CN102286561A - 一种鲜鹿茸酶降解提取有效成分的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种鲜鹿茸酶降解提取有效成分的方法。鲜鹿茸经Alcalase碱性蛋白酶降解处理后，获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液，其降解率为82％～93％；获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液中，含有脂肪酸、磷脂、甾体化合物、糖类、微量元素等多种有效成分，所有的有机质都变成了易于人体吸收的溶液状态，可用于制药、保健品、食品、化妆品诸多方面；用Alacalase碱性蛋白酶降解鲜鹿茸，鲜鹿茸降解后的残渣物为鹿茸钙化物质及无机元素等，可用作良好的饲料添加剂；鹿茸的生物活性物质的浓缩液分离纯化后得到纯度为97％的氨基酸产品为重要的营养品，氨基酸的收率达到12％以上。本发明的反应条件温和、操作简单、鹿茸的全部有效成分都能被充分利用，提高了鹿茸的应用价值和经济效益。
Description
技术领域
本发明属于鲜鹿茸酶降解提取有效成分的方法，涉及一种利用Alcalase碱性蛋白酶直接降解鲜鹿茸提取有效成分的方法。
背景技术：
鹿茸是指雄性梅花鹿或马鹿未骨化的角组织，是著名的传统中药材，含有磷脂、糖脂、胶脂、激素、脂肪酸、氨基酸、维生素、蛋白质及钙、磷、镁、纳等[1]成份。近年来采用冷冻干燥法分离出一些活性物质，鹿茸中含有多种生理活性成分[2]，如神经生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子及鹿茸多肽等。依据其溶解性分为水溶性、脂溶性、和不溶性物质；水溶性物质中主要包括19种氨基酸、多肽、蛋白质，粘多糖、粘蛋白、氨基己糖和葡萄糖。脂溶性物质主要是磷脂、甾体化合物、脂肪酸、中性脂、维生素类和前列腺素等；不溶性物质主要包括硬蛋白和胶原蛋白等物质。鹿茸性温而不燥，对全身虚弱、久病之后患者，有较好的保健作用[3]-[4]。因此由其提取的鹿茸素含有多种生物活性物质，能够促进机体的生长发育和新陈代谢，增强机体的免疫功能，具有壮肾阳，益精血，强筋骨等特殊功效。
鹿茸素是鹿茸中的活性成份的总称。鹿茸素在食品、医药、保健、美容化妆品的应用随着人们生活水平的提高有不断上升的趋势，市场销售前景十分广阔。
目前提取鹿茸素的方法主要有：(1)乙醇提取法[5]-[6]：采用乙醇提取鹿茸素，乙醇用量为10倍量时，出膏率为5％，醇提物中只含有17KD以下的多肽。(2)酸提法：盐酸提取鹿茸多糖操作比较复杂[7]，一般需要反复多次提取，酸提法获得的鹿茸提取物中的活性成分含量低，且含有一些不易被人体吸收的物质，如蛋白质等大分子物质。(3)超临界CO2萃取法[8-10]：超临界CO2萃取技术是纯物理方式提取鹿茸中活性物质，具有无毒、环保、萃取时间短、产品质量高等特点，但鹿茸中活性物质提取率也只有10％，而且设备投资费用大，成本高。
概括而言，目前提取鹿茸素的方法主要存在操作复杂、提取率低、提取的有效成分不完全的缺点，难以满足当今市场对鹿茸素的需求。
发明内容
本发明的目的是针对上述已有技术的不足，提供一种鲜鹿茸酶降解提取有效成分的方法，具体涉及一种利用Alcalase碱性蛋白酶直接降解鲜鹿茸提取有效成分的方法。
本发明的方法反应条件温和、操作简单、鹿茸的全部有效成分都能被充分提取利用。
本发明的技术方案包括以下操作步骤：
(1)鲜鹿茸经燎毛、洗净，在4～6℃的条件下机械切成片状；
(2)取切成片状的鲜鹿茸，按底物浓度为0.05g/mL～0.20g/mL的比例加入缓冲溶液，用胶体磨粉碎至微米级，调pH值为7～10，按切成片状的鲜鹿茸重量的0.01～0.03倍加入Alcalase碱性蛋白酶，在温度为50℃～70℃条件下降解3h～8h，降解过程保持pH值恒定，降解后90-95℃加热15min，将Alcalase碱性蛋白酶灭活；所用缓冲溶液为pH值为9～12的碳酸钠缓冲溶液、乳酸钠-氢氧化钠缓冲溶液或碳酸氢钠缓冲溶液；
(3)用滤纸或离心过滤去除鲜鹿茸降解后的残渣物，收集滤液，将得到的滤液减压蒸馏，浓缩，获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液；鲜鹿茸经Alcalase碱性蛋白酶降解处理后，其降解率为82％～93％；
(4)将过滤得到的鲜鹿茸降解后的残渣物烘干；
(5)将已处理好的氢型732强酸性阳离子交换树脂装入两支串联的柱子里，将步骤(3)的获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液调pH值为2-5后上柱，吸附3-6h，用蒸馏水洗脱，至收集液使茚三酮显阳性，再用洗脱剂洗脱至使茚三酮显阴性，得到鹿茸有效成分氨基酸；收率达到12％以上；
所述的洗脱剂为NH4Cl溶液、NH4Ac溶液或NH3.H2O；氢型732强酸性阳离子交换树脂的处理方法为：将树脂置于其两倍量的浓度为26.5％的食盐溶液中浸泡18-20小时，然后放尽食盐水，用清水漂洗净，使排出水不带黄色；再用与食盐溶液量相同的浓度为2％-4％的NaOH溶液浸泡2-4小时，或作小流量清洗，放尽碱液后，用清水冲洗树脂直至排出水接近中性为止，最后用与食盐溶液量相同的浓度为5％的HCL溶液浸泡4-8小时，放尽酸液，用清水漂流至中性待用。
有益效果：本发明提供一种鲜鹿茸酶降解提取有效成分的方法，鲜鹿茸经Alcalase碱性蛋白酶降解处理后，获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液，其降解率为82％～93％；获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液中，经分析含有脂肪酸、磷脂、甾体化合物、糖类、微量元素等多种有效成分，所有的有机质都变成了易于人体吸收的溶液状态，可用于制药、保健品、食品、化妆品诸多方面；用Alacalase碱性蛋白酶降解鲜鹿茸，鲜鹿茸降解后的残渣物为鹿茸钙化物质及无机元素等，可用作良好的饲料添加剂；鹿茸的生物活性物质的浓缩液分离纯化后得到纯度为97％的氨基酸产品为重要的营养品，氨基酸的收率达到12％以上。本发明的反应条件温和、操作简单、鹿茸的全部有效成分都能被充分利用，提高了鹿茸的应用价值和经济效益，能够解决目前市场上鹿茸素供不应求的局面。
附图说明
图1.1是本发明的鲜鹿茸酶解产物中氨基酸的HPLC图。1.天冬氨酸Asp，2.谷氨酸Glu，3.丝氨酸Ser，4.苏氨酸Thr，5.精氨酸Arg，6.丙氨酸Ala，7.脯氨酸Pro，8.缬氨酸Val，9.甲硫氨酸Met，10.异亮氨酸Ile，11.亮氨酸Leu，12.苯丙氨酸Phe，13.组氨酸His，14.赖氨酸Lys，15.酪氨酸Tyr。
图1.2是17种氨基酸混合标准溶液HPLC图。1.天冬氨酸Asp，2.谷氨酸Glu，3.丝氨酸Ser，4.甘氨酸Gly，5.苏氨酸Thr，6.精氨酸Arg，7.丙氨酸Ala，8.脯氨酸Pro，9.缬氨酸Val，10.甲硫氨酸Met，11.半胱氨酸Cys，12.异亮氨酸Ile，13.亮氨酸Leu，14.苯丙氨酸Phe，15.组氨酸His，16.赖氨酸Lys，17.酪氨酸Tyr。通过图1.1与图1.2的对比，可以得出本发明的鹿茸酶降解产物中含有精氨酸、赖氨酸、亮氨酸等15种氨基酸。
图2是本发明的鲜鹿茸酶解产物中氨基酸的红外光谱图。由图2可以看出吸收峰为3414.96的官能团为氨基，在氨基酸的红外光谱上，没有典型的羧基(-COOH)伸展吸收峰1275cm-1-1700cm-1，而只有-COO负离子的伸展吸收峰1650cm-1-1545cm-1，因此可以判断图中的吸收峰1628.49979cm-1是由羧基产生的，而且杂质峰很少，本发明的方法分离的混合氨基酸纯度也很高，可达97％。
具体实施方式
实施例1：本发明的技术方案包括以下操作步骤：
(1)鲜鹿茸经燎毛、洗净，在4～6℃的条件下机械切成片状；
(2)取15.01g切成片状的鲜鹿茸，放入500mL烧杯中，按底物浓度为0.1g/mL的比例加入乳酸钠-氢氧化钠缓冲溶液，用胶体磨粉碎至微米级，调pH值为8.5，按切成片状的鲜鹿茸重量的0.02倍加入Alcalase碱性蛋白酶，在温度为65℃条件下降解6h，降解过程保持pH值恒定，降解后95℃加热15min，将Alcalase碱性蛋白酶灭活；所用缓冲溶液为pH值为9～12的NH3.H2O；
(3)用滤纸或离心过滤去除鲜鹿茸降解后的残渣物，收集滤液，将得到的滤液减压蒸馏，浓缩，获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液；鲜鹿茸经Alcalase碱性蛋白酶降解处理后，其降解率为93％；
(4)将过滤得到的鲜鹿茸降解后的残渣物烘干；
(5)将已处理好的氢型732强酸性阳离子交换树脂装入两支串联的柱子里，将步骤(3)的获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液调pH值为2后上柱，吸附3-6h，用蒸馏水洗脱，至收集液使茚三酮显阳性，再用洗脱剂洗脱至使茚三酮显阴性，得到鹿茸有效成分氨基酸；收率达到12％以上；
所述的洗脱剂为NH4Cl溶液、NH4Ac溶液或NH3.H2O；氢型732强酸性阳离子交换树脂的处理方法为：将树脂置于其两倍量的浓度为26.5％的食盐溶液中浸泡18-20小时，然后放尽食盐水，用清水漂洗净，使排出水不带黄色；再用与食盐溶液量相同的浓度为2％-4％的NaOH溶液浸泡2-4小时，或作小流量清洗，放尽碱液后，用清水冲洗树脂直至排出水接近中性为止，最后用与食盐溶液量相同的浓度为5％的HCL溶液浸泡4-8小时，放尽酸液，用清水漂流至中性待用。
实施例2-6的条件如表1，其余的同实施例1。
表1
注：“底物浓度”为切成片状的鲜鹿茸重量与缓冲溶液的体积的比值；“加酶量”为加入Alcalase碱性蛋白酶的重量是切成片状的鲜鹿茸重量的倍数值。
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Claims (7)
1.一种鲜鹿茸酶降解提取有效成分的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)鲜鹿茸经燎毛、洗净，在4～6℃的条件下机械切成片状；
(2)取切成片状的鲜鹿茸，按底物浓度为0.05g/mL～0.20g/mL的比例加入缓冲溶液，用胶体磨粉碎至微米级，调pH值为7～10，按切成片状的鲜鹿茸重量的0.01～0.03倍加入Alcalase碱性蛋白酶，在温度为50℃～70℃条件下降解3h～8h，降解过程保持pH值恒定，降解后90-95℃加热15min，将Alcalase碱性蛋白酶灭活；所用缓冲溶液为pH值为9～12的碳酸钠缓冲溶液、乳酸钠-氢氧化钠缓冲溶液或碳酸氢钠缓冲溶液；
(3)用滤纸或离心过滤去除鲜鹿茸降解后的残渣物，收集滤液，将得到的滤液减压蒸馏，浓缩，获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液；
(4)将过滤得到的鲜鹿茸降解后的残渣物烘干；
(5)将已处理好的氢型732强酸性阳离子交换树脂装入两支串联的柱子里，将步骤(3)的获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液调pH值为2-5后上柱，吸附3-6h，用蒸馏水洗脱，至收集液使茚三酮显阳性，再用洗脱剂洗脱至使茚三酮显阴性，得到鹿茸有效成分氨基酸；
所述的洗脱剂为NH4Cl溶液、NH4Ac溶液或NH3.H2O；氢型732强酸性阳离子交换树脂的处理方法为：将树脂置于其两倍量的浓度为26.5％的食盐溶液中浸泡18-20小时，然后放尽食盐水，用清水漂洗净，使排出水不带黄色；再用与食盐溶液量相同的浓度为2％-4％的NaOH溶液浸泡2-4小时，或作小流量清洗，放尽碱液后，用清水冲洗树脂直至排出水接近中性为止，最后用与食盐溶液量相同的浓度为5％的HCL溶液浸泡4-8小时，放尽酸液，用清水漂流至中性待用。
2.如权利要求1所述的一种鲜鹿茸酶降解提取有效成分的方法，其特征在于所述的(2)底物浓度为0.01g/mL，调pH值为8.5，按切成片状的鲜鹿茸重量的0.02倍加入Alcalase碱性蛋白酶，在温度为65℃条件下降解6h，缓冲溶液为乳酸钠-氢氧化钠缓冲溶液；(5)将步骤(3)的获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液调pH值为2后上柱，吸附4h，所述的洗脱剂为NH3.H2O；其余的同权利要求1。
3.如权利要求1所述的一种鲜鹿茸酶降解提取有效成分的方法，其特征在于所述的(2)底物浓度为0.05g/mL，调pH值为7.5，按切成片状的鲜鹿茸重量的0.01倍加入Alcalase碱性蛋白酶，在温度为50℃条件下降解3h，缓冲溶液为碳酸钠缓冲溶液；(5)将步骤(3)的获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液调pH值为2后上柱，吸附3h，所述的洗脱剂为NH4Cl溶液；其余的同权利要求1。
4.如权利要求1所述的一种鲜鹿茸酶降解提取有效成分的方法，其特征在于所述的(2)底物浓度为0.08g/mL，调pH值为8.0按切成片状的鲜鹿茸重量的0.015加入Alcalase碱性蛋白酶，在温度为55℃条件下降解4h，缓冲溶液为碳酸氢钠缓冲溶液；(5)将步骤(3)的获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液调pH值为3上柱，吸附4h，所述的洗脱剂为NH4Ac溶液；其余的同权利要求1。
5.如权利要求1所述的一种鲜鹿茸酶降解提取有效成分的方法，其特征在于所述的(2)底物浓度为0.10g/mL，调pH值为8.5按切成片状的鲜鹿茸重量的0.02加入Alcalase碱性蛋白酶，在温度为60℃条件下降解5h，缓冲溶液为碳酸钠缓冲溶液；(5)将步骤(3)的获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液调pH值为4上柱，吸附4h，所述的洗脱剂为NH3.H2O；其余的同权利要求1。
6.如权利要求1所述的一种鲜鹿茸酶降解提取有效成分的方法，其特征在于所述的(2)底物浓度为0.15g/mL，调pH值为9.0按切成片状的鲜鹿茸重量的0.025加入Alcalase碱性蛋白酶，在温度为65℃条件下降解6h，缓冲溶液为碳酸钠缓冲溶液；(5)将步骤(3)的获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液调pH值为5上柱，吸附6h，所述的洗脱剂为NH3.H2O；其余的同权利要求1。
7.如权利要求1所述的一种鲜鹿茸酶降解提取有效成分的方法，其特征在于所述的(2)底物浓度为0.20g/mL，调pH值为9.5按切成片状的鲜鹿茸重量的0.030加入Alcalase碱性蛋白酶，在温度为70℃条件下降解8h，缓冲溶液为碳酸钠缓冲溶液；(5)将步骤(3)的获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液调pH值为4上柱，吸附3h，所述的洗脱剂为NH4C溶液；其余的同权利要求1。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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