CN114196718B - 一种富含精氨酸特征肽段的核桃蛋白酶解物及其制法和用途 - Google Patents
一种富含精氨酸特征肽段的核桃蛋白酶解物及其制法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种富含精氨酸特征肽段的核桃蛋白酶解物及其制法和用途。本发明的核桃蛋白酶解物，精氨酸特征肽段占总肽段数目的49.11‑50.13％。所述核桃蛋白酶解物的制备方法包括以下步骤：将核桃蛋白加水适度稀释后，加入蛋白酶酶解，然后灭酶，离心，取上清液，含有富含精氨酸特征肽段的核桃蛋白酶解物；所述的蛋白酶为胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶。本发明含精氨酸特征肽段的核桃蛋白水解物对东莨菪碱诱导的斑马鱼记忆障碍具有良好的改善作用，表明具有潜在的缓解认知和记忆损伤的功效，可用于制备改善记忆类药物或改善记忆类保健品，也可与其他保健品或食品添加剂复配使用。
Description
技术领域
本发明属于生物活性肽药物领域，具体涉及一种富含精氨酸特征肽段的核桃蛋白酶解物及其制法和用途。
背景技术
记忆和认知障碍是神经退行性疾病的主要临床症状。而胆碱能系统在包括学习和记忆过程在内的一系列认知功能中发挥着重要作用。在大脑衰老过程中，胆碱能神经元发生退行性变化，导致神经冲动减少和信号传递不足，引发胆碱能系统功能障碍，最终导致学习和记忆障碍。
乙酰胆碱(Ach)是一种是神经系统中普遍存在的神经递质，在大脑皮层发育、皮层活动以及认知和记忆调节中起着重要作用。Ach由胆碱和乙酰辅酶A通过胆碱乙酰转移酶(ChAT)催化的反应形成。相反，乙酰胆碱酯酶(AchE)会催化Ach水解成胆碱和乙酸，从而导致Ach水平降低。若Ach被AchE过度降解，Ach就无法与突触后膜上的特定受体结合，从而导致突触之间神经信号的传递受到干扰，进而导致记忆丧失。
人们越来越关注使用食品衍生的生物活性产品作为功能性食品和膳食补充剂中的干预剂，以对抗神经退行性疾病。具有神经保护和认知增强作用的膳食生物活性肽引起越来越多的关注，因为它们能够在体内和体外影响认知和心理健康。
目前，生物活性肽的神经保护作用主要通过体外细胞培养和体外化学方法进行评估。众所周知，体外活性并不总是与体内生物活性或结构特性一致。而且通过大鼠或小鼠模型评估所有肽的活性是不可行的。
斑马鱼(Danio rerio)基因高度保守，与人类的同源性超过87％。因此，它可作为人类疾病发病机制相关研究和功能参数的可靠模型。同时，斑马鱼具有成本效益高、维护成本低和后代数量众多等优势，正是由于这些原因，斑马鱼逐步成为研究神经发育和学习记忆行为表现分子基础的重要模型。
东莨菪碱作为毒蕈碱乙酰胆碱受体的拮抗剂，可有效破坏胆碱能系统，目前已被广泛用于诱导痴呆动物模型。据报道使用东莨菪碱可造成斑马鱼和小鼠学习和记忆功能障碍，同时研究表明东莨菪碱在小鼠和斑马鱼模型中具有非常相似的作用途径，而斑马鱼T迷宫试验和小鼠Morris水迷宫试验也被广泛认为是可靠的行为学评价方法。
以往关于改善记忆肽的研究主要集中在验证蛋白水解物的神经保护作用以及分离、纯化、鉴定，富集活性强的肽段。工作量巨大，但获得有效肽段有限且此种方法很难用于工业化生产，实际应用价值较低。再者，由于受到蛋白质本身结构，氨基酸组成以及酶解条件的限制，在整个酶解物中靠提高某条或某几条生物活性肽的含量，很难从根本上提高整个酶解物的生物活性。况且通常情况下很难大规模提升某条特定肽序列的含量。近年来，人们逐步认识到蛋白质水解物的生物活性不仅与鉴定肽的强活性有关，而且与它们的含量息息相关。
发明内容
本发明的目的在于提供一种富含精氨酸特征肽段的核桃蛋白酶解物及其制法和用途。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种富含精氨酸特征肽段的核桃蛋白酶解物，其中精氨酸特征肽段占总肽段数目的49.11-50.13％；
所述的精氨酸特征肽段是指含有至少一个精氨酸残基的多肽。
上述富含精氨酸特征肽段的核桃蛋白酶解物的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用碱溶酸沉的方法从核桃粕中提取核桃蛋白；
(2)步骤(1)的核桃蛋白加水适度稀释后，加入蛋白酶在50～60℃下酶解12-18h，然后灭酶，离心，取上清液，含有富含精氨酸特征肽段的核桃蛋白酶解物；以核桃蛋白质量为计算基准，蛋白酶添加量为0.5～1.0％；
所述的蛋白酶为胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶；
所述步骤(1)包括以下步骤：
核桃粕打粉后加水溶解(料液比为1:8～12)→溶液调pH至8.0～9.0→搅拌2～4h→离心(8000～10000rpm，15～20min，4℃)→取上清液调pH至4.5→搅拌2～4h→离心(8000～10000rpm，15～20min，4℃)→取沉淀物溶解→透析脱盐2d→干燥→核桃蛋白；
步骤(2)所述的灭酶是将酶解物料升温至95℃保温15～30min；
步骤(2)中所述的离心是将灭酶后物料在8000～10000rpm下离心20～30min；
步骤(2)所得上清液适度浓缩后，进行喷雾干燥，得到富含精氨酸特征肽段的核桃蛋白酶解物粉。
本发明的富含精氨酸特征肽段的核桃蛋白酶解物可以用于制备改善记忆的药品或保健品。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明含精氨酸特征肽段的核桃蛋白水解物对东莨菪碱诱导的斑马鱼记忆障碍具有良好的改善作用，表明具有潜在的缓解认知和记忆损伤的功效，可用于制备改善记忆类药物或改善记忆类保健品，也可与其他保健品或食品添加剂复配使用。
附图说明
图1是实施例和对比例所得富含精氨酸特征肽段核桃蛋白水解物对东莨菪碱诱导斑马鱼在T迷宫中逃避潜伏期的影响。
图2是实施例和对比例所得富含精氨酸特征肽段核桃蛋白水解物对东莨菪碱诱导斑马鱼在T迷宫中游动总距离的影响。
图3是实施例和对比例所得富含精氨酸特征肽段核桃蛋白水解物对东莨菪碱诱导斑马鱼在T迷宫中进入目标区域次数的影响。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明实施例中所涉及的试验指标其实验方法如下：
(1)斑马鱼给药及处理：斑马鱼(野生AB型，6个月)被置于可控环境(25±2℃，14/10h光/暗循环)，每天喂两次活丰年虾。成年野生斑马鱼随机分组(n＝10)：对照(正常斑马鱼)、模型(东莨菪碱200μM)、以及不同酶水解所得核桃肽组(20mg/L)。斑马鱼以20mg/L给药量处理7天。随后，将模型组和各核桃肽组斑马鱼转移到装有东莨菪碱(200μM)的玻璃杯中，静置处理1h。
(2)斑马鱼T迷宫测试：斑马鱼从21cm的起始臂开始放入，然后在11cm短臂和20cm长臂之间进行选择，其中一条通向方形水库。所述蓄水池(6cm2)比其余臂深为5cm，是不透明的黑色，底部有人造草和大理石。水库的实验原理是提供斑马鱼喜欢的生存环境。大多数斑马鱼在训练后大部分时间都在水库中游动。斑马鱼在T型迷宫中的行为表现由ZebraTower(Viewpoint，法国)记录。进入目标区的次数、斑马鱼定位目标区的时间(逃逸潜伏期)和斑马鱼在T型迷宫中的游动距离(总距离)被记录下来。
实施例1
富含精氨酸特征肽段的核桃蛋白酶解物的制备，具体地包括以下步骤：
(1)核桃蛋白粉的制备：采用碱溶酸沉的方法从核桃粕中提取核桃蛋白。具体操作为：核桃粕打粉后加水其质量8倍的去离子水，混合均匀后调节pH至8.0，常温下搅拌4h，然后在4℃下8000rpm离心20min，收集上清液调节器pH至4.5，继续搅拌4h，再次在4℃下8000rpm离心20min，收集沉淀物，1:4料液比加水溶解后，装入透析袋中，将透析袋浸泡在5L超纯水中于4℃透析2d进行脱盐，其中每隔4h更换一次超纯水，最后将透析液干燥，得到核桃蛋白粉。
(2)核桃蛋白酶解液的制备：取8000g水加入1000g核桃蛋白粉中混合均匀，再分别加入5g胰蛋白酶在60℃下酶解18h，然后将酶解物料升温至95℃保温20min灭酶，然后在10000rpm下离心15min，取上清液，得到核桃蛋白酶解液1。
(3)核桃蛋白酶解粉的制备：采用真空浓缩系统将核桃蛋白酶解液1浓缩至固形物40％，采用喷雾干燥塔将其干燥，得到核桃蛋白酶解粉A。
实施例2
富含精氨酸特征肽段的核桃蛋白酶解物的制备，具体地包括以下步骤：
(1)核桃蛋白粉的制备：采用碱溶酸沉的方法从核桃粕中提取核桃蛋白。具体操作为：核桃粕打粉后加水其质量8倍的去离子水，混合均匀后调节pH至8.0，常温下搅拌4h，然后在4℃下8000rpm离心20min，收集上清液调节器pH至4.5，继续搅拌4h，再次在4℃下8000rpm离心20min，收集沉淀物，1:4料液比加水溶解后，装入透析袋中，将透析袋浸泡在5L超纯水中于4℃透析2d进行脱盐，其中每隔4h更换一次超纯水，最后将透析液干燥，得到核桃蛋白粉。
(2)核桃蛋白酶解液的制备：取8000g水加入1000g核桃蛋白粉中混合均匀，再分别加入5g胰凝乳蛋白酶在60℃下酶解18h，然后将酶解物料升温至95℃保温20min灭酶，然后在10000rpm下离心15min，取上清液，得到核核桃蛋白酶解液2。
(3)核桃蛋白酶解粉的制备：采用真空浓缩系统将核桃蛋白酶解液2浓缩至固形物40％，采用喷雾干燥塔将其干燥，得到核桃蛋白酶解粉B。
对比例1
富含精氨酸特征肽段的核桃蛋白酶解物的制备，具体地包括以下步骤：
(1)核桃蛋白粉的制备：采用碱溶酸沉的方法从核桃粕中提取核桃蛋白。具体操作为：核桃粕打粉后加水其质量8倍的去离子水，混合均匀后调节pH至8.0，常温下搅拌4h，然后在4℃下8000rpm离心20min，收集上清液调节器pH至4.5，继续搅拌4h，再次在4℃下8000rpm离心20min，收集沉淀物，1:4料液比加水溶解后，装入透析袋中，将透析袋浸泡在5L超纯水中于4℃透析2d进行脱盐，其中每隔4h更换一次超纯水，最后将透析液干燥，得到核桃蛋白粉。
(2)核桃蛋白酶解液的制备：取8000g水加入1000g核桃蛋白粉中混合均匀，再加入5g木瓜蛋白酶在60℃下酶解18h，然后将酶解物料升温至95℃保温20min灭酶，然后在10000rpm下离心15min，取上清液，得到核桃蛋白酶解液3。
(3)核桃蛋白酶解粉的制备：采用真空浓缩系统将核桃蛋白酶解液3浓缩至固形物40％，采用喷雾干燥塔将其干燥，得到核桃蛋白酶解粉C。
对比例2
富含精氨酸特征肽段的核桃蛋白酶解物的制备，具体地包括以下步骤：
(1)核桃蛋白粉的制备：采用碱溶酸沉的方法从核桃粕中提取核桃蛋白。具体操作为：核桃粕打粉后加水其质量8倍的去离子水，混合均匀后调节pH至8.0，常温下搅拌4h，然后在4℃下8000rpm离心20min，收集上清液调节器pH至4.5，继续搅拌4h，再次在4℃下8000rpm离心20min，收集沉淀物，1:4料液比加水溶解后，装入透析袋中，将透析袋浸泡在5L超纯水中于4℃透析2d进行脱盐，其中每隔4h更换一次超纯水，最后将透析液干燥，得到核桃蛋白粉。
(2)核桃蛋白酶解液的制备：取8000g水加入1000g核桃蛋白粉中混合均匀，再加入5g胃蛋白酶在60℃下酶解18h，然后将酶解物料升温至95℃保温20min灭酶，然后在10000rpm下离心15min，取上清液，得到核桃蛋白酶解液4。
(3)核桃蛋白酶解粉的制备：采用真空浓缩系统将核桃蛋白酶解液4浓缩至固形物40％，采用喷雾干燥塔将其干燥，得到核桃蛋白酶解粉D。
对比例3
一种利用核桃粕制备改善记忆肽方法，具体地包括以下步骤：
(1)核桃粕酶解液的制备：取8000g水加入1000g核桃粕粉中混合均匀，再加入5g胰蛋白酶在60℃下酶解18h，然后将酶解物料升温至95℃保温20min灭酶，然后在10000rpm下离心15min，取上清液，得到核桃粕酶解液1。
(2)核桃粕酶解粉的制备：采用真空浓缩系统将核桃粕酶解液1浓缩至固形物40％，采用喷雾干燥塔将其干燥，得到核桃粕酶解粉A。
对比例4
一种利用核桃粕制备改善记忆肽方法，具体地包括以下步骤：
(1)核桃粕酶解液的制备：取8000g水加入1000g核桃粕粉中混合均匀，再加入5g胰凝乳蛋白酶在60℃下酶解18h，然后将酶解物料升温至95℃保温20min灭酶，然后在10000rpm下离心15min，取上清液，得到核桃粕酶解液2。
(2)核桃粕酶解粉的制备：采用真空浓缩系统将核桃粕酶解液2浓缩至固形物40％，采用喷雾干燥塔将其干燥，得到核桃粕酶解粉B。
在uniprot网站(https://www.uniprot.org/downloads)获得核桃蛋白序列，包括Globulin，Albumin，Vicilin和Legumin序列。
在Biopep网站(http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep)中导入上述Globulin，Albumin，Vicilin和Legumin核桃种子储藏蛋白序列，使用实施例1-2、对比例1-2的四种蛋白酶(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶)对上述序列进行模拟水解，获得不同蛋白酶水解核桃蛋白序列释放的多肽碎片，统计多肽碎片中包含精氨酸的核桃特征肽段并计算其理论含量。
表1计算机模拟水解核桃蛋白释放含精氨酸特征肽段情况
表1为计算机模拟水解核桃蛋白释放含精氨酸特征肽段情况。结果显示胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶模拟水解核桃储藏蛋白序列释放的含精氨酸特征肽段为213条和220条，在核桃蛋白序列中理论占比达49.11％和50.13％，而胃蛋白酶和木瓜蛋白酶模拟水解核桃储藏蛋白序列释放的含精氨酸特征肽段均为132条，在核桃蛋白序列中理论占比为27.00％和30.12％。表明胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶具有良好的含精氨酸核桃特征肽段释放潜力。
图1-图3为各组核桃肽处理对东莨菪碱诱导斑马鱼记忆障碍的影响。结果如下，东莨菪碱处理使斑马鱼到达目标区域的逃避潜伏期和总距离变长，同样，东莨菪碱处理减少了斑马鱼进入目标区域的次数，表明模型组中的斑马鱼无法准确记住和定位目标区域。
采用本发明工艺酶解制备所得核桃蛋白酶解粉A和B(实施例1和2)处理显著增加了斑马鱼对目标区域的定位，且其活性显著高于使用木瓜蛋白酶制备的核桃蛋白酶解粉C(对比例1)和使用胃蛋白酶制备的核桃蛋白酶解粉D(对比例2)，这与计算机模拟水解所得结论一致，即胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶可有效释放和富集核桃储藏蛋白序列中的含精氨酸特征肽段，从而在斑马鱼记忆障碍模型中表现出优于木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解产物的改善记忆活性。
另外，在同样条件下，不论是使用胰蛋白酶还是胰凝乳蛋白酶进行水解，以核桃粕作为原料所得核桃粕酶解粉A和B(对比例2)其改善记忆活性均显著弱于本发明工艺制备的核桃蛋白酶解物。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种富含精氨酸特征肽段的核桃蛋白酶解物，其特征在于：所述精氨酸特征肽段占总肽段数目的50.13%；
所述的精氨酸特征肽段是指含有至少一个精氨酸残基的多肽；
所述富含精氨酸特征肽段的核桃蛋白酶解物的制备方法包括以下步骤：
（1）核桃蛋白粉的制备： 核桃粕打粉后加水其质量8倍的去离子水，混合均匀后调节pH至8.0，常温下搅拌4 h，然后在4℃下8000 rpm离心20 min，收集上清液调节其pH至4.5，继续搅拌4 h，再次在4℃下8000 rpm离心20 min，收集沉淀物，1:4料液比加水溶解后，装入透析袋中，将透析袋浸泡在5 L超纯水中于4℃透析2 d进行脱盐，其中每隔4 h更换一次超纯水，最后将透析液干燥，得到核桃蛋白粉；
（2）核桃蛋白酶解液的制备：取8000 g水加入1000 g核桃蛋白粉中混合均匀，再加入5g胰凝乳蛋白酶在60℃下酶解18 h，然后将酶解物料升温至95℃保温20 min灭酶，然后在10000 rpm下离心15 min，取上清液，得到富含精氨酸特征肽段的核桃蛋白酶解物；
所述的蛋白酶为胰凝乳蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的酶解物，其特征在于：
步骤（2）所述上清液适度浓缩后，进行喷雾干燥，得到富含精氨酸特征肽段的核桃蛋白酶解物粉。
3.权利要求1所述富含精氨酸特征肽段的核桃蛋白酶解物在制备改善记忆的药品或保健品中的应用。
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