CN110763750A - 一种大豆品种脂氧酶缺失的鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大豆品种脂氧酶缺失的鉴定方法，包括：(1)将待鉴定的大豆种子播种，待出苗后取长出的子叶为样品提取蛋白质；(2)将所提取的蛋白质采用ISDS‑PAGE方法进行电泳，分析鉴定Lox‑1，2，3三个目标条带是否缺失。本发明将播种前从种子取样改为播种出苗后取样，这样种子不受损，降低了种子感染病虫害的几率，能够确保含目标性状的大豆种子能安全出苗，大大降低了含目标基因性状个体的死亡率，含目标性状个体的成活率由传统取样法的50％左右提高到99％以上。本发明鉴定方法不仅极大的提高了含目标基因形状的成活率，还有效节约了时间及人力成本。

Description

一种大豆品种脂氧酶缺失的鉴定方法

技术领域

本发明涉及大豆品种脂氧酶缺失的鉴定方法，尤其涉及采用改良的SDS-PAGE鉴定大豆品种脂氧酶缺失的方法，属于脂氧酶缺失大豆品种的鉴定领域。

背景技术

脂肪氧化酶(lipoxygenase,略：Lox)简称脂氧酶，又称脂氧合酶，包含三个同工酶，即：Lox-1，Lox-2和Lox-3。大豆种子破碎遇氧，种子中所含的亚油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸，在脂氧酶的作用下，就会被氧化成己烯醛、醇、酮等小分子的物质，是大豆产生豆腥味的主要源泉。

为了培育新大豆品种，选取适宜的父母本进行杂交，收获杂交成功的种子称为F1种子，F1种子种下去，再收获的种子称为F2种子，F2代的每一粒种子都具有不同的特点，用什么筛选方法能从众多的F2种子中筛选到含目标性状的种子，又能确保其安全出苗，繁育后代，是大豆品质改良育种的瓶颈。

脂氧酶Lox-1,2,3缺失性状，是有两个等位基因位点控制的隐性性状，根据孟德尔遗传学原理，在Lox-1,2,3完全缺失性状在F2代出现的几率为1/16，在F2代一旦完全缺失个体，这个性状就是纯合的，所以，培育脂氧酶完全缺失的大豆新品种，在种子量最少的F2代进行逐粒筛选，是最经济合算的最佳筛选时期，否则若等到到种子量多的高世代再筛选，将会如同大海捞针，很难筛选到含脂氧酶完全缺失的目标性状个体。但是由于F2代种子每一粒豆各不相同，传统的分析方法须从每一粒F2种子上切取大约10mg的粉末进行分析鉴定，最终获得脂氧酶完全缺失的目标性状个体，但是，在将目标个体播种扩繁时，由于种子已经受过伤害，播下去的目标种子几乎有50％的种子无法安全出苗。导致辛辛苦苦1年多才获得的本来就极少的目标种子的极大地损失甚至全军覆没，1年多的辛苦付出就白白浪费掉了。

现有的脂氧酶缺失大豆新品种的鉴定方法主要有以下几种方法：聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE鉴定法：其作用原理是聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应，根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂(SDS即十二烷基硫酸钠)后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，即根据优不同蛋白亚基分子量大小差异，区分蛋白种类。在种子取样方式上：从远离种脐的位置切取8-10mg粉末，提取蛋白，跑胶、染色、脱色、观察鉴定。该方法的优点是：简单易操作，易掌握。该方法存在的主要缺点是：1.对于分子量接近的蛋白亚基的区分比较困难，脂氧酶缺失鉴定就存在这样的问题，由于脂氧酶由三个同工酶构成，分子量在94-97Kd之间，很接近，鉴定三个同工酶同时缺失时比较容易，当需要鉴定其中一个酶缺失时比较困难，存在误判率高的缺点；2.检测周期长，一个周期下来，至少需要10个小时以上。3.最大缺点：苗前取样检测，伤害种子，无法确保含目标基因种子安全出苗，繁殖后代。

聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳(IEF-PAGE)：等电聚焦电泳是一种特殊的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，它的特点是在凝胶柱中加入两性电解质载体：Ampholine,从而使凝胶柱上产生pH梯度。当向两性载体凝胶施加电场时，即可形成pH梯度，其顺序是从阳极到阴极pH值逐渐增大。因为蛋白质为两性电解质，其所带的电荷的性质和数量随所处的环境的pH而变化，当蛋白质在等电聚焦凝胶柱中进行电泳时，带电荷的蛋白质离子即在凝胶柱上泳动，当蛋白质样品泳动到某一部位，这一部位的pH值正好相当于该蛋白质的等电点时，蛋白质的净电荷为零不再移动，则聚焦成一条蛋白质条带。这种按等电点的大小在pH梯度某一相应位置聚焦的方法为等电聚焦电泳法。该方法的主要优点是鉴定准确，不易误判。该方法存在的主要缺点如下：1.操作程序繁杂，不易掌握。2.同样存在检测周期长，工作效率低的问题，3.同SDS-PAGE鉴定法一样，也存在苗前取样检测，伤害种子，无法确保含目标基因种子安全出苗，繁殖后代的问题。

在培育脂氧酶缺失大豆新品种的育种过程中，如何能在杂交后代F2分离世代每一粒种子的脂氧酶缺失与否，准确地进行精准鉴定，而且要能确保鉴定后的个体能够正常地完成世代扩增繁育，为培育在培育脂氧酶缺失大豆新品种提供检测技术方法的支持，成为无腥味大豆育种能否继续下去的关键。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种大豆品种脂氧酶缺失的鉴定方法；

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种大豆品种脂氧酶缺失的鉴定方法，包括：(1)将待鉴定的大豆种子播种，待出苗后取长出的子叶为样品提取蛋白质；(2)将所提取的蛋白质采用ISDS-PAGE方法进行电泳分析鉴定Lox-1，2，3三个目标条带是否缺失。

从配置杂交组合收获F1种子再到F2种子，从春季播种到秋季收获，再到冬季海南加代扩繁才能收获到F2种子，至少需要1年以上的时间，如果在F2分离时代进行目标性状鉴定时，即便获得了含目标性状的个体，可能会因取样量过大，而导致其无法安全出苗，这样之前那年的工作结白做了。本发明首先改变了取样方式，由过去的播前取样为苗后取样，即从传统的播种前切取种子的一部分粉末提取蛋白跑胶的方式，改变为先播种等种子安全出苗后，在从即将展开的子叶上切取部分鲜子叶提取蛋白跑胶鉴定。由于不需要从种子中取样，能够确保含目标性状的种子能安全出苗，这种颠覆性取样鉴别方式的改变，大大降低了含目标基因性状个体的死亡率，含目标性状个体的成活率由传统取样法的50％左右提高到99％以上。所以，极大地提高含目标基因形状的成活率，节约时间及人力成本。

在不影响对目标蛋白条带的鉴别区分情况下，以最大限度减少取样量，减少对幼苗的伤害为基本原则进行取样，本发明经过10mg、20mg、40mg鲜子叶三个梯度的取样比较，最终确定20mg的子叶的取样量为最佳取样量。

本发明改变ISDS-PAGE的制胶试剂配比，采用浓缩胶、分离胶浓度均为7.5％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测条件完全相同，苗后子叶不同时期同一取样量检测法与播前子叶取样检测法相比，在子叶Ⅰ时期时期Ⅰ(即：子叶刚刚分开)，取样量仅为20mg的条件下，便能清晰地区分开Lox-1、Lox-2、Lox-3三个条带，用时短，且鲜子叶取样量相对较少，确保了含目标基因种子正常的继代繁育。

本发明方法不需要从种子中取样，苗后取样种子不受损，能够正常生长，能够确保含目标性状的大豆种子能安全出苗，降低种子感染病虫害的几率，大大降低了含目标基因性状个体的死亡率，含目标性状个体的成活率由传统取样法的50％左右提高到99％以上，不仅极大地提高含目标基因形状的成活率，还有效节约了时间及人力成本。

附图说明

图1子叶展开初期长相(A)及取样后状态(B)。

图2传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。

图3ISDS-PAGE改良聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。

图4为不同时期同一取样量法与干粉取样法电泳图，泳道1、2、3为合丰55的苗后子叶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期取样法实验结果，子叶取样量均为20mg；泳道4为合丰55干粉取样量6mg。

图5为同一时期不同取样量法与干粉取样法电泳图，泳道1、2、3为合丰55苗后子叶Ⅰ时期，取样量分别10mg，20mg，40mg；泳道4为合丰55干粉取样量6mg。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1脂氧酶缺失大豆新品种的鉴定

(1)制胶及蛋白提取液所需的主要试剂配比

经过改良后的方法，实验所需的溶液包括分离胶、浓缩胶用溶液、蛋白质提取液、电泳缓冲液及染色、脱色液；ISDS-PAGE电泳实验所需主要试剂配比：

(1)A液：181.5g Tris，2g SDS，用HCL调pH至8.82，定容至500mL。

(2)B液：15g Tris，2g SDS，用HCL调pH至6.78，定容至500mL。

(3)C液：150g Acrylamide，4g Bisacrylamide，定容至500mL。

(4)E液：8mg核黄素，定容至200mL。

(5)P液：0.78g过硫酸铵，定容至50mL。

(6)蛋白质提取液：6.057g Tris，0.1g溴酚蓝，50g甘油，用HCL调pH至8.0，定容至1000mL。

(7)10×电泳缓冲液：30g Tris，10g SDS，144g Glycine，定容至1000mL。

(8)染色液：65mL冰乙酸，310mL甲醇，考马斯亮蓝G-250 1.5g，定容至1000mL。

(9)脱色液：60mL冰乙酸，210mL甲醇，定容至1000mL。

(2)样品前处理

用壁纸刀分别切取处于子叶展开初期(图1-A)的子叶20mg(图1-B)，按顺序将样品倒入8×12的96孔板的每一个方格中。用排枪统一向样品盒每方格中加入500μL的蛋白质提取液(0.05mol·L^-1Tris-HCL溶液，2％溴酚蓝，4％甘油，pH调至8.0)，其中5％甘油可在电泳时起沉降作用，防止上样后样品飘移流失或混入其他泳道，2％溴酚蓝作为用来观察电泳进度的指示剂。为了在电泳时保护巯基不被氧化，对样品提取前在提取液中加入2％β-巯基乙醇。用漩涡混合器振荡1min，随后在超声清洗器中萃取10min，取出后静置20～30min，准备取上层提取液10μL用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。

(3)电泳用玻璃板的组装

取4套干净无水痕的玻璃板，每套玻璃板中一块在同一侧的两端有一对磨砂玻璃间隙条，另一块玻璃的顶端有凹槽，凹槽下沿有斜面切口，将带磨砂玻璃条的玻璃板置于桌面上(磨砂玻璃一侧向上)，将U型硅胶条在左、下、右三个方向紧贴两个磨砂玻璃条并将其包围，盖上带凹槽的玻璃板(斜面切口一侧向内)，然后用4个长尾夹(两大两小)分别固定在玻璃板的四个角，大号夹子在下端以便在实验台上垂直放置。

(4)分离胶的制备

本方法需制作分离胶浓度为6.75％的聚丙烯酰胺凝胶。以制作4枚浓度为6.75％的聚丙烯酰胺凝胶为例：取一个150mL的锥形瓶，向其中依次加入18.0mL A液、16.2mL C液、3.6mL P液、34.2mL蒸馏水，每加入一种试剂后立即轻摇混匀，最后加入48μL的TEMED，再次轻摇混匀，缓慢由安装好的两块玻璃板间倒入(注意不要在中间倒入，以免造成浓度不均)，直到液面距离玻璃板凹槽下沿3cm左右。将去离子水用注射器轻轻淋在胶面的上部，至液面抵达玻璃板凹槽下沿。将其置于日光灯箱上，静置40min左右，待胶体与其上方的去离子水之间可见一条明显的分界线，说明分离胶已完全凝固，将上方的蒸馏水倒掉，用定性滤纸吸去玻璃板上残余的水分，从灯箱上取下为加入浓缩胶做准备。

(5)浓缩胶的制备

本实验浓缩胶的浓度为7.5％。取一个50mL的锥形瓶，向其中依次加入6.4mL B液，4.0mL C液，0.8mL P液，5.2mL E液，7.6mL蒸馏水，每加入一种试剂后立即轻摇混匀，最后加入24μL TEMED，再次轻摇混匀，缓慢由制好分离胶的两块玻璃板间倒入，直到液面距离玻璃板凹槽下沿2mm左右，插入28齿规格的泳道梳(由左至右倾斜插入以赶走气泡)，将其置于日光灯箱上，静置30min左右，待胶体凝固后，将固定于四角的长尾夹以及U形硅胶条依次拆掉，缓慢拔掉泳道梳，并用去离子水冲洗掉悬附在玻璃板上无用的残胶，用保鲜膜密封，放入冰箱(4℃)中倒置冷藏备用。

(6)ISDS-PAGE凝胶电泳

向电泳槽中缓慢倒入电泳缓冲液，将制作好的胶板缓慢倾斜放入电泳液中(注意凹槽一面向内)，在放入的同时注意排出胶板底部的两块玻璃板之间的缝隙中的气体，将四块胶板分别放入后用白色旋钮将其固定，使其与灰色海绵条紧贴。在两侧胶板间倒入电泳液，注意液面没过内侧的凹槽以形成通路。用12头排枪从96孔样品盒中吸取10μL提取液将其注入泳道。启动电泳槽的冷却系统，将电泳仪与电泳槽连接并通电，电压调至100V后电泳75min左右。待指示条带移动至浓缩胶与分离胶的交界处，将电压调至150V，继续电泳5.5h。待条带超过底部灰色海绵条2～3cm，关闭电泳仪并断开电源，取下胶板，切掉凝胶上半部的浓缩胶，并用小刀对分离胶进行切角标记(目的是为各块凝胶编号并方便辨认泳道的起点及顺序)。随后将分离胶小心地从胶板上取下，放入染色液，在摇床上染色2h左右(以最低速轻摇以防止损坏胶体)，之后小心取出用蒸馏水简单冲洗，沥干水后放入脱色液中(尽可能减轻对脱色液的污染以增加脱色液使用次数)，置于摇床以最低速轻摇4h以上。随后取出凝胶，在普通荧光灯箱上辨识Lox-1,-2,-3的三个同工酶条带的缺失与否(图3)。

本发明进一步以脂氧酶Lox-1,2,3不缺失种质“合丰55”普通大豆品种为例，播种于营养钵中，播种3周内，待子叶出土，真叶展开前取样，并与干粉取样法进行对比分析：

对比实施例1

苗后子叶不同时期取样法与干粉取样法电泳实验：用壁纸刀分别切取处于时期Ⅰ(子叶刚刚分开)、时期Ⅱ(两片真叶展开)时期、Ⅲ(第一片三出复叶展开)的参试品种20mg，放入2mL的离心管，加液氮研磨。向每个离心管中加入500μL蛋白质提取液(0.05mol/LTris-HCL pH8.0，4％甘油，2％β-巯基乙醇，2％溴酚蓝)，用漩涡混合器振荡1min，随后在超声清洗器中萃取10min，取出后静置20～30min后再次搅拌，6000r/min离心5min，取上清液用浓缩胶、分离胶浓度均为7.5％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳解析。

切取合丰55种子干粉6mg，以同样方法进行蛋白提取及聚丙烯酰胺凝胶电泳解析。

根据试验结果(图4)可见，采用苗后不同的时期取样采用浓缩胶、分离胶浓度均为7.5％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳解析，检测条件完全相同，苗后子叶不同时期同一取样量检测法与播前子叶取样检测法相比，在子叶Ⅰ时期，取样量仅为20mg的条件下，便能清晰地区分开Lox-1、Lox-2、Lox-3三个条带，用时短，且鲜子叶取样量相对较少，确保了含目标基因种子正常的继代繁育。

对比实施例2

苗后子叶同一时期不同取样量法与干粉取样法电泳实验：用壁纸刀分别切取处于时期Ⅰ的参试品种10mg，20mg，40mg，分别放入2mL的离心管，加液氮研磨。向每个离心管中加入500μL蛋白质提取液(0.05mol/LTris-HCL pH8.0，4％甘油，2％β-巯基乙醇，2％溴酚蓝)，用漩涡混合器振荡1min，随后在超声清洗器中萃取10min，取出后静置20～30min后再次搅拌，6000r/min离心5min，取上清液用浓缩胶、分离胶浓度均为7.5％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳解析。

切取合丰55种子干粉6mg，以同样方法进行蛋白提取及聚丙烯酰胺凝胶电泳解析。

根据图5的试验结果可见，采用浓缩胶、分离胶浓度均为7.5％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测条件完全相同，苗后子叶同一时期不同取样量检测法与播前子叶取样检测法，均能区分开Lox-1、Lox-2、Lox-3三个条带，其中，苗后子叶取样量大于20mg的条件下便能清晰区分开Lox-1、Lox-2、Lox-3三个条带，苗后取样种子不受损，能够正常生长，降低种子感染病虫害的几率。

Claims (8)

1.一种大豆品种脂氧酶缺失的鉴定方法，其特征在于，包括：(1)将待鉴定的大豆种子播种，待种子出苗后取长出的子叶为样品提取蛋白质；(2)将所提取的蛋白质采用ISDS-PAGE方法进行电泳，分析鉴定样品中的Lox-1，2，3三个目标条带是否缺失。

2.按照权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，待种子出苗后取处于子叶Ⅰ时期的子叶为样品提取蛋白质。

3.按照权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述的子叶Ⅰ时期为子叶刚刚分开。

4.按照权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，待种子出苗后取处于子叶Ⅰ时期的子叶10-40mg提取蛋白质。

5.按照权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，待种子出苗后取处于子叶Ⅰ时期的子叶20mg提取蛋白质。

6.按照权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述ISDS-PAGE中的浓缩胶的浓度为7.5wt％。

7.按照权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述ISDS-PAGE中的分离胶的浓度为6.75wt％-7.5wt％。

8.按照权利要求17所述的鉴定方法，其特征在于，所述SDS-PAGE中的分离胶的浓度为7.5wt％。

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