CN101358247B - 用于鉴别ⅰ型鸭肝炎病毒的引物组 - Google Patents
用于鉴别ⅰ型鸭肝炎病毒的引物组 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种I型鸭肝炎病毒的分子生物学鉴别方法，包括处理待检样品、制取样品的RNA、反转录得到样品的cDNA、荧光定量RT-PCR或巢式PCR法鉴定I型鸭肝炎病毒等步骤。本发明具有诊断快速、灵敏性高、且适用范围广的有益效果，可用于从组织样品、棉拭子、鸭或鸡胚尿囊液或细胞培养物中均可鉴定DHV-1。
Description
技术领域
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种I型鸭肝炎病毒(DHV-1)分子鉴别诊断方法。
背景技术
鸭病毒性肝炎是雏鸭的一种传播迅速和高度致死的传染病。肝脏的病变特征是体积增大和有出血斑点，开始发病时的死亡率高达90％以上，造成很大损失。
鸭肝炎由3种不同病毒引起，分别是鸭肝炎病毒(DHV)I、II、III型，最常见的为DHVI型，属肠道病毒；DHVII型呈星状病毒；DHvIII型呈小核糖核酸病毒。DHVI、II、III型有明显差异，各型之间上交叉免疫性。I病毒的大小20～40纳米，能够在发育鸡胚的尿囊内生长繁殖，病毒对外界环境的抵抗力很强，在污染的育雏室内的病毒至少能够生存10周，阴湿处粪便中的病毒能够存活37天。含有病毒的胚液保存在2？4℃冰箱内，700天后仍保持存活。病毒在2％来苏儿溶液中37℃能够存活1小时，在0.1％福尔马林中能够存活8小时。
目前尚未见到I型鸭肝炎病毒的分子生物学鉴别方法的相关技术报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种I型鸭肝炎病毒的分子生物学鉴别方法。
本发明的目的通过以下技术方案来予以实现：
提供一种I型鸭肝炎病毒的分子生物学鉴别方法，包括以下步骤：
(1)处理待检样品；
(2)制取样品的RNA；
(3)反转录得到样品的cDNA；
(4)荧光定量RT-PCR或巢式PCR法鉴定I型鸭肝炎病毒。
步骤(1)所述待检样品为组织样品、棉拭子、鸭/鸡胚尿囊液或细胞培养物。
步骤(4)所述荧光定量RT-PCR法的鉴定方法为：进行荧光PCR反应，在每次循环的延伸时收集荧光信号，根据收集的荧光曲线和Ct值判断结果。
阴性-无Ct值或无扩增曲线，表示样品中无DHV-1；阳性-Ct值小于等于30，且出现典型的扩增曲线，表示样品中有DHV-1；有效原则-Ct值大于30的样品重做，重做无数值者为阴性，否则为阳性；以阳性标准品为参照。
所述荧光定量RT-PCR法的引物序列为：
F：5-CTGTCAGTGCCAGAGGTGCG-3；
R：5-CCAATAATTTTGCGGGTCCC-3；
预计扩增片段约为175bp。
所述荧光定量RT-PCR法的扩增条件为95℃1min，95℃10s，58℃10s，72℃40s，共40个循环。
步骤(4)所述巢式PCR法的鉴定方法为：进行两次PCR反应， 第二次PCR反应结束后，取PCR样品电泳，取凝胶置于紫外灯下观察特异的DNA条带或成像。
在外套PCR中阳性对照在约400bp处有一条特异的DNA条带，阴性对照则无相应的特异条带出现，则外套PCR实验成立；在内套PCR中阳性对照在约250bp处有一条特异的DNA条带，阴性对照则无相应的特异条带出现，则内套PCR实验成立；待检检品在相应位置如出现特异性条带，或者在约400bp出现条带或者仅在约250处出现特异条带，则可判为阳性。
所述巢式PCR法的引物序列为：
PP1：5-AGATATGGCAGGTAGAAGG-3；
PP2：5-TTGCTGTTTGAATGCTTCTGGTCCC-3；
PP3：5-ATgTACCACTgTggTCAATT-3；
PP4：5-TCTTCAgAAATTCTATCTC-3；
其中：PP1和PP2为外套引物，预计扩增片段约为400bp；
PP3和PP4为内套引物，预计扩增片段约为250bp。
所述巢式PCR法的扩增包括两次，分别为：
第一次PCR：94℃，3min；94℃，40s；55℃，30s；72℃，30s，30个循环；72℃，7min；
第二次PCR：以第一次PCR扩增产物为模板，运行94℃，3min；94℃，40s；49℃，30s；72℃，30s，30个循环；72℃，7min。
本发明的有益效果是：公开了一种I型鸭肝炎病毒的分子生物学鉴别诊断方法，该方法具有诊断快速、灵敏性高、且适用范围广的特 点，可用于从组织样品、棉拭子、鸭/鸡胚尿囊液或细胞培养物中均可鉴定DHV-1。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步详细说明本发明。
实施例1
1、处理待检样品；
(1)被检样品
选用肝或肾等组织样品、棉拭子、尿囊液和细胞培养物，被检样品必须新鲜，或者置于低温冰箱(-70℃)保存。
A组织样品的处理
往1～3g肝或肾等组织样品中加适量灭菌的0.85％生理盐水研磨成5～10倍悬浮液，反复冻融2～3次后，4000g离心10min，取上清液作核酸抽提用。
B棉拭子的处理
将棉拭子充分捻动拧干后除去拭子，0.5mL样品液经4000g离心10min，取上清液作核酸抽提用。
C细胞培养物
取1mL细胞培养物反复冻融2～3次后，4000g离心10min，取上清液作核酸抽提用。
D阴性尿囊液：
10d鸭/鸡胚尿囊液。
E阳性病毒液：
DHV-1R株接种10d鸭/鸡胚，孵育48～72h后收获的尿囊液。(2)RNA分离试剂盒，华美生物工程公司的RNA分离试剂盒(III)(目录号MK0043)，或Invitrogen公司的Trizol LS Reagent(目录号10296010)；灭菌1.5mL离心管；无RNase水；纯氯仿(分析纯以上级)；无RNase水配制的75％乙醇。
2、制取样品的RNA；
以华美生物工程公司的RNA分离试剂盒(III)为例：
(1)取100μL1.1.1中的上清液或尿囊液置于一灭菌的1.5mL离心管中同时设立阴性尿囊液或阴性细胞培养液和A/Goose/Guangdong/FSh54/1996(H5N1)阳性病毒液为对照，再分别加入900μL冰冷的裂解液，剧烈混合样品15s，室温放置5min；
(2)加入200μL纯氯仿，颠倒离心管混合2次，剧烈混合10s，4℃10000g离心15min；
(3)吸取500μL上层水相于新1.5mL灭菌离心管中，加入500μL异丙醇，4℃放置10min，4℃10000g离心15min；
(4)小心弃去全部上清液，加入1mL无RNase水配制的75％乙醇，上下轻缓颠倒两次，4℃7500g离心5min；
(5)弃去全部上清，风干5～10min，即制得RNA。
3、反转录得到样品的cDNA；
(1)材料准备
反转录酶Reverse transcriptase XL(AMV)(目录号D2620)、核糖核酸酶抑制剂(RNasin)(目录号D2310A)、dNTP Mixture(目 录号D4030A)均来自宝生物(大连)有限公司；反转录引物为随机引物和oligo(T)按3：1比例的混合物；1.5mL灭菌PCR管。
(2)操作方法
(A)在一个洁净的1.5mL灭菌PCR管中依次加入无RNase水6.25μL，5×AMV buffer2μL，dNTP Mixture2μL，反转录引物(CU)1μL(20pmol)，核糖核酸酶抑制剂RNasin0.25μL(10U)，反转录酶AMV0.5μL(2.5U)，轻缓混匀；
(B)用3.2.1中的反转录混合液重悬2.2.5中制备的RNA；
(C)置于室温10min；
(D)放入42℃水浴1h，取出冰浴2min，所得的反应液即为反转录产物cDNA，将cDNA置于-20℃保存或直接做PCR扩增。
4、荧光定量RT-PCR或巢式PCR法鉴定I型鸭肝炎病毒。
(1)材料准备
荧光定量PCR仪，普通PCR仪，SYBRGreen I Realtime PCRMaster Mix、EX-Taq酶(目录号DRR001A)来自宝生物(大连)有限公司；dNTP Mixture(目录号D4030A)，100bp DNA分子量标准(目录号D505A)来自宝生物(大连)有限公司；0.5mL灭菌离心管；2.0％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL EB)。
PCR扩增引物
荧光定量RT-PCR引物浓度分别为20pmol/μL：
F：5-CTGTCAGTGCCAGAGGTGCG-3；
R：5-CCAATAATTTTGCGGGTCCC-3；
预计扩增片段约为175bp。
巢式PCR引物浓度分别为25pmol/μL
PP1：5-AGATATGGCAGGTAGAAGG-3；
PP2：5-TTGCTGTTTGAATGCTTCTGGTCCC-3；
PP3：5-ATgTACCACTgTggTCAATT-3；
PP4：5-TCTTCAgAAATTCTATCTC-3。
其中：PP1和PP2为外套引物，预计扩增片段约为400bp；
PP3和PP4为内套引物，预计扩增片段约为250bp。
(2)操作方法
(一)、巢式PCR
(A)在一个洁净的0.5mL灭菌PCR管中依次加入无RNase水19.3μL，10×EX-Taq buffer2.5μL，dNTP Mixture1μL，PP1、PP2各为0.5μL，EX-Taq酶0.2μL(2.5U)，轻缓混匀；
(B)加入1μL3.2.4步骤中制备的cDNA，轻缓混匀；
(C)第一次PCR：置于PCR仪中运行94℃，3min；94℃，40s；55℃，30s，；72℃，30s，30个循环；72℃，7min。同时设立以DHV-1R株的阴性细胞培养液cDNA为模板的阳性DHV-1病毒对照和阴性尿囊液或阴性细胞培养液阴性细胞培养液cDNA为模板的阴性AIV病毒对照。
第二次PCR：
以第一次PCR扩增产物为模板，置于PCR仪中运行94℃，3min；94℃，40s；49℃，30s；72℃，30s；30个循环；72℃，7min。
(D)PCR产物的检测
待步骤(C)第二次PCR反应结束后，每个PCR样品取5μL于2.0％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL EB)孔中电泳，同时加入5μL标准100bpDNA分子量标准电泳作为参照。在75V恒压电泳30min，取凝胶置于紫外灯下观察或成像。
(E)若(D)中结果为阳性则将产物做相应倍数的稀释；若结果为阴性，则直接将产物直接作为模板进行内套PCR扩增(引物为PP3/PP4)，同时设立阴性对照。
(F)判定
在外套PCR中阳性对照在约400bp处有一条特异的DNA条带，阴性对照无相应的特异条带出现，则外套PCR实验成立。
在内套PCR中阳性对照在约250bp处有一条特异的DNA条带，阴性对照无相应的特异条带出现，则内套PCR实验成立。
待检检品在相应位置如出现特异性条带，或者在约400bp出现条带或者仅在约250处出现特异条带，则均可判为阳性。
(G)进一步验证
可将获得的大小约为400bp或250bp的PCR产物回收按照常规方法纯化后测序，将测序结果提交NCBI进行BLAST分析。BLAST结果显示：大小约为400bp或者大小约为250bp的测定序列与GenBank中注册的DHV-1序列同源性最高，可进一步确证检测结果阳性。
(二)、荧光定量RT-PCR
(1)扩增试剂准备
从试剂盒中取出相应的荧光PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2000r/min离心5s。设所需要荧光PCR检测总数为n，其中n为被检样品、阳性样品与阴性样品的和，每个样品测试反应体系配制见表1所示：
表1实时定量PCR反应体系
根据实验常规，按照测试样品的数量计算好各试剂的使用量，加到适当体积荧光PCR管中，充分混匀，向每管中分装23μL反应混合物液体(cDNA模板此步骤暂时不装入)。
(2)加样
在各设定的荧光PCR管放入步骤3(D)所述cDNA溶液各2μL，盖紧管盖，500r/m离心30s。
(3)荧光PCR检测
将上一步(2)离心后的PCR管放入到荧光PCR检测仪中，记录样品摆放顺序。
循环条件设置：95℃1min，95℃10s，58℃10s，72℃40s；共40个循环。在每次循环的延伸时收集荧光信号。试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判断结果。
荧光PCR扩增曲线可以分三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在明显线性关系，选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上任意设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，在本实验中荧光阈值是通过ABI7500system SDSsoftware(Sequence Detection Software--Version1.2.2)软件自动优化选择的。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值。CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线，其中横坐标代表CT值，纵坐标代表起始拷贝数的对数。因此只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
(4)结果判定
直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器躁声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
质控标准：
阴性样品无Ct值或无扩增曲线。阳性对照的Ct值应小于30，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。
结果描述及判断
阴性：无Ct值或无扩增曲线，表示样品中无DHV-1。
阳性：Ct值应小于等于30，且出现典型的扩增曲线，表示样品中有DHV-1。
有效原则：Ct值大于30的样品建议重做，重做无数值者为阴性，否则为阳性。
Claims (3)
1.一组引物在制备用于分子生物学方法鉴别I型鸭肝炎病毒的试剂中的应用，其特征在于应用于荧光定量RT-PCR法，所述引物为：
F：5-CTGTCAGTGCCAGAGGTGCG-3，
R：5-CCAATAATTTTGCGGGTCCC-3。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述引物F和R对反转录样品RNA所得到的cDNA进行荧光定量RT-PCR反应，在每次循环的延伸时收集荧光信号，根据收集的荧光曲线和Ct值判断结果。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述荧光定量RT-PCR反应的扩增条件为95℃1min，95℃10s，58℃10s，72℃40s，共40个循环。
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