CN103665121A - 一种棉花叶片蛋白质提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种棉花叶片蛋白质提取方法，包括以下步骤：1）取棉花叶片，研磨；2）经研磨的叶片粉末转入离心管中，并加入三氯乙酸提取液，混合均匀，放在－20℃冰箱中两小时以上；3）离心管离心，弃上清，留沉淀，向沉淀中加入-20℃预冷丙酮溶液，混合均匀，于-20℃静置2～4h；4）离心管离心，弃上清，留沉淀，洗涤沉淀，并保留沉淀；5）沉淀抽真空，挥发丙酮，得到蛋白质干粉；6）取干燥的蛋白粉末，加入蛋白裂解液，35℃的水浴中裂解1h，离心，取上清，所述上清为棉花叶片蛋白溶解液。本发明所述棉花叶片蛋白质提取方法提取的蛋白质稳定,重复性好，且蛋白质纯度较高,电泳图谱显示几乎没有横条纹和拖尾等纹理现象。

Description

一种棉花叶片蛋白质提取方法

技术领域

本发明涉及生物化学领域，尤其涉及一种棉花叶片蛋白质提取方法。

背景技术

棉花是世界上最重要的天然纤维作物,也是重要的油料作物；同时棉花也是世界性的重要的经济作物，在国民经济中占有重要的地位。棉花能制成各种规格的纺织物，这些纺织物具有穿着舒适，坚牢耐磨，能洗涤并在高温下熨烫等特点。因此，棉花具有巨大的应用价值和开发潜力。

棉花作为一种重要的经济和油料作物，在其进行大量的分子标记和QTL等研究后，对它开展蛋白质组研究就显得十分迫切，也更为可行。但棉花中含有大量的色素、酚、醌等一些次生代谢产物，严重影响所提蛋白的纯度，从而影响棉花蛋白质领域的研究，以及影响棉花产业的发展。因此，在提取蛋白质时应尽可能的除去这些物质的干扰，对解决棉花产业发展中遇到的技术问题具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种棉花叶片蛋白质提取方法，该方法提取的棉花叶片蛋白纯度高，适合后续研究工作的开展，利于促进棉花产业发展。

一种棉花叶片蛋白质提取方法，包括以下步骤：

1）取棉花叶片，用液氮研磨；

2）经液氮研磨的叶片粉末转入离心管中，并加入预冷的三氯乙酸提取液，混合均匀，放在－20℃冰箱中两小时以上，每半小时震荡一次；

3）离心管离心，弃上清，留沉淀，向沉淀中加入-20℃预冷丙酮溶液，混合均匀，于-20℃静置2～4h；

4）离心管离心，弃上清，留沉淀，洗涤沉淀，并保留沉淀；

5）沉淀抽真空，挥发丙酮，得到蛋白质干粉；

6）取干燥的蛋白粉末，加入蛋白裂解液，35℃的水浴中裂解1h，离心，取上清，所述上清为棉花叶片蛋白溶解液。

所述三氯乙酸提取液的配方为：10%TCA，0.07%-0.1%DTT，0.5％β-巯基乙醇，1mmol/L PMSF，溶剂为丙酮。

所述丙酮溶液含有0.07%-0.1%DTT和1mmol/L PMSF。

所述蛋白裂解液的配方为：7mol/L尿素,2mol/L硫脲,4%CHAPS,80mmol/L DTT,1mmol/L PMSF，0.3%载体两性电解质。

用液氮研磨叶片时加入PVPP和石英砂。

所述三氯乙酸提取液的用量是每0.4克叶片加入1.8mL预冷三氯乙酸提取液。

步骤4）所述沉淀重复洗涤3次或3次以上，或过夜洗涤，至接近白色。

所述蛋白裂解液的用量是每毫克干燥蛋白干粉加入蛋白裂解液20μl。

本发明所述棉花叶片蛋白质提取方法提取的蛋白质稳定,重复性好，且蛋白质纯度较高,电泳图谱显示几乎没有横条纹和拖尾等纹理现象,清晰，圆润。

附图说明

图1不同提取方法对棉花叶片蛋白质2-DE图谱的影响，A：酚法，B：TCA/丙酮法，C：改良的TCA/丙酮法；

图2不同上样量对棉花叶片蛋白质2-DE图谱的影响(IPGpH4-7，18cm）；

图3不同上样量对棉花叶片蛋白质2-DE图谱的影响(IPGpH4-7，24cm）。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。

本发明用到的材料：

植物材料：棉花品种“KK1543”，由新疆农业大学农学院作物遗传实验室提供。

实施例1棉花叶片获取

选取籽粒饱满且脱绒干净的棉花种子处理后放入三角瓶里，浸种24小时，待种子露白后转入放有两层滤纸的发芽盒中，并保持发芽盒湿润，待长出两片子叶后，选取长势健壮，均一的棉苗转入1/2Hoagland培养液中，人工气候室水培。培养条件为温度为28/25C(白天/晚上)，光强为12000lx以上光照350～400，每天光照10小时，相对湿度为60～80%。每隔4d换一次培养液,并注意清洗根部和盆子等处的青苔，培养半个月后取其叶片，用纯水，去离子水依次清洗干净，用滤纸吸干水后，于液氮中速冻后置于-80℃超低温冰箱保存，待用。

本实施例所用棉花为KK1543。

实施例2棉花叶片蛋白提取

将洗净的研钵用酒精灯烧三分钟放于-20℃冰箱中预冷后，加入1～2g材料，适量的PVPP和少许石英砂，用液氮研磨充分，直至粉末泛白即可。转入几个2mL离心管中（每管约0.4g），每管中加入1.8mL预冷的三氯乙酸提取液中充分混合后，放在－20℃冰箱中两小时以上，并约半小时震荡一次。4℃，13000r/min离心15min，弃上清，取沉淀。将沉淀用枪头捣碎后加入1.8mL的-20℃预冷丙酮(含0.07%-0.1%DTT，1mmol/LPMSF)，混匀后于-20℃静置2～4h.，同上离心，弃上清，取沉淀,重复洗涤3次。最后取沉淀，如果发现有仍有粉色则可再过夜，直到沉淀颜色接近白色为止。得到沉淀后均用parafilm封口，用针在膜上扎几个小洞，真空机中抽真空，挥发丙酮之后成为蛋白质干粉。

取适量干燥后的样品粉末，按20μl/mg的比例加入蛋白裂解液后，涡旋器上震荡成粘稠状，然后放在35℃（不能高于36℃）的水浴中裂解1h，不时振荡。试管拿出后，室温下13000r/min离心15min，取上清（重复一次），得到棉花叶片蛋白溶解液，放于－80℃保存。

三氯乙酸提取液配方如下：10%TCA，0.07%-0.1%DTT，0.5％β-巯基乙醇，1mmol/LPMSF，溶剂为丙酮

蛋白裂解裂解液配方如下：7mol/L尿素,2mol/L硫脲,4%CHAPS,80mmol/LDTT,1mmol/LPMSF，0.3%载体两性电解质。

本实施例所述棉花叶片蛋白提取方法命名为改良的TCA/丙酮沉淀法。

对照例1酚抽提法提取棉花叶片蛋白质

取用蒸馏水冲洗干净的棉花叶片约3g，加入0.2g聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpoly pyrrolidone,PVPP)后，在研钵中加入液氮冷冻研磨成粉后取1g粉末加入到无菌的10mL大离心管中，加入4～5倍体积的蛋白质提取缓冲液（50mmol/LTris，50mmol/LEDTA，100mmol/LKCl，1mmol/LPMSF，体积分数2%β-巯基乙醇）混匀，加入等体积pH8.0 Tris-饱和酚，充分涡旋后，离心（4℃，,12000r/min）离心20min；回收酚相转至一新的离心管，各加入50mL乙酸铵甲醇溶液（0.1mol/L），-20℃沉淀2h以上或过夜。4℃，15000r/min离心20min，弃上清液,沉淀用丙酮(含体积分数2%β-巯基乙醇，-20℃)洗涤1次，-20℃放置至少1h后，重复以上步骤一次，弃上清，留蛋白沉淀。

对照例2  TCA/丙酮法提取棉花叶片蛋白质

取用蒸馏水冲洗干净的棉花叶片约2.5g，迅速在液氮中研磨后加入3倍体积-20℃预冷的含50％（w/v）TCA（三氯乙酸）的水溶液，上下剧烈颠倒，于4℃静置2h以上，离心（4℃，12000r/min）20min，弃上清；将沉淀悬浮于-20℃预冷的含0.1％DTT（二硫苏糖醇）的丙酮溶液中，蜗旋并在-20℃沉淀2h，离心（4℃，12000r/min）20min，弃上清。重复3次，最后弃上清，留蛋白沉淀。

实施例3所提取蛋白叶片蛋白纯度检测

检测方法：

1.蛋白质定量

用1%BAS(牛血清蛋白)做标准蛋白，0.01%考马斯亮蓝G250，含5%乙醇（浓度为95%）,10%磷酸染色，在紫外分光光度计上以595nm波长下测定OD值绘制标准曲线。依据标准曲线计算样品蛋白质浓度。

2.水化

将置于超低温冰箱下的蛋白样品室温下解冻后,向离心管中加入水化缓冲液(7mol/L尿素,2mol/L硫脲,4%CHAPS,80mmol/LDTT,1mmol/LPMSF，0.3%载体两性电解质（PH4-7）,质量分数0.002%溴酚蓝）。本实验,先用pH3-10的IPG胶条分离棉花叶片的总蛋白，发现蛋白点主要集中在pH5-8之间（结果未显示）。为了使大部分蛋白得到更好地分离，得到较为理想的电泳图谱，改用了pH4-7的IPG胶条。实验中使用pH4～7,长度分别为24cm和18cm长的IPG线性胶条,这样有助于掌握棉花叶片总蛋白在2-DE图像上整体的分布情况。在保证其他实验条件一致的情况下，上样量为采用：18cm，pH4～7的线性IPG胶条：设计每根胶条上样量分别为300μg，400μg，500μg，600μg上样总体积为350μL，以确定最佳上样量。24cm，pH4～7的线性IPG胶条：设计每根胶条上样量分别为400μg，500μg，600μg，700μg。上样总体积为450μL，以确定最佳上样量。

选择两种不同的IPG胶条和八个不同的上样量进行双向电泳，比较实验结果，以期找到最适合的上样量和最优的IPG胶条种类。将蛋白水化液，沿着水化盘的边缘从左至右线性加入到水化盘中.将已室温解冻十分钟的IPG胶条去除预制IPG胶条上的保护层，胶面朝下轻轻地放入水化槽内,除去胶面与泡胀液间的气泡,盖上胶条槽的盖子，1h后滴加2～3mL矿物油,20℃水化13-15个小时后。

3.等电聚焦电泳(IEF)

将水化完成后的IPG胶条转移至聚焦盘上，用去离子水将预制好的电极滤纸片湿润，置于IPG胶条的末端，安装电极，设定程序参数并开始运行。采用的聚焦程序为：

24cm IPG胶条：100V（1h）→200V（1h）→500V（1h）→1000V（1h）→8000V（2h）→8000~12000V（2h）→维持电压500V。

18cm IPG胶条：250V（1h）→500V（1h）→2000V（1h）→8000V（2h）→8000→65000V（2h）→维持电压500V。

4.胶条平衡

等电聚焦完成后,将水化盘中多余的矿物油倒掉，然后胶面向上转移到一张干燥的滤纸上，用湿润的滤纸吸去IPG胶条上的矿物油,然后在平衡液A中平衡15min,再在平衡液B中平衡15min,再在干净的滤纸上点两下,以吸去胶条上多余的平衡液。胶条也可于–70℃下保存。平衡液A、B配制:

平衡液A:含36%尿素，2%SDS，25%Tris-HCl(pH8.8)，20%甘油和2%DTT（现用现加）。

平衡液B:含36%尿素，2%SDS，25%Tris-HCl(pH8.8)，20%甘油和2.5%-3%碘乙酰胺（现用现加）。

5.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

平衡后的胶条置于分离效果较好的12%聚丙烯酰胺凝胶上,用0.5%的低熔点琼脂糖(含有痕量溴酚蓝)作为封胶液压顶，从而使使胶不至于飘动。(注意胶条与凝胶间不能有气泡)。按如下参数进行电泳:16℃恒温下,1W/条,1.5h;10W/条,4h～6h。电泳至溴酚蓝前沿达到胶的底部1-2cm时停止电泳。

6.剥胶与染色

将玻璃板从电泳槽上卸下后依次用自来水和去离子水冲洗，然后将胶剥下放在洗净的染色盘里，用去离子水洗三次，每次五分钟。然后进行染色。

固定:50mL冰乙酸,200mL无水乙醇,加水至500mL,摇床上轻摇1h。

敏化:称取1g硫代硫酸钠,17g无水乙酸钠,150mL无水乙醇,加水至500mL,摇床上轻摇30min。

漂洗:每次取500mL去离子水，水洗3次,每次在摇床上轻摇5min。

银染:称取1g硝酸银溶于500mL水,避光、摇床上轻摇30min。

漂洗:500mL去离子水水洗3次,每次摇床上轻摇10s。

显色:称取25g碳酸钠,0.1mL甲醛,加水至1L,摇床上快速摇,显色2次,两次共约3～4min。

终止:称取7.3gEDTA溶于500mL水,摇床上轻摇15min。

漂洗:500mL水洗3次,摇床轻摇5min/次。

7.图象的扫描和分析

染色后的胶用Umax(PowerLook 2100XL)扫描仪扫描，采用透射模式，分辨率为600dpi。图象用PDQuest软件动检测蛋白点，人工去除了错误检测的蛋白点，加入未被检测的蛋白点。

检测结果：

1.蛋白稳定性及纯度

对比三张图谱结果可知：采用酚抽提法(图1-A)，2-DE图谱中蛋白点最少.尤其是碱性端蛋白质也很模糊，而且有横向的拖尾，分辨率很低。采用TCA/丙酮法(图1-B)，蛋白点虽有一定程度的增加但有有较多的纵向和横向拖尾,表明采用此方法沉淀蛋白时,提取物中仍含有较多的杂质直接影响蛋白质的等电聚焦和电泳电泳。而且用此方法获得的蛋白质干粉较少，蛋白干粉得率很低。采用本申请改良的TCA/丙酮沉淀法(图1-C)中蛋白点较多,尤其在酸性蛋白区域,用此方案提取蛋白质稳定,重复性好，且蛋白质纯度较高,几乎没有横条纹和拖尾等纹理现象,电泳图谱清晰，圆润,说明用此改良的方案适用于棉花的蛋白质组研究。

2.蛋白上样量的确定及IPG胶条长度的选择

上样量的确定,不仅与IPG胶条的长度及pH值范围有关,也与凝胶的种类及染色方法有关[。要想获得更多的蛋白点,就要保证足够的上样量,但是随着上样量的加大又会使样品中的盐离子及其它杂质含量提高，这就将直接影响等电聚焦时电压的上升，会造成蛋白质的沉淀或图谱横纵向拖尾；而且会掩盖有相似等电点/分子量的低丰度蛋白；较小的上样量虽会提高蛋白质的分离效果,但过少的上样量使低丰度蛋白无法显示。为探索棉花叶片蛋白质双向电泳的最佳上样量，本实验从SDS-PAGE凝胶的分辨率、染色方法及IPG胶条的PH梯度和长度范围等条件综合考虑，利用改良的三氯乙酸/丙酮法提取的蛋白样品摸索优化体系。经软件分析比较,上样量为（18cm：300μg图2-A，400μg图2-B；24cm：400μg图3-A，500μg图3-B）时,蛋白点数明显较少,主要为酸性端蛋白,碱性端蛋白点较少，检测范围受到限制，影响实验的准确性。但由图可观察到两种胶条随着上样量的加大，并没有呈现背景很重的现象，而且蛋白点都在增加；上样量达到（18cm：500μg图2-C；24cm：600μg图3-C）时,蛋白点数量增幅很大,经软件分析有大约(18cm：900,24cm：970)个点,碱性端蛋白和低丰度蛋白数量明显增加,整个凝胶图上背景色很浅,蛋白点边界清晰，分离均匀,圆润，横向与纵向拖尾少；上样量为（18cm：600μg图2-D；24cm：700μg图3-D）时,蛋白点虽然有所增加，但增加不明显,在酸性端和碱性端蛋白点出现横向与纵向拖尾及外形不规则,说明上样量增加，高丰度蛋白质的斑点过大，一些高丰度蛋白过于集中、交叉，重叠,低丰度蛋白被掩盖。影响其他蛋白质点的分离，这样不利于后续蛋白点的检测、鉴定。在图2-C和图3-C中凝胶背景清晰,蛋白点较多。综合考虑,为了能够得到更好的蛋白分离效果,获得感兴趣蛋白,决定采用最佳上样量为（18cm：500μg，24cm：600μg），另外，由图2和图3比较观察可知，棉花叶片蛋白质广泛分布于pH4～7的范围,但是18cm胶条电泳结果（图2-C）,蛋白点非常密集,蛋白点之间不易区分,而且在胶条两端,部分蛋白质在等电聚焦后没有得到很好的分离,而使用了24cm胶条（图3-C）后,上述问题得到了较好的解决。所以,上样量要兼顾最后蛋白分离的效果及分离到蛋白点的多少及重复性,综合考虑,本试验最终采用pH4～7,24cm的IPG胶条。

Claims (8)

1.一种棉花叶片蛋白质提取方法，包括以下步骤：

1）取棉花叶片，用液氮研磨；

2）经液氮研磨的叶片粉末转入离心管中，并加入预冷的三氯乙酸提取液，混合均匀，放在－20℃冰箱中两小时以上，每半小时震荡一次；

3）离心管离心，弃上清，留沉淀，向沉淀中加入-20℃预冷丙酮溶液，混合均匀，于-20℃静置2～4h；

4）离心管离心，弃上清，留沉淀，洗涤沉淀，并保留沉淀；

5）沉淀抽真空，挥发丙酮，得到蛋白质干粉；

6）取干燥的蛋白粉末，加入蛋白裂解液，35℃的水浴中裂解1h，离心，取上清，所述上清为棉花叶片蛋白溶解液。

2.根据权利要求1所述的一种棉花叶片蛋白质提取方法，其特征在于，所述三氯乙酸提取液的配方为：10%TCA，0.07%-0.1%DTT，0.5％β-巯基乙醇，1mmol/L PMSF，溶剂为丙酮。

3.根据权利要求1所述的一种棉花叶片蛋白质提取方法，其特征在于，所述丙酮溶液含有0.07%-0.1%DTT和1mmol/L PMSF。

4.根据权利要求1所述的一种棉花叶片蛋白质提取方法，其特征在于，所述蛋白裂解液的配方为：7mol/L尿素,2mol/L硫脲,4%CHAPS,80mmol/L DTT,1mmol/L PMSF，0.3%载体两性电解质。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种棉花叶片蛋白质提取方法，其特征在于，用液氮研磨叶片时加入PVPP和石英砂。

6.根据权利要求1-4任意一项所述的一种棉花叶片蛋白质提取方法，其特征在于，所述三氯乙酸提取液的用量是每0.4克叶片加入1.8mL预冷三氯乙酸提取液。

7.根据权利要求1-4任意一项所述的一种棉花叶片蛋白质提取方法，其特征在于，步骤4）所述沉淀重复洗涤3次或3次以上，或过夜洗涤，至接近白色。

8.根据权利要求1-4任意一项所述的一种棉花叶片蛋白质提取方法，其特征在于，所述蛋白裂解液的用量是每毫克干燥蛋白干粉加入蛋白裂解液20μl。

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