照组死亡或晚期凋亡率和自发早期凋亡率相比，各浓度海湾扇贝多肽组诱导细胞凋亡率均显著升高(p＜0.05)，且随海湾扇贝多肽浓度的提高，细胞凋亡发生率也相应增高，呈正相关。其中，海湾扇贝多肽浓度为12mg/mL时，细胞凋亡率达到31.33±0.024。说明，海湾扇贝多肽对SMMC-7721细胞具有明显诱导细胞凋亡的作用。
实验例2：不同制备方法制备得到的海湾扇贝多肽含量的比较
按照实施例1的方法进行海湾扇贝多肽的制备，区别在于：
对比例1：不进行超声；
对比例2：超声条件为：超声温度50℃，功率150w，超声和间歇时间比1∶1、时间20min；
对比例3：超声条件为：超声温度55℃，功率450w，超声和间歇时间比1∶4、时间20min。
表3：
| 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | |
| 水解率(％) | 36.26％ | 40.10％ | 39.02％ |
实验例3：不同的酶水解条件得到的海湾扇贝多肽含量的比较
按照实施例1的方法进行海湾扇贝多肽的制备，区别在于：酶解采用以下条件：
对比例4：仅用酸性蛋白酶处理：底物浓度为13.8％、酶用量1312.82U/g、pH值3.53、温度50℃、酶用量1312.82U/g；
对比例5：仅用复合蛋白酶处理：底物浓度为14％、酶用量1400U/g、pH6.0、温度55℃、时间3h；
对比例6：仅用碱性蛋白酶处理：底物浓度8％、酶用量700U/g、pH 7.5、温度60℃、时间2h；
对比例7：同时用复合蛋白酶和碱性蛋白酶处理；底物浓度为10％，复合蛋白酶用量1200U/g，碱性蛋白酶用量600U/g、pH7.0、温度55℃、时间3h。
表4：
| 对比例4 | 对比例5 | 对比例6 | 对比例7 | |
| 水解率(％) | 26.25％ | 25.62％ | 28.28％ | 29.76％ |
将上述对比例按照实验例1的方法进行肿瘤抑制试验，在浓度为12mg/mL的条件下，对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用为：
表5：不同对比例对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用(n＝4，)
注：*p＜0.05、**p＜0.01与实验例1组相比。
实验例4：
按照实施例1的方法进行海湾扇贝多肽的制备，区别仅在于改变复合蛋白酶处理条件，具体条件如表6所示：
表6：对比例8～15中复合蛋白酶处理条件：
| 底物浓度(％) | 酶用量(U/g) | pH | 温度(℃) | |
| 对比例8 | 8 | 1200 | 6.5 | 50 |
| 对比例9 | 16 | 1200 | 6.5 | 50 |
| 对比例10 | 12 | 800 | 6.5 | 50 |
| 对比例11 | 12 | 2400 | 6.5 | 50 |
| 对比例12 | 12 | 1200 | 6.0 | 50 |
| 对比例13 | 12 | 1200 | 8.0 | 50 |
| 对比例14 | 12 | 1200 | 6.5 | 45 |
| 对比例15 | 12 | 1200 | 6.5 | 60 |
按对比例8～15的处理条件制备，制备得到的海湾扇贝多肽的水解率如表7所示：
表7：对比例8～15的水解率
| 水解率(％) | |
| 对比例8 | 41.3 |
| 对比例9 | 42.4 |
| 对比例10 | 31.7 |
| 对比例11 | 42.1 |
| 对比例12 | 41.9 |
| 对比例13 | 40.5 |
| 对比例14 | 38.6 |
| 对比例15 | 42.5 |
将对比例8～15制备得到的产品按照实验例1的方法进行肿瘤抑制试验，在浓度为12mg/mL的条件下，对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用的实验结果如表8所示：
表8：对比例8～15对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用(n＝4，)
注：*p＜0.05、**p＜0.01与实验例1组相比。
实验例5：
按照实施例1的方法进行海湾扇贝多肽的制备，区别仅在于改变碱性蛋白酶处理条件，具体条件如表9所示：
表9：对比例16～23的碱性蛋白酶处理条件
| 底物浓度(％) | 酶用量(U/g) | pH | 温度(℃) | |
| 对比例16 | 4 | 600 | 7.5 | 60 |
| 对比例17 | 10 | 600 | 7.5 | 60 |
| 对比例18 | 6 | 400 | 7.5 | 60 |
| 对比例19 | 6 | 800 | 7.5 | 60 |
| 对比例20 | 6 | 600 | 6.0 | 60 |
| 对比例21 | 6 | 600 | 9.0 | 60 |
| 对比例22 | 6 | 600 | 7.5 | 45 |
| 对比例23 | 6 | 600 | 7.5 | 65 |
表10：对比例16～23的水解率
| 水解率(％) | |
| 对比例16 | 39.5％ |
| 对比例17 | 41.7％ |
| 对比例18 | 39.8％ |
| 对比例19 | 41.6％ |
| 对比例20 | 36.5％ |
| 对比例21 | 42.2％ |
| 对比例22 | 41.7％ |
| 对比例23 | 38.9％ |
将对比例16～23制备得到的产品按照实施例1的方法进行肿瘤抑制试验，在浓度为12mg/mL的条件下，对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用为：
表11：不同对比例16～23对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用(n＝4，)
注：*p＜0.05、**p＜0.01与实验例1组相比。
Claims (10)
1.一种海湾扇贝多肽，其特征在于，所述海湾扇贝多肽的制备方法包括：对新鲜海湾扇贝进行前处理、研磨、超声破碎、酶解、超滤和层析；
其中，所述超声破碎的条件为：温度50～55℃，功率350w，超声和间歇时间比3∶1、时间20～30min；
所述酶解的步骤为：先用复合蛋白酶处理，再用碱性蛋白酶处理；
所述复合蛋白酶处理的条件为：底物浓度为12％～14％、酶用量1200～1400U/g、pH5.5～7.0、温度50～55℃、时间1～3h；
所述碱性蛋白酶处理的条件为：底物浓度6％～8％、酶用量600～700U/g、pH 5.0～8.0、温度56～60℃、时间2～3h；
所述超滤步骤的条件为：将经过两步水解后的海湾扇贝水解液依次进行三级超滤，截留分子量为0～1ku的蛋白水解物。
2.根据权利要求1所述的海湾扇贝多肽，其特征在于，所述复合蛋白酶处理时，pH为6.5～7.0。
3.根据权利要求1所述的海湾扇贝多肽，其特征在于，所述复合蛋白酶处理时，温度为50～54℃。
4.根据权利要求1所述的海湾扇贝多肽，其特征在于，所述碱性蛋白酶处理时，pH为7.0～8.0。
5.根据权利要求1所述的海湾扇贝多肽，其特征在于，所述的三级超滤为分别经过截留分子量为10ku、5ku和1ku的超滤膜。
6.根据权利要求1所述的海湾扇贝多肽，其特征在于，所述的层析步骤的条件为：采用Spehadex G-15层析柱对分子量为0～1ku的组分进行分离纯化，具体步骤为：上样浓度为20～30mg/mL，上样量1～4mL，蒸馏水洗脱流速0.1～0.15mL/min。
7.根据权利要求1所述的海湾扇贝多肽，其特征在于，在水解后还包括一个加热灭酶的步骤，条件为：加热至95～100℃灭酶15～20min。
8.根据权利要求1～7任一权利要求所述的海湾扇贝多肽，其特征在于，所述海湾扇贝多肽的分子量为700u～950u。
9.根据权利要求8所述的海湾扇贝多肽，其特征在于，所述海湾扇贝多肽的分子量为700u～790u。
10.一种如权利要求1的海湾扇贝多肽在制备治疗肝癌药物中的应用。
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