CN116218966A - 一种脐带血细菌和真菌快速检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及血液快速检测方法技术领域，特别涉及一种脐带血细菌和真菌快速检测的方法。本发明提出的针对脐带血中细菌和真菌污染的检测方法，首先进行脐血中人源DNA去除以及去人源DNA的微量提取，再使用数字PCR方法对提取得到的微量细菌和真菌DNA进行高精度检测，以此实现对脐血中微量细菌和真菌的检测。

Description

一种脐带血细菌和真菌快速检测的方法

技术领域

本发明涉及血液快速检测方法技术领域，特别涉及一种脐带血细菌和真菌快速检测的方法。

背景技术

本领域的技术方案是以培养法为主要检测方法，其原理是以细菌和真菌培养时物质变化进行检测。其中用以检测脐带血有无细菌和真菌污染的主要设备以法国梅里埃BacT/ALEＲT3D240和美国BD BACTECTM FX 为主。

但是其具有以下不足：1.设备配套检测方法检测周期长，一般为5-7天；2.由于检测方法为培养法，对于不易培养的细菌和真菌无法进行有效培养，而导致出现假阴性结果。3.当细菌和真菌数量极少时，也会由于细菌和真菌迟滞期过长，导致在检测时间内不会出现培养过程中的指数增长阶段，而出现假阴性；4.检测样本需要16-20 mL，体积需求较大。

现阶段PCR技术已经广泛用于多种领域的病毒检测，但是并没有用于脐带血细菌和真菌检测。主要原因在于：1.相比于病毒，细菌和真菌的结构更为复杂，无法通过简单操作直接作为PCR模版使用。2.细菌和真菌核酸提取方法回收率并不稳定，尤其是在处理样本中细菌或真菌浓度极低的情况下，能否进行有效提取是后续能否使用PCR检测的关键。3.在提取方法能够达到微量提取的目的后，PCR检测精确度能否达到存在少量模版就完成扩增的目的。4.对于人源样本，样本内会存在大量的人源核酸，这些核酸样本会大幅度降低对细菌或真菌核酸的提取效率，同时在存在大量人源核酸的样本中，人源核酸也会竞争引探而影响检测。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明提供了一种脐带血细菌和真菌快速检测的方法，其能够提高脐血细菌和真菌检测的效率，在不需要培养的条件下，微生物低浓度（细菌和真菌浓度1-10 CFU/mL量级下）的状态下也能够进行检测，另外，也在一定程度的减少培养所需要的时间，提高了检测效率。

本发明所采用的技术方案如下：

一种脐带血细菌和真菌快速检测的方法，包括以下步骤：

A、进行脐血中人源DNA去除以及去人源DNA的提取，裂解细菌和真菌细胞壁，释放细菌和真菌核酸；

B、使用数字PCR方法对提取得到的细菌和真菌DNA进行检测，以此实现对脐血中微量细菌和真菌的检测；所述的细菌或真菌包括：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、大肠杆菌、酿脓链球菌、藤黄微球菌、痤疮丙酸杆菌、乙型伤寒沙门氏菌、卷曲乳杆菌、黑曲霉、白色念球菌。

优选的，步骤A具体包括：

A1、用注射器将脐血在采血袋中充分混匀，取5mL样本置于15mL离心管中并做好标记；

A2、每个含5 mL血样的离心管中加2 mL 细胞裂解液，使用涡旋振荡器，震荡15s混合均匀，室温放置5 min；

A3、离心去除盖子上的液体，向15mL离心管中加入2mL 核酸释放液，然后吸取10 μLDNA酶至裂解产物中，立即涡旋震荡15 s，室温静置15 min；

A4、将样本分装入5个2 mL EP管中，每管1.8 mL；

A5、将EP管以离心力12000g离心10 min，之后吸取上清液丢弃，加入200μL 清洗重悬液，震荡混匀；

A6、将五个2 mL EP管中重悬样本汇聚入1个2 mL EP管中；

A7、裂解细菌和真菌细胞壁，释放细菌和真菌核酸，完成去人源DNA的提取。

优选的，步骤B具体包括：

B1、体系配置；

B2、生成微滴液；

B3、对微滴液内的细菌和真菌进行数字PCR的扩增；

B4、使用生物芯片分析仪对扩增后的微滴液进行检测并进行数据分析。

步骤B1中，体系配置包括针对细菌16s基因和真菌18s基因的16s体系和18s体系。

所述的16s体系中，按照以下试剂比例进行体系配制。每个样本含10 μL数字PCR用反应预混液，1 μL 16s检测混合液，0.5 μL 稳定剂，8.5 μL细菌核酸样本，总计20 μL。

所述的18s体系中，按照以下试剂比例进行体系配制。每个样本含5 μL 数字PCR用反应预混液，1 μL 18s检测混合液，0.6 μL酶混合液，0.4 μL水，13 μL真菌核酸样本，总计20 μL。

步骤B4是使用MicroDrop-100B生物芯片分析仪中进行检测，数据分析软件为QuantDrop。

优选的，步骤B4中，进行数据分析的具体方法包括：

B41、微滴数范围值取70000-90000，若微滴数小于50000，则数据无效；

B42、细菌样本：分析仪的荧光检测通道，线荧光值10000，拷贝数大于20则判定为阳性，小于等于20判定为阴性；

B43、真菌样本：分析仪的荧光检测通道，线荧光值10000，有阳性微滴判定为阳性，无则为阴性。

本发明提供的技术方案带来的有益效果是：

本发明主要是提供一种针对脐带血中细菌和真菌污染的检测方法。首先进行脐血中人源DNA去除以及去人源DNA的微量提取，再使用数字PCR方法对提取得到的微量细菌和真菌DNA进行高精度检测，以此实现对脐血中微量细菌和真菌的检测。本发明的检测方法时间显著小于培养法时间。

除上述有益效果外，本发明还具有以下特点：

1、检测所需时间更短。相较于培养法5-7天出结果，本发明可以在9小时内完成检测（核酸提取约4h，数字PCR检测约4.5h）。

2、本发明无需培养法的增菌过程，不会出现因细菌或真菌难以培养或增殖较慢而出现无法检出的情况。检测方法基于数字PCR对细菌和真菌核酸进行检测。

3、样本需求量小。培养法检测需要对需氧和厌氧两个培养瓶进行加样，总样本量在16-20 mL，本方法样本量仅需要5mL。

4、该方法检出限为1-2 CFU/mL。在低浓度（1-2 CFU/mL）下，检测稳定性高于培养法。

5、实现了对脐血体系内的微量细菌和真菌的核酸提取。通过对人源样本的去除的相关改良，以及细菌和真菌同时进行微量提取，完成了在脐血体系内对微量细菌和真菌的核酸提取。

6、实现了使用数字PCR方法对存在人源核酸样本的细菌和真菌核酸体系检测。相较于q-PCR和传统PCR方法，数字PCR通过对样本体系的拆分减少了人源核酸对检测的影响，最终达到检测目的。

7、通过对数据分析方法的改良，在实现极低浓度检测的同时，将假阳性样本控制在合理范围内。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的一种脐带血细菌和真菌快速检测的方法中，伤寒沙门氏菌的检测效果示意图；

图2为本发明的一种脐带血细菌和真菌快速检测的方法中，大肠杆菌检测的效果对比示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

实施例

本实施例提供一种脐带血细菌和真菌快速检测的方法，包含以下过程：

一、从脐血中提取去人源基因组DNA

核酸提取部分使用sepsiTest检测试剂盒进行脐血中人源DNA去除以及去人源DNA的微量提取。

具体步骤如下：

1、用20 mL注射器在采血袋中将脐带血血样充分混匀，取5mL样本置于15 mL离心管并做好标记。

2、每个含5 mL血样的离心管中加2 mL 细胞裂解液，全速旋涡震荡15s混合均匀。室温放置5 min。

3、短暂离心以去除盖子上的液体，向15mL离心管中加入2mL 核酸释放液，然后吸取10 μL DNA酶至裂解产物中，立即涡旋震荡15 s，室温静置15 min。将样本分装入5个2 mLEP管中，每管1.8 mL。

4、将EP管以离心力12000g离心10 min，之后轻轻吸取上清液丢弃加入200μL 清洗重悬液，震荡混匀。并将五个2 mL EP中重悬样本汇聚入1个2 mL EP管中。

5、后续操作与试剂盒说明书一致。裂解细菌或真菌细胞壁，释放细菌或真菌核酸，完成全基因组提取。

本步骤中的方法可以在大部分超速离心机上实现。以较少的操作步骤和效率达成5mL体系下进行核酸提取的目的。试剂原本的使用方法存在混匀不够充分，导致脐血中红细胞裂解不完全，而沉降在离心管下部，影响去除效果。通过此步骤，在转移过程中进一步混匀，使人源核酸去除更充分。

二、数字PCR检测去人源基因组DNA

PCR检测阶段使用广东永诺医疗科技有限公司细菌16s基因核酸检测试剂盒、真菌18s基因核酸检测试剂盒，针对细菌16s基因和真菌18s基因进行d PCR扩增，并使用配套检测仪器进行检测。

具体步骤如下：

1、体系配制，参考试剂盒中体系及试剂比例进行体系配制。

16s体系中，按照以下试剂比例进行体系配制。每个样本含10 μL数字PCR用反应预混液，1 μL 16s检测混合液，0.5 μL 稳定剂，8.5 μL细菌核酸样本，总计20 μL。

18s体系中，按照以下试剂比例进行体系配制。每个样本含5 μL 数字PCR用反应预混液，1 μL 18s检测混合液，0.6 μL酶混合液，0.4 μL水，13 μL真菌核酸样本，总计20 μL。

2、微液滴生成

按照试剂盒使用说明进行微滴生成。

PCR扩增

使用广东永诺医疗科技有限公司基因扩增仪（型号：P100），扩增程序如下：

50 ℃ 2 min；95 ℃，10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，循环45次；98 ℃ 10min；16 ℃维持。设置热盖温度105℃，样本体积50μL，升降温速率1℃/s

（4）微液滴检测：

使用MicroDrop-100B生物芯片分析仪中进行检测。数据分析软件为QuantDrop，按照使用说明进行使用。使用该仪器的优势：

1、微滴生成采用油包水乳化微滴技术，在微管道中利用气压驱动，2 min生成数万个微滴，效率更高。

2、微滴生成芯片为高精度微流控芯片设计，可同时处理8个样本。

3、理论单个样本微滴总数100,000个，实际检测过程中约为70,000-90,000微滴数，精密度和准确性更高。

（5）数据分析

试剂盒原有方法通过阳性微滴是否存在进行数据分析，由于体系中存在生产菌的核酸残留，导致原有分析方法下存在极大的假阳性风险，无法满足检测需求。通过大量数据分析整理，统计空白组拷贝数的相关数据，最终通过改良后分析方法可以达成检测需求，假阳性样本也出于可接受范围。

本实施例的分析方式具体如下：

1、微滴数范围为70000-90000，若微滴数小于50000，则数据无效。通常是由于加样异常，未加入稳定剂；微滴生成异常，液相或油相为完全用于微滴生成，或未加入密封剂；PCR温度异常或取出样本时温度过高，导致微滴破裂；生物芯片分析仪故障，液路堵塞。

2、细菌样本：通道一（FAM），判定线荧光值10000，拷贝数大于20判定为阳性，小于等于20判定为阴性。

3、真菌样本：通道一（FAM），判定线荧光值10000，有阳性微滴判定为阳性，无则为阴性。

一、本发明的快速检测方法可检出细菌或真菌种类包括：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、大肠杆菌、酿脓链球菌、藤黄微球菌、痤疮丙酸杆菌、乙型伤寒沙门氏菌、卷曲乳杆菌、黑曲霉、白色念球菌。总计12种。

如附图1所示，以伤寒沙门氏菌为例，分别在0CFU/mL，1-2 CFU/mL，5-10 CFU/mL下进行检测，证明此方法可以完成沙门氏菌检测。

同理检测其他细菌或真菌种类，汇总得知此方法可以检测所需检出的12种细菌或真菌。

二、快速检测方法检出限

通过六次重复实验，金黄色葡萄球菌等前文提及12种微生物检测限为1-2 CFU/mL。

如附图2所示，以大肠杆菌为例，在1-2 CFU/mL下，本发明的发明方法和培养法性能对比。

其他细菌或真菌种类使用相同检测方法，每种细菌或真菌在1-2CFU/mL浓度下分别用发明方法和培养法进行检测，进行六次重复，以此确定发明方法检测限及两种方法在低浓度下的检出效率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种脐带血细菌和真菌快速检测的方法，包括以下步骤：

A、进行脐血中人源DNA去除以及去人源DNA的提取，裂解细菌或真菌细胞壁，释放细菌和真菌核酸；

B、使用数字PCR方法对提取得到的细菌和真菌DNA进行检测，以此实现对脐血中微量细菌或真菌的检测，所述的细菌或真菌包括：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、大肠杆菌、酿脓链球菌、藤黄微球菌、痤疮丙酸杆菌、乙型伤寒沙门氏菌、卷曲乳杆菌、黑曲霉、白色念球菌。

2.根据权利要求1所述的一种脐带血细菌和真菌快速检测的方法，其特征在于，所述步骤A具体包括：

A1、用注射器将脐血在采血袋中充分混匀，取5mL样本置于15mL离心管中并做好标记；

A2、每个含5 mL血样的离心管中加2 mL 细胞裂解液，使用涡旋振荡器，震荡15s混合均匀，室温放置5 min；

A3、离心去除盖子上的液体，向15mL离心管中加入2mL 核酸释放液，然后吸取10 μLDNA酶至裂解产物中，立即涡旋震荡15 s，室温静置15 min；

A4、将样本分装入5个2 mL EP管中，每管1.8 mL；

A5、将EP管以离心力12000g离心10 min，之后吸取上清液丢弃，加入200μL 清洗重悬液，震荡混匀；

A6、将五个2 mL 的EP管中重悬样本汇聚入1个2 mL 的EP管中；

A7、裂解细菌或真菌细胞壁，释放细菌或真菌核酸，完成去人源DNA的提取。

3.根据权利要求1所述的一种脐带血细菌和真菌快速检测的方法，其特征在于，所述的步骤B具体包括：

B1、体系配置；

B2、生成微滴液；

B3、对微滴液内的细菌和真菌进行数字PCR的扩增；

B4、使用生物芯片分析仪对扩增后的微滴液进行检测并进行数据分析。

4.根据权利要求3所述的一种脐带血细菌和真菌快速检测的方法，其特征在于，所述的步骤B1中，体系配置包括针对细菌16S基因和真菌18S基因的16S体系和18s体系；

所述的16s体系中，按照以下试剂比例进行体系配制：每20 μL样本含10 μL数字PCR用反应预混液，1 μL 16S检测混合液，0.5 μL 稳定剂，8.5 μL细菌核酸样本；

所述的18s体系中，按照以下试剂比例进行体系配制：每20 μL样本含5 μL 数字PCR用反应预混液，1 μL 18S检测混合液，0.6 μL酶混合液，0.4 μL水，13 μL真菌核酸样本。

5.根据权利要求3所述的一种脐带血细菌和真菌快速检测的方法，其特征在于，所述的步骤B4中，进行数据分析的具体方法包括：

B41、微滴数范围值取70000-90000，若微滴数小于50000，则数据无效；

B42、细菌样本：分析仪的荧光检测通道，线荧光值10000，拷贝数大于20则判定为阳性，小于等于20判定为阴性；

B43、真菌样本：分析仪的荧光检测通道，线荧光值10000，有阳性微滴判定为阳性，无则为阴性。

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