CN106399566A - 一套适于栽培绿豆品种鉴定的ssr引物组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一套适于栽培绿豆品种鉴定的SSR引物组合及其应用。该引物组合由30对多态性好、扩增稳定的SSR引物组成，所述的30对多态性好、扩增稳定的SSR引物序列分别如SEQ ID NO.1‑60所示。此外，本发明还公开了一种使用本发明所述的SSR引物组合鉴定绿豆品种的方法。本发明利用一套多态性好、PCR扩增稳定的SSR引物对鉴定品种的遗传信息进行分析，与现在广泛使用的表型鉴定方法和之前报道的分子鉴定方法相比更加准确。另外本发明直接利用绿豆籽粒提取基因组DNA，省去了将待测品种进行发芽或育苗后再取样的过程，鉴定过程更加简洁迅速。
Description
技术领域
本发明涉及一种绿豆品种的鉴定方法，特别涉及一套适于栽培绿豆品种鉴定的SSR引物组合以及利用该SSR引物组合进行栽培绿豆品种鉴定的方法。本发明属于种质资源鉴定技术领域。
背景技术
绿豆是最主要的食用豆类栽培种之一，在温带、亚热带和热带高海拔地区被广泛种植，主要分布在印度、中国、巴基斯坦、缅甸等亚洲国家。绿豆在中国的年均种植面积约80万公顷，年均产量约100万吨，是中国的重要出口创汇农产品之一。绿豆具有生育期短、抗旱耐瘠等特点，且可以与根瘤菌共生固氮，在农业种植结构调整中发挥着重要作用。近年来随着绿豆杂交育种技术的发展，绿豆新品种数量不断增加。为了加快育种进度，提高选择效率，各育种单位往往选用少数优良品种作为骨干亲本，从而导致育成品种的遗传基础越来越窄，品种相似性越来越高，加大了利用外观表型性状区分不同绿豆品种的难度，给品种管理和保护造成了困难。
此外，外观表型鉴定还存在着鉴定周期长、工作量大、受季节和地域限制的缺陷。分子标记检测技术具有测试周期短、不受环境影响和季节限制、供选择的标记数量多、且可以进行高通量测试分析等优势，已逐步应用于作物新品种鉴定、种子纯度及品种真实性检测中。
因此，寻找和开发合适的分子标记，利用分子标记技术建立DNA指纹图谱，可以为绿豆种质资源和品种鉴别、纯度检测等提供有力的工具。RFLP、RAPD、AFLP等分子标记曾先后用于绿豆的遗传多样性分析、遗传图谱构建以及QTL定位等研究，但由于上述标记或者由于操作过程较为繁琐，不易掌握，或者由于重复性差等缺陷，限制了它们在绿豆遗传研究中应用。
随着对绿豆的分子遗传及分子生物学研究的进步，绿豆转录组和基因组相继公布，这为其他DNA分子标记的开发鉴定提供了条件。其中，以微卫星序列为基础的SSR(Simple sequence repeat)分子标记具有独特的优越性，它不仅覆盖范围广、呈共显性遗传、重复性好、多态性丰富，而且操作简单，成本低廉。可以高效准确的应用于绿豆品种和种质资源的鉴定与分析。
本发明是基于SSR分子标记鉴定法建立的，利用多态性好、PCR扩增稳定的30对SSR引物组成的一套引物组合对不同绿豆品种进行鉴定的技术体系。该技术体系能够快速、准确的对不同栽培绿豆品种进行鉴定，能准确区分绿豆品种间差异并最大限度准确反映绿豆品种间的亲缘关系。
发明内容
本发明的目的在于提供一套基于绿豆转录组和基因组序列开发的SSR核心引物组，这些引物具有扩增稳定、电泳条带清晰、多态性丰富的优点，可有效用于DNA指纹图谱构建、品种鉴定等研究。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一套适于栽培绿豆品种鉴定的SSR引物组合，该引物组合由30对多态性好、扩增稳定的SSR引物组成，所述的30对多态性好、扩增稳定的SSR引物序列分别如SEQ IDNO.1-60所示。
一种适于栽培绿豆品种鉴定的试剂盒，其含有本发明所述的SSR引物组合以及PCR检测用试剂。
进一步的，本发明还提出了所述的SSR引物组合在栽培绿豆品种鉴定中的用途。
一种使用本发明所述的SSR引物组合鉴定绿豆品种的方法，包括如下步骤：
(1)提取待鉴定绿豆籽粒样品基因组DNA；
(2)采用权利要求1所述的SSR引物组进行PCR扩增；
(3)将步骤(2)的扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析；
(4)根据特异性图谱进行绿豆品种的鉴定。
在本发明所述的方法中，优选的，步骤(1)中采用CTAB法或改良的CTAB法进行待鉴定绿豆籽粒样品基因组DNA的提取。
在本发明所述的方法中，优选的，步骤(2)中用于扩增所述分子标记的PCR反应体系和扩增程序为：
PCR反应体系为10μL，含1×PCR缓冲液，0.2mM dNTPs,上下游引物各0.2μM，20ng待测绿豆品种的基因组DNA，0.5U Taq酶；
PCR扩增程序：95℃预变性5min，然后每个循环：95度变性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共进行35次循环，最后72℃延伸10min。
在本发明所述的方法中，优选的，步骤(3)中所述的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析为使用8％(w/w)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物，在PCR产物中加2μL上样缓冲液，280V恒电压电泳1h，0.1％(w/w)AgNO3染色10min，使用含0.5％(v/v)甲醛1.5％(w/w)NaOH溶液显影。
相较于现有技术本发明的有益效果为：
本发明利用一套多态性好、PCR扩增稳定的SSR引物对鉴定品种的遗传信息进行分析，与现在广泛使用的表型鉴定方法和之前报道的分子鉴定方法相比更加准确。另外本发明直接利用绿豆籽粒提取基因组DNA，省去了将待测品种进行发芽或育苗后再取样的过程，鉴定过程更加简洁迅速。
附图说明
图1为29个绿豆栽培品种基于30对绿豆SSR引物的聚类分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1绿豆SSR引物的开发及筛选
利用SSRLocatorI V.1软件扫描绿豆转录组和基因组数据库中的SSR位点，并设计引物。在上海英骏生物技术有限公司合成其中的3000对引物，利用6份代表性绿豆资源进行多态性引物筛选，从中选择出30对多态性好、扩增稳定的SSR引物作为品种鉴定分析的核心引物(见表1)。
表1 30对绿豆SSR引物信息
实施例2本发明的SSR引物组合在栽培绿豆品种鉴定中的应用
1、绿豆基因组DNA提取
选取29份主栽绿豆栽培品种作为鉴定材料(表2)。
表2 本发明中用于绿豆品种鉴定的材料信息
DNA提取具体步骤如下：
1)各取3-5粒参试绿豆材料的种子，利用研钵或组织研磨仪研成粉末，置于2ml离心管中，加入800μl 65℃预热的CTAB提取液，涡旋震荡1min。
2)将离心管置于65℃水浴40min，每10min颠倒混匀一次。将样品从水浴锅中取出，静置片刻，加入800μl氯仿与异戊醇的混合液(24氯仿：1异戊醇)，混匀15min，然后静置10min，10000rpm室温离心10min。
3)取600μl上清液于另一新的2ml离心管中，加入900μl 95％乙醇，-20℃放置30min。10000rpm离心10min，倒掉上清液，留沉淀。
4)加入500μl 75％乙醇，轻轻将沉淀弹起，10000rpm离心5min，倒掉上清液。
5)重复步骤4)一次。
6)将离心管开口朝下倾斜放置，便于多余乙醇流出，室温干燥1h或50℃烘干20min。加入150μl灭菌ddH2O或1×TE。置65℃水浴锅溶解1h。
7)取出离心管，放置至室温，10000rpm离心2min，将上清液吸取到新的1.5ml离心管中，以便去除淀粉等沉淀物。利用nanodrop2000进行DNA浓度测定和质量检测，-20℃冰箱保存，备用。
2、鉴定材料PCR扩增
利用实施例1表1中给出的SSR引物对待鉴定材料DNA进行PCR扩增，PCR反应体系和扩增程序如下：
PCR反应体系为10μL，含1×PCR缓冲液，0.2mM dNTPs，上下游引物各0.2μM，20ng待测绿豆品种的基因组DNA，0.5UTaq酶；
PCR扩增程序：95℃预变性5min，然后每个循环：95度变性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共进行35次循环，最后72℃延伸10min。
3、8％(w/w)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测
采用8％(w/w)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物。在PCR产物中加2μL上样缓冲液，每一个加样孔加入1.5μL样品，280V恒电压电泳1h。0.1％(w/w)AgNO3染色10min，1.5％(w/w)NaOH(含0.5％(v/v)甲醛)溶液显影5-10min。最后用蒸馏水漂洗2次。
4、根据DNA分子量标准和引物的迁移率记录结果，迁移率最大(分子量最小)的条带记为01，迁移率次之的记为02，依次类推，无条带记为00，建立供试材料SSR基因型信息数据库。
统计每个品种在引物中的扩增情况，构建DNA指纹图谱(表3)，通过比较各引物扩增位点的差异，发现任意2个品种的DNA指纹图谱都不相同。
表3. 28份绿豆品种DNA指纹数据
5、利用NTSYSpc2.10分析软件计算绿豆各品种间的遗传相似系数，然后基于相似系数矩阵，利用SHAN子程序按照UPGMA算法进行聚类分析(图1)。
在相似系数为1(两个品种基因型完全相同时，二者相似系数＝1)时，29个绿豆栽培品种各自处于不同的分支上，表明29个测试材料为不同品种。在相似系数0.39处，29个测试材料分为明显的两类，其中一类主要集中了来自北京、河北石家庄、河北保定的绿豆品种，如中绿5号、中绿8号、中绿11号、中绿12号均为中国农业科学院作物科学研究所育成；冀绿7号、冀绿10号、冀绿11号、冀绿13号、冀绿0518、冀绿0509均为河北省农林科学院粮油作物研究所育成；冀绿2号和保942均为保定市农科院育成。同时，在该分类内的一些品种具有亲缘关系，如冀绿7号、冀绿10号、保942均使用了冀绿2号作为杂交亲本之一，冀绿0509则使用了保942作为杂交亲本之一。另一类则主要集中了来自于东北和内蒙古地区的绿豆品种。如白绿8号、白绿9号、白绿11号、吉绿4号，吉绿5号、辽绿8号、内蒙古绿豆、科绿1号等。这部分品种多具有半直立生长的特性。
以上结果说明本发明的绿豆SSR引物组合可以很好的区分绿豆栽培品种，并反映出品种的亲缘、地理来源等信息，可用于绿豆品种鉴定及多样性分析。
序列表
<110> 河北省农林科学院粮油作物研究所
<120> 一套适于栽培绿豆品种鉴定的SSR引物组合及其应用
<130> KLPI161247
<160> 60
<170> PatentIn 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 1
gtgatggtgc tgcttttc 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 2
atgcgtgggg agaagtaa 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 3
ttcacaccct tttctgattc 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 4
gtttccttct tggtctcc 18
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 5
acgttcattg ttcctttccc tctg 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 6
gtgctcgaag agttcgtctt cctc 24
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 7
acggctattc atcgttttgc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 8
caacccgaag ccaaaaacta 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 9
cagcaacgga aagaaaatcg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 10
tgttgtgaag gcaccaacat 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 11
ttcccctttc tgcttcttca 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 12
acgctgacgt tgactcctct 20
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 13
tctcttcctc tatggctt 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 14
gctcctcttt ttgctgca 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 15
gtcgtttccg gaaactgt 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 16
gatccgaacc tctttctg 18
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 17
gaagggaatg aaaatgaa 18
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 18
gttcaatcca ttcagtct 18
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 19
agaagaaccc taccacag 18
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 20
ccaaaaacgt tccctcag 18
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 21
ccggggtgaa attgatacac 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 22
caaaggggct atgaacagga 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 23
gaggttccaa catctcagcc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 24
ggatggacaa tgttgtgctg 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 25
atgtttgagg catttccctg 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 26
atcaggcaac aacaaccaca 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 27
acgcaaagag aggtgcagat 20
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 28
tccctaccat tttccagatc a 21
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 29
gcaggcaata cgaggagttc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 30
agggtcggtc catcaacata 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 31
attcaagcca gagaaggcaa 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 32
ggtgggaggg tattggctat 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 33
aagactaaaa ggcgccgaac 20
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 34
aaggagaaag ataccgtttt caga 24
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 35
catgcagacg aagcagag 18
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 36
gagcgtcgtc gtttcgat 18
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 37
aagcactggc ttcaccagat 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 38
tcgcagcatt tgaaaaatca 20
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 39
tccaatgttt ggtttcatgt tt 22
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 40
tctgagctct gaggtgggat 20
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 41
cattcaacgc tgtgtaaggt ccag 24
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 42
ttgcagaaga gctttgtgat gagg 24
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 43
cccactgcag aggttatcgt 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 44
gaagatccag cacaacccat 20
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 45
tctgcgaaaa tcttcttcca a 21
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 46
ggtggggaaa agaaccctaa 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 47
tggaactcct tcccctcttt 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 48
ggaagcgagt ccacgagtag 20
<210> 49
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 49
gcttcacatg catagtac 18
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 50
ttaacttggg ttgtctgc 18
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 51
ctcattgtac cactggatat 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 52
gcctcctttc aggtgattgt 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 53
ggcagcataa gagaagccac 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 54
aacccccttt tcatgctctt 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 55
ctccatgtcc ctcttttcca 20
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 56
tgggttgagt ttgtttcttg g 21
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 57
caatcatgga tttggggaac 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 58
cgatctcatt cacgcacttt 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 59
gcctgcattt tggtttgaat 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 60
tcccaaagtc tgcaagatcc 20
Claims (7)
1.一套适于栽培绿豆品种鉴定的SSR引物组合，该引物组合由30对多态性好、扩增稳定的SSR引物组成，其特征在于，所述的30对多态性好、扩增稳定的SSR引物序列分别如SEQ IDNO.1-60所示。
2.权利要求1所述的SSR引物组合在栽培绿豆品种鉴定中的用途。
3.一种适于栽培绿豆品种鉴定的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的SSR引物组合以及PCR检测用试剂。
4.一种使用权利要求1所述的SSR引物组合鉴定绿豆品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待鉴定绿豆籽粒样品基因组DNA；
(2)采用权利要求1所述的SSR引物组进行PCR扩增；
(3)将步骤(2)的扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析；
(4)根据特异性图谱进行绿豆品种的鉴定。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中采用CTAB法或改良的CTAB法进行待鉴定绿豆籽粒样品基因组DNA的提取。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中用于扩增所述分子标记的PCR反应体系和扩增程序为：
PCR反应体系为10μL，含1×PCR缓冲液，0.2mM dNTPs,上下游引物各0.2μM，20ng待测绿豆品种的基因组DNA，0.5U Taq酶；
PCR扩增程序：95℃预变性5min，然后每个循环：95度变性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共进行35次循环，最后72℃延伸10min。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析为使用8％(w/w)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物，在PCR产物中加2μL上样缓冲液，280V恒电压电泳1h，0.1％(w/w)AgNO3染色10min，使用含0.5％(v/v)甲醛1.5％(w/w)NaOH溶液显影。
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| CN103642912A (zh) * | 2013-11-29 | 2014-03-19 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 基于转录组测序开发绿豆ssr引物的方法 |
| CN105368956A (zh) * | 2015-12-11 | 2016-03-02 | 河北省农林科学院粮油作物研究所 | 一种用于绿豆抗豆象新基因Br3辅助选择的分子标记及其应用 |
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