CN109880868B - 一种具有抗谷氨酸诱导ht-22细胞氧化应激损伤作用的鹿茸活性组分及制备和应用 - Google Patents
一种具有抗谷氨酸诱导ht-22细胞氧化应激损伤作用的鹿茸活性组分及制备和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109880868B CN109880868B CN201711272312.8A CN201711272312A CN109880868B CN 109880868 B CN109880868 B CN 109880868B CN 201711272312 A CN201711272312 A CN 201711272312A CN 109880868 B CN109880868 B CN 109880868B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protease
- oxidative stress
- temperature
- glutamic acid
- cornu cervi
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 45
- 230000006378 damage Effects 0.000 title claims abstract description 33
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 30
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 title claims abstract description 30
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 title claims abstract description 28
- 208000014674 injury Diseases 0.000 title claims abstract description 28
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 title claims description 13
- 210000003056 antler Anatomy 0.000 claims abstract description 42
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims abstract description 34
- 230000008809 cell oxidative stress Effects 0.000 claims abstract description 19
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 claims abstract description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 25
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 21
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 14
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 14
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 13
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 12
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 12
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 9
- 101710180012 Protease 7 Proteins 0.000 claims description 9
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 9
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 claims description 9
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 8
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 8
- 108010004032 Bromelains Proteins 0.000 claims description 7
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 claims description 7
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 7
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 7
- 235000019835 bromelain Nutrition 0.000 claims description 7
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 claims description 7
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 7
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 7
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 claims description 6
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 claims description 6
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims description 6
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims description 6
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims description 6
- 238000011049 filling Methods 0.000 claims description 6
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 claims description 6
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 108010042388 protease C Proteins 0.000 claims description 6
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 108010007119 flavourzyme Proteins 0.000 claims description 5
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 claims description 5
- 229940055729 papain Drugs 0.000 claims description 5
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 claims description 4
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 claims description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 claims description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 2
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 claims description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 claims description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims 3
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 claims 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims 2
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims 2
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 claims 2
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 claims 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 abstract description 8
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 2
- 102000056251 Prolyl Oligopeptidases Human genes 0.000 description 34
- 101710178372 Prolyl endopeptidase Proteins 0.000 description 33
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 13
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 6
- NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N di-n-propyl-acetic acid Natural products CCCC(C(O)=O)CCC NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940084026 sodium valproate Drugs 0.000 description 6
- AEQFSUDEHCCHBT-UHFFFAOYSA-M sodium valproate Chemical compound [Na+].CCCC(C([O-])=O)CCC AEQFSUDEHCCHBT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 241000283007 Cervus nippon Species 0.000 description 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 3
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 3
- 239000004956 Amodel Substances 0.000 description 2
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 2
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006941 Amino Acid Transport System X-AG Human genes 0.000 description 1
- 101800000068 Antioxidant peptide Proteins 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- 241000283026 Cervus elaphus Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108091006151 Glutamate transporters Proteins 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 229910002567 K2S2O8 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- UTXSFKPOIVELPQ-SFHVURJKSA-N benzyl n-[2-[(2s)-2-[(4-nitrophenyl)carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-2-oxoethyl]carbamate Chemical compound C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1NC(=O)[C@H]1N(C(=O)CNC(=O)OCC=2C=CC=CC=2)CCC1 UTXSFKPOIVELPQ-SFHVURJKSA-N 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000002964 excitative effect Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 description 1
- 239000000321 herbal drug Substances 0.000 description 1
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004295 hippocampal neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000005040 ion trap Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 210000002243 primary neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 125000000168 pyrrolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种具有抗谷氨酸诱导HT‑22细胞氧化应激损伤作用的鹿茸活性组分的制备及其应用。本发明以鹿茸为原料，建立了具有抗氧化活性、PEP抑制活性和抗谷氨酸诱导HT‑22细胞氧化应激损伤作用的鹿茸活性组分的制备方法，该活性组分可应用于阿尔茨海默症等认知障碍疾病的预防和治疗，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有抗谷氨酸诱导HT-22细胞氧化应激损伤作用的鹿茸活性组分的制备及其应用。具有抗谷氨酸诱导HT-22细胞氧化应激损伤作用的活性组分，可用于治疗或预防神经退行性疾病如阿尔茨海默症等认知障碍疾病。
背景技术
鹿茸是鹿科动物梅花鹿或马鹿的雄鹿密生绒毛的未骨化幼角，始载于汉代的《神农本草经》，入药已有2000多年的历史，其后在历代药学典籍中对鹿茸的药用均有收载。鹿茸具有包含抗衰老、增强中枢神经系统等许多药理作用(Chinese Traditional andHerbal Drugs.2007,38(8),1163-1167)。
HT-22细胞是小鼠海马原代神经元永生化而得的细胞系，可以较理想地模拟与海马神经元相关疾病的体外细胞模型，广泛应用于与神经元相关疾病的研究。谷氨酸是脑与脊髓中含量最丰富的内源性兴奋型神经递质，但当其胞外浓度过高时会直接引发谷氨酸转运体的谷氨酸摄取功能饱和，引发一系列的神经系统紊乱。且谷氨酸在许多神经与精神疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症等疾病中发挥着重要的传递作用。因此，利用谷氨酸诱导HT-22细胞建立细胞损伤模型，可用于研究考察鹿茸活性组分对于阿尔茨海默病的潜在治疗作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抗谷氨酸诱导HT-22细胞氧化应激损伤作用的鹿茸活性组分及其应用。鹿茸经蛋白酶酶解，产物具有抗谷氨酸诱导HT-22细胞氧化应激损伤作用，可作为改善阿尔茨海默症等认知障碍疾病药物研发的潜在来源。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种具有抗谷氨酸诱导HT-22细胞氧化应激损伤作用的鹿茸活性组分的制备方法，将鹿茸提取、酶解、纯化，得到一种具有抗谷氨酸诱导HT-22细胞氧化应激损伤作用的鹿茸活性组分；
具体过程如下：
1)新鲜鹿茸切碎后冷冻干燥，粉碎，加入鹿茸质量5～30倍(最优范围为10～20倍)的去离子水，升温至30～70℃(最优范围为40～55℃)后加入鹿茸质量0.1～2.0％(w/w)的蛋白酶A，搅拌提取1～5小时(最优范围为2～4)，提取结束后冷却至室温，以2500×g～15000×g于2～8℃离心5～30min，保留上清液；
2)用1～6M的盐酸将提取物的pH调至1.0～5.0(最优范围为3.0～4.0)，搅拌均匀后加入鹿茸质量0.1～5.0％(w/w)(最优范围为2.0～3.0％)的蛋白酶B，在20～65℃(最优范围为30～50℃)温度下酶解0.5～24小时(最优范围为3～10小时)；酶解结束后用1～6M的NaOH溶液将pH调节至6.0～8.0(最优范围为6.5～7.5)，再加入鹿茸质量0.1～5.0％(w/w)(最优范围为2.0～3.0％)的蛋白酶C，在20～65℃(最优范围为30～50℃)温度下酶解0.5～24小时(最优范围为3～10小时)，反应结束后将温度升至90～100℃(最优范围为95～100℃)并保温10～30分钟后冷却至室温；
3)酶解液以2500×g～10000×g的速度于2～8℃离心5～30分钟，上清液加水稀释至15～50mg/mL待用。将溶胀后的Sephadex G-25填料填装成直径1.4～10.0cm、柱高与直径比5:1～10:1的凝胶柱。将酶解液加载于凝胶柱上，以去离子水为洗脱液、流速0.03～10L/h进行洗脱，收集流份并在205nm检测吸光度。检测各流份的PEP(脯氨酰内切酶)抑制活性，将PEP抑制活性最高的流份冷冻干燥，得到具有抗谷氨酸诱导HT-22细胞氧化应激损伤作用的组分。
所述蛋白酶A为碱性蛋白酶、风味蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶中的一种或二种以上组合；蛋白酶B为胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一种或二种以上组合；蛋白酶C为菠萝蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶中的一种或二种以上组合。且蛋白酶A、蛋白酶B和蛋白酶C均不能相同，即蛋白酶A、蛋白酶B和蛋白酶C所采用的蛋白酶不同或所采用的组合蛋白酶中的蛋白酶不同。
所制备的活性组分含有LHVDPEN、FPSIVGRP、FPHFDLSHGSA、PGPMGPRGAP两种或两种以上的抗氧化肽(筛选这4条肽的原则：含有较多的富电子集团(如芳香族基团、吡咯环、咪唑环)残基、含有较多的疏水性基团、N端为疏水性氨基酸残基、C端第二位含有易形成氢键的基团)。
所述制备方法获得的具有抗谷氨酸诱导HT-22细胞氧化应激损伤作用的鹿茸活性组分。
所述具有抗谷氨酸诱导HT-22细胞氧化应激损伤作用的鹿茸活性组分，可用于制备治疗和/或预防神经系统疾病的药物及保健食品。
所述神经系统疾病为神经性退化性疾病。
所述疾病为阿尔兹海默症或帕金森症等认知障碍疾病。
本发明建立了一种具有抗谷氨酸诱导HT-22细胞氧化应激损伤作用的鹿茸活性组分的制备方法，所制备的鹿茸活性组分可应用于阿尔茨海默症等认知障碍疾病的预防和治疗，具有广阔的应用前景。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
1.使用本方法所制备的鹿茸活性组分提取率高、条件温和，对鹿茸中原有的活性组分保留较好。该方法简便可行，对环境友好，可用于大规模生产。
2.通过建立氧化应激损伤细胞模型考察与验证组分的活性，为其治疗认知障碍性疾病的潜在作用奠定药理学基础。
3.具有良好的应用前景。本发明作为认知障碍疾病药物或保健食品研发的潜在来源具有广泛的应用前景。
具体实施方式
实施例1
1.以新鲜梅花鹿鹿茸为原料，按照以下工艺制备：
新鲜鹿茸冷冻干燥粉碎后取1kg粉末，加入5L去离子水，升温至45℃，加入2.5g胰蛋白酶搅拌5小时后冷却至室温，以5000×g离心10分钟，保留上清液。用1M的盐酸将上清液的pH调至4.0，搅拌均匀后加入1g胃蛋白酶，在37℃温度下酶解2小时；酶解结束后用1M的NaOH溶液将pH调节至7.0，再加入0.5g胰凝乳蛋白酶与0.5g胰蛋白酶，37℃酶解2小时，反应结束后将温度升至90℃并保温10分钟后冷却至室温。
酶解液以5000×g的速度于4℃离心10分钟，上清液加水稀释至40mg/mL待用。将溶胀后的Sephadex G-25填料填装成直径10.0cm、柱高100cm的凝胶柱。将酶解液加载于凝胶柱上，以去离子水为洗脱液、流速10L/h进行洗脱，收集流份并在205nm检测吸光度。检测各流份的PEP(脯氨酰内切酶)抑制活性，将PEP抑制活性最高的流份冷冻干燥，得到具有抗谷氨酸诱导HT-22细胞氧化应激损伤作用的组分。
2.对获得的鹿茸组分进行抗谷氨酸诱导HT-22细胞氧化应激损伤作用的活性检测：
1)方法
(1)细胞培养：所选用的细胞为HT-22细胞系。将细胞置于含有0.1mg/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素和10％(v/v)FBS的DMEM高糖型培养基中，37℃5％CO2培养。当细胞铺满培养皿底部70％进行传代。每2天更换一次培养液。
(2)谷氨酸诱导的氧化应激损伤模型的建立：将对数生长期的HT-22细胞用0.25％胰蛋白酶消化，加入适当体积的含10％FBS的DMEM培养基混匀，1000×g离心后弃去上清，沉淀用5％FBS的DMEM稀释成约5×104CFU/mL的悬液，按表一向96孔板的各孔中加入相应溶液后在37℃湿润的5％CO2培养箱中进行培养，最后测定细胞活力。
表一 谷氨酸诱导的氧化应激损伤模型的分组与体系
表一中：
细胞悬液：用含5％FBS的DMEM培养基分散的浓度5×104CFU/mL的HT-22细胞悬液。
PBS：磷酸盐缓冲水溶液(每1L含0.20g KCl、0.24g KH2PO4、8.00g NaCl、1.44gNa2HPO4，pH＝7.4)
样品溶液：用PBS将鹿茸活性组分稀释若干倍，过0.22μM无菌滤膜，滤液经Nanodrop oneC(Thermo Fisher公司)测定肽浓度(肽浓度＝A205/31，mg/mL)。
谷氨酸钠溶液：140mg谷氨酸钠加双蒸水定容至10mL，过0.22μM滤膜。模型体系中的谷氨酸钠浓度为5mM。
细胞活力按碧云天Beyotime公司的WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒进行测定，细胞活力计算公式为：(A样品组-A模型组)/(A正常组-A模型组)×型组活力。
2)检测结果
以细胞活力为指标衡量活性提取物对损伤模型细胞的保护作用，结果如表二所示。
表二 活性提取物抗谷氨酸诱导HT-22细胞氧化应激损伤作用实验结果
3.对获得的鹿茸组分进行PEP抑制活性检测
1)原理
PEP能够特异性地在脯氨酸的羧基末端水解小分子量多肽。因此本方法采用Z-Gly-Pro-4-nitroanilide作为PEP的底物，Z-Gly-Pro-4-nitroanilide被PEP切下Z-Gly-Pro后，生成黄色的对硝基苯胺在405nm有特征吸收峰，根据加入样品和底物前后的405nm下的吸光度变化，可以计算样品对于PEP的抑制活性。
2)方法
样品：将样品溶解于10mM的PBS缓冲液(pH＝7.0)，按实验需要分别配制成0.5、1.0和2.0mg/mL浓度的溶液。
底物溶液：Z-Gly-Pro-4-nitroanilide(Z-Gly-Pro-pNA)溶液，Z-Gly-Pro-4-nitroanilide用40％(v/v)的二氧六环配制成10mM的溶液。
阳性药物：丙戊酸钠(Sodium Valproate)溶液，丙戊酸钠溶于10mM的PBS(pH＝7.0)，按实验需要将其分别配制成0.2、0.4、1.0、2.0和4.0mM浓度的溶液。
酶溶液：PEP溶液，将PEP用保护液(45mM Tris-HCl，pH 8.0，124mM NaCl，2.4mMKCl，10％(v/v)甘油，225mM咪唑和3mM DTT)稀释成1U/mL的溶液分装储存于-80℃冰箱，临用前用PBS(10mM PBS，137mM NaCl和2.7mM KCl，pH 7.0)稀释8倍，作为PEP溶液。
实验在96孔板中进行，利用酶标仪在405nm检测吸光度。首先将140μL PBS，20μL样品(或缓冲液)和20μL PEP酶溶液依次加入到样品孔中，37℃孵育5min后，再加入20μL底物，混匀后于37℃温育30分钟，用酶标仪测定405nm吸光度。反应总体积为200μl。每孔做三个平行，计算样品抑制率。
表三PEP抑制活性实验分组及加样量
抑制率计算公式：
其中I表示抑制率，ASample表示样品吸光度值，ASampleblank表示样品空白吸光度值，AControl表示阴性对照组吸光度值，Ablank表示空白组吸光度值。
3)检测结果
以丙戊酸钠为阳性对照药物，按上述方法分别检测体系浓度为0.2、0.4、1、2和4mM时的PEP抑制率，结果如表四所示：
表四 丙戊酸钠PEP抑制率
由表二可知丙戊酸钠的IC50为1.98mM。
以鹿茸活性组分样品代替丙戊酸钠同法操作。当鹿茸活性组分样品浓度为4.0和2.0mg/mL时，PEP抑制率分别为78.5和66.3％
4.对获得的鹿茸组分进行抗氧化活性检测
ABTS经活性氧氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS·+，抗氧化成分会与ABTS·+发生反应而使反应体系褪色，因此可在其最大吸光波长734nm下检测吸光度的变化从而考察样品抗氧化活性强弱。将样品与含抗坏血酸的对照标准体系比较,换算出被测物质抗氧化能力。
配置含8mM ABTS(M＝548.68)、3mM K2S2O8的溶液，室温避光静置16h。用0.1M PBS(pH＝7.4，含0.15mM NaCl)将ABTS·+溶液的OD730nm稀释至1.5，按表五配置反应溶液，室温遮光反应30min，
表五ABTS·+清除活性实验体系
注：“—”为对应体积的蒸馏水
5μg/mL抗环血酸的ABTS·+清除率为48％，50％g/mL活性提取物ABTS·+清除率为56％。
5.获得的鹿茸组分的肽组成
将样品用0.1％甲酸水溶液复溶，取4μg样品经LTQ orbitrap Velos(线性离子阱回旋共振组合色谱仪)和Mascot 2.5.1数据处理软件分析，得到如下肽段。
表六 鹿茸组分的肽组成
实施例2
以新鲜梅花鹿鹿茸为原料，按照以下工艺制备：
新鲜鹿茸冷冻干燥粉碎后取1kg粉末，加入15L去离子水，升温至55℃，加入2g木瓜蛋白酶搅拌3小时后冷却至室温，以3500×g离心10分钟，保留上清液。用2M的盐酸将上清液的pH调至5.5，搅拌均匀后加入1g菠萝蛋白酶，在45℃温度下酶解2小时；酶解结束后用1M的NaOH溶液将pH调节至7.0，再加入1.0g中性蛋白酶，37℃酶解2小时，反应结束后将温度升至90℃并保温10分钟后冷却至室温。
酶解液以3500×g的速度于4℃离心15分钟，上清液加水稀释至25mg/mL待用。将溶胀后的Sephadex G-25填料填装成直径10.0cm、柱高100cm的凝胶柱。将酶解液加载于凝胶柱上，以去离子水为洗脱液、流速10L/h进行洗脱，收集流份并在205nm检测吸光度。检测各流份的PEP(脯氨酰内切酶)抑制活性，将PEP抑制活性最高的流份冷冻干燥，得到具有抗谷氨酸诱导HT-22细胞氧化应激损伤作用的组分。
2.对获得的鹿茸组分进行抗谷氨酸诱导HT-22细胞氧化应激损伤作用的活性检测：鹿茸活性组分浓度为500、200性g/mL时，细胞活力百分比分别为41.8％、14.4％。
3.对获得的鹿茸组分进行PEP抑制活性检测：鹿茸活性组分样品浓度为4.0、2.0mg/mL时，PEP抑制率分别为66.3％、58.2％。
4.对获得的鹿茸组分进行抗氧化活性检测：50茸g/mL活性提取物ABTS·+清除率为52％。
实施例3
以新鲜梅花鹿鹿茸为原料，按照以下工艺制备：
新鲜鹿茸冷冻干燥粉碎后取1kg粉末，加入20L去离子水，升温至45℃，加入2g菠萝蛋白酶搅拌3小时后冷却至室温，以10000×g离心10分钟，保留上清液。用2M的盐酸将上清液的pH调至3.5，搅拌均匀后加入1g胃蛋白酶，在37℃温度下酶解2小时；酶解结束后用4M的NaOH溶液将pH调节至7.0，再加入0.5g风味蛋白酶和1.0g碱性蛋白酶，50℃酶解2小时，反应结束后将温度升至90℃并保温15分钟后冷却至室温。
酶解液以3500×g的速度于4℃离心15分钟，上清液加水稀释至20mg/mL待用。将溶胀后的Sephadex G-25填料填装成直径10.0cm、柱高100cm的凝胶柱。将酶解液加载于凝胶柱上，以去离子水为洗脱液、流速10L/h进行洗脱，收集流份并在205nm检测吸光度。检测各流份的PEP(脯氨酰内切酶)抑制活性，将PEP抑制活性最高的流份冷冻干燥，得到具有抗谷氨酸诱导HT-22细胞氧化应激损伤作用的组分。
2.对获得的鹿茸组分进行抗谷氨酸诱导HT-22细胞氧化应激损伤作用的活性检测：鹿茸活性组分浓度为1000、200活g/mL时，细胞活力百分比分别为100.0％、74.9％。
3.对获得的鹿茸组分进行PEP抑制活性检测：鹿茸活性组分样品浓度为4.0、2.0mg/mL时，PEP抑制率分别为73.1％、53.2％。
4.对获得的鹿茸组分进行抗氧化活性检测：50茸g/mL活性提取物ABTS·+清除率为56.9％。
实施例4
以新鲜梅花鹿鹿茸为原料，按照以下工艺制备：
新鲜鹿茸冷冻干燥粉碎后取1kg粉末，加入20L去离子水，升温至50℃，加入2g胰凝乳蛋白酶搅拌5小时后冷却至室温，以3000×g离心10分钟，保留上清液。用2M的盐酸将上清液的pH调至4.0，搅拌均匀后加入1g胃蛋白酶，在40℃温度下酶解2小时；酶解结束后用4M的NaOH溶液将pH调节至7.0，再加入1.0g碱性蛋白酶，50℃酶解2小时，反应结束后将温度升至90℃并保温15分钟后冷却至室温。
酶解液以3500×g的速度于4℃离心15分钟，上清液加水稀释至20mg/mL待用。将溶胀后的Sephadex G-25填料填装成直径10.0cm、柱高100cm的凝胶柱。将酶解液加载于凝胶柱上，以去离子水为洗脱液、流速10L/h进行洗脱，收集流份并在205nm检测吸光度。检测各流份的PEP(脯氨酰内切酶)抑制活性，将PEP抑制活性最高的流份冷冻干燥，得到具有抗谷氨酸诱导HT-22细胞氧化应激损伤作用的组分。
2.对获得的鹿茸组分进行抗谷氨酸诱导HT-22细胞氧化应激损伤作用的活性检测：鹿茸活性组分浓度为80、20为g/mL时，细胞活力百分比分别为127.6％、71.3％。
3.对获得的鹿茸组分进行PEP抑制活性检测：鹿茸活性组分样品浓度为4.0、2.0mg/mL时，PEP抑制率分别为68.0％、44.4％。
4.对获得的鹿茸组分进行抗氧化活性检测：50茸g/mL活性提取物ABTS·+清除率为50.7％。
Claims (5)
1.一种具有抗谷氨酸诱导HT-22细胞氧化应激损伤作用的鹿茸活性组分的制备方法，其特征在于：将鹿茸提取、酶解、纯化，得到一种具有抗谷氨酸诱导HT-22细胞氧化应激损伤作用的鹿茸活性组分；
具体过程如下：
1）新鲜鹿茸切碎后冷冻干燥，粉碎，加入鹿茸质量5～30倍的去离子水，升温至30~70℃后加入鹿茸质量0.1～2.0%（w/w）的蛋白酶A，搅拌提取1～5小时，提取结束后冷却至室温，以2500×g～15000×g于2～8℃离心5～30min，保留上清液；
2）用1～6 M的盐酸将提取物的pH调至1.0～5.0，搅拌均匀后加入鹿茸质量0.1～5.0 %（w/w）的蛋白酶B，在20～65℃温度下酶解0.5～24小时；酶解结束后用1~6 M的NaOH溶液将pH调节至6.0～8.0，再加入鹿茸质量0.1～5.0 %（w/w）的蛋白酶C，在20～65℃温度下酶解0.5～24小时，反应结束后将温度升至90～100℃并保温10～30分钟后冷却至室温；
3）酶解液以2500×g～10000×g的速度于2～8℃离心5～30分钟，上清液加水稀释至15～50 mg/mL待用；将溶胀后的Sephadex G-25填料填装成直径1.4～10.0 cm、柱高与直径比5:1~10:1的凝胶柱；将酶解液加载于凝胶柱上，以去离子水为洗脱液、流速0.03~10 L/h进行洗脱，收集流份并在205 nm检测吸光度；检测各流份的脯氨酰内切酶抑制活性，将脯氨酰内切酶抑制活性最高的流份冷冻干燥，得到具有抗谷氨酸诱导HT-22细胞氧化应激损伤作用的组分；
所述蛋白酶A、B、C分别为：胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶，或者所述蛋白酶A、B、C分别为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶，或者所述蛋白酶A、B、C分别为菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶和碱性蛋白酶，或者所述蛋白酶A、B、C分别为胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶。
2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤1）中加入鹿茸质量10～20倍的去离子水，升温至40～55℃后加入鹿茸质量0.1～2.0%（w/w）的蛋白酶A，搅拌提取2～4小时；
步骤2）中用1～6 M的盐酸将提取物的pH调至3.0～4.0，搅拌均匀后加入鹿茸质量2.0～3.0 %（w/w）的蛋白酶B，在30～50℃温度下酶解3～10小时；酶解结束后用1~6 M的NaOH溶液将pH调节至6.5～7.5，再加入鹿茸质量2.0～3.0 %（w/w）的蛋白酶C，在30～50℃温度下酶解3～10小时，反应结束后将温度升至95～100℃并保温10～30分钟后冷却至室温。
3.一种权利要求1-2任一所述制备方法制备获得的具有抗谷氨酸诱导HT-22细胞氧化应激损伤作用的鹿茸活性组分。
4.一种权利要求3所述制备方法制备获得的具有抗谷氨酸诱导HT-22细胞氧化应激损伤作用的鹿茸活性组分的应用，其特征在于：所述具有抗谷氨酸诱导HT-22细胞氧化应激损伤作用的鹿茸活性组分，用于制备治疗和/或预防神经系统疾病的药物；
所述神经系统疾病为神经性退化性疾病。
5.按照权利要求4所述的应用，其特征在于：所述疾病为阿尔兹海默症或帕金森症认知障碍疾病。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711272312.8A CN109880868B (zh) | 2017-12-06 | 2017-12-06 | 一种具有抗谷氨酸诱导ht-22细胞氧化应激损伤作用的鹿茸活性组分及制备和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711272312.8A CN109880868B (zh) | 2017-12-06 | 2017-12-06 | 一种具有抗谷氨酸诱导ht-22细胞氧化应激损伤作用的鹿茸活性组分及制备和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109880868A CN109880868A (zh) | 2019-06-14 |
| CN109880868B true CN109880868B (zh) | 2022-04-05 |
Family
ID=66923227
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201711272312.8A Active CN109880868B (zh) | 2017-12-06 | 2017-12-06 | 一种具有抗谷氨酸诱导ht-22细胞氧化应激损伤作用的鹿茸活性组分及制备和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109880868B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102020210725A1 (de) * | 2019-10-31 | 2021-05-06 | Gelita Ag | Ernährungsphysiologisch optimiertes Kollagenpeptid |
| CN114855285B (zh) | 2022-06-02 | 2023-02-17 | 山东省食品药品检验研究院 | 一种快速鉴别鹿茸种属来源的特征多肽库及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20120057699A (ko) * | 2010-08-16 | 2012-06-07 | 주식회사 제이비티 | 녹용으로 수용성 물질의 제조를 위한 추출방법의 개발과 추출물의 생리 활성 |
| CN102925522A (zh) * | 2012-10-31 | 2013-02-13 | 王�华 | 一种采用酶解法制取鹿茸多肽干粉的方法 |
| CN106551391A (zh) * | 2015-09-25 | 2017-04-05 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种鹿茸深加工方法 |
| RU2016119723A (ru) * | 2016-05-20 | 2017-11-23 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт пантового оленеводства" (ФГБНУ ВНИИПО) | Способ переработки пантов оленей |
-
2017
- 2017-12-06 CN CN201711272312.8A patent/CN109880868B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20120057699A (ko) * | 2010-08-16 | 2012-06-07 | 주식회사 제이비티 | 녹용으로 수용성 물질의 제조를 위한 추출방법의 개발과 추출물의 생리 활성 |
| CN102925522A (zh) * | 2012-10-31 | 2013-02-13 | 王�华 | 一种采用酶解法制取鹿茸多肽干粉的方法 |
| CN106551391A (zh) * | 2015-09-25 | 2017-04-05 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种鹿茸深加工方法 |
| RU2016119723A (ru) * | 2016-05-20 | 2017-11-23 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт пантового оленеводства" (ФГБНУ ВНИИПО) | Способ переработки пантов оленей |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Protein digestomic analysis reveals the bioactivity of deer antler velvet in simulated gastrointestinal digestion;Yang Yu et al.;《Food Research International》;20170405;第96卷;第182-190页 * |
| 鹿生物活性制备新技术开发及新产品创制;靳艳，晏嘉泽;《第八届（2017）中国鹿业发展大会论文集》;20171103;第110-112页 * |
| 鹿茸冻干粉的酶解及其酶解产物性质的研究;郑帆等;《中国中药杂志》;20101031;第35卷(第19期);第2628-2633页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109880868A (zh) | 2019-06-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5957096B2 (ja) | バチルス、ヒアルロン酸酵素、及びそれらの使用 | |
| Shashkina et al. | Chemical and medicobiological properties of chaga | |
| KR100189144B1 (ko) | 신규 생리 활성 물질 | |
| CN105147564B (zh) | 一种马齿苋发酵原浆化妆品及其制备方法与应用 | |
| CN109880868B (zh) | 一种具有抗谷氨酸诱导ht-22细胞氧化应激损伤作用的鹿茸活性组分及制备和应用 | |
| WO2018214458A1 (zh) | 一种富含可溶性多酚以及黄酮苷元的番石榴叶及制备方法与应用 | |
| CN109303789B (zh) | 一种具有脯氨酰内切酶抑制活性的鹿茸活性组分及制备和应用 | |
| de Souza et al. | Cell toxicity by ricin and elucidation of mechanism of Ricin inactivation | |
| CN110240630A (zh) | 一种具有肝细胞氧化损伤保护作用的天然寡肽 | |
| Liu et al. | Role of aqueous extract of the wood ear mushroom, auricularia polytricha (agaricomycetes), in avoidance of haloperidol-lnduced catalepsy via oxidative stress in rats | |
| Shaheen et al. | Photoprotection against UV-induced skin damage using hyaluronic acid produced by Lactiplantibacillus plantarum and Enterococcus durans | |
| CN105250169A (zh) | 一种芦荟发酵原浆化妆品及其制备方法与应用 | |
| Lai et al. | Antioxidant and antiedema properties of solid-state cultured honey mushroom, Armillaria mellea (higher Basidiomycetes), extracts and their polysaccharide and polyphenol contents | |
| KR20140136326A (ko) | 체중 감소용 감태 추출물 및 이의 제조방법 | |
| Biswas et al. | In-vitro cholinesterase inhibitory activity of dry fruit extract of Phyllanthus emblica relevant to the treatment of Alzheimer’s disease | |
| US10702564B2 (en) | Blood pressure lowering composition containing as active ingredient exopolysaccharide produced by means of ceriporia lacerata | |
| CN108949617A (zh) | 一种枯草芽孢杆菌及其应用、一种酶制剂 | |
| DD222895A5 (de) | Verfahren zur herstellung eines hypotriglyceridemisch aktiven polysaccharids | |
| CN104473988A (zh) | 千里光注射液及其制备方法与应用 | |
| Falé et al. | Interaction between Plectranthus barbatus herbal tea components and human serum albumin and lysozyme: Binding and activity studies | |
| CN105147565B (zh) | 一种番茄发酵原浆化妆品及其制备方法与应用 | |
| CN110846365B (zh) | 一种移山参肽、及其制备方法和应用 | |
| KR20140037401A (ko) | α-ａｍｙｌａｓｅ 분비능이 우수한 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용한 홍삼 효소처리 조성물, 효소처리 홍삼 | |
| CN1307198C (zh) | 眼镜蛇毒神经毒素和细胞毒素的分离纯化方法 | |
| Meera et al. | Antiarthritic Activity of a Polysaccharide-Protein Complex Isolated from Phellinus rimosus (Berk.) Pilát (Aphyllophoromycetideae) in Freund's Complete Adjuvant− Induced Arthritic Rats |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |