CN104862425B - 鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式rt-pcr检测试剂盒 - Google Patents

鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式rt-pcr检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT‑PCR检测试剂盒，该试剂盒含有两对特异性引物。本发明具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点，应用本发明可建立鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT‑PCR检测方法，实现同时检测和鉴别鸭甲肝病毒1型和3型两种病原体，既可以节约时间的成本，又可以减少污染。

Description

鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测试剂盒
技术领域
本发明属于RT-PCR检测技术领域，尤其涉及一种鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测试剂盒。
背景技术
鸭肝炎是鸭肝炎病毒(DHV)引起的一种传播迅速并对雏鸭具有高度致死性的病毒病，以肝脏肿大及出血为主要发病症状。DHV根据血清型曾被分为Ⅰ型DHV(DHV-1)、Ⅱ型DHV(DHV-2)和Ⅲ型DHV(DHV-3)，但后来又发现，血清Ⅰ型鸭肝炎病毒还存在两个变种，分别是“台湾NDHV”变异株和“韩国NDHV”变异株，且这两个变异株均不与血清Ⅰ型DHV产生交叉中和反应。最新分类将血清Ⅰ型DHV及其变异株重新更名为鸭甲肝病毒(DHAV)，而原来的血清Ⅱ型和Ⅲ型DHV则被更名为鸭星状病毒1型(DAstV-1)和鸭星状病毒2型(DAstV-2)，归属为星状病毒科。传统的血清Ⅰ型DHV和“台湾NDHV”、“韩国NDHV”则被分类为DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3。
目前，我国流行的DHAV主要为DHAV-1和DHAV-3，由于DHAV-1和DHAV-3所导致的鸭病毒性肝炎临床症状和病理变化非常相似，常常不能正确诊断和有效防控而给养殖业造成巨大经济损失。虽然对DHAV-1和DHAV-3传统的检测方法主要有病毒分离、血清学试验、琼脂扩散试验和酶联免疫吸附试验等，但这些方法存在耗时长、敏感性差、难标准化等局限性，更不能有效鉴别是何种DHAV所造成的感染。
PCR技术实现了对模板的定量检测，而且具有敏感、特异、准确可靠、能实现多重反应等特点。在实际应用中，当样品量非常大时，单重PCR在成本和时间方面就存在一定的劣势，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量的快速检测。二温式PCR是根据经典PCR技术原理，对标准PCR进行改进，把退火和延伸合并为一个温度，比标准PCR退火温度高，不仅提高了反应的特异性，更大大缩短了检测时间。然而，建立二重PCR方法比单重要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要保证不同引物间无相互干扰。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种操作简便、敏感性高、特异性强、重复性好的鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测试剂盒，以实现同时检测和鉴别鸭甲肝病毒1型和3型两种病原体。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测引物组，包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。
引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为0.5-1∶0.5-1∶1∶1。
引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为1∶1∶1∶1。
上述鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测引物组在PCR扩增方面的非诊断应用，PCR扩增的退火温度为60.0-70.0℃。
PCR扩增的退火温度为65℃。
鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒含有以下试剂：
A液：PCR反应液，含2×Taq PCR Mix(购自全式金.AS111-12)、DHAV-1上下游引物、DHAV-3上下游引物、ddH2O，DHAV-1上下游引物分别是引物1和2，DHAV-3上下游引物分别是引物3和4，引物1至4分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列；
B液：DHAV-1+DHAV-3模板，作为阳性对照；
C液：ddH2O，作为阴性对照。
PCR反应液含2×Taq PCR Mix 12.5μL、DHAV-1上下游引物各0.5μl、DHAV-3上下游引物各0.5μl、ddH2O 7.5μL，其中各引物浓度均为25μmol/mL；B液含DHAV-1+DHAV-3模板共3μL，C液为2μL ddH2O。
上述鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测试剂盒在PCR扩增方面的非诊断应用，PCR扩增的退火温度为60.0-70.0℃。
PCR扩增的退火温度为65℃。
针对目前缺乏对鸭甲肝病毒1型和3型同时进行检测和诊断的有效可靠的技术，发明人研究设计了两对特异性引物，据此建立了鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。本发明具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点，应用本发明可同时检测和鉴别鸭甲肝病毒1型和3型两种病原体，既可以节约时间的成本，又可以减少污染。
附图说明
图1是二重PCR敏感性试验结果电泳图，图中：M.100bp DNA ladder，1.DHAV-1cDNA+DHAV-3cDNA(等体积混合)，2.DHAV-1cDNA，3.DHAV-3cDNA，4.H5AIV的cDNA，5.H9AIV的cDNA，6.番鸭呼肠孤病毒的cDNA，7.番鸭细小病毒的DNA，8.鸭圆环病毒DNA，9.鸭副粘病毒的cDNA，10.鸭瘟病毒的DNA，11.阴性对照(ddH2O)。
图2是二重PCR特异性试验结果电泳图，图中：M.100bp DNA ladder，1.49ng DHAV-1cDNA和75ng DHAV-3cDNA，2.4.9ng DHAV-1cDNA和7.5ng DHAV-3cDNA，3.490pg DHAV-1cDNA和750pg DHAV-3cDNA，4.49pg DHAV-1cDNA和75pg DHAV-3cDNA，5.4.9pg DHAV-1cDNA和7.5pg DHAV-3cDNA，6.0.49pg DHAV-1cDNA和0.75pg DHAV-3cDNA。
图3是二重PCR部分临床样品检测结果电泳图，图中：M.100bp DNA ladder，1阳性对照(DHAV-1cDNA+DHAV-3cDNA)，2-17分别为部分有目的条带的鸭病料检测结果。
具体实施方式
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下：
鸭瘟病毒AV1221购自中国兽医药品监察所。
鸭肝炎病毒(DHAV-1)记载在“鸭Ⅰ型肝炎病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立”，中国预防兽医学报，2012，34(2):112-115，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
鸭肝炎病毒(DHAV-3)记载在“新型鸭肝炎病毒的分离与初步鉴定”，广西畜牧兽医，2003，19(5):198-199，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
番鸭细小病毒记载在“广西番鸭细小病毒的分离和鉴定”，广西畜牧兽医，2002，18(6):5-7，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
鸭圆环病毒记载在“广西部分地区鸭圆环病毒感染情况调查”，中国畜牧兽医，2010，37(11):156-158，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
鸭副粘病毒(鸭新城疫)记载在“鸭新城疫病毒和鸭圆环病毒二重PCR检测方法的建立”，中国动物检疫，2012，29(5)：34-37，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
番鸭呼肠孤病毒记载在“番鸭花肝病病原的研究”，中国兽医科技，2003,5(33)：7-8，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
H5亚型禽流感病毒记载在“H5亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测技术的建立”，南方农业学报，2013,02:323-327，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
H9亚型禽流感病毒记载在“多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流感病毒方法的建立”，中国人兽共患病学报，2006，(09):858-860，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
试剂：100bp Marker ladder、2×Taq PCR Mix、DNA/RNA提取试剂盒、反转录试剂均购自北京全式金生物技术有限公司；胶回收试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司；pMD18T vector试剂盒购自大连宝生物公司。
实施例1、引物的设计与合成
根据GenBank中DHAV-13C基因与DHAV-3的VP0基因的保守序列，利用DNAStar软件进行多序列比对，在保守区用primer 5.0设计引物。引物(见表1)由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
表1引物信息
实施例2、二重二温室RT-PCR检测方法的建立
一、核酸的提取及RNA的反转录
参照DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭瘟病毒的DNA，同时对H5、H9、番鸭呼肠孤病毒、鸭副粘病毒、鸭肝炎病毒的RNA进行抽提，并按反转录说明书将RNA反转录成cDNA，具体如下：采用10μL体系，于EP管中依次加入2μL 5×反转录缓冲液、10mmol/L dNTP 1μL、5U/μLAMV 0.5μL、20U/μL RNA酶抑制剂0.5μL、自由引物0.5μL、待检总RNA模板2μL，用无RNA酶的灭菌水补足体积为10μL，瞬离后置PCR仪中，42℃1h、99℃5min，制备的cDNA置-30℃保存备用。
二、二重RT-PCR扩增体系的建立
总反应体积为25μL，其中2×PCR Master Mix 12.5μL，DHAV-1cDNA和DHAV-3cDNA共3μL作为混合模板，引物DHAV-1-F、DHAV-1-R各加入0.5μL，DHAV-3-F、DHAV-3-R各加入0.5μL，最后用双蒸水补至25μL。对二重二温室RT-PCR的各引物浓度进行优化及PCR反应的各参数(温度、时间)进行优化，以筛选出二重二温室RT-PCR反应体系中最佳的反应模式。
对DHAV-1引物、DHAV-3引物、模板等用量进行优化，多次重复试验后，最终确定二重二温室RT-PCR反应体系为25μL：2×PCR Master Mix(北京全式金，AS111-12)12.5μL、DHAV-1上下游引物各0.5μl(引物浓度均为25μmol/mL，在反应体系中的终浓度均为0.5μmol/mL)、DHAV-3上下游引物各0.5μL(引物浓度均为25μmol/mL，在反应体系中的终浓度均为0.5μmol/mL)、DHAV-1+DHAV-3模板共3μL，加水至25μL。
按照上述反应体系，模板为DHAV-1和DHAV-3的cDNA等体积混合物，将退火温度按60.0℃-70℃依次递增，多次重复试验后确定最佳退火温度。最终确定最佳的反应条件：94℃3min；94℃30s；65℃30s，35个循环；72℃10min。
三、二重二温室RT-PCR特异性试验
按照上述二优化的PCR反应体系和优化的反应条件进行二重二温室PCR扩增，不同的模板分别如下：
DHAV-1的cDNA+DHAV-3的cDNA(等体积混合)、提取番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭瘟病毒的DNA，H5、H9、番鸭呼肠孤病毒、鸭副粘病毒、鸭肝炎病毒的cDNA。结果如图1所示，可见，1-3有632bp和370bp的目的片段，其余均没有目的片段。说明，本发明的引物和方法有高特异性，可应用于鉴定未知样本是否感染鸭甲肝病毒1型和鸭甲肝病毒3型：若得到632bp的片段，则样本中含有鸭甲肝病毒1型病毒，反之则没有；若得到370bp的片段，则样本中含有鸭甲肝病毒3型病毒，反之则没有。
四、二重二温室RT-PCR的敏感性试验
用DU 800紫外分光光度计测得鸭甲肝病毒1型和鸭甲肝病毒3型的核酸浓度分别为49ng/μl和75ng/μl，将二者分别进行10倍梯度稀释后等体积混合作为模板，按照上述二优化的PCR反应体系和优化的反应条件进行二重二温室RT-PCR扩增，结果如图2所示，可见，1-5均有目的片段扩出，因此建立的二重二温室RT-PCR方法对鸭甲肝病毒1型病毒的核酸最低检出限为4.9pg；对鸭甲肝病毒3型病毒的核酸最低检出限为7.5pg。
实施例3、检测试剂盒的组装
根据实施例1和2的研究结果，组装检测试剂盒以方便使用。
A液：PCR反应液，含2×Taq PCR Mix(购自全式金.AS111-12)12.5μL，DHAV-1上下游引物各0.5μl(引物浓度均为25μmol/mL，在反应体系中的终浓度均为0.5μmol/mL)、DHAV-3上下游引物各0.5μl(引物浓度均为25μmol/mL，在反应体系中的终浓度均为0.5μmol/mL)、ddH2O 7.5μL；
B液：DHAV-1+DHAV-3模板共3μL，作为阳性对照；
C液：ddH2O 2μL，作为阴性对照。
实施例4、二重PCR检测临床样本
取实验室采集的183份鸭病料，提取鸭病料的RNA，并将RNA反转录得到cDNA。分别将上述cDNA作为模板，按照实施例二优化的PCR反应体系和优化的反应条件进行二重二温室RT-PCR扩增。参考上述诊断标准，若得到632bp的片段，则样本中含有鸭甲肝病毒1型病毒，反之则没有；若得到370bp的片段，则样本中含有鸭甲肝病毒3型病毒，反之则没有。
部分扩增结果如图3所示，可见，10有632bp目的片段，4、14有370bp目的片段，其余均无其他目的片段，183份鸭病料中检出7份DHAV-1，含有DHAV-1的感染率为3.8％(7/183)，183份鸭病料中检出9份DHAV-3，含有DHAV-3的感染率为4.9％(9/183)。

Claims (8)

1.鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测引物组，其特征在于包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别为序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列，所述引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为0.5-1∶0.5-1∶1∶1。
2.根据权利要求1所述的鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测引物组，其特征在于：所述引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为1∶1∶1∶1。
3.权利要求1所述鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测引物组在PCR扩增方面的非诊断应用，其特征在于：所述PCR扩增的退火温度为60.0-70.0℃。
4.根据权利要求3所述的非诊断应用，其特征在于：所述PCR扩增的退火温度为65℃。
5.一种鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有以下试剂：
A液：PCR反应液，含2×Taq PCR Mix、DHAV-1上下游引物、DHAV-3上下游引物、ddH2O，DHAV-1上下游引物分别是引物1和2，DHAV-3上下游引物分别是引物3和4，引物1至4分别为序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列；所述引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为0.5-1∶0.5-1∶1∶1；
B液：DHAV-1+DHAV-3模板，作为阳性对照；
C液：ddH2O，作为阴性对照。
6.根据权利要求5所述的鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述PCR反应液含2×Taq PCR Mix 12.5μL、DHAV-1上下游引物各0.5μl、DHAV-3上下游引物各0.5μl、ddH2O 7.5μL，其中各引物浓度均为25μmol/mL；所述B液含DHAV-1+DHAV-3模板共3μL，所述C液为2μL ddH2O。
7.权利要求6所述鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测试剂盒在PCR扩增方面的非诊断应用，其特征在于：所述PCR扩增的退火温度为50.0-60.1℃。
8.根据权利要求7所述的非诊断应用，其特征在于：所述PCR扩增的退火温度为65℃。
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