CN109022525A - 一种改善记忆功能的核桃活性肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种改善记忆功能的核桃活性肽的制备方法，属于活性肽制备技术领域。以脱脂核桃粕为原料，经粉碎均质后，通过碱性蛋白酶和中性蛋白酶两步控制酶解技术充分水解，并采用膜分离技术，得到分子量﹥10kDa、10kDa～3kDa及﹤3kDa三个组分多肽。本发明所述技术，在两种酶共同作用下获得高水解度、高活性的核桃肽。分别以小鼠Morris水迷宫中空间探索试验和定位航行试验、避暗试验和跳台试验等行为学试验为指标，评价本发明物对实验动物改善记忆力的影响。结果显示，肽链较短的小肽(＜3kDa)对记忆障碍小鼠的空间认知及学习能力具有改善作用，并为食源性肽，具有安全性高，可长期服用。

Description

一种改善记忆功能的核桃活性肽及其制备方法

技术领域

本发明属于活性肽制备技术领域，具体涉及一种以脱脂核桃粕为原料制备的具有明显改善记忆功能的核桃活性肽及其制备方法。

背景技术

随着全球人口老龄化的增加，与记忆力障碍密切相关的帕金森病(Parkinson'sdisease，PD)、阿尔滋海默病(Alzheimer's disease，AD)等一系列神经退行性疾病的发病率逐年递增，给家庭和社会带来了沉重的负担。目前，记忆衰退患者的主要治疗药物为盐酸多奈哌奇和吡啦西坦等化学合成类药物，虽然可以改善患者空间学习和记忆认知能力，但同时会产生一些不良反应，如幻觉、易激怒和攻击行为的精神紊乱。因此开发和使用天然来源改善记忆力的药物显得尤为重要。

近年来，食源性植物蛋白的开发与利用成为人们关注的热点，利用酶工程技术获得的蛋白肽更是具有抗衰老、抗氧化、改善记忆力、消除疲劳、增强人体免疫功能等生理功能。核桃仁是一种优质的植物蛋白，蛋白含量高达20％，蛋白质中氨基酸含量丰富，且必需氨基酸种类齐全。利用酶控制水解技术，制备具有抗氧化和改善记忆力的生物活性肽，用以预防和治疗氧化及自由基损伤引发的记忆力障碍等疾病具有很好的现实意义。

发明内容

本发明目的是提供一种具有明显改善记忆功能的核桃活性肽及其制备方法，以脱脂核桃粕为原料，采用复合酶控制水解技术，通过分离纯化，制备得到具有明显改善记忆的核桃活性肽。

本发明所述的一种改善记忆功能的核桃活性肽的制备方法，其步骤如下：

(1)核桃脱脂蛋白粉制备

取脱脂核桃粕50～250g，经多功能粉碎机粉碎30～90s后，与蒸馏水按照质量比1：5～10的比例混合，经胶体磨均质30～90s，静止3～8h，去掉部分上清液后，于3000～8000rpm离心10～20min；留沉淀，于-50℃、＜30Pa条件下冷冻干燥20～30h，得到核桃脱脂蛋白粉；

(2)核桃活性肽粗粉的制备

将步骤(1)制备的核桃脱脂蛋白粉与蒸馏水配制成质量分数2％～7％溶液，在90～100℃条件下恒温水浴10～20min，冷却至40℃～60℃后，用1mol/L NaOH调节溶液pH至7.5～9.5；保持pH值恒定，加入碱性蛋白酶Alcalase 2.4L，加酶量为1000U/g～9000U/g，酶解0.5～5h后，溶液在90℃下灭酶10～20min；最后冷却至40℃～60℃，用1mol/L NaOH调节溶液pH至6.5～7.5；保持pH值恒定，加入中性蛋白酶Neutrase 0.8L，加酶量为1000U/g～11000U/g，酶解0.5～5h后，90℃灭酶10～20min；5000～8000rpm离心10～20min，上清液冷冻干燥后得到核桃活性肽粗粉；加入中性蛋白酶和加入碱性蛋白酶，加酶量均是按照核桃脱脂蛋白粉进行计算；

(3)核桃活性肽粗提物的分离纯化

将步骤(2)得到的核桃活性肽粗粉用蒸馏水配成浓度1～5mg/mL的溶液，利用超滤膜进行分离；将得到的溶液收集，旋转蒸发后-20℃冷冻后，于-50℃、＜30Pa条件下冷冻干燥20～30h，得到本发明所述的具有改善记忆的核桃活性肽。

步骤(3)中所述的超滤膜为切向流超滤系统及Biomax改良聚醚砜复合膜包，分别采用膜分子截流量为10kDa和3kDa的超滤膜进行分离；先用分子截流量为10kDa的膜包过膜，得出>10kDa和＜10kDa两个不同分子量组分的核桃活性肽；再将＜10kDa分子量组分的核桃活性肽粗液用分子截流量为3kDa的膜包过膜，得到3～10kDa和＜3kDa两个不同分子量组分的核桃活性肽，这样经过10kDa和3kDa的超滤膜就可以最终得到分子量＜3kDa的活性肽。

本发明相比现有技术优点为：

本发明首次公开了一种改善记忆功能的核桃活性肽的制备方法，利用脱脂核桃粕为原料，经粉碎均质后，通过碱性蛋白酶和中性蛋白酶两步控制酶解技术充分水解，并采用膜分离技术，得到﹥10kDa、10kDa～3kDa及﹤3kDa三个组分多肽，本发明公布的复合酶控制水解技术，在其共同作用下获得高水解度，高活性肽。按照《保健食品检验与评价规范》对其进行功效实验，分别以小鼠Morris水迷宫中空间探索试验和定位航行试验、避暗试验和跳台试验等行为学试验为指标，评价本发明物对实验动物改善记忆力的影响。结果显示，肽链较短的小肽(＜3kDa)对记忆障碍小鼠的空间认知及学习能力具有改善作用，并为食源性肽，具有安全性高，可长期服用。本发明属于活性肽制备技术领域。

附图说明

图1：为小鼠定位航行试验路径图；

图中黑色框为计算机探头所监测的包括泳池在内的实验区域，黑色大圆圈为泳池，黑色小圆圈和在小圆圈与大圆圈中间的圆圈为计算机自动将泳池平均分成三等分，其中“十字”将泳池划分为四个象限，右上区域为NE象限，右下区域为SE象限，左上区域为NW象限，左下区域为SW象限。图1为将小鼠在SW象限面向池壁放入水中，直径为8cm，高为20～35cm的圆形平台放在NE象限，杂乱曲线轨迹为小鼠在泳池内寻找平台的游走路线。

图2：为小鼠空间探索试验路径图；

图中黑色框为计算机探头所监测的包括泳池在内的实验区域，黑色大圆圈为泳池，黑色小圆圈和在小圆圈与大圆圈中间的圆圈为计算机自动将泳池平均分成三等分，其中“十字”将泳池划分为四个象限，右上区域为NE象限，右下区域为SE象限，左上区域为NW象限，左下区域为SW象限。图2为将小鼠在SW象限面向池壁放入水中，将原来放在NE象限的直径为8cm，高为20～35cm的圆形平台移走，观察小鼠在60s内穿过原平台的次数，杂乱曲线为小鼠在泳池内寻找原平台的游走路线。

图3：为核桃活性肽对小鼠避暗错误次数的影响柱形图；

图4：为核桃活性肽对小鼠避暗反应试验中潜伏期的影响柱形图；

图5：为核桃活性肽对小鼠跳台错误次数的影响柱形图；

图6：为核桃活性肽对小鼠跳台试验中潜伏期的影响柱形图。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明作任何限定。

实施例1：

(1)核桃脱脂蛋白粉制备

取脱脂核桃粕50g经多功能粉碎机粉碎40s，与蒸馏水按照料液比1：6(质量)混合，用胶体磨均质60s后，静止8h，去掉上清液后，5000rpm离心10min，取沉淀物，与-20℃冷冻后，于-50℃、25Pa条件下冷冻干燥24h，即得核桃脱脂蛋白粉。

(2)核桃活性肽制备

将5g核桃脱脂蛋白粉溶于100mL蒸馏水配制成质量分数5％的溶液，90℃水浴10min，用1.0mol/L NaOH调节溶液pH＝8，冷却至40℃；保持pH值恒定，加入碱性蛋白酶Alcalase 2.4L，加酶量7000U/g，40℃下酶解3h后，溶液在90℃下灭酶10min；冷却至40℃，用1.0mol/L NaOH调节溶液pH至7.0；保持pH值恒定，加入Neutrase 0.8L中性蛋白酶，加酶量8000U/g，55℃酶解2.5h后，溶液在90℃下灭酶10min；冷却至室温，5000rpm离心10min，上清液冷冻干燥后得到核桃活性肽粗粉。

(3)核桃活性肽粗提物的分离纯化

将核桃活性肽粗粉溶于蒸馏水中配成2mg/mL的溶液，分别采用膜分子截流量为10kDa和3kDa的超滤膜进行分离。将得到的分子量＜3kDa溶液收集，经旋转蒸发后在-50℃、25Pa条件下冷冻干燥24h，即为本发明所述的分子量＜3kDa的具有改善记忆的核桃活性肽。

实施例2：本发明物对小鼠行为学试验研究

1、受试动物：SPF级昆明小鼠，体重18～20g，60只，由长春生物制品研究所有限责任公司提供。

2、实验分组

实验分为空白对照组、记忆损伤模型组、阳性对照组和核桃活性肽低、中、高剂量组，自由适应饲养一周后，随机分为6组，每组10只小鼠。饲养期间，每天上午8时，按体重计算，分别灌胃低(200mg/kg.bw)、中(400mg/kg.bw)、高(800mg/kg.bw)剂量组不同浓度的核桃活性肽溶液(用蒸馏水配置核桃活性肽溶液)，阳性对照组灌胃吡拉西坦溶液(400mg/kg.bw)，空白对照组和记忆损伤模型组灌胃同等体积的质量分数9％生理盐水。连续灌胃30d。第31d，除空白对照组外，分别注射东莨菪碱溶液(1mg/kg.bw)，30min后进行Morris水迷宫试验(注射东莨菪碱溶液可以获得记忆损伤模型组。东莨菪碱是一种非选择性的M胆碱能受体，它能够阻断胆碱能信号通路，抑制乙酰胆碱传递，从而减弱海马的长时增效)。

3、Morris水迷宫行为学试验

(1)定位航行试验

将直径为8cm，高为35cm的圆形平台固定在NW象限，位于水下1cm，试验共6d。每日每只小鼠测试4次，每次将小鼠面向池壁轻放入水中。第一次和第四次从目标象限対侧的象限(SE)入水，第二次和第三次随机从SW和NE象限入水。小鼠游泳的监测时间为60s，计算机采集系统自动记录从小鼠入水到找到隐藏平台的数据和过程。从小鼠入水到找到平台的时间记为潜伏期。小鼠找到平台后让其在平台上停留10s，寻台失败的小鼠也应在平台上停留10s，潜伏期记为60s、每次训练完，用干毛巾将小鼠擦干，以防止低体温造成的应激，让小鼠休息60s后开始下一次训练。小鼠定位航行路径图见图1，水迷宫试验中，动物的探索路径一般分“随机式、直线式、趋向式、边缘式”四种方式。如图1所示，东莨菪碱记忆损伤模型组小鼠游走路径无任何规律，以边缘式为主，需要较长时间找到平台，这说明东莨菪碱腹腔注射后造模成功，记忆模型损伤组小鼠学习能力显著下降。低剂量核桃活性肽组小鼠游走路径比空白和阳性对照组复杂，但高于记忆模型损伤组；而中、高剂量核桃活性肽组小鼠游走路径主要以趋向式为主，且明显高于阳性对照组。

(2)空间探索试验

评价小鼠空间记忆能力的试验方法中空间探索试验是一种权威的试验方法。将直径为8cm，高为35cm的圆形平台从水池中移除，每日每只小鼠测试1次，每次将小鼠面向池壁轻放入水中。小鼠游泳的监测时间为60s，计算机采集系统自动记录从小鼠经过原平台的次数。它是通过移除隐藏在水下的平台，检测小鼠对原平台位置的空间记忆能力。由图2可看出，空白对照组小鼠探索策略为典型的直线型和趋向型，而记忆损伤模型组主要为边缘型和随机型，表明东莨菪碱使小鼠对平台未知的记忆完全丧失；核桃活性肽的小鼠探索策略主要为趋向型，从游走路径可看出，核桃活性肽对小鼠记忆损伤具有一定的修复作用。

4、避暗反应试验

小鼠Morris水迷宫试验结束后，让小鼠稍作休息。将小鼠放入36V、50Hz的避暗室里。先让小鼠适应5min，然后再通入电源。其原理是小鼠进入暗室会遭受电击，逃往明室，明室会有强光照射。记录小鼠在5min内进入暗室次数以及避暗潜伏期。在5min试验过程中，小鼠进入暗室的次数，即为错误次数。如图3所示，记忆模型损伤组小鼠避暗错误次数明显高于空白对照组(p＜0.01)，而低剂量组与模型组无显著差异，且随着核桃活性肽浓度的增大，效果逐渐增强；其中，中、高剂量多肽组小鼠避暗错误次数显著低于模型损伤组(p＜0.01)。如图4所示，记忆模型损伤组小鼠潜伏期明显小于空白对照组(p＜0.01)，而核桃活性肽低、中、高剂量组的小鼠潜伏期明显高于模型损伤组(p＜0.05或p＜0.01)；尤其核桃活性肽高剂量组中小鼠潜伏期最长(p＜0.01)，高于阳性对照组。说明核桃活性肽可以抑制东莨菪碱造成的记忆损伤。

5、跳台试验

将小鼠放入36V、50Hz的栅栏里。先让小鼠适应5min，然后再通入电源。其原理是小鼠在栅栏处会遭受电击，然后会跳上高为8cm、宽为3cm的平台上。学习记忆好的小鼠会记住栅栏有电，而不会跳下来。记录小鼠在5min内跳台错误次数和潜伏期。在5min试验过程中，小鼠受到的电击次数即跳台错误次数。如图5所示，记忆模型损伤组小鼠跳台次数明显多于空白对照组(p＜0.01)；与模型损伤组比较，低剂量多肽处理组对小鼠跳台错误次数显著降低(p＜0.05)，随着核桃活性肽浓度的增加，小鼠跳台错误次数逐渐减少，中、高剂量组核桃活性肽对小鼠跳台错误次数显著降低(p＜0.01)。表明核桃活性肽可以抑制东莨菪碱造成的记忆损伤。

在5min试验过程中，小鼠第一次跳下栅栏的时间即跳台潜伏期。如图6所示，记忆模型损伤组小鼠潜伏期小于空白对照组；随着核桃活性肽浓度的增加，小鼠的潜伏期逐渐延长。与模型损伤组比较，三个剂量的核桃活性肽对小鼠的潜伏期均显著增加(p＜0.01)，表明核桃活性肽可以抑制东莨菪碱造成的记忆损伤。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，对于本技术领域的人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进与润色，这些改进与润色也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种改善记忆功能的核桃活性肽的制备方法，其步骤如下：

(1)核桃脱脂蛋白粉制备

取脱脂核桃粕50～250g，经多功能粉碎机粉碎30～90s后，与蒸馏水按照质量比1：5～10的比例混合，经胶体磨均质30～90s，静止3～8h，去掉部分上清液后，于3000～8000rpm离心10～20min；留沉淀，于-50℃、＜30Pa条件下冷冻干燥20～30h，得到核桃脱脂蛋白粉；

(2)核桃活性肽粗粉的制备

将步骤(1)制备的核桃脱脂蛋白粉与蒸馏水配制成质量分数2％～7％溶液，在90～100℃条件下恒温水浴10～20min，冷却至40℃～60℃后，用1.0mol/L NaOH调节溶液pH至7.5～9.5，保持pH值恒定，加入碱性蛋白酶Alcalase 2.4L，加酶量为1000U/g～9000U/g，酶解0.5～5h后，溶液在90℃下灭酶10～20min；最后冷却至40℃～60℃，用1.0mol/L NaOH调节调节溶液pH至6.5～7.5；保持pH值恒定，加入中性蛋白酶Neutrase 0.8L，加酶量为1000U/g～11000U/g，酶解0.5～5h后，90℃灭酶10～20min；5000～8000rpm离心10～20min，上清液冷冻干燥后得到核桃活性肽粗粉；加入中性蛋白酶和加入碱性蛋白酶，加酶量均是按照核桃脱脂蛋白粉进行计算；

(3)核桃活性肽粗提物的分离纯化

将步骤(2)得到的核桃活性肽粗粉用蒸馏水配成浓度1～5mg/mL的溶液，利用超滤膜进行分离；将得到的溶液收集，旋转蒸发后-20℃冷冻后，于-50℃、＜30Pa条件下冷冻干燥20～30h，得到具有改善记忆功能的核桃活性肽。

2.如权利要求1所述的一种改善记忆功能的核桃活性肽的制备方法，其特征在于：步骤(2)中的中性蛋白酶为Neutrase 0.8L。

3.如权利要求1所述的一种改善记忆功能的核桃活性肽的制备方法，其特征在于：步骤(2)中的碱性蛋白酶为碱性蛋白酶Alcalase 2.4L。

4.如权利要求1所述的一种改善记忆功能的核桃活性肽的制备方法，其特征在于：步骤(3)中分别采用膜分子截流量为10kDa和3kDa的超滤膜进行分离；先用分子截流量为10kDa的膜包过膜，得出>10kDa和＜10kDa两个不同分子量组分的核桃活性肽；再将＜10kDa分子量组分的核桃活性肽粗液用分子截流量为3kDa的膜包过膜，得到3～10kDa和＜3kDa两个不同分子量组分的核桃活性肽，从而得到分子量＜3kDa的核桃活性肽。

5.一种改善记忆的核桃活性肽，其特征在于：是由权利要求1～4任何一项所述的方法制备得到。