CN113528619A - 一种提取肺泡灌洗液全核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提取肺泡灌洗液全核酸的方法，包括以下步骤：1)肺泡灌洗液中加入Buffer CDL，以及蛋白酶K，消化处理；2)将消化处理后液体冷却至室温，加入Tracer，再加入预冷的异丙酮，混匀，离心处理，弃上清，留沉淀；3)往沉淀中加入Buffer CDB，在液面下加入BufferCDD，混匀；4)加入无水乙醇，涡旋振荡混匀；5)液体移入微量核酸吸附柱中，离心，倒掉收集管中的液体；6)往微量核酸吸附柱中加入Buffer CW1，离心，倒掉收集管中的液体；7)往微量核酸吸附柱中加入Buffer CW2，离心，倒掉收集管中的液体；8)换用新的收集管容纳微量核酸吸附柱，再离心；9)将微量核酸吸附柱套在离心管中，开盖孵育；10)往微量核酸吸附柱滴加Buffer CDE，闭盖孵育，离心，收集样品全核酸。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种提取肺泡灌洗液全核酸的方法。
背景技术
核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，根据化学组成不同，核酸可分为脱氧核糖核酸(简称DNA)和核糖核酸(简称RNA)。DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础。RNA在蛋白质合成过程中起着重要作用，因而核酸在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中起决定性的作用。核酸的研究可从本质上揭示微生物的结构、组成，甚至是致病机理的神秘面纱，可以更有效的研究如何预防、治疗由此产生的疾病，因此，对核酸的研究有着至关重要的意义。
肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage，BAL)是诊断呼吸道疾病的重要检查手段，高效、高质的获取BAL，有助于诊断支气管肺癌、间质性肺疾病(ILD)、肺部感染等呼吸系统疾病。
现有的提取肺泡灌洗液中核酸的方法都是需要采用分别用提取DNA或者RNA的商品化试剂盒进行提取(refrence:[1]张新宇,江峥增,李春,叶茂松,胡沁,赵彦程,张道允,巩子英,侯英勇,张新.支气管冲洗液辅助现场快速评估为阴性的肺癌进行表皮生长因子受体基因检测的临床应用价值[J].中华病理学杂志,2018,47(12):915-919.)，无法实现同一份标本中既提取DNA又提取RNA。
发明内容
针对现有技术中肺泡灌洗液只能分别提取DNA或RNA的现状，本发明提供一种提取肺泡灌洗液全核酸的方法。
本发明的方法可以同时提取肺泡灌洗液中的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明提供一种提取肺泡灌洗液全核酸的方法，包括以下步骤：
1)肺泡灌洗液中加入Buffer CDL，以及蛋白酶K，充分混匀，消化处理；
2)将步骤1)消化处理后液体冷却至室温，加入Tracer，混匀后，再加入预冷的异丙酮，混匀，离心处理，弃上清，留沉淀；
3)往沉淀中加入Buffer CDB，在液面下加入BufferCDD，混匀；
4)步骤3)所得物中加入无水乙醇，涡旋振荡混匀；
5)步骤4)所得液体移入微量核酸吸附柱中，离心，倒掉收集管中的液体；
6)往微量核酸吸附柱中加入Buffer CW1，离心，倒掉收集管中的液体；
7)往微量核酸吸附柱中加入Buffer CW2，离心，倒掉收集管中的液体；
8)换用新的收集管容纳微量核酸吸附柱，再离心；
9)将微量核酸吸附柱套在离心管中，开盖孵育；
10)往微量核酸吸附柱的核酸吸附膜中心滴加Buffer CDE，闭盖孵育，离心，收集样品全核酸。
在本发明的一个实施方式中，步骤1)中，Buffer CDL加入的量为：4-8ml BufferCDL/10ml肺泡灌洗液，优选为6ml Buffer CDL/10ml肺泡灌洗液。
在本发明的一个实施方式中，步骤1)中，蛋白酶K加入的量为：400-600ul蛋白酶K/10ml肺泡灌洗液，优选为500-550ul蛋白酶K/10ml肺泡灌洗液。
步骤1)中加入Buffer CDL以及蛋白酶K是为了进行细胞的裂解，以释放核酸。
在本发明的一个实施方式中，步骤1)中，消化处理的条件为60℃消化20min。
在本发明的一个实施方式中，步骤1)中，消化处理是在水浴条件下进行的。
在本发明的一个实施方式中，步骤2)中，加入Tracer的量为：以初始肺泡灌洗液的量计，800-1200ul Tracer/10ml肺泡灌洗液，优选为1000ul Tracer/10ml肺泡灌洗液。
在本发明的一个实施方式中，步骤2)中，加入异丙酮的量为：以初始肺泡灌洗液的量计，6-10ml异丙酮/10ml肺泡灌洗液，优选为8-9ml异丙酮/10ml肺泡灌洗液。
步骤2)中加入Tracer以及预冷的异丙酮是为了使核酸沉淀。
在本发明的一个实施方式中，步骤2)中加入异丙酮推荐预冷方式为：使用前一天将异丙酮放入-20℃冰箱预冷，预冷后的异丙酮核酸沉淀效果更好，用-20℃预冷异丙酮沉淀效果较等体积乙醇沉淀好；异丙酮约和2.5倍体积的无水乙醇效果相当；但DNA微溶于无水乙醇，使用无水乙醇沉淀会使部分DNA溶解损失；所以选用-20℃预冷异丙酮。一般6500倍到8000倍重力10分钟就可以将异丙酮沉淀的核酸紧密的分离到管底。
在本发明的一个实施方式中，步骤2)中，离心的条件为：10000g离心5min。
在本发明的一个实施方式中，步骤3)中，加入Buffer CDB的量为：以初始肺泡灌洗液的量计，1000-1300ul Buffer CDB/10ml肺泡灌洗液，优选为1100-1200ul Buffer CDB/10ml肺泡灌洗液。
在本发明的一个实施方式中，步骤3)中，加入Buffer CDD的量为：以初始肺泡灌洗液的量计，80-120ul Buffer CDD/10ml肺泡灌洗液，优选为100ul Buffer CDD/10ml肺泡灌洗液。
步骤3)中加入Buffer CDB、BufferCDD是为了将所得混合物沉淀溶解。
在本发明的一个实施方式中，步骤3)中，混匀实现的方式为：放在涡旋混匀仪上，2500rpm室温振荡混匀15min。
在本发明的一个实施方式中，步骤4)中，加入无水乙醇的量为：以初始肺泡灌洗液的量计，800-1200ul无水乙醇/10ml肺泡灌洗液，优选为1000ul无水乙醇/10ml肺泡灌洗液。
步骤4)中加入无水乙醇是为了使核酸沉淀。
在本发明的一个实施方式中，步骤5)中，微量核酸吸附柱购自于厦门艾德生物医药科技股份有限公司货号为8.0226201X024G的核酸提取试剂中的吸附柱。
在本发明的一个实施方式中，步骤5)中，10000g离心30s。
在本发明的一个实施方式中，步骤6)中，Buffer CW1加入的量为：以初始肺泡灌洗液的量计，1600-2000ul Buffer CW1/10ml肺泡灌洗液，优选为1700-1800ul Buffer CW1/10ml肺泡灌洗液。
在本发明的一个实施方式中，步骤7)中，Buffer CW2加入的量为：以初始肺泡灌洗液的量计，1600-2000ul Buffer CW2/10ml肺泡灌洗液，优选为1700-1800ul Buffer CW2/10ml肺泡灌洗液。
步骤6、7)中BufferCW1和BufferCW2实为不同浓度的乙醇溶液，加入Buffer CW1、Buffer CW2是为了清洗微量核酸吸附柱的吸附膜上除了核酸以外的杂质，比如蛋白质等。
在本发明的一个实施方式中，步骤6)中，10000g离心30s。
在本发明的一个实施方式中，步骤7)中，10000g离心30s。
在本发明的一个实施方式中，步骤9)中，微量核酸吸附柱购自于厦门艾德生物医药科技股份有限公司货号为8.0226201X024G的核酸提取试剂中的吸附柱。
在本发明的一个实施方式中，步骤9)中，孵育的条件为：56℃，开盖孵育2min。孵育的目的是为了使膜上的乙醇蒸发使吸附膜干燥。
在本发明的一个实施方式中，步骤10)中，微量核酸吸附柱购自于厦门艾德生物医药科技股份有限公司货号为8.0226201X024G的核酸提取试剂中的吸附柱。
在本发明的一个实施方式中，步骤10)中，孵育的条件为：56℃，闭盖孵育2min。步骤10)中，孵育的目的是使吸附膜上的核酸更好的溶解在Buffer CDE中。
在本发明的一个实施方式中，步骤10)中，离心的条件为：13000g离心1min。
在本发明的一个实施方式中，步骤10)中，离心后收集的样品为离心到管底的液体，即为全核酸。
在本发明的一个实施方式中，步骤10)中，离心后收集的样品全核酸建议马上使用，如超过6h未使用，于-20℃以下保存。
本发明以上技术方案中，Buffer CDL、Tracer、Buffer CDB、Buffer CDD、BufferCW1、Buffer CW2、Buffer CDE试剂均为购自于厦门艾德生物医药科技股份有限公司货号为8.0226201X024G的核酸提取相关试剂，本发明通过调控不同试剂的用量将这些试剂用于肺泡灌洗液的提取中，并获得全核酸。
现有技术的肺泡灌洗液提取方法是脱氧核糖核酸和核糖核酸分开提取，且肺泡灌洗液需要离心后取上清液进行提取，操作复杂且需2倍的样本。由于肺泡灌洗液样本珍贵，且多为晚期肺癌患者，取样困难，如果分开提取需抽取大量灌洗液，增加患者的痛苦。同时，大多数患者都有进行后续基因检测的需求，因此需要提高肺泡灌洗液中核酸的提取效率，最大程度节约标本，并且同时获取DNA和RNA，以为后续试验做铺垫。
本发明的方法，对收到肺泡灌洗液样本无需离心，混匀后即可采用同血浆抽提的方法进行抽提，其中第一步酶的消化时间进行了延长，无需加入DNA或RNA酶进行消化，最终洗脱的核酸即为全核酸(DNA/RNA)，且试验证明提出的全核酸(DNA/RNA)足以满足后续基因检测需求。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明的方法无需对肺泡灌洗液样品进行离心，可直接提取，操作简便且仅需一份样本即可同时获得足够的全核酸(DNA/RNA)，以便进行后续的基因检测。
本发明方法仅需一份标本及可获得含有DNA/RNA的全核酸，并且由于后续的检测无需将RNA和DNA部分完全分开，固DNA/RNA的全核酸抽提就可以满足检测需求。
本发明方法的亮点主要是改进了原本的血浆提取的方案，并应用于肺泡灌洗液的提取，本发明方法最大程度的节约了肺泡灌洗液标本，且可同时提取全核酸(DNA/RNA)为后续基因检测做铺垫。
本发明未采用DNAase和RNAase的消化，且最大程度的利用了标本，固实现了DNA和RNA的同时提取。
附图说明
图1为实施例1中所得全核酸用于厦门艾德公司的“五种突变基因检测”试剂盒检测，ALK阳性RNA部分HEX信号；
图2为实施例1中所得全核酸用于厦门艾德公司的“五种突变基因检测”试剂盒检测，ALK阳性RNA部分FAM信号；
图3为实施例1中所得全核酸用于厦门艾德公司的“五种突变基因检测”试剂盒检测，EGFR基因第19号外显子存在点突变。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
以下实施例中，Buffer CDL、Tracer、Buffer CDB、Buffer CDD、Buffer CW1、Buffer CW2、Buffer CDE试剂均为购自于厦门艾德生物医药科技股份有限公司货号为8.0226201X024G的核酸提取相关试剂，微量核酸吸附柱购自于厦门艾德生物医药科技股份有限公司货号为8.0226201X024G的核酸提取试剂中的吸附柱。
实施例1
本实施例提供一种提取肺泡灌洗液全核酸的方法，包括以下步骤：
1.移取4ml肺泡灌洗液(具体为在CT引导下靶向冲洗肺癌患者病灶区域所得的液体，无需离心标本混匀后直接吸取)，加入10ml圆底离心管中，加入2.4ml Buffer CDL，再加入210ul Digestion solution蛋白酶K，充分混匀10s；
2.放入水浴锅中，60℃消化20min。
3.快速冷却至室温，加入400ul Tracer，混匀后，再加入3.3ml预冷的异丙酮，上下颠倒混匀20次，立即10000g离心5min；
4.从离心机中取出离心管，弃上清，留沉淀，并用移液枪吸干残留的液体；
5.往沉淀中加入470ulBuffer CDB，在液面下加入40ulBufferCDD。
6.放在涡旋混匀仪上，2500rpm室温振荡混匀15min。
7.取出离心管，往离心管中加入250ul无水乙醇，涡旋振荡混匀5s；
8.将全部液体移入微量核酸吸附柱中，10000g离心30s，倒掉收集管中的液体；
9.往微量核酸吸附柱中加入700ul Buffer CW1，10000g离心30s，倒掉收集管中的液体；
10.往微量核酸吸附柱中加入700ul Buffer CW2，10000g离心30s，倒掉收集管中的液体；
11.换用新的收集管，13000g离心1min，丢弃收集管；
12.将吸附柱套在1.5ml离心管中，56度开盖孵育2min；
13.往核酸吸附膜中心滴加50ul-100ulBuffer CDE，56度闭盖孵育2min，13000g离心1min；
14.收集样品全核酸(DNA/RNA)并保存。所提取的全核酸建议马上使用，如超过6h未使用，于-20度以下保存。
用nanodrop进行定量，测量DNA及RNA，OD值处于1.8-2.0为核酸质量合格。将所得全核酸用于厦门艾德公司的“五种突变基因检测”试剂盒检测，所得结果如下：
RNA：图1中线条为HEX信号，4孔均升起说明RNA质量良好，图2中线条表示FAM信号有升起，说明ALK/ROS1有阳性，结果如图1、2所示；
DNA：如图3所示，线条1为外控，升起说明DNA质量良好，曲线2升起说明该样本DNA部分存在点突变。
RNA部分HEX信号为RNA的管家基因，其信号升起说明核酸中有RNA且质量良好，并且有RNA部分的FAM信号有升起，说明其中RNA片段的有效性，进一步证明RNA的质量，DNA部分有阳性信号的升起说明模版中含有DNA且DNA片段具有有效性，证明DNA的质量良好。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种提取肺泡灌洗液全核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)肺泡灌洗液中加入Buffer CDL，以及蛋白酶K，充分混匀，消化处理；
2)将步骤1)消化处理后液体冷却至室温，加入Tracer，混匀后，再加入预冷的异丙酮，混匀，离心处理，弃上清，留沉淀；
3)往沉淀中加入Buffer CDB，在液面下加入BufferCDD，混匀；
4)步骤3)所得物中加入无水乙醇，涡旋振荡混匀；
5)步骤4)所得液体移入微量核酸吸附柱中，离心，倒掉收集管中的液体；
6)往微量核酸吸附柱中加入Buffer CW1，离心，倒掉收集管中的液体；
7)往微量核酸吸附柱中加入Buffer CW2，离心，倒掉收集管中的液体；
8)换用新的收集管容纳微量核酸吸附柱，再离心；
9)将微量核酸吸附柱套在离心管中，开盖孵育；
10)往微量核酸吸附柱的核酸吸附膜中心滴加Buffer CDE，闭盖孵育，离心，收集样品全核酸。
2.根据权利要求1所述的一种提取肺泡灌洗液全核酸的方法，其特征在于，步骤1)中，Buffer CDL加入的量为：4-8ml Buffer CDL/10ml肺泡灌洗液；
步骤1)中，蛋白酶K加入的量为：400-600ul蛋白酶K/10ml肺泡灌洗液。
3.根据权利要求1所述的一种提取肺泡灌洗液全核酸的方法，其特征在于，步骤1)中，消化处理的条件为60℃消化20min。
4.根据权利要求1所述的一种提取肺泡灌洗液全核酸的方法，其特征在于，步骤2)中，加入Tracer的量为：以初始肺泡灌洗液的量计，800-1200ul Tracer/10ml肺泡灌洗液；
步骤2)中，加入异丙酮的量为：以初始肺泡灌洗液的量计，6-10ml异丙酮/10ml肺泡灌洗液。
5.根据权利要求1所述的一种提取肺泡灌洗液全核酸的方法，其特征在于，步骤3)中，加入Buffer CDB的量为：以初始肺泡灌洗液的量计，1000-1300ul Buffer CDB/10ml肺泡灌洗液；
步骤3)中，加入Buffer CDD的量为：以初始肺泡灌洗液的量计，80-120ul Buffer CDD/10ml肺泡灌洗液。
6.根据权利要求1所述的一种提取肺泡灌洗液全核酸的方法，其特征在于，步骤4)中，加入无水乙醇的量为：以初始肺泡灌洗液的量计，800-1200ul无水乙醇/10ml肺泡灌洗液。
7.根据权利要求1所述的一种提取肺泡灌洗液全核酸的方法，其特征在于，步骤6)中，Buffer CW1加入的量为：以初始肺泡灌洗液的量计，1600-2000ul Buffer CW1/10ml肺泡灌洗液。
8.根据权利要求1所述的一种提取肺泡灌洗液全核酸的方法，其特征在于，步骤7)中，Buffer CW2加入的量为：以初始肺泡灌洗液的量计，1600-2000ul Buffer CW2/10ml肺泡灌洗液。
9.根据权利要求1所述的一种提取肺泡灌洗液全核酸的方法，其特征在于，步骤9)中，孵育的条件为：56℃，开盖孵育2min；
步骤10)中，孵育的条件为：56℃，闭盖孵育2min。
10.根据权利要求1所述的一种提取肺泡灌洗液全核酸的方法，其特征在于，BufferCDL、Tracer、Buffer CDB、Buffer CDD、Buffer CW1、Buffer CW2、Buffer CDE试剂均为购自于厦门艾德生物医药科技股份有限公司货号为8.0226201X024G的核酸提取相关试剂，微量核酸吸附柱购自于厦门艾德生物医药科技股份有限公司货号为8.0226201X024G的核酸提取试剂中的吸附柱。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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