CN111171108B

CN111171108B - 一种澳洲坚果叶片总蛋白质的高效提取方法

Info

Publication number: CN111171108B
Application number: CN201911378326.7A
Authority: CN
Inventors: 井敏敏; 陈倪; 刘恒; 曾辉
Original assignee: South Subtropical Crops Research Institute CATAS
Current assignee: South Subtropical Crops Research Institute CATAS
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2019-12-27
Publication date: 2021-12-10
Anticipated expiration: 2039-12-27
Also published as: CN111171108A

Abstract

本发明公开了一种澳洲坚果叶片总蛋白质的高效提取方法。包括以下步骤：将澳洲坚果新鲜叶片液氮研磨粉碎后，加入预冷裂解液PW1进行一次提取，经固液分离后得到第一沉淀，清洗并晾干第一沉淀；加入提取液PW2进行二次提取，经固液分离后得到第二上清液，加入预冷甲醇溶液，离心，获得第二沉淀，清洗并烘干第二沉淀；加入溶解液PW3进行三次提取，经固液分离后得到第三上清液，即得。本发明以新鲜澳洲坚果叶片为材料，向澳洲坚果叶片粉末加入本发明的3种提取液可有效避免原料氧化，避免蛋白质降解，总蛋白质得率高，所提取蛋白纯度高，SDS‑PAGE电泳条带整洁清晰，并适用于Western Blot分析。

Description

一种澳洲坚果叶片总蛋白质的高效提取方法

技术领域

本发明属于蛋白质提取技术领域。更具体地，涉及一种澳洲坚果叶片总蛋白质的高效提取方法。

背景技术

澳洲坚果(Macadamia ternifolia F.Muell.)，又称昆士兰栗、夏威夷果、澳洲胡桃，属山龙眼科澳洲坚果属，常绿乔木，原产于澳大利亚昆士兰州东南部和新南威尔州北部、南纬25°～31°的沿海亚热带雨林。澳洲坚果营养丰富，含油量为70％～79％，尤其富含不饱和脂肪酸，蛋白质丰富，还含有丰富的磷、钙、铁、维生素、氨基酸等，素有“干果皇后”、“世界坚果之王”的美称。目前，国内外对澳洲坚果的研究主要集中在栽培技术推广、种质鉴定、资源利用等方面，对于澳洲坚果的抗逆性以及代谢调控机理的研究较少。

利用蛋白质组学技术对蛋白质种类、丰度、修饰、蛋白质互作以及蛋白质复合体的研究成为热点，并为研究植物抗逆性以及代谢调控机理奠定基础。然而，澳洲坚果属于“顽拗植物”，其组织细胞内含有大量多糖、色素、多酚等次级代谢产物，利用传统TCA/丙酮提取液提取蛋白质过程中澳洲坚果叶片极易氧化褐变，造成蛋白质降解、提取率低甚至失败，少数所获得的蛋白质样品不易溶解、粘稠、纯度低，严重影响蛋白质组学分析。

专利文献CN 104336296 B、CN 109043117 A、CN 103719531 A和CN 103652313 A均涉及到了以脱油后的澳洲坚果油粕为原料提取、生产蛋白质的方法，但上述专利均是针对澳洲坚果果实中蛋白质的提取，很少有涉及到澳洲坚果叶片中蛋白质的提取纯化研究，果实与叶片的结构不同，蛋白质在果实与叶片中的分布不一样，从果实与叶片中提取蛋白质的目的也不相同。从澳洲坚果果实中提取的蛋白质一般用作食品营养补充剂或添加剂，而从叶片中提取蛋白质主要用作蛋白质组学分析，为研究澳洲坚果的抗逆性以及代谢调控机理奠定基础。因此，针对澳洲坚果富含色素、多糖、多酚等次级代谢产物的特性，开发一种高效的澳洲坚果叶片总蛋白质的提取方法意义重大。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种澳洲坚果叶片总蛋白质的高效提取方法，采用该方法所提取的澳洲坚果叶片总蛋白质纯度高，SDS-PAGE电泳条带整洁清晰，并适用于Western Blot分析，有效解决了澳洲坚果叶片总蛋白在传统提取过程中极易氧化褐变，所提取得到的蛋白质纯度不高的问题。

本发明通过以下技术方案实现：

一种澳洲坚果叶片总蛋白质的高效提取方法，包括以下步骤：

S1.将澳洲坚果新鲜叶片液氮研磨粉碎后，加入预冷裂解液PW1进行一次提取，经固液分离后得到第一沉淀，清洗并晾干第一沉淀；

S2.向第一沉淀中加入提取液PW2进行二次提取，经固液分离后得到第二上清液，加入预冷甲醇溶液，离心，获得第二沉淀，清洗并烘干第二沉淀；

S3.向第二沉淀中加入溶解液PW3进行三次提取，经固液分离后得到第三上清液，即得所述澳洲坚果叶片总蛋白质；

其中，所述裂解液PW1的配方为：10％～12％三氯醋酸、0.01％～0.05％聚乙烯吡咯烷酮、10～50mmol/L二硫苏糖醇，溶剂为丙酮；

所述提取液PW2的配方为：55％～70％Tris饱和酚溶液、10％～15％蔗糖、0.8％～1.5％十二烷基硫酸钠、0.03～0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液、20～50mmol/L二硫苏糖醇、0.5～1.5mmol/L苯甲基磺酰氟；

所述溶解液PW3的配方为：0.1％～0.3％十二烷基硫酸钠、6～8mol/L尿素、1～3mol/L硫脲、20～30mmol/L的Tris-HCl缓冲液、10～50mmol/L二硫苏糖醇。

本发明以新鲜澳洲坚果叶片为材料，依次采用三种经科学配比组成的提取液进行裂解、提取和溶解，以避免澳洲坚果叶片氧化，从而有效避免蛋白质降解，总蛋白质得率高，同时可有效降低澳洲坚果叶片内多糖、多酚、色素等物质对蛋白质的影响，所获得的蛋白质纯度高，品质好，可满足Western Blot等实验分析需求。

作为一种优选方案，所述提取液PW2中Tris-HCl缓冲液的pH值为7.8～8.2；所述溶解液PW3中Tris-HCl缓冲液的pH值为6.6～7.0。

作为一种优选方案，S1中所述裂解液PW1的添加量为：控制S1样品粉末与裂解液PW1的质量体积比为1～2g：3～6mL。

作为一种优选方案，S2中所述提取液PW2的添加量为：控制S1样品粉末与提取液PW2的质量体积比为1～2g：4～8mL。

作为一种优选方案，S3中所述溶解液PW3的添加量为：100～500μL。

作为一种优选方案，S1中所述清洗为：取5～10mL的甘油乙醇溶液混匀沉淀后，于4～6℃、3000～5000rpm条件下离心1～3min，吸除清洗液后，再采用同样方法用丙酮溶液清洗1～2次。

作为一种优选方案，所述甘油乙醇溶液以90％～95％乙醇配制，其浓度为2％～3％；所述丙酮溶液的浓度为78％～82％。

作为一种优选方案，S2中所述甲醇溶液含有0.05～0.15mol/L醋酸铵；所述甲醇溶液的添加量为第二上清液的5～6倍。

作为一种优选方案，S2中所述清洗为依次采用甲醇、78％～82％丙酮清洗2～3次；S2中所述烘干为于48～52℃温度下烘干。

作为一种优选方案，S1中提取条件为：加入3～5℃预冷裂解液PW1混匀后，冰上静置5～10min，期间旋涡混匀2～3次，再于3～5℃、3000～5000rpm条件下离心2～4min。

作为一种优选方案，S2中提取条件为：加入提取液PW2混匀后，冰上静置5～10min，再加入3～5℃预冷甲醇溶液混匀后，于-20～-10℃静置1～12h，再于3～5℃、12000～14000rpm离心8～12min。

作为一种优选方案，S3中提取条件为：加入溶解液PW3后，旋涡震荡20～30S，90～95℃水浴4～6min，再于3～5℃、12000～14000rpm离心8～12min。

作为一种优选方案，S1中所述晾干可采用室温风干或者于48～52℃烘干8～12min，以除去残余丙酮。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明以新鲜澳洲坚果叶片为材料，向澳洲坚果叶片粉末加入本发明的三种提取液可有效避免原料氧化，避免蛋白质降解，总蛋白质得率高。另外，与传统TCA/丙酮提取蛋白质方法相比，采用本方法可很好的避免提取蛋白质难以溶解的弊端，并且本发明可有效降低澳洲坚果叶片内多糖、多酚、色素等物质影响，获得的蛋白质纯度高，经SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色发现蛋白质条带清晰，无重影，背景干净，且蛋白大小分布广泛，可满足Western Blot等实验分析需求。

附图说明

图1是本发明实施例1、实施例2、实施例3所提澳洲坚果叶片蛋白质的SDS-PAGE电泳图谱。

图2是本发明实施例1、实施例2、实施例3所提澳洲坚果叶片蛋白质的WesternBlot图。

图3为本发明BSA标准蛋白定量标准曲线。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘述，但并不因此限制本发明，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，都应包含在本发明范围内。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

缩写：TCA为三氯醋酸；PVP为聚乙烯吡咯烷酮；DTT为二硫苏糖醇；SDS为十二烷基硫酸钠；PMSF为苯甲基磺酰氟。

实施例1

裂解液PW1：采用丙酮配置，其中TCA含量为10％，PVP为0.01％，DTT为20mM；

提取液PW2：用无菌蒸馏水配置，其中Tris饱和酚含量为55％，蔗糖为10％，SDS为1％，Tris-HCl为0.05mol/L pH 8.0，DTT为20mM，PMSF为1mM；

溶解液PW3：用无菌蒸馏水配置，其中SDS含量为0.2％，尿素为7mol/L，硫脲为2mol/L，Tris-HCl为25mmol/L pH 6.8，DTT为10mM。

1)取南亚1号澳洲坚果新鲜叶片1.0g，置于液氮预冷10mL打样杯中，加入钢珠，采用组织研磨器于50Hz条件下研磨1min，然后取出打样杯液氮再次冷冻，重复研磨两次，将样品研磨成粉末；取粉末至离心管内，加入6mL 4℃预冷裂解液PW1，迅速旋涡混匀，冰上静置5min，期间旋涡混匀2次；

2)样品混合液于4℃、3000rpm条件下离心2min，吸除上清，加入5mL 2.5％甘油乙醇溶液，用移液器轻轻吸打混匀沉淀，于4℃、3000rpm条件下离心1min，吸净上清；然后采用同样的方法用80％丙酮再清洗1遍，室温晾干沉淀；

3)取步骤2)中所述晾干沉淀，加入8mL提取液PW2充分混匀，于冰上静置10min，4℃、12000rpm离心10min；取上层有机相，加入5倍体积的4℃预冷甲醇溶液，充分混匀，置于-20℃条件下静置2h后，4℃、12000rpm离心10min，获得蛋白质白色沉淀；向所述蛋白沉淀加入5mL甲醇，充分混匀沉淀，4℃、12000rpm离心1min，吸除上清液，再采用同样的方法用80％丙酮清洗2次，50℃烘干沉淀；

4)取步骤3)中烘干后的沉淀，加入300μL溶解液PW3，旋涡震荡20s，95℃水浴5min，4℃、12000rpm离心5min，得到上清液，即为所述澳洲坚果叶片总蛋白质。

实施例2

裂解液PW1：采用丙酮配置，其中TCA含量为11％，PVP为0.05％，DTT为50mM；

提取液PW2：用无菌蒸馏水配置，其中Tris饱和酚含量为60％，蔗糖为11％，SDS为0.8％，Tris-HCl为0.03mol/L pH 7.8，DTT为30mM，PMSF为0.5mM；

溶解液PW3：用无菌蒸馏水配置，其中SDS含量为0.1％，尿素为7mol/L，硫脲为1mol/L，Tris-HCl为20mmol/L pH 6.6，DTT为10mM。

1)取南亚1号澳洲坚果新鲜叶片1.5g，置于液氮预冷10mL打样杯中，加入钢珠，采用组织研磨器于55Hz条件下研磨1min，然后取出打样杯液氮再次冷冻，重复研磨两次，将样品研磨成粉末；取粉末至离心管内，加入7mL 4℃预冷裂解液PW1，迅速旋涡混匀，冰上静置10min，期间旋涡混匀2次；

2)样品混合液于4℃、4000rpm条件下离心2min，吸除上清，加入8mL 2％甘油乙醇溶液，用移液器轻轻吸打混匀沉淀，于4℃、4000rpm条件下离心1min，吸净上清；然后采用同样的方法用78％丙酮再清洗1遍，室温晾干沉淀；

3)取步骤2)中所述晾干沉淀，加入10mL提取液PW2充分混匀，于冰上静置10min，4℃、12000rpm离心10min；取上层有机相，加入6倍体积的4℃预冷甲醇溶液，充分混匀，置于-20℃条件下静置4h后，4℃、12000rpm离心10min，获得蛋白质白色沉淀；向所述蛋白沉淀加入5mL甲醇，充分混匀沉淀，4℃、12000rpm离心1min，吸除上清液，再采用同样的方法用78％丙酮清洗2次，48℃烘干沉淀；

4)取步骤3)中烘干后的沉淀，加入350μL溶解液PW3，旋涡震荡30s，90℃水浴4min，4℃、12000rpm离心5min，得到上清液，即为所述澳洲坚果叶片总蛋白质。

实施例3

裂解液PW1：采用丙酮配置，其中TCA含量为12％，PVP为0.03％，DTT为35mM；

提取液PW2：用无菌蒸馏水配置，其中Tris饱和酚含量为65％，蔗糖为15％，SDS为1.2％，Tris-HCl为0.06mol/L pH 8.2，DTT为50mM，PMSF为1.5mM；

溶解液PW3：用无菌蒸馏水配置，其中SDS含量为0.3％，尿素为8mol/L，硫脲为3mol/L，Tris-HCl为30mmol/L pH 7.0，DTT为50mM。

1)取南亚1号澳洲坚果新鲜叶片2.0g，置于液氮预冷10mL打样杯中，加入钢珠，采用组织研磨器于60Hz条件下研磨1min，然后取出打样杯液氮再次冷冻，重复研磨两次，将样品研磨成粉末；取粉末至离心管内，加入12mL 4℃预冷裂解液PW1，迅速旋涡混匀，冰上静置10min，期间旋涡混匀3次；

2)样品混合液于4℃、5000rpm条件下离心2min，吸除上清，加入10mL3.5％甘油乙醇溶液，用移液器轻轻吸打混匀沉淀，于4℃、5000rpm条件下离心1min，吸净上清；然后采用同样的方法用82％丙酮再清洗1遍，50℃温度条件下烘干沉淀10min；

3)取步骤2)中所述晾干沉淀，加入12mL提取液PW2充分混匀，于冰上静置10min，4℃、12000rpm离心10min；取上层有机相，加入5倍体积的4℃预冷甲醇溶液，充分混匀，置于-20℃条件下静置过夜，4℃、12000rpm离心10min，获得蛋白质白色沉淀；向所述蛋白沉淀加入5mL甲醇，充分混匀沉淀，4℃、12000rpm离心1min，吸除上清液，再采用同样的方法用82％丙酮清洗2次，52℃烘干沉淀；

4)取步骤3)中烘干后的沉淀，加入400μL溶解液PW3，旋涡震荡30s，95℃水浴5min，4℃、12000rpm离心5min，得到上清液，即为所述澳洲坚果叶片总蛋白质。

试验例

采用赛默飞公司Pierce BCA Protein Assay Kit测定实施例1、实施例2、实施例3所提的澳洲坚果叶片蛋白质的浓度，并进行SDS-PAGE电泳(分两块胶同时进行)和WesternBlot实验。

步骤如下：

(1)上样量为5μL，分离胶浓度为12％，恒压80V电泳30min，将样品在浓缩胶层浓缩成一条直线，后恒压150V电泳至蛋白Marker条带分散开停止电泳；

(2)取电泳后的一块胶加入100mL考马斯亮蓝染液R250，于摇床上轻摇染色过夜，倒去染色液，加入100mL脱色液，于摇床上脱色，直至蛋白条带清晰可见，即可拍照观察结果，其结果见图1；

(3)取另一块胶采用叶绿体蛋白抗体anti-FBPase antibody(蛋白大小在43kD左右)进行检测所提蛋白质是否适用于Western Blot实验；将裁切过的SDS-PAGE胶，采用bio-rad公司半干转法转膜仪，于恒压20V转膜30min，将转膜完成的PVDF膜，经5％脱脂牛奶封闭1h，然后孵育一抗anti-FBPase antibody(浓度1:1000)1h，清洗过后加入二抗anti-RabbitlgG antibody(浓度1:5000)孵育50min，清洗过后，加入化学发光液(赛默飞公司)于化学发光仪内显影拍照，其结果见图2。

表1绘制标准曲线所测标准品BSA吸光值

以BSA含量及A₅₆₂吸光值建立蛋白质标准曲线，如图3所示。根据图3可得蛋白质标准曲线回归方程为：y＝0.0014x+0.0075，R²＝0.9985。

根据测得实施例1、实施例2、实施例3所提澳洲坚果叶片蛋白质10倍稀释液A₅₆₂吸光值，代入蛋白质标准曲线方程计算每个样品蛋白质浓度，结果见表2。

表2澳洲坚果叶片蛋白质浓度

根据表2可以得出，实施例1获得澳洲坚果叶片蛋白质总量为1.118mg，实施例2获得蛋白质总量为1.727mg，实施例3获得蛋白质总量为1.968mg。由此可见，采取本发明提取的澳洲坚果叶片总蛋白质含量可以满足蛋白质组学相关实验分析。

经SDS-PAGE电泳分离，考马斯亮蓝染色发现：本发明提取的蛋白质大小分布于10～180kD之间，分布广，条带整洁清晰，背景干净，无拖尾，无重影，说明蛋白质质量佳。由Western Blot实验结果可见，所得蛋白质条带清楚，明亮。说明本发明向澳洲坚果叶片粉末加入本发明的3种提取液可有效避免原料氧化，避免蛋白质降解，提高总蛋白质得率，与传统TCA/丙酮提取蛋白质方法相比，采用本方法可很好的避免提取蛋白质难以溶解的弊端，并且本发明可有效降低澳洲坚果叶片内多糖、多酚、色素等物质影响，获得的蛋白质纯度高；所提取的蛋白质可较好的满足蛋白质免疫印记实验的要求，并有利于后期对澳洲坚果蛋白质组学分析。

申请人声明，以上具体实施方式为便于理解本发明而说明的较佳实施例，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种澳洲坚果叶片总蛋白质的高效提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的高效提取方法，其特征在于，所述提取液PW2中Tris-HCl缓冲液的pH值为7.8～8.2；所述溶解液PW3中Tris-HCl缓冲液的pH值为6.6～7.0。

3.根据权利要求1所述的高效提取方法，其特征在于，S1中所述裂解液PW1的添加量为：控制S1样品粉末与裂解液PW1的质量体积比为1～2g：3～6mL。

4.根据权利要求1所述的高效提取方法，其特征在于，S2中所述提取液PW2的添加量为：控制S1样品粉末与提取液PW2的质量体积比为1～2g：4～8mL。

5.根据权利要求1所述的高效提取方法，其特征在于，S3中所述溶解液PW3的添加量为：100～500μL。

6.根据权利要求1所述的高效提取方法，其特征在于，S1中所述清洗为：取5～10mL的甘油乙醇溶液混匀沉淀后，于4～6℃、3000～5000rpm条件下离心1～3min，吸除清洗液后，再采用同样方法用丙酮溶液清洗1～2次。

7.根据权利要求6所述的高效提取方法，其特征在于，所述甘油乙醇溶液以90％～95％乙醇配制，其浓度为2％～3％；所述丙酮溶液的浓度为78％～82％。

8.根据权利要求1所述的高效提取方法，其特征在于，S2中所述甲醇溶液含有0.05～0.15mol/L醋酸铵；所述甲醇溶液的添加量为第二上清液的5～6倍。

9.根据权利要求1所述的高效提取方法，其特征在于，S2中所述清洗为依次采用甲醇、78％～82％丙酮清洗2～3次；S2中所述烘干为于48～52℃温度下烘干。

10.根据权利要求1所述的高效提取方法，其特征在于，S1中提取条件为：加入3～5℃预冷裂解液PW1混匀后，冰上静置5～10min，期间旋涡混匀2～3次，再于3～5℃、3000～5000rpm条件下离心2～4min；

S2中提取条件为：加入提取液PW2混匀后，冰上静置5～10min，再加入3～5℃预冷甲醇溶液混匀后，于-20～-10℃静置1～12h，再于3～5℃、12000～14000rpm离心8～12min；

S3中提取条件为：加入溶解液PW3后，旋涡震荡20～30S，90～95℃水浴4～6min，再于3～5℃、12000～14000rpm离心8～12min。