CN107098948B - 一种快速提取果梅花芽中蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速提取果梅花芽中蛋白质的方法，以25‑30mg果梅花芽为原料，液氮研磨至粉末；加入100‑150μL SDS缓冲液研磨至匀浆，4‑10℃、8000‑12000g短暂离心30‑60秒，煮沸5‑8min，4‑10℃、8000‑12000g离心10‑15分钟，上清即梅组织中的蛋白质。本发明方法提取得到的蛋白质用于Western‑blot、ChIP试验的应用。相较于这些传统方法，本发明方法只需要25‑30mg的果梅花芽材料，整个提取过程只需要30分钟，大大减少了样品的使用量及提取时间。

Description

一种快速提取果梅花芽中蛋白质的方法
技术领域
本发明涉及一种快速提取果梅花芽中蛋白质的方法，专用于Western-blot、ChIP等蛋白试验。
背景技术
果树分子生物学领域的研究越来越深入，然而长期以来，由于果树木本植物的特性，其蛋白质的提取过程十分复杂耗时，因此进一步进行Western-blot、ChIP等试验显得尤为困难。Western-blot(Western印迹技术)，也称Western杂交技术，是一种常见的半定量分析生物组织蛋白质表达的方法，是蛋白质分析的常用分子生物学技术之一。
果梅(Prunus mume Sieb et Zucc)属蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus L.)，原产中国，是我国的特色树种，亦是我国重要的创汇果树。花是果树重要的生殖器官，在梅产量形成中具有重要意义。研究花芽发育过程的蛋白质组学，是进一步揭示梅花器官的形成和发育以及休眠机制的有效手段。目前，鲜有关于梅Western-blot研究的报道，从梅组织中提取高质量的总蛋白，是开展梅Western-blot技术研究的前提。关于梅组织总蛋白质的提取已有文献报道[1]，一般传统方法如TCA/丙酮沉淀法、酚抽法及Tris-HCl法，梅组织用量较多，实验操作较繁杂、耗时长、成本高，提取得到的蛋白质也仅用于梅双向电泳分析，蛋白质双向电泳图谱结果背景较高、非特异性条带较多。
[1]庄维兵,高志红,章镇,侍婷,邵静.果梅花芽蛋白质双向电泳优化体系的建立.南京农业大学学报.2011,34(6):47-52.
发明内容
技术问题
本发明的目的在于解决现有果树中通用的蛋白质提取方法十分繁琐耗时，无法为果树蛋白质组学进一步研究提供技术支持，针对深入研究果梅蛋白质组学的需求，本发明从蛋白提取所需样品量、提取液配方、提取的时间等方面进行了优化改良，建立了一套快速、特异、灵敏地提取梅组织蛋白质的方法，为梅组织中蛋白质的Western-blot、ChIP等试验奠定了基础。
技术方案
一种快速提取果梅花芽中蛋白质的方法，包括以下步骤：
(1)、以25-30mg果梅花芽为原料，液氮研磨至粉末；
(2)、加入100-150μL SDS缓冲液研磨至匀浆，4-10℃、8000-12000g短暂离心30-60秒，煮沸5-8min，4-10℃、8000-12000g离心10-15分钟，上清即梅组织中的蛋白质。
步骤(2)中，所述的SDS缓冲液为：pH 6.8的1.0mol/L Tris-HCl 1.0mL，10％(w/v)SDS溶液4.0mL，1％(w/v)溴酚蓝0.05mL，甘油2.0mL，50μLβ-巯基乙醇，双蒸水定容至20mL。SDS缓冲液包括了提取液(pH 6.8的1.0mol/L Tris-HCl 1.0mL)、裂解液(10％SDS溶液4.0mL)以及上样指示液(1％溴酚蓝0.05mL)，因此，在完成蛋白质快速提取后，直接上样跑胶，没有干燥纯化等待的时间，一步到位。
优选的，步骤(2)中，加入100-150μL SDS缓冲液研磨至匀浆，4℃、8 000g短暂离心30秒，煮沸5min，4℃、12 000g离心15min，上清即梅组织中的蛋白质。
本发明所述的方法快速便利地提取果梅花芽中的蛋白质，并为后续Western-blot、ChIP等试验提供了高纯度的蛋白质样品，因此，本发明的另一个目的是提供所述的方法提取得到的蛋白质用于Western-blot、ChIP试验的应用。
本发明的有益效果：
相较于这些传统方法，本发明大大减少了样品的使用量及提取时间。具体表现为：本发明方法原料量较少，只需要25-30mg的果梅花芽材料，而传统蛋白质提取方法通常需要约100mg，大大节省植物样品量；提取液配制简单易行；本发明可以快速、高效提取出梅组织中的蛋白质，相比传统蛋白质提取所需要的3个小时，本发明方法整个提取过程只需要30分钟，大大节省了操作者的时间。
Figure BDA0001286857550000021
附图说明
图1为不同提取方法的蛋白质Western blot分析。
图中，1、2：传统Tris-HCl法；3、4：SDS缓冲液直接提取法。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
SDS缓冲液直接提取法：准备25mg果梅花芽，加入2mL离心管中，液氮研磨至粉末。加入100μL SDS缓冲液(pH6.8的1.0mol/L Tris-HCl 1.0mL，10％SDS 4.0mL，1％溴酚蓝0.05mL，甘油2.0mL，50μLβ-巯基乙醇，双蒸水定容至20mL)研磨至匀浆，短暂离心(8 000g，4℃)使其混匀，煮沸5min使蛋白质灭活，离心(12 000g，15min，4℃)，取上清液，即梅组织中的蛋白质。
对比例1
Tris-HCl法：取0.1g花芽，液氮研磨后置于2mL离心管中，加入0.1g PVPP和0.9mL蛋白质提取缓冲液(pH 6.8的62.5mmol/L Tris-HCl，0.5％SDS和5％β-巯基乙醇)，涡旋后4℃放置1h，12000g离心20min。取上清液0.3mL转移至2mL离心管中，加入0.9mL预冷丙酮，混匀后-20℃放置1h以沉降蛋白质，5000g离心10min，弃上清液，待丙酮完全挥发后加入200μL上样缓冲液(pH 6.8的62.5mmol/L Tris-HCl，0.5％SDS，20％甘油，10％β-巯基乙醇和溴酚蓝)溶解蛋白质，混匀。煮沸5min，离心(12000g，15min，4℃)，取上清液，即梅组织中的蛋白质，备用。
用梅CCoAOMT蛋白抗体检测普通Tis-HCl法和本发明方法提取梅花芽蛋白的效果(见图1)。结果表明，均能检测到目标蛋白CCoAOMT的条带，且2种方法条带亮而清楚，并无明显差异。因此，从提取效率和Western-blot效果来看，本方法获得的花芽蛋白质适宜梅Western-blot分析，且提取过程优于传统的Tris-HCl法。同时，按照本发明的技术方案，调整果梅花芽和SDS缓冲液的用量，也能够实现同样的提取效率和效果。

Claims (2)

1.一种快速提取果梅花芽中蛋白质的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）、以25-30 mg果梅花芽为原料，液氮研磨至粉末；
（2）、加入100-150 µL SDS缓冲液研磨至匀浆，4-10 ℃、8000-12000 g短暂离心30-60秒，煮沸5-8 min，4-10 ℃、8000-12000 g离心10-15 分钟，上清即梅组织中的蛋白质；其中，所述的SDS缓冲液为：pH 6.8的1.0 mol/L Tris-HCl 1.0 mL，10% (w/v)SDS溶液 4.0mL，1% (w/v)溴酚蓝0.05 mL，甘油2.0 mL，50 µL β-巯基乙醇，双蒸水定容至20 mL。
2.根据权利要求1所述的快速提取果梅花芽中蛋白质的方法，其特征在于步骤（2）中，加入100-150 µL SDS缓冲液研磨至匀浆，4 ℃、8000 g短暂离心30秒，煮沸5 min，4 ℃、12000 g离心15 min，上清即梅组织中的蛋白质。
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SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（1×）;zljiruykx;《https：//wenku.baidu.com/view/b1715e2d0029bd64793e2c37.html》;20150802;产品简介、使用说明 *
果梅CCoAOMT蛋白Western-blot体系建立与优化;张勇等;《南京农业大学学报》;20171231;第40卷(第6期);第977-982页 *
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适合双向电泳的植物全蛋白提取方法比较;陈晶瑜等;《中国农学通报》;20101231;第26卷(第23期);第99页4 Tris-HCl法 *

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