CN104830833B - 一种磁珠法结合离心套管提取dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磁珠法结合离心套管提取DNA的方法，包括以下步骤：1)将检材置入离心套管的内套管内，将TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠、蛋白酶K按体积比混匀后加入离心套管的内套管内，置金属浴上裂解；2)加入吸附液再次离心；3)去除内套管，加入吸附液，加入磁珠悬浊液置自动涡旋仪上吸附；4)置于磁力架上吸去上清后置离心机内离心再次吸去残液；5)加入冰乙醇涡旋后，置于磁力架上，充分吸去上清，置离心机内离心再次吸去残夜；6)烘干磁珠，加入洗脱液充分涡旋后置金属浴上孵化；7)PCR扩增液内扩增；本发明方法检出率高，最终模板保有量达50‑70％，特别适用于微量检材的检验，可检出模板含量在100pg以上的现场DNA检材。
Description
技术领域
本发明涉及一种提取DNA的方法，具体是采用磁珠法结合离心套管提取DNA的方法。
背景技术
生物磁珠是一种新型的功能化固体载体，其表面包被有活性基团，可以与多种生物活性物质发生偶联，兼具有液体的流动性和固体磁性材料等特点，在外磁场的作用下可以定向移动和集中，当撤去外磁场后，稍加振荡或抽吸又可均匀分散于液体中，从而使固液相的分离变的十分快捷方便，通过简单的洗脱可以得到纯度很高的靶向物质。
裂解液是一种蛋白变性剂，可使动植物的细胞裂解，并使与DNA结合的蛋白质变性，DNA游离释放，磁球可以特异地吸附DNA，通过洗涤，去除DNA以外的RNA、蛋白质等杂质，再因洗脱液解离吸附在磁珠上的DNA，得到纯度和浓度均很高的DNA，可用于PCR扩增、酶切、分子杂交等。
专利文献CN102229927A公开的一种提取案件微量检材DNA的方法：
1)将已转移好的可能含有脱落细胞的载体置于离心管，并加入裂解液和蛋白酶，漩涡震荡混匀，离心管置于孵育器上56度孵育40～60分钟；
2)离心管漩涡震荡混匀，置于孵育器上70-100度孵育3～8分钟后，13000转离心3分钟；
3)转移上清，加入磁珠悬液、结合液I和结合液II，吹打混匀，形成固液均相分散的悬浊液；
4)磁力架将吸附了DNA的磁珠从固液均相分散的悬浊液中分离出；
5)清洗液洗涤吸附有DNA的磁珠2-3次，将磁珠上的杂质洗去；
6)超纯水解吸附磁珠上的DNA，获得纯的浓缩的DNA溶液。
以上这种方法在行业内广泛使用，其优点是提取后的DNA模板纯度高，基本无杂质残留，有利于PCR扩增，对于血迹、烟头等杂质含量高、模板浓度高的常规检材，提取效果好。但这种方法在微量检材检验时效果差，DNA面板损失量较大，损失率高达80-90％，检出率低下。
发明内容
本发明的目的是提供一种磁珠法结合离心套管提取DNA的方法，该提取方法适用于微量检材的检验。
为了达到上述目的，本发明的技术方案是：
一种磁珠法结合离心套管提取DNA的方法，包括以下步骤：
(1)将检材置入离心套管的内套管内，将TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠、蛋白酶K(10mg/ml)按体积比10:2～3:2～3(优选体积比10:2:2)混匀后，取160～200微升，加入离心套管的内套管内，置37～56℃金属浴上裂解20～30分钟，95～99℃裂解10～15分钟；
在本专利中，离心套管采用专利文献CN103146569B公开的离心管，该离心管包括离心管和内套管。
本步骤的目的是将DNA裂解，将DNA与蛋白质分离，从细胞核中释放出来。
(2)将离心套管放入离心机中13000～17000g(优选15000g)离心0.5～1分钟，打开离心套管的管盖加入吸附液200～300微升，再次放入离心机13000～17000g离心2～5分钟；本步骤是利用具有过滤作用的离心套管去除载体和杂质。
(3)打开离心套管管盖，去除内套管，加入吸附液700～1000微升，加入磁珠悬浊液10～16微升，置自动涡旋仪上1000～1300转吸附15～20分钟；本步骤的目的是将水溶性DNA吸附在磁珠上。
上述吸附液优选硫氰酸胍。
(4)去除吸附液：将离心套管的离心管置于磁力架上，充分吸去上清后，置离心机内6000～8000g离心20～30秒，再次吸去残液；
(5)加入-20℃冰乙醇600～800微升，充分涡旋后，置于磁力架上，充分吸去上清，置离心机内6000～8000g离心20～30秒，再次吸去残夜；本步骤的目的是洗去残留扩增抑制物，如残留吸附液。
(6)置56℃金属浴上烘干磁珠，加入洗脱液20～100微升，充分涡旋后，置56～60℃金属浴上孵化15～20分钟，将DNA从磁珠上释放出来。
(7)将磁珠悬浊液加入PCR扩增液内扩增，提高DNA模板产量。
本发明利用机械离心原理，使用离心套管将载体上的DNA充分移至离心管内，并最大限度地过滤杂质，保留DNA模板；加大吸附液的用量，(现有技术用量为300微升，本发明中用量在1200微升左右)，从而保证吸附液的浓度没有明显下降，从而保证磁珠能够充分吸附DNA；删去现有技术中的漂洗步骤，不仅简化提取流程，更重要的是减少DNA模板损失；减少乙醇漂洗步骤，在充分吸取残留物的基础上，减少DNA模板损失；将磁珠悬浊液加入PCR扩增液内扩增，使磁珠上的残留的DNA模板得到充分利用。
本发明方法检出率高，最终模板保有量达50-70％，特别适用于微量检材的检验，可检出模板含量在100pg以上的现场DNA检材。
具体实施方式
实施例1
(1)将手套印棉签拭子置入离心套管的内套管内，将TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠、蛋白酶K(10mg/ml)按体积比10:2:2混匀后，取200微升，加入离心套管的内套管内，置56℃金属浴上裂解20分钟，99℃裂解10分钟；
(2)将离心套管放入离心机中17000g离心30秒，打开离心套管的管盖加入吸附液200微升，再次放入离心机15000g离心2分钟；
(3)打开离心套管的管盖，去除内套管，加入硫氰酸胍1000微升，加入磁珠悬浊液10微升，置自动涡旋仪上1300转吸附15分钟；
(4)将离心套管的离心管置于磁力架上，充分吸去上清后，置离心机内8000g离心20秒，再次吸去残液；
(5)加入-20℃冰乙醇750微升，充分涡旋后，置于磁力架上，充分吸去上清，置离心机内6000g离心30秒，再次吸去残夜；
(6)置56℃金属浴上烘干磁珠，加入洗脱液20微升，充分涡旋后，置56℃金属浴上孵化15分钟；
(7)将磁珠悬浊液加入PCR扩增液内扩增。
提取结果：检出模板含量在100pg的手套印棉签拭子。
实施例2
(1)将网线插头压片剪入离心套管的内套管内，将TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠、蛋白酶K(10mg/ml)按体积比10:2:3混匀后，取160微升，加入离心套管的内套管内，置56℃金属浴上裂解20分钟，95℃裂解15分钟；
(2)将离心套管放入离心机中15000g离心1分钟，打开离心套管的管盖加入吸附液200微升，再次放入离心机13000g离心5分钟；
(3)打开离心套管的管盖，去除内套管，加入硫氰酸胍700微升，加入磁珠悬浊液16微升，置自动涡旋仪上1000转吸附20分钟；
(4)将离心套管的离心管置于磁力架上，充分吸去上清后，置离心机内8000g离心30秒，再次吸去残液；
(5)加入-20℃冰乙醇600微升，充分涡旋后，置于磁力架上，充分吸去上清，置离心机内8000g离心20秒，再次吸去残夜；
(6)置56℃金属浴上烘干磁珠，加入洗脱液80微升，充分涡旋后，置60℃金属浴上孵化15分钟；
(7)将磁珠悬浊液加入PCR扩增液内扩增。
提取结果：检出模板含量在100pg，检出率在80％以上。
实施例3
(1)将作案工具手柄擦拭子置入离心套管的内套管内，将TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠、蛋白酶K(10mg/ml)按体积比10:3:3混匀后，取180微升，加入离心套管的内套管内，置37℃金属浴上裂解30分钟，99℃裂解10分钟；
(2)将离心套管放入离心机中13000g离心1分钟，打开离心套管的管盖加入吸附液300微升，再次放入离心机17000g离心2分钟；
(3)打开离心套管的管盖，去除内套管，加入硫氰酸胍1000微升，加入磁珠悬浊液16微升，置自动涡旋仪上1200转吸附18分钟；
(4)将离心套管的离心管置于磁力架上，充分吸去上清后，置离心机内8000g离心20秒，再次吸去残液；
(5)加入-20℃冰乙醇800微升，充分涡旋后，置于磁力架上，充分吸去上清，置离心机内8000g离心20秒，再次吸去残夜；
(6)置56℃金属浴上烘干磁珠，加入洗脱液100微升，充分涡旋后，置56℃金属浴上孵化20分钟；
(7)将磁珠悬浊液加入PCR扩增液内扩增。
提取结果：检出模板含量在100pg，检出率在80％以上。
上述实施例不以任何方式限制本发明，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。
Claims (5)
1.一种磁珠法结合离心套管提取DNA的方法，所述方法适用于检验模板含量在100pg以上的现场DNA 检材,其特征在于包括以下步骤：
（1）将检材置入离心套管的内套管内，将TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠、蛋白酶K10mg/ml按体积比10:2～3:2～3混匀后，取160～200微升，加入离心套管的内套管内，置37～56℃金属浴上裂解20～30分钟，95～99℃裂解10～15分钟；
（2）将离心套管放入离心机中13000～17000g离心0.5～1分钟，打开离心套管的管盖加入吸附液200～300微升，再次放入离心机13000～17000g离心2～5分钟；
（3）打开离心套管管盖，去除内套管，加入吸附液700～1000微升，加入磁珠悬浊液10～16微升，置自动涡旋仪上1000～1300转吸附15～20分钟；
（4）将离心套管的离心管置于磁力架上，充分吸去上清后，置离心机内6000～8000g离心20～30秒，再次吸去残液；
（5）加入-20℃冰乙醇600～800微升，充分涡旋后，置于磁力架上，充分吸去上清，置离心机内6000～8000g 离心20～30秒，再次吸去残夜；
（6） 置56℃金属浴上烘干磁珠，加入洗脱液20～100微升，充分涡旋后，置56～60℃金属浴上孵化15～20分钟；
（7）将磁珠悬浊液加入PCR 扩增液内扩增。
2.根据权利要求1 所述的一种磁珠法结合离心套管提取DNA 的方法，其特征在于：在所述步骤（1）中，所述体积比10:2:2。
3.根据权利要求1所述的一种磁珠法结合离心套管提取DNA的方法，其特征在于：在所述步骤（1）中，置56℃金属浴上裂解20～30分钟，99℃裂解10～15分钟。
4.根据权利要求1所述的一种磁珠法结合离心套管提取DNA的方法，其特征在于：在所述步骤(2)中，离心套管放入离心机中15000g离心。
5.根据权利要求1所述的一种磁珠法结合离心套管提取DNA的方法，其特征在于：所述吸附液为硫氰酸胍。
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