CN109438553A - 一种适合桃花芽蛋白质的提取方法 - Google Patents

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王召元
常瑞丰
刘国俭
陈湖
徐金涛
韩继成
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    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/145—Extraction; Separation; Purification by extraction or solubilisation
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Abstract

本发明属于植物蛋白质的提取技术领域，具体涉及到一种适合桃花芽蛋白质的提取方法。本发明通过溶解、沉淀、纯化、干燥，将桃花芽中的蛋白质分离纯，本发明所述方法步骤简单，通过本发明所述方法提取桃花芽中的蛋白质纯度高杂质少，便于桃花芽蛋白质组学相关的研究。

Description

一种适合桃花芽蛋白质的提取方法
技术领域
本发明属于植物蛋白质的提取技术领域，具体涉及到一种适合桃花芽蛋白质的提取方法。
背景技术
植物蛋白质提取的难点在于植物细胞中蛋白质的含量低，同时含有许多干扰蛋白质提取的有机物,如酚类、色素、脂类及核酸等，桃花芽更是由于外部有鳞片包裹，适合提取蛋白的内部芽体很小，核酸含量高、酚类物质较多不易提取出高质量的蛋白质进行一系列的试验，而常规的TCA-丙酮提取法无法获得理想的电泳图谱,严重制约了其蛋白质组学相关的研究。而蛋白质组学技术是研究桃花芽中次级代谢产物合成的有力工具。
传统的酚法进行了植物叶片蛋白质提取，利用多糖类物质不溶于酚相这一特征，可使用饱和酚萃取蛋白，从而除去样品中的多糖类及其他不溶于酚的物质，但酚法无法有效去除多酚类和盐类物质。因此，酚法提取得到的桃花芽蛋白质质量不佳，无法用于下一步蛋白质组学分离，进而无法进行蛋白质组学分析。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种适合桃花芽蛋白质的提取方法。
所述方法包括以下步骤：
步骤1，冬季采摘桃花芽，剥除桃花芽的外部干枯鳞片后将所述桃花芽通过液氮冷冻并放置于-70℃的冰箱中保存；
步骤2，称取1g冰箱中保存的桃花芽，将所称取的桃花芽在液氮中研磨成粉末，研磨过程中加入0.1g的PPVP，称取桃花芽粉末0.5g作为样品备用；
步骤3，取10ml离心管加入4.5ml的-20℃的植物蛋白提取液、10ul PMSF和10ulDTT，将所述样品转移到装有提取液的10ml离心管中，涡旋30s，在4℃下浸提1h；
步骤4，将样品摇匀后放置于高速冷冻离心机中，在4℃、8000r/min的条件下离心15min；
步骤5，另取1个10ml离心管中加4.5ml丙酮，丙酮在-20℃下预冷，取1.5ml的步骤4中离心后的上清液转移至装有丙酮的离心管中，摇匀，在-20℃下静置12h；
步骤6，将步骤5中装有丙酮的离心管放置于高速冷冻离心机中，在4℃、8000r/min的条件下离心15min，弃掉上清液，将剩余沉淀物用1ml冷丙酮重复清洗3-4次；
步骤7，将步骤6中清洗后的沉淀物在室温下风干，将风干后的沉淀物放置于10ml离心管中用250ul所述植物蛋白提取液溶解后涡旋3-4次，1h后，在4℃、12000r/min的条件下离心15min，取上清液200ul，加入40ul10％的SDS和5ul溴酚蓝，混匀后在沸水浴中热处理5min，冷却至室温即为待测蛋白质。
优选地，步骤6中所述剩余沉淀物清洗至色素变淡。
优选地，步骤3中所述植物蛋白提取液由pH6.8的62.5mmol/L的Tris-HCl、0.5％的SDS、10％的甘油、5％的β-巯基乙醇按体积比1.25：1：1：1配制而成。
本发明所述方法有益效果在于：方法步骤简单，通过本发明所述方法提取桃花芽中的蛋白质纯度高、便于去除杂质，便于桃花芽蛋白质组学相关的研究。
具体实施方式
本发明提供一种适合桃花芽蛋白质的提取方法。所述方法包括以下步骤：
步骤1，冬季采摘桃花芽，剥除所述桃花芽的外表干枯鳞片后将所述桃花芽通过液氮冷冻并放置于-70℃的冰箱中保存；
步骤2，称取1g冰箱中保存的桃花芽，用研钵将所称取的桃花芽在液氮中研磨成粉末，研磨过程中加入0.1g的PPVP，称取桃花芽粉末0.5g作为样品备用；
步骤3，取10ml离心管加入4.5ml的-20℃预冷的植物蛋白提取液、10ul PMSF和10ulDTT，将所述样品转移到装有提取液的10ml离心管中，涡旋30s，在4℃下浸提1h；
步骤4，将样品摇匀后放置于高速冷冻离心机中，在4℃、8000r/min的条件下离心15min；
步骤5，另取1个10ml离心管中加4.5ml丙酮，所述丙酮在-20℃下预冷，取1.5ml的步骤4中离心后的上清液转移至装有丙酮的10ml离心管中，摇匀，在-20℃下静置12h；
步骤6，将步骤5中装有丙酮的离心管放置于高速冷冻离心机中，在4℃、8000r/min的条件下离心15min，弃掉上清液，将剩余沉淀物用1ml冷丙酮重复清洗3-4次，直到色素变淡；
步骤7，将步骤6中清洗后的沉淀物在室温下风干，将风干后的沉淀物放置于10ml离心管中用250ul所述植物蛋白提取液溶解后涡旋3-4次，1h后，在中4℃、12000r的条件下离心15min，取上清液200ul，加入40ul10％SDS和5ul溴酚蓝，混匀后在沸水浴中热处理5min，冷却至室温得到待测蛋白。
优选地，步骤6中所述剩余沉淀物清洗至色素变淡。
优选地，步骤3中所述植物蛋白提取液由pH6.8的62.5mmol/LTris-HCl、0.5％的SDS、10％的甘油、5％的β-巯基乙醇按体积比1.25：1：1：1配制而成。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种适合桃花芽蛋白质的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，冬季采摘桃花芽，剥除所述桃花芽的外表干枯鳞片后将所述桃花芽通过液氮冷冻并放置于-70℃的冰箱中保存；
步骤2，称取1g冰箱中保存的桃花芽，将所称取的桃花芽在液氮中研磨成粉末，研磨过程中加入0.1g的PPVP，称取桃花芽粉末0.5g作为样品备用；
步骤3，取10ml离心管加入4.5ml的-20℃的植物蛋白提取液、10ul PMSF和10ulDTT，将所述样品转移到装有植物蛋白提取液的10ml离心管中，涡旋30s，4℃浸提1h；
步骤4，将样品摇匀，将装有植物蛋白提取液的10ml离心管放置于高速冷冻离心机中，在4℃、8000r/min的条件下离心15min；
步骤5，另取1个10ml离心管中加4.5ml丙酮，所述丙酮在-20℃下预冷，取1.5ml的步骤4中离心后的上清液转移至装有丙酮的10ml离心管中，摇匀，在-20℃下静置12h；
步骤6，将步骤5中所述离心管放置于高速冷冻离心机中，在4℃、8000r/min的条件下离心15min，弃掉上清液，将剩余沉淀物用1ml冷丙酮重复清洗3-4次；
步骤7，将步骤6中所述沉淀物在室温下风干，将风干后的沉淀物放置于10ml离心管中用250ul上样缓冲液溶解后涡旋3-4次，1h后，在4℃、12000r的条件下离心15min，取上清液200ul，加入40ul10％SDS和5ul的溴酚蓝，混匀后在沸水浴中热处理5min，冷却至室温得到待测蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物蛋白提取液由pH6.8的62.5mmol/LTris-HCl、0.5％的SDS、10％的甘油、5％的β-巯基乙醇按体积比1.25：1：1：1配制而成。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6中所述剩余沉淀物清洗至色素变淡。
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CN105241720A (zh) * 2015-10-20 2016-01-13 中国科学院南海海洋研究所 一种适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法

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