CN112626066A - 一种病毒核酸提取后浓缩的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种病毒核酸提取后浓缩的方法，包括以下步骤：用RNA提取试剂提取标本RNA；用逆转录试剂将步骤(1)中得到的RNA进行反转录为cDNA；步骤(2)核酸保存于离心管中，用封口膜封口，用10ul枪头封口膜上扎若干小孔，在浓缩仪中进行浓缩，离心转速为16000g，温度为4℃，时间为1小时。本发明可以提高核酸浓度4‑10倍，并保持核酸活性，对环境危害小，不需要复杂操作，即可有效提高检测的灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于生命科学和生物技术领域，特别涉及一种病毒核酸提取后浓缩的方法。
背景技术
一项发表在《新英格兰医学杂志》上的新研究发现，导致COVID-19的病毒在固体表面和气溶胶中能持续数小时至数天。这项研究表明，人们很有可能通过空气和接触受污染物体后感染冠状病毒。科学家发现，这种病毒在气溶胶中可持续3个小时，在铜表面上可持续4小时，在纸板上可持续24小时，在塑料和不锈钢上可持续2至3天。因此有必要对固体表面进行病毒的检查。但通常固体表面的病毒含量少，容易漏检，导致假阴性，因此本发明提供一种病毒核酸提取后浓缩的技术，以提高检出率。
从样本采集开始，对固体物体，如衣物、操作台、门把手、电脑等要规范操作，要求用病毒采样管中的病毒保存液，充分浸润采样棉签后，对拟采集物体的表面重复涂抹、涮洗3次以上。同时要满足对采样对象表面，进行多点分布式采样。采集后的样品冷藏运输保存。
通常人体咽拭子采集后放置在胍盐的裂解液中，到实验室通过自动核酸提取仪进行提取，然后使用荧光定量PCR试剂进行检测。但固体表面的新冠病毒含量可能很少，达不到检测试剂盒的检测下限，这样可能会导致假阴性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种固体表面病毒核酸浓缩的方法，即真空离心浓缩的方法，可以提高核酸浓度4-10倍，并保持核酸活性，对环境危害小，不需要复杂操作，即可有效提高检测的灵敏度。
一种病毒核酸提取后浓缩的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用RNA提取试剂提取标本RNA；
(2)用逆转录试剂将步骤(1)中得到的RNA进行反转录为cDNA；
(3)步骤(2)核酸保存于离心管中，用封口膜封口，用10ul枪头封口膜上扎若干小孔，在浓缩仪中进行浓缩，离心转速为16000g，温度为4℃，时间为1小时。
进一步地，步骤(1)的具体提取步骤如下：
1)吸取560ul含有carrier RNA的buffer AVL到离心管中；
2)将140ul样本加入到装有buffer AVL-carrier RNA的离心管中，斡旋15秒，混匀；
3)室温放置10min；
4)瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底；
5)样品中加入560ul无水乙醇，斡旋15s充分混匀，然后瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底；
6)吸取630ul步骤(5)中的溶液加入column中，放入2ml离心管，8000rpm离心1min；将column放入新的2ml离心管中；
7)打开column盖子，重复第6步；直到所有的裂解液都上柱；
8)打开column盖子，加入500ul buffer AW1；盖上盖子，8000rpm离心，1min。将column放入新的2ml收集管中；
9)打开column盖子，加入500ul buffer AW2；盖上盖子，14000rpm全速离心3min；
10)将column放入新的2ml收集管中，14000rpm全速离心1min；
11)将column放在1.5ml离心管中；加入60ul室温的buffer AVE；盖上盖子，室温放置1min；8000rpm离心1min。
进一步地，步骤(2)的逆转录具体步骤如下：向10ul RNA中加入1ul 100uM PrimerMix，将混合液至于65℃，5min后，冰浴2min；向上述混合液加入4ul5×RT-Buffer，4ul DEPC水，1ul 100U/ul ReverTra Ace逆转录酶，混匀，37℃60min，95℃5min，获得cDNA-20℃备用。
RNA提取可采用QIAamp Viral RNA mini Kit进行核酸提取，再用逆转录试剂包括5×RT-Buffer，100uM Primer Mix，100U/ul ReverTra Ace逆转录酶和DEPC水；最后再采用真空浓缩的方法，进一步浓缩。
具体实施方式
实施例1
病毒核酸提取后浓缩的方法，步骤如下：
(1)用RNA提取试剂提取呼吸道标本(如鼻咽分泌物、口腔含漱液、气管吸出物或呼吸道上皮细胞)的RNA；具体抽取步骤：
1)吸取560ul准备好的buffer AVL(含有carrier RNA)到1.5ml离心管中。(根据样品的实际量按比例调整buffer AVL-carrier RNA)
2)将140ul血浆，血清，尿液，培养细胞上清液或是无细胞体液加入到装有bufferAVL-carrier RNA的离心管中。斡旋15秒，混匀。(为保证裂解效率，一定要彻底混匀，形成均一溶液。只溶解过一次的样品也仍然可用)。
3)室温放置10min。(10分钟足够，延长时间不会增加产物质量。Buffer AVL可以使潜在的污染和Rnase失活)。
4)瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底。
5)样品中加入560ul无水乙醇(96％～100％)，斡旋15s充分混匀。然后瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底。(只可以用乙醇，因为其他酒精会降低产量和纯度。不要用变性酒精，因为其中含有其他物质。如果样品量大于140ul，按比例增加乙醇的量。该步骤要充分混匀，形成均一溶液，以保证产量)。
6)吸取630ul上步中的溶液小心的加入column(已装入到2ml离心管中)中，注意不要碰到柱子的边缘。盖上盖子，6000×g(8000rpm)离心1min。将column放入新的2ml离心管中，弃去旧的收集管。(每一个column都要盖上，以防交叉污染。8000rpm的速度是为了限制噪音，全速离心也是可以的，不会影响产物。如果溶液没有完全透过膜，可以更高的速度再次离心，直到溶液完全透过)。
7)小心的打开column的盖子，重复第6步。(如果样品量超过了140ul，那么重复此步骤，直到所有的裂解液都上柱)。
8)小心的打开column盖子，加入500ul buffer AW1。盖上盖子，8000rpm离心，1min。将column放入新的2ml收集管(Kit提供)中，弃去旧的收集管。(即使样品量大于140ul，也无需增加buffer AW1的量)。
9)小心的打开column盖子，加入500ul buffer AW2。盖上盖子，全速离心(14000rpm)，3min。接着先进行第10步，以避免buffer AW2残留，然后再进行第11步。(buffer AW2残留会影响下游实验。有些离心机在减速时会发生振动，导致回流，使得buffer AW2接触到column。将column和收集管从离心机里拿出来时也可能会导致该现象产生，因此，最好先进行第10步)。
10)将column放入新的2ml收集管中，弃去旧的收集管，全速离心1min。
11)将column放在1.5ml离心管中。弃去旧的收集管。小心的打开column，加入60ul室温的buffer AVE。盖上盖子，室温放置1min。8000rpm离心1min。
(2)用逆转录试剂将步骤(1)中得到的RNA进行反转录为cDNA；具体步骤如下：向10ul RNA中加入1ul 100uM Primer Mix，将混合液至于65℃，5min后，冰浴2min；向上述混合液加入4ul 5×RT-Buffer，4ul DEPC水，1ul 100U/ul ReverTra Ace逆转录酶，混匀，37℃60min，95℃5min，获得cDNA-20℃备用。
(3)步骤(2)核酸保存在1.5ml离心管中。打开浓缩仪，预热15min，将离心管对称放置在转子上。离心管盖不要盖住，用封口膜封住，用10ul枪头扎几个小孔，在浓缩仪中，进行浓缩，采用的离心转速为16000g，温度为4度，时间为1小时。通过这个浓缩过程，可以使浓度浓缩4-10倍。
Claims (3)
1.一种病毒核酸提取后浓缩的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用RNA提取试剂提取标本RNA；
(2)用逆转录试剂将步骤(1)中得到的RNA进行反转录为cDNA；
(3)步骤(2)核酸保存于离心管中，用封口膜封口，用10ul枪头封口膜上扎若干小孔，在浓缩仪中进行浓缩，离心转速为16000g，温度为4℃，时间为1小时。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的具体提取步骤如下：
1)吸取560ul含有carrier RNA的buffer AVL到离心管中；
2)将140ul样本加入到装有buffer AVL-carrier RNA的离心管中，斡旋15秒，混匀；
3)室温放置10min；
4)瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底；
5)样品中加入560ul无水乙醇，斡旋15s充分混匀，然后瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底；
6)吸取630ul步骤(5)中的溶液加入column中，放入2ml离心管，8000rpm离心1min；将column放入新的2ml离心管中；
7)打开column盖子，重复第6步；直到所有的裂解液都上柱；
8)打开column盖子，加入500ul buffer AW1；盖上盖子，8000rpm离心，1min。将column放入新的2ml收集管中；
9)打开column盖子，加入500ul buffer AW2；盖上盖子，14000rpm全速离心3min；
10)将column放入新的2ml收集管中，14000rpm全速离心1min；
11)将column放在1.5ml离心管中；加入60ul室温的buffer AVE；盖上盖子，室温放置1min；8000rpm离心1min。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)的逆转录具体步骤如下：向10ul RNA中加入1ul 100uM Primer Mix，将混合液至于65℃，5min后，冰浴2min；向上述混合液加入4ul 5×RT-Buffer，4ul DEPC水，1ul 100U/ul ReverTra Ace逆转录酶，混匀，37℃ 60min，95℃ 5min，获得cDNA-20℃备用。
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