CN113604464A - 一种用于微量复杂性物证检材dna提取纯化的试剂盒与提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于微量复杂性物证检材DNA提取纯化的试剂盒与提取方法。所述试剂盒可有效进行多年陈旧布类、铁锈、泥土、色素中DNA提取纯化,由裂解液、结合液、漂洗液1、漂洗液2、纳米磁珠和洗脱液六部分组成,该试剂盒提取DNA的方法包括以下步骤:裂解液对检材中细胞的消化、磁珠吸附DNA、磁珠分离、磁珠漂洗、DNA洗脱。本发明的创新点是在于一种特殊的试剂体系,可有效去除复杂物证检材中的抑制物如腐殖酸、多糖以及阳离子等,有利于含有铁锈、泥土、色素等复杂检材中DNA的提取,使得DNA纯度更高,完整性更好,更有利于下游的STR扩增与电泳图谱分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于微量复杂性物证检材DNA提取纯化的试剂盒与提取方法,属于生物和医学检验技术领域。
背景技术
DNA是自然界生物几乎都含有的生物大分子,每个生物之间都有其特异性,利用短串联重复序列(short tandem repeat,STR)分型技术可以有效的对每个生物进行准确识别,DNA检验技术是案件侦破过程中使用的重要方法之一。通常情况下,公安部门人员在案发现场锁定物证类型多为脱落细胞类,主要包括实物物证与擦拭物证,此类物证可能是陈年的旧衣服类且易脱色。由于案发现场环境复杂,搜集的物证检材中可能含有铁锈、泥土等物质,这类样本通常含有大量的多糖、腐殖酸及阳离子,对于这类微量且复杂物证检材很难有行之有效的方法提取高纯度的DNA。目前市面上用于提取纯化DNA的方法有Chelex100法、硅珠过柱法、磁珠法等。而这些方法存在一定不足:如Chelex100法提取DNA需要对物证进行清洗,使得本来微量的DNA样本进一步损耗;硅珠过柱法提取复杂DNA,操作繁琐、灵敏度低、抗抑制能力弱;目前市面上虽然有基于磁珠法原理的自动化DNA提取工作站,但无法实现含有多种抑制物检材DNA的高效提取,导致STR位点检出率低。上述三种方法虽然对常规检材提取效果较好,但都不能解决复杂检材的抑制性问题,这些复杂检材包含:多年陈旧布料、铁锈、泥土、色素等。
针对上述情况,有必要开发一种即具有高提取灵敏度,又要有超强去杂质能力的DNA提取纯化试剂盒,依据该试剂盒体系的建立,可以实现微量复杂样本检材中DNA的高效提取与纯化。
发明内容
本发明主要目的是在于提供一种提取与纯化复杂样本中微量DNA的方法,解决复杂样本中DNA提取纯化的难题,实现快速、简便、高质量地提取与纯化。
为实现上述发明目的,本发明提供了一种用于微量复杂性物证检材DNA提取纯化的试剂盒与提取方法。所述试剂盒包括一种超强去杂质的裂解液、超高促进DNA与磁珠的结合液、漂洗液1、漂洗液2、纳米磁珠悬浮液和洗脱液六部分。
本发明采用如下技术方案:
一种用于微量复杂性物证检材DNA提取纯化的试剂盒,所述试剂盒包含:裂解液、结合液、漂洗液1、漂洗液2、纳米磁珠悬浮液和洗脱液。所述试剂盒能够有效去除复杂物证检材中的抑制物如腐殖酸、多糖以及阳离子等。
其中,所述裂解液组成为盐酸胍0.5-5mM;十二烷基磺酸钠1-5mM;EDTA 5-50mM;蛋白酶K 20-100mg/ml;PVP 2-80mM;所述的裂解液在使用时,使用醋酸0.2-1M、醋酸钠0.2-1M缓冲液调节PH值范围为3.5-6。
所述结合液组成为异硫氰酸胍2-6M,醋酸0.2-1M、醋酸钠0.2-1M,DMSO 1-100mM。
所述漂洗液1组成为盐酸胍1-3M,无水乙醇体积百分比55%,醋酸0.2-1M、醋酸钠0.2-1M。
所述漂洗液2组成为醋酸钠0.5-2M,无水乙醇体积百分比75%;
所述纳米磁珠悬浮液中,悬浮纳米磁珠尺寸为50-100nm。纳米磁珠悬浮液中,所述磁珠质量百分比为10-30%,使用0.5-1xPBS作为缓冲液。磁珠材料包括铁化合物、钴化合物和镍化合物中的一种或多种。
所述洗脱液组成为0.1-0.5X TE。
所述裂解液作用为,包括具有特定工作浓度的盐酸胍、十二烷基磺酸钠、EDTA、PVP、蛋白酶K和醋酸0.2-1M、醋酸钠0.2-1M、缓冲液协同作用,赋予了本发明对于人脱落细胞有良好的裂解功能,适用于人DNA的提取,并能保证DNA结构的完整性,能鳌合阳离子、溶解腐殖酸与多糖等物质,从而实现复杂样本杂质的去除;
所述结合液作用为,提供DNA与磁珠有效的结合环境,其中DMSO的加入有利于促进磁珠免受杂质的干扰,促进磁珠能有效的与DNA进行结合与吸附作用。
所述漂洗液作用为通过漂洗液操作,可以有效去除磁珠上除DNA以外的所附着的杂质,进一步提高磁珠吸附的DNA在质量,有利于后续STR扩增使用;通过优化漂洗液所含的离子浓度以及无水乙醇的含量,进行梯度的溶解与洗涤除DNA以外的离子、蛋白、多糖等。
所述纳米磁珠,为磁性纳米粒子,在结合液的作用下能够有效的与DNA的结合,其尺寸为50-100nm,分散在0.5-1xPBS缓冲液中。
制备如上所述的试剂盒的方法,包括如下步骤:
按照各组分含量分别配制裂解液、结合液、漂洗液1、漂洗液2、纳米磁珠悬浮液和洗脱液。
本发明同时提供如上所述的一种用于微量复杂性物证检材DNA提取纯化的试剂盒的提取方法,包括如下步骤:
1)取待提取物证片段或擦拭的棉签放入离心管中,向离心管中加入裂解液,接着加入蛋白酶K溶液,涡旋混匀后,放入恒温摇床温浴;
2)温浴后,离心;取出上清液于新的离心管中,向上清液中等体积加入结合液,再加入纳米磁珠悬浮液,室温,放于振荡器中连续振荡吸附;
3)吸附完成后,将离心管置于磁力架上,静置,吸弃管中废液,保留磁珠;
4)向离心管中加入漂洗液1,盖上离心管盖,涡旋振荡重悬磁珠后置于磁力架,吸弃液体保留磁珠;
5)向离心管中加入漂洗液2,盖上离心管盖,涡旋振荡重悬磁珠后置于磁力架,吸弃液体保留磁珠;
6)将离心管置于室温干燥;
7)加入洗脱液,涡旋振荡,使磁珠重悬至洗脱液中进行保存待用。
进一步地,步骤1)中,取待提取物证片段或擦拭的棉签放入离心管中,取150-600μl裂解液,按照加入裂解液总体积的5%~10%加入蛋白酶K溶液,涡旋混匀后,放入56~60℃恒温摇床温浴8-30min;优选地,步骤1)中,取待提取物证片段或擦拭的棉签放入离心管中,取150-600μl裂解液,按照加入裂解液总体积的5%加入蛋白酶K溶液,涡旋混匀后,放入56℃恒温摇床温浴8-30min。
进一步地,步骤2)中,温浴后,离心10000rpm,1min;取出上清液于新的离心管中,向上清液中等体积加入结合液,再加入10-20μl纳米磁珠悬浮液,室温,放于振荡器中连续振荡吸附10-20min;
进一步地,步骤3)中,吸附完成后,将离心管置于磁力架上,静置5-10min,吸弃管中废液,保留磁珠。
进一步地,步骤4)中,向离心管中加入500-1000μl漂洗液1,盖上离心管盖,涡旋振荡重悬磁珠后置于磁力架,吸弃液体保留磁珠。
进一步地,步骤5)中,向离心管中加入500-1000μl漂洗液2,盖上离心管盖,涡旋振荡重悬磁珠后置于磁力架,吸弃液体保留磁珠。
进一步地,步骤6)中,将离心管置于室温干燥5-20min。
进一步地,步骤7)中,加入30-70μl洗脱液,涡旋振荡,使磁珠重悬至洗脱液中进行保存待用。
特别地,本发明同时提供如上所述的一种用于微量物证复杂性检材DNA提取纯化的试剂盒的提取方法,包括如下步骤:
1)取待提取物证合适大小片段或擦拭的棉签放入离心管中,向离心管中加入100-600μl裂解液,接着按照裂解液总体积的5%加入蛋白酶K溶液,涡旋混匀后,放入56-60℃恒温摇床温浴8-30min;
2)温浴后,离心10000rpm,1-5min;取出上清液于新的离心管中,向上清液中等体积加入结合液,再加入10-20μl纳米磁珠悬浮液,室温,放于振荡器中连续振荡吸附10-20min;
3)吸附完成后,将离心管置于磁力架上,静置5-10min,吸弃管中废液,保留磁珠;
4)向离心管中加入500-1000μl漂洗液1,盖上离心管盖,涡旋振荡重悬磁珠后置于磁力架,吸弃液体保留磁珠;
5)向离心管中加入500-1000μl漂洗液2,盖上离心管盖,涡旋振荡重悬磁珠后置于磁力架,吸弃液体保留磁珠;
6)将离心管置于室温干燥5-20min;
7)加入30-70μl洗脱液,涡旋振荡,使磁珠重悬至洗脱液中进行保存待用。
本发明能发挥积极的作用在于:超高的DNA回收效率,可以对微量的脱落细胞进行高效的回收;超强的去除杂质能力,对铁锈、泥土、多年的陈旧布料等复杂的检材提取的DNA质量好,操作简单,所用时间较短,同时可以匹配自动化核酸提取仪,有效提高工作效率。
附图说明
图1不同提取方法提取复杂检材DNAreal-time PCR扩增曲线;
图2实施例1STR图谱;
图3实施例2STR图谱;
图4chelex-100提取复杂检材DNA STR图谱。
具体实施方式
根据上述发明的技术方案,借助一下实施例对本发明做进一步描述,该实施例作为示范性,仅供参考。
实施例1
为实现上述发明目的,本发明的一方面,提供了一种用于微量复杂性物证检材DNA提取纯化的试剂盒,包括:超强去杂质裂解液、超高促进DNA与磁珠的结合液、漂洗液1、漂洗液2、纳米磁珠悬浮液和洗脱液六部分组成,
其中,所述纳米磁珠为购买的商业化纳米磁珠(prenano-30-NA,金准智造生物科技有限公司)50nm;
所述裂解液组成为盐酸胍2mM;十二烷基磺酸钠3mM;EDTA20mM;蛋白酶K 20mg/ml;PVP 50mM;醋酸0.2M、醋酸钠0.2M缓冲液调节工作PH值为5;
所述结合液组成为异硫氰酸胍(5M),醋酸0.2M、醋酸钠0.2M,DMSO(20mM);
所述漂洗液1组成为盐酸胍(2M),无水乙醇体积百分比55%,醋酸0.2M、醋酸钠0.2M,
所述漂洗液2组成为醋酸钠(1M),无水乙醇体积百分比75%;
所述磁珠悬浮液中,纳米磁珠粒径为50nm,纳米磁珠质量百分比为10%,使用1xPBS作为缓冲液;
所述洗脱液组成为0.1-0.5X TE;
按照上述各组分含量分别配制裂解液、结合液、漂洗液1、漂洗液2、纳米磁珠悬浮液和洗脱液。
用于微量复杂性物证检材DNA提取纯化的试剂盒的提取方法,包括如下步骤:
1)取待提取物证陈旧衣物同时带有铁绣、泥土混合物合适大小(1cmx2cm)片段放入离心管中,向离心管中加入200μl裂解液,接着加入40mg/ml的蛋白酶K溶液10μL,涡旋混匀后,放入56℃恒温摇床温浴10min;
2)温浴后,离心10000rpm,1min;取出上清液于新的离心管中,向上清液中等体积加入结合液,再加入10μl纳米磁珠悬浮液,室温,放于振荡器中连续振荡吸附10min;
3)吸附完成后,将离心管置于磁力架上,静置5min,吸弃管中废液,保留磁珠;
4)向离心管中加入500μl漂洗液1,盖上离心管盖,涡旋振荡重悬磁珠后置于磁力架,吸弃液体保留磁珠;
5)向离心管中加入500μl漂洗液2,盖上离心管盖,涡旋振荡重悬磁珠后置于磁力架,吸弃液体保留磁珠;
6)将离心管置于室温干燥10min;
7)加入50μl洗脱液,涡旋振荡,使磁珠重悬至洗脱液中进行保存待用。
实施例2
为实现上述发明目的,本发明的一方面,提供了一种用于微量复杂性物证检材DNA提取纯化的试剂盒,包括:超强去杂质裂解液、超高促进DNA与磁珠的结合液、漂洗液1、漂洗液2、纳米磁珠悬浮液和洗脱液六部分组成,
其中,所述纳米磁珠为购买的商业化纳米磁珠(prenano-30-NA,金准智造生物科技(吉林)有限公司)50nm;
所述裂解液组成为盐酸胍1mM;十二烷基磺酸钠2mM;EDTA 10nM;蛋白酶K 30mg/ml;PVP 30mM;醋酸0.3M、醋酸钠0.3M缓冲液调节工作PH值为4.5;
所述结合液组成为异硫氰酸胍(4M),醋酸0.3M、醋酸钠0.3M,DMSO(80mM);
所述漂洗液1组成为盐酸胍(3M),无水乙醇55%(体积百分比),醋酸0.3M、醋酸钠0.3M;
所述漂洗液2组成为醋酸钠(2M),无水乙醇75%(体积百分比);
所述磁珠悬浮液中,纳米磁珠粒径为100nm,纳米磁珠质量百分比为20%,使用0.5xPBS作为缓冲液;
所述洗脱液组成为0.5XTE。
用于微量复杂性物证检材DNA提取纯化的试剂盒的提取方法,包括如下步骤:
1)取待提取物证陈旧衣物同时带有铁泥混合物合适大小(1cmx2cm)片段放入离心管中,向离心管中加入300μl裂解液,接着加入30mg/ml的蛋白酶K溶液15μL,涡旋混匀后,放入56℃恒温摇床温浴15min;
2)温浴后,离心10000rpm,1min;取出上清液于新的离心管中,向上清液中等体积加入结合液,再加入15μl纳米磁珠悬浮液,室温,放于振荡器中连续振荡吸附15min;
3)吸附完成后,将离心管置于磁力架上,静置8min,吸弃管中废液,保留磁珠;
4)向离心管中加入600μl漂洗液1,盖上离心管盖,涡旋振荡重悬磁珠后置于磁力架,吸弃液体保留磁珠;
5)向离心管中加入600μl漂洗液2,盖上离心管盖,涡旋振荡重悬磁珠后置于磁力架,吸弃液体保留磁珠;
6)将离心管置于室温干燥12min;
7)加入50μl洗脱液,涡旋振荡,使磁珠重悬至洗脱液中进行保存待用。
对比实验:为说明在复杂样本检材提取DNA的突出效果,本实验选择目前市面上使用的chelex-100作为对比方法,与本发明的试剂盒同时进行微量复杂样本检材DNA提取纯化实验。
chelex-100提取步骤
1)取与实施例1同样大小的多年陈旧布先放入去离子水中56℃孵育30min,样本释放到去离子水中去,吸出孵育液至新的2ml离心管中。
2)向含有样本的孵育液中加入等体积10%的chelex-100,放于90℃恒温振荡器100rpm1小时。
3)12000rpm离心5min后,取上清液用于PCR以及str扩增与电泳。
本发明实验中发明的试剂盒按照实施例1、2进行配置,样本与chelex-100所使用的样本相同,经过消化、裂解、吸附、漂洗和磁珠重悬的DNA。采用相同的荧光定量PCR与STR电泳;实验结果如图1、2、3、4和表1。图1为不同方法对微量复杂检材DNA提取的荧光定量效果对比;图2为实施例1STR图谱、图3为实施例2STR图谱、图4为chelex提取复杂检材DNA STR图谱。表1不同方法对微量复杂检材DNA提取的STR效果对比。由实验结果可以看出本发明的一种用于微量物证复杂性检材DNA提取纯化的试剂盒对于微量复杂检材DNA提取的优势突出。
表1不同方法对微量复杂检材DNA提取的STR效果对比
Chelex-100 | 实施例1 | 实施例2 | |
复杂物质检材 | 未检出 | STR位点齐全 | STR位点齐全 |
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述,优选实施例并没有详尽叙述所有的细节,也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种用于微量复杂性物证检材DNA提取纯化的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含:裂解液、结合液、漂洗液1、漂洗液2、纳米磁珠悬浮液和洗脱液;
其中,所述裂解液组成为:盐酸胍0.5-5mM、十二烷基磺酸钠1-5mM、EDTA5-50mM、蛋白酶K 20-100mg/ml、PVP 2-80mM;所述的裂解液在使用时,使用醋酸0.2-1M、醋酸钠0.2-1M缓冲液调节PH值范围为3.5-6;
所述结合液组成为:异硫氰酸胍2-6M、醋酸0.2-1M、醋酸钠0.2-1M、DMSO 1-100mM;
所述漂洗液1组成为:盐酸胍1-3M、无水乙醇体积百分比55%,醋酸0.2-1M、醋酸钠0.2-1M;
所述漂洗液2组成为:醋酸钠0.5-2M,无水乙醇体积百分比75%;
所述纳米磁珠悬浮液中,悬浮纳米磁珠尺寸为50-100nm,所述纳米磁珠质量百分比为10-30%,使用0.5-1x PBS作为缓冲液;磁珠材料包括铁化合物、钴化合物和镍化合物中的一种或多种;
所述洗脱液成份为0.1-0.5x TE。
2.制备如权利要求1所述的试剂盒的方法,其特征在于,包括如下步骤:
按照各组分含量分别配制裂解液、结合液、漂洗液1、漂洗液2、纳米磁珠悬浮液和洗脱液。
3.权利要求1所述的一种用于微量复杂性物证检材DNA提取纯化的试剂盒的提取方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)取待提取物证片段或擦拭的棉签放入离心管中,向离心管中加入裂解液,接着加入蛋白酶K溶液,涡旋混匀后,放入恒温摇床温浴;
2)温浴后,离心;取出上清液于新的离心管中,向上清液中等体积加入结合液,再加入纳米磁珠悬浮液,室温,放于振荡器中连续振荡吸附;
3)吸附完成后,将离心管置于磁力架上,静置,吸弃管中废液,保留磁珠;
4)向离心管中加入漂洗液1,盖上离心管盖,涡旋振荡重悬磁珠后置于磁力架,吸弃液体保留磁珠;
5)向离心管中加入漂洗液2,盖上离心管盖,涡旋振荡重悬磁珠后置于磁力架,吸弃液体保留磁珠;
6)将离心管置于室温干燥;
7)加入洗脱液,涡旋振荡,使磁珠重悬至洗脱液中进行保存待用。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤1)中,取待提取物证片段或擦拭的棉签放入离心管中,取150-600μl裂解液,按照裂解液总体积的5%~10%加入蛋白酶K溶液,涡旋混匀后,放入56~60℃恒温摇床温浴8-30min;步骤1)中,取待提取物证片段或擦拭的棉签放入离心管中,取150-600μl裂解液,按照裂解液总体积的5%加入蛋白酶K溶液,涡旋混匀后,放入56℃恒温摇床温浴8-30min。
5.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤2)中,温浴后,离心10000rpm,1min;取出上清液于新的离心管中,向上清液中等体积加入结合液,再加入10-20μl纳米磁珠悬浮液,室温,放于振荡器中连续振荡吸附10-20min。
6.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤3)中,吸附完成后,将离心管置于磁力架上,静置5-10min,吸弃管中废液,保留磁珠。
7.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤4)中,向离心管中加入500-1000μl漂洗液1,盖上离心管盖,涡旋振荡重悬磁珠后置于磁力架,吸弃液体保留磁珠。
8.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤5)中,向离心管中加入500-1000μl漂洗液2,盖上离心管盖,涡旋振荡重悬磁珠后置于磁力架,吸弃液体保留磁珠。
9.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤6)中,将离心管置于室温干燥5-20min。
10.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤7)中,加入30-70μl洗脱液,涡旋振荡,使磁珠重悬至洗脱液中进行保存待用。
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