CN102911932A

CN102911932A - 一种同时提取和纯化rna和dna的试剂盒及方法

Info

Publication number: CN102911932A
Application number: CN2012104140191A
Authority: CN
Inventors: 张伟; 蒲静; 高志强; 凌凤俊; 汪琳; 谷强; 乔彩霞; 尹义; 张利峰; 张鹤晓
Original assignee: Beijing Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Peoples Republic of China
Current assignee: Beijing Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Peoples Republic of China
Priority date: 2012-10-25
Filing date: 2012-10-25
Publication date: 2013-02-06

Abstract

本发明公开了一种同时提取和纯化RNA和DNA的试剂盒及方法。本发明所述的试剂盒包括共提取裂解液、2M醋酸钠、水饱和酚、氯仿/异戊醇混合液、异丙醇、70%或75%DEPC酒精、灭菌DEPC水、反提萃取液和核酸纯化柱。本发明的优点是：建立了同时提取RNA和DNA的提取方法并组装了试剂盒。该方法与经典的单独提取RNA或者DNA单独提取的方法相比较，提取效率相当，同时在方法中还提供了RNA和DNA进一步纯化的方法。其优势在于能够同时提取并纯化RNA和DNA，使用者可以根据实际的检测需要，选取不同的方法进行核酸提取。此外，本发明也为同时检测两种不同类型核酸的检测技术提供了很好的基础平台。

Description

一种同时提取和纯化RNA和DNA的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及一种同时提取和纯化RNA和DNA的试剂盒及方法，属于检验检疫领域。

背景技术

在动物检疫中，根据检疫条款，一种样品往往需要针对多种疫病开展检测。随着多重PCR和基因芯片等高通量检测方法的广泛应用，可以实现一次试验完成多种针对检疫条款的检疫性疫病。而核酸（DNA和RNA）的提取与纯化是这些技术应用的基础与前提。

核酸提取与纯化主要分为以下几种方法：

1.酚氯仿抽提法。该方法是核酸分离纯化技术中最经典的方法之一，是由冷泉港实验室中的研究人员首先提取的，并被大量的科研究工作者进行改良使用。其原理是：在酚氯仿的共同作用下，蛋白质会被变性，形成不溶解的物质。由于蛋白质的密度小于酚而大于水，所以离心后，会在酚相和水相于之间，形成蛋白质中间层，从而有效地将蛋白质和核酸分离开来。

2.盐析法。该技术原理是在组织或细胞裂解液中，加入高浓度盐（NaCl或NH₄Cl，KI，KAC）来沉淀去除蛋白质，从而得到高纯度的基因组DNA。

3.玻璃珠法。在高离液盐（盐酸胍，异硫氰酸胍，NaI）条件下，玻璃珠会同核酸发生吸附反应，而在低盐条件下，核酸又可以被洗脱下来。但是玻璃珠的残留以及干燥问题影响了这一技术的运用。至目前为止，大部分的公司已经去除这个纯化技术。

4.硅胶柱法。硅胶柱将核酸抽提或纯化变成一种简单的过滤操作，以取代传统溶液型抽提技术的离心方式。硅胶柱的纯化原理就是使用一种特殊的玻璃纤维滤膜，这种滤膜在高离液剂（盐酸胍，NaI,NaClO₄）的条件下，可以同核酸发生吸附反应，而在低盐条件下，核酸又可以从滤膜中释放出来，蛋白质和其它杂质不会被吸附，从而达到纯化核酸的目的。硅胶柱的过滤吸附操作大大减少了抽提过程中离心和干燥时间，并去除耗时的醇类沉淀过程。

5.磁珠法。磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。硅磁（Magnetic Silica Particle）就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料，来吸附核酸，其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式。离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料（如DEAE，COOH）等，从而达到吸附核酸目的。不同性质的磁珠微珠所对应的纯化原理是不一致。

本发明根据实际需要，建立了同时提取动物细菌与病毒的RNA和DNA的提取方法并组装了试剂盒。该方法与经典的单独提取RNA或者DNA单独提取的方法相比较，提取效率相当，同时在方法中还提供了对动物细菌和病毒的RNA和DNA进一步纯化的方法。其优势在于能够同时提取并纯化动物细菌和病毒的RNA和DNA，使用者可以根据实际的检测需要，选取不同的方法进行核酸提取。此外，本发明也为同时检测两种不同类型核酸的检测技术提供了很好的基础平台。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种同时提取和纯化动物细菌与病毒的RNA和DNA的试剂盒。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种同时提取和纯化动物细菌与病毒的RNA和DNA的方法。

为解决第一个技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种同时提取和纯化RNA和DNA的试剂盒，其包括共提取裂解液、2M醋酸钠、水饱和酚、氯仿/异戊醇混合液、异丙醇、70%或75%DEPC酒精、灭菌DEPC水、反提萃取液和核酸纯化柱。

其中，所述共提取裂解液包含：4.5mol/L异硫氰酸胍，2g/L十二烷基肌酸钠，体积分数7×10^-6%β-巯基乙醇、3g/L消泡剂-A、0.05mol/L乙二胺四乙酸；其pH值为8.0。

进一步地，所述氯仿/异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。

进一步地，所述反提萃取液包含4mol/L异硫氰酸胍、0.05mol/L柠檬酸钠、1mol/LTris；其pH值为8.0。

进一步地，所述核酸纯化柱优选为硅胶膜离心吸附柱。

为解决第二个技术问题，本发明采用以下技术方案：

利用上述试剂盒的同时提取和纯化RNA和DNA的方法，包括如下步骤：

（1）利用共提取裂解液对样品进行裂解得到裂解物；

（2）将裂解物轻微振荡，加入2M醋酸钠、水饱和酚、氯仿/异戊醇混合液，置冰上放置10min；

（3）离心，得到上层液相及下层液相；

（4）吸取步骤（3）中离心得到的上层液相，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，获得混合液体A，然后进行RNA提取与纯化；

进一步地，如果对RNA的纯度要求不高，可按照常规操作提取与纯化RNA，具体方法为：将混合液体A离心，弃上清，用70%或75%DEPC酒精洗涤，干燥后加入灭菌DEPC水溶解，即得。

如果为了达到更高的纯度要求，所述RNA提取与纯化的具体方法为：将混合液体A利用核酸纯化柱提取与纯化，得到高纯度的RNA。

（5）吸取步骤（3）中离心得到的下层液相，加入反提萃取液，颠倒混匀，静置，离心，吸取上层液相再加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，静置，获得混合液体B，然后进行DNA提取与纯化。

进一步地，如果对DNA的纯度要求不高，所述DNA提取与纯化的具体方法为：将混合液体B离心，弃上清，用70%或75%DEPC酒精洗涤，干燥后加入灭菌DEPC水溶解，即得。

如果为了达到更高的纯度要求，所述DNA提取与纯化的具体方法为：将混合液体B利用核酸纯化柱提取与纯化，得到高纯度的DNA。

本发明的优点是：建立了同时提取RNA和DNA的提取方法并组装了试剂盒。该方法与经典的RNA或者DNA单独提取的方法相比较，提取效率相当，同时在方法中还提供了对RNA和DNA进一步纯化的方法。其优势在于能够同时提取并纯化RNA和DNA，使用者可以根据实际的检测需要，选取不同的方法进行核酸提取或纯化。此外，本发明也为同时检测两种不同类型核酸的检测技术提供了很好的基础平台。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为应用提取的核酸样品进行口蹄疫病毒RT-PCR检测和猪链球菌2型PCR检测结果，其中：

M：Marker DL2000；

1：Trizol法提取RNA，口蹄疫RT-PCR检测结果；

2：实施例4的试剂盒提取核酸，口蹄疫RT-PCR检测结果；

3：煮沸法提取DNA，猪链球菌2型PCR检测结果；

4：实施例4的试剂盒提取核酸，猪链球菌2型PCR检测结果。

具体实施方式

本发明所用灭活的口蹄疫病毒为北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心保存，灭活的猪链球菌由中国兽医药品监察所提供。

实施例1：混合样品的制备

为了验证本发明试剂盒的提取效果，选择本实验室保存的已灭活的口蹄疫病毒和猪链球菌作为参试材料，制备了含有动物细菌和病毒的混合样品。

亚洲1型口蹄疫病毒(毒株编号为：As-1/PK-1/2005）细胞培养物。灭活前病毒的浓度为：10⁹TCID₅₀/mL。

灭活猪链球菌2型（中国兽医药品监察所馈赠）菌悬液，灭活前菌悬液的浓度为10⁸CFU/mL。

具体制备过程如下：

（1）在二级生物安全柜内，用灭菌的PBS(pH7.2)将上述两种参试菌/毒株的浓缩悬液分别稀释至10⁵TCID₅₀/mL和10⁵CFU/mL。

（2）将两种稀释后的悬液分别取5mL，充分混合均匀，分装至1.5mL灭菌离心管中，制成混合样品，-80℃保存备用。

实施例2：Trizol法单独提取混合样品的RNA

用Trizol法提取实例1中混合样品的RNA，具体步骤如下：

（1）取5个灭菌的1.5mL灭菌离心管，编号分别为1-5；

（2）每管加入600μL裂解液，加入被检样本、阴性对照、阳性对照各100μL，一份样本换用一个吸头，再加入200μL氯仿，混匀器上振荡混匀5s（不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手颠倒混匀）。于4℃、12000r/min离心15min；

（3）取与5个灭菌的1.5mL灭菌离心管，加入500μL异丙醇（-20℃预冷），做标记。吸取2）中各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500μL，不能吸出中间层，颠倒混匀；

（4）于4℃、12000r/min离心15min（灭菌离心管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)；加入600μL 75％乙醇，颠倒洗涤；

（5）于4℃、12000r/min离心10min（灭菌离心管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品须在吸水纸不同地方沾干）；

（6）4000r/min离心10s（灭菌离心管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3min，不能过于干燥，以免RNA不溶；

（7）每管分别加入25μL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。若需长期保存须放置-80℃冰箱。

实施例3：煮沸法单独提取混合样品DNA

用DNA提取试剂提取混合样品中的DNA，具体操作如下：

（1）取n个1.5mL灭菌离心管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。

（2）每管加入200μL DNA提取液I，然后分别加入待测样本、阴性对照和阳性对照各100μL，一份样本换用一个吸头；混匀器上震荡混匀5s。于4℃~25℃条件下，13000r/min离心10min。

（3）尽可能吸弃上清且不碰沉淀，再加入10μL DNA提取液II，混匀器上震荡混匀5s。于4℃~25℃条件下，2000r/min离心10s。

（4）100℃干浴或沸水浴10min；5000r/min离心5s,充分振荡一下，5000r/min再次离心5s，加入25μL无DNA酶的灭菌纯化水，充分振荡后，5000r/min离心5min，上清即为提取的DNA，冰上保存备用。

（5）提取的DNA放置于-80℃冰箱保存备用。

实施例4：同时提取和纯化动物细菌与病毒的DNA和RNA的试剂盒及其使用方法

一、同时提取和纯化动物细菌与病毒的RNA和DNA的试剂盒，室温保存，由以下试剂组成：

（1）共提取裂解液，包含4.5mol/L异硫氰酸胍，2g/L十二烷基肌酸钠，体积分数7×10^-6%β-巯基乙醇、3g/L消泡剂-A、0.05mol/L乙二胺四乙酸，pH值为8.0。配制方法为：在2000mLDEPC处理过的烧杯中加入300mL灭菌DEPC水，加入531.72g异硫氰酸胍，如果水不够可以加适量的水使得异硫氰酸胍充分溶解，加入2g十二烷基肌酸钠、7μL β-巯基乙醇、3g消泡剂-A和14.61g乙二胺四乙酸，充分溶解后，用氢氧化钠调节pH值至8.0，最后用灭菌DEPC水定容至1000mL。分装25mL/瓶；

（2）2M醋酸钠：其配制方法为NaAc·3H₂O 13.6g加DEPC水定容至50mL，高压灭菌。分装3mL/管；

（3）水饱和酚：其配制方法为取重蒸酚200mL，于65℃水浴溶解，加100mL灭菌DEPC水混匀，静置，取上层水相（大部分），加0.2g 8-巯基喹啉，混匀。分装25mL/瓶；

（4）氯仿/异戊醇混合液：其配制方法为在2000mLDEPC处理过的烧杯中加入960mL氯仿，加入40mL异戊醇，充分混匀后分装入棕色管中备用。分装5mL/管；

（5）异丙醇：异丙醇，分析纯。分装100mL/瓶；

（6）70%或75%DEPC酒精：其配制方法为在700mL无水乙醇中加入300mL灭菌的DEPC水或在750mL无水乙醇中加入250mL灭菌的DEPC水，充分混匀分装备用。分装100mL/瓶；

（7）灭菌DEPC水：5mL/管×1管；其配制方法为在1000mL三蒸水中加入1mLDEPC，磁力器搅拌过夜，高压灭菌121℃25min；分装5mL/管；

（8）反提萃取液，包含4mol/L异硫氰酸胍、0.05mol/L柠檬酸钠、1mol/L Tris，pH值为8.0。其配制方法为在2000mL灭菌烧杯中加入300mL灭菌三蒸水，加入472.64g异硫氰酸胍，使异硫氰酸胍充分溶解，加入12.90g柠檬酸钠和121.14g Tris，充分溶解后，用盐酸调节pH值至8.0，最后用灭菌三蒸水定容至1000mL，分装5mL/管；

（9）核酸纯化柱：硅胶膜离心吸附柱（微量）(silica spin column for miniprep)，包括50个spin column和100个2mL离心管。该硅胶膜离心吸附柱（微量），型号：60911A-50，购买自北京天恩泽基因科技有限公司。

二、利用所述试剂盒进行同时提取和纯化RNA和DNA的方法

（1）按照标准的要求进行样品的采集。组织样品或者固体样品取2g，用手术剪刀剪碎，加10mL PBS(Ph7.2)，在高压灭菌的研磨中磨碎。离心3000r/min离心10秒取上清100μL加入400μL共提取裂解液中；液体样品直接取100μL，加入400μL溶液A中；

（2）轻微震荡5s，加入40μL2M醋酸钠、400μL水饱和酚、200μL氯仿/异戊醇混合液，置冰上放置10min；

（3）13000r/min 4℃，离心15min，得到上层液相及下层液相；

（4）RNA的提取与纯化：吸取步骤（3）中离心得到的上层液相入另一个无核酸酶的1.5mL灭菌离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，要轻柔，获得混合液体A；

如果对RNA的纯度要求不高，可按照常规操作提取RNA。通常使用的方法例如：将上述混合液体A，13000r/min 4℃，离心15min，弃掉上清，用750μL 70%或75%DEPC酒精洗涤3次，自然干燥3min。加入25μL灭菌DEPC水溶解，即得到动物细菌与病毒的RNA。置-20℃或-80℃保存备用。

如果为了达到更高的纯度要求，还可以利用silica spin column for miniprep，具体方法为：

a.将silica spin column for miniprep置于2mL离心管中，加入上述混合液体A，静置1分钟，12000r/min离心1min（此spin column之最大容量为800μL，若样品体积超过800μL，则需分次加入）；

b.离心后，倒掉离心管流出液，将spin column置回原离心管中，加入750μL70%或75%DEPC酒精，静置5min；

c.13,000r/min离心1分钟，倒掉离心管流出液，将spin column置于原离心管中，重复13,000r/min离心1分钟；

d.将spin column置于另一个干净的1.5mL离心管中，自然干燥3分钟，加入25μL灭菌DEPC水，静置3分钟；

e.13,000r/min离心2分钟，丢弃spin column，此溶液即为提取并纯化好的动物细菌与病毒的RNA，置-20℃或-80℃保存备用；

（5）DNA的提取与纯化：吸取步骤（3）中离心得到的下层液相，加入250μL反提萃取液，颠倒混匀，要轻柔，室温静置10min；13000r/min 4℃，离心15min，吸取上层液相入另一个无核酸酶的1.5mL灭菌离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，要轻柔，室温静置15min，获得混合液体B；

如果对DNA的纯度要求不高，可按照常规操作提取DNA。通常使用的方法例如：13000r/min 4℃，离心15min，弃掉上清，用750μL75%DEPC酒精洗涤3次，自然干燥3min。加入25μL灭菌DEPC水溶解，即得到动物细菌与病毒的DNA。置-20℃或-80℃保存备用。

a.将silica spin column for miniprep置于2mL离心管中，加入上述混合液体B，静置1分钟，12000r/min离心1min（此spin column之最大容量为800μL，若样品体积超过800μL，则需分次加入）；

e.13,000r/min离心2分钟，丢弃spin column，此溶液即为提取并纯化好的动物细菌与病毒的DNA，置-20℃或-80℃保存备用。

实施例5：单独提取DNA与RNA方法与本发明试剂盒提取效果的比较

一、方法

1.核酸浓度及纯度的测定

采用紫外吸收法。分别测定Trizol法、煮沸法和本发明试剂盒方法提取的核酸的纯度具体方法如下：

将每组中提取的5管核酸样品，各取5ul充分混合，每组有25ul混合核酸。取每组1中的混合核酸10ul，用灭菌的DEPC水稀释至1000ml，每组两管。取洁净离心管两支，分别标记为甲乙，分别准确加入1.0mL稀释好的DNA/RNA样液，然后向甲管加入1.0mL蒸馏水，向乙管加入1.0ml过氯酸-钼酸铵沉淀剂，摇匀后置-20℃内30min，使沉淀完全。3000r/min离心10min，各吸取上清液0.5mL转入相应的甲乙两容量瓶内，定容至50mL。以蒸馏水作空白对照，使用紫外光度计分别测定上述甲乙两稀释A₂₆₀值和A₂₈₀。

1)通过的公式数值来计算核酸的浓度：

DNA(ug/mL)=（甲A₂₆₀－乙A₂₆₀）×V_总×D/0.020

RNA(ug/mL)=（甲A₂₆₀－乙A₂₆₀）×V_总×D/0.022

式中甲A₂₆₀:被测稀释液在260nm处的总光密度值；

乙A₂₆₀:加沉淀剂除去大分子核酸后被测稀释液260nm处的光密度值；

两者之差（甲A₂₆₀－乙A₂₆₀）为被测稀释液的光密度值；

V_总:被测试液总体积（mL）

D:样液的稀释倍数。

2)纯度判定方法：从A₂₆₀/A₂₈₀的比值可判断样品的纯度。纯RNA的A₂₆₀/A₂₈₀≥2.0；DNA的A₂₆₀/A₂₈₀≥1.8。当样品中蛋白质含量较高时，则比值下降。RNA和DNA的比值分别低于2.0和1.8时，表示此样品不纯。

2.提取的核酸的实际应用

为了进一步验证试剂盒的核酸提取效果，选取实例2-4提取并保存的核酸作为试验样品。参照赵战勤等（2008）《猪链球菌2型PCR快速检测试剂盒的研制及初步应用》中的方法进行猪链球菌2型PCR检测，参照娄高明等（2002）《RT-PCR快速检测口蹄疫病毒》中的方法进行口蹄疫病毒RT-PCR检测。通过琼脂糖凝胶电泳，比较样品在实际检测中的效果。

二、结果

1.核酸浓度及纯度的测定结果详情见表2。

表2：核酸浓度及纯度测定结果

从表2可以看出，本发明同时提取的DNA和RNA，提取效率（浓度）于传统的单提方法相当，核酸的纯度比传统方法要高。

2.提取的核酸的实际应用

(RT-)PCR检测结果如图1所示，从结果可以看出，本发明同时提取的DNA和RNA可以用于PCR的实际检测中，与传统的Trizol法提取RNA以及煮沸法提取DNA相比，检测结果没有显著差异。

Claims

1.一种同时提取和纯化RNA和DNA的试剂盒，其特征在于，包括共提取裂解液、2M醋酸钠、水饱和酚、氯仿/异戊醇混合液、异丙醇、70%或75%DEPC酒精、灭菌DEPC水、反提萃取液和核酸纯化柱，

其中，所述共提取裂解液包含：4.5mol/L异硫氰酸胍，2g/L十二烷基肌酸钠，体积分数7×10^-6%β-巯基乙醇、3g/L消泡剂-A、0.05mol/L乙二胺四乙酸，pH值为8.0。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述氯仿/异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述反提萃取液包含4mol/L异硫氰酸胍、0.05mol/L柠檬酸钠、1mol/L Tris，pH值为8.0。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸纯化柱为硅胶膜离心吸附柱。

5.利用权利要求1-4任一所述的试剂盒同时提取和纯化RNA和DNA的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)利用共提取裂解液对样品进行裂解得到裂解物；

(2)将裂解物轻微振荡，加入2M醋酸钠、水饱和酚、氯仿/异戊醇混合液，置冰上放置10min；

(3)离心，得到上层液相及下层液相；

(4)吸取步骤(3)中离心得到的上层液相，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，获得混合液体A，然后进行RNA提取与纯化；

(5)吸取步骤(3)中离心得到的下层液相，加入反提萃取液，颠倒混匀，静置，离心，吸取上层液相再加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，静置，获得混合液体B，然后进行DNA提取与纯化；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述RNA提取与纯化的具体方法为：将混合液体A离心，弃上清，用70%或75%DEPC酒精洗涤，干燥后加入灭菌DEPC水溶解，即得。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述RNA提取与纯化的具体方法为：将混合液体A利用核酸纯化柱提取与纯化，得到高纯度的RNA。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述DNA提取与纯化的具体方法为：将混合液体B离心，弃上清，用70%或75%DEPC酒精洗涤，干燥后加入灭菌DEPC水溶解，即得。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述DNA提取与纯化的具体方法为：将混合液体B利用核酸纯化柱提取与纯化，得到高纯度的DNA。