CN104388589A - 一种利用实时荧光定量pcr检测h7n9禽流感病毒的引物及方法 - Google Patents

一种利用实时荧光定量pcr检测h7n9禽流感病毒的引物及方法 Download PDF

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李文静
王淑一
黎飒
徐建成
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Abstract

本发明公开了利用实时荧光定量PCR检测H7N9禽流感病毒的引物，包括：(1)检测H7N9禽流感病毒包膜表面血凝素H7的引物及探针；(2)检测H7N9禽流感病毒神经氨酸酶N9的引物及探针。利用本发明的引物，通过对病毒RNA抽提，逆转录和实时荧光定量PCR，可检测H7N9禽流感病毒，具有高准确性，高敏感性，高特异性和短检测窗口期等优点，可为疫病早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。

Description

一种利用实时荧光定量PCR检测H7N9禽流感病毒的引物及方法
本申请是申请号为201310129302.4、申请日2013年4月12日的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种用于检测H7N9禽流感病毒的试剂盒。
背景技术
流感病毒属于正粘病毒科( orthomyxoviridae) ，有包膜、分节段基因组的单负链RNA 病毒。根据核蛋白和包膜内侧面的M1 蛋白的抗原性将流感病毒分甲( A) 、乙( B) 、丙( C) 三型。甲型流感病毒再根据包膜表面血凝素( hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶( neuraminidase，NA) 两种刺突的抗原性分若干亚型，目前包括H1 ～ H16 亚型，NA包括N1 ～ N9 亚型。所有人类的流感病毒都可以引起禽类流感，但不是所有的禽流感病毒都可以引起人类流感，禽流感病毒中，H3、H5、H7、H9可以传染给人，其中H5为高致病性。H3为人犬共患，依据流感病毒特征可分为HxNx共135种亚型，H7N9亚型禽流感病毒是其中的一种。这个病毒的生物学特点、致病力、传播力，还没有依据进行分析判断。
H7N9亚型禽流感病毒是甲型流感中的一种，既往仅在禽间发现，未发现过人的感染情况。但我国人感染H7N9禽流感于2013年3月底在上海和安徽两地率先发现。H7N9型禽流感是全球首次发现的新亚型流感病毒，尚未纳入我国法定报告传染病监测报告系统，并且至2013年4月初尚未有疫苗推出。
中国国家卫生和计划生育委员会2013年3月3日印发人感染H7N9禽流感诊疗方案、防控方案及医院感染预防与控制技术指南。根据人感染H7N9禽流感诊疗方案（2013年第1版），人感染H7N9禽流感传染源目前尚不明确，根据以往经验及本次病例流行病学调查，推测可能为携带H7N9禽流感病毒的禽类及其分泌物或排泄物。传播途径为经呼吸道传播，也可通过密切接触感染的禽类分泌物或排泄物等被感染，直接接触病毒也可被感染。现尚无人与人之间传播的确切证据。现阶段高危人群主要是从事禽类养殖、销售、宰杀、加工业者，以及在发病前1周内接触过禽类者。 诊疗方案指出，人感染H7N9禽流感潜伏期一般为7天以内。患者一般表现为流感样症状，如发热，咳嗽，少痰，可伴有头痛、肌肉酸痛和全身不适。重症患者病情发展迅速，表现为重症肺炎，体温大多持续在39℃以上，出现呼吸困难，可伴有咯血痰；可快速进展出现急性呼吸窘迫综合征、纵隔气肿、脓毒症、休克、意识障碍及急性肾损伤等。
根据流行病学接触史、临床表现及实验室检查结果，可作出人感染H7N9禽流感的诊断。在流行病学史不详的情况下，根据临床表现、辅助检查和实验室检测结果，特别是从患者呼吸道分泌物标本中分离出H7N9禽流感病毒，或H7N9禽流感病毒核酸检测阳性，可以诊断。
发明内容
鉴于核酸检测是直接检测病原体核酸，具有高敏感，高特异和短检测窗口期等优点，为疫病早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。本发明提供了一种实时荧光定量PCR检测H7N9禽流感病毒的试剂盒，用于检测H7N9禽流感病毒核酸。
一种利用实时荧光定量PCR检测H7N9禽流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(1) RNA提取试剂、逆转录试剂、实时荧光定量PCR扩增反应试剂；
(2) 用于扩增样本cDNA的引物及探针，包括：
检测H7N9禽流感病毒包膜表面血凝素H7的引物及探针：
H7-F: GGGWTTCACMTACAGYGGAATAAG
H7-R: ACAGGARCCATTTCATCTCYGC
H7-probe: FAM-CAACSAGTGCATGTAGGAGATCAGGWTCTTC-TAMARA
      检测H7N9禽流感病毒神经氨酸酶N9的引物及探针：
N9-F: TGARTGCAGGTTCTATGCTCTCA
N9-R: TGTATACTGTGGGYGGTGATGA
N9-Probe: HEX-CTCAAACGGAACAATACACGATAGGTCCCA-TAMARA。
进一步地，所述RNA提取试剂包括QIAamp Viral RNA mini Kit；所述逆转录试剂包括5×RT-Buffer，100uM Primer Mix，100U/ul ReverTra Ace逆转录酶和DEPC水；所述实时荧光定量PCR扩增反应试剂包括qPCR Mix，50×ROX，扩增引物及探针和灭菌水。
更进一步地，所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：
 (1) 用RNA提取试剂提取呼吸道标本的RNA；
(2) 用逆转录试剂将步骤(1)中得到的RNA进行反转录为cDNA；
(3) 使用引物H7-F、H7-R和N9-F、N9-R及相应探针H7-probe、N9-probe在单管PCR反应体系中对步骤(2)得到的cDNA进行实时荧光定量PCR检测。
其中，实时荧光定量PCR反应程序：95℃ 10min 预变性；95℃ 15sec，58℃ 35sec，39个循环。
步骤(1)的具体抽取步骤如下：
1)      吸取560ul准备好的buffer AVL（含有carrier RNA）到1.5ml离心管中。（根据样品的实际量按比例调整buffer AVL-carrier RNA）。
2)      将140ul血浆，血清，尿液，培养细胞上清液或是无细胞体液加入到装有buffer AVL-carrier RNA的离心管中。斡旋15秒，混匀。（为保证裂解效率，一定要彻底混匀，形成均一溶液。只溶解过一次的样品也仍然可用）。
3)      室温放置10min。（10分钟足够，延长时间不会增加产物质量。Buffer AVL可以使潜在的污染和Rnase失活）。
4)      瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底。
5)      样品中加入560ul无水乙醇（96％～100％），斡旋15s充分混匀。然后瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底。（只可以用乙醇，因为其他酒精会降低产量和纯度。不能使用变性酒精，因为其中含有其他物质。如果样品量大于140ul，按比例增加乙醇的量。该步骤要充分混匀，形成均一溶液，以保证产量）。
6)      吸取630ul上步中的溶液小心的加入column（已装入到2ml离心管中）中，注意不要碰到柱子的边缘。盖上盖子，6000×g（8000rpm）离心1min。将column放入新的2ml离心管中，弃去旧的收集管。（每一个column都要盖上，以防交叉污染。8000rpm的速度是为了限制噪音，全速离心也是可以的，不会影响产物。如果溶液没有完全透过膜，可以更高的速度再次离心，直到溶液完全透过）。
7)      小心的打开column的盖子，重复第6步。（如果样品量超过了140ul，那么重复此步骤，直到所有的裂解液都上柱）。
8)      小心的打开column盖子，加入500ul buffer AW1。盖上盖子，8000rpm离心，1min。将column放入新的2ml收集管（Kit提供）中，弃去旧的收集管。（即使样品量大于140ul，也无需增加buffer AW1的量）。
9)      小心的打开column盖子，加入500ul buffer AW2。盖上盖子，全速离心（14000rpm），3min。接着进行第11步，或者先进行第10步，以避免buffer AW2残留，然后再进行第11步。（buffer AW2残留会影响下游实验。有些离心机在减速时会发生振动，导致回流，使得buffer AW2接触到column。将column和收集管从离心机里拿出来时也可能会导致该现象产生，因此，最好先进行第10步）。
10)  推荐：将column放入新的2ml收集管（Kit中未提供）中，弃去旧的收集管，全速离心1min。
11)  将column放在1.5ml离心管（kit中未提供）中。弃去旧的收集管。小心的打开column，加入60ul 室温的buffer AVE。盖上盖子，室温放置1min。8000rpm离心1min。
步骤(2)的逆转录具体步骤如下：向10ul RNA中加入1ul 100uM Primer Mix，将混合液至于65℃，5min后，冰浴2min；向上述混合液加入4ul 5×RT-Buffer，4ul DEPC水，1ul 100U/ul ReverTra Ace逆转录酶，混匀，37℃ 60min，95℃ 5min，获得cDNA -20℃备用。
步骤(3)实时荧光定量PCR检测方法中，通过不同荧光标记（FAM、HEX）的两条探针，完成一例样本在一管PCR反应体系中同时检测甲型禽流感病毒包膜表面血凝素（HA）基因及神经氨酸酶（NA）基因，既可以同时检测出H7N9禽流感病毒的H7亚型和N9亚型。
根据实时荧光定量PCR检测结果，可以对检测样本是否感染H7N9禽流感病毒进行鉴定。具体方法为：在H7阳性质控和N9的阳性质控都有扩增曲线，且Ct值≤38的前提下，1）检测样本的一管PCR反应体系中，如果FAM标记的探针和HEX标记的探针都产生扩增曲线，且Ct值≤38，则判定样本是H7N9病毒阳性；2）如果检测样本的一管PCR反应体系中，FAM标记的探针和HEX标记的探针都无明显扩增曲线，或者只有其中一条探针有扩增曲线，则判定样本是H7N9阴性。
有益效果：本发明的用于检测H7N9禽流感病毒核酸的试剂盒，通过对病毒RNA抽提，逆转录和实时荧光定量PCR，可以鉴定H7N9禽流感病毒。该试剂盒所得的结果具有高准确性，高敏感性，高特异性和短检测窗口期等优点，为疫病早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。
附图说明
图1是样本A实时荧光定量PCR检测结果。由图可知，该样本H7和N9都产生扩增曲线，因此样本A为H7N9禽流感病毒阳性。
图2是样本B实时荧光定量PCR检测结果。该样本只有H7产生扩增曲线，因此样本B为H7N9禽流感病毒阴性。
图3是样本C实时荧光定量PCR检测结果。该样本只有N9产生扩增曲线，因此样本C为H7N9禽流感病毒阴性。
图4是样本D实时荧光定量PCR检测结果。该样本H7和N9都无扩增曲线，因此样本D为H7N9禽流感病毒阴性。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
用于检测H7N9禽流感病毒核酸的试剂盒，包括：
(i) RNA提取试剂：QIAamp Viral RNA mini Kit；
(ii) 逆转录试剂：5×RT-Buffer，100uM Primer Mix，100U/ul ReverTra Ace逆转录酶，DEPC水； 
(iii) 实时荧光定量PCR试剂：qPCR Mix，50×ROX，用于扩增样本cDNA的2对引物及相应的探针，灭菌水，其中：
检测H7N9禽流感病毒包膜表面血凝素H7的引物及探针：
H7-F: GGGWTTCACMTACAGYGGAATAAG
H7-R: ACAGGARCCATTTCATCTCYGC
H7-probe: FAM-CAACSAGTGCATGTAGGAGATCAGGWTCTTC-TAMARA
检测H7N9禽流感病毒神经氨酸酶N9的引物及探针：
N9-F: TGARTGCAGGTTCTATGCTCTCA
N9-R: TGTATACTGTGGGYGGTGATGA
N9-Probe: HEX-CTCAAACGGAACAATACACGATAGGTCCCA-TAMARA
所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1) 用QIAamp Viral RNA mini Kit提取血清待检样本RNA；
(2) 用逆转录试剂将步骤(1)中得到的RNA进行反转录为cDNA；
(3) 使用2对引物及相应探针在单管PCR反应体系中对步骤(2)得到的cDNA进行实时荧光定量PCR检测；PCR检测体系为25ul，其中包括12.5ul qPCR Mix，10 uM探针各0.4ul（探针分别为H7-probe、N9-probe）；10uM 正向引物各0.8ul（正向引物分别为H7-F、N9-F）；10uM 反向引物各0.8ul（反向引物分别为H7-R、N9-R）；50×ROX 0.5ul，cDNA 2ul，ddH2O 6ul；实时荧光定量PCR反应程序：95℃ 10min 预变性；95℃ 15sec，58℃ 35sec，39个循环。
根据实时荧光定量PCR检测结果，可以对检测样本是否感染H7N9禽流感病毒进行鉴定。具体方法为：在H7阳性质控和N9的阳性质控都有扩增曲线，且Ct值≤38的前提下，1）检测样本的一管PCR反应体系中，如果FAM标记的探针和HEX标记的探针都产生扩增曲线，且Ct值≤38，则判定样本是H7N9病毒阳性；2）如果检测样本的一管PCR反应体系中，FAM标记的探针和HEX标记的探针都无明显扩增曲线，或者只有其中一条探针有扩增曲线，则判定样本是H7N9阴性。
实施例2：检测方法
1.待检测样本的 RNA的抽取
1)      吸取560ul准备好的buffer AVL（含有carrier RNA）到1.5ml离心管中。（根据样品的实际量按比例调整buffer AVL-carrier RNA）。
2)      将140ul血浆，血清，尿液，培养细胞上清液或是无细胞体液加入到装有buffer AVL-carrier RNA的离心管中。斡旋15秒，混匀。（为保证裂解效率，一定要彻底混匀，形成均一溶液。只溶解过一次的样品也仍然可用）。
3)      室温放置10min。（10分钟足够，延长时间不会增加产物质量。Buffer AVL可以使潜在的污染和Rnase失活）。
4)      瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底。
5)      样品中加入560ul无水乙醇（96％～100％），斡旋15s充分混匀。然后瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底。（只可以用乙醇，因为其他酒精会降低产量和纯度。不要用变性酒精，因为其中含有其他物质。如果样品量大于140ul，按比例增加乙醇的量。该步骤要充分混匀，形成均一溶液，以保证产量）。
6)      吸取630ul上步中的溶液小心的加入column（已装入到2ml离心管中）中，注意不要碰到柱子的边缘。盖上盖子，6000×g（8000rpm）离心1min。将column放入新的2ml离心管中，弃去旧的收集管。（每一个column都要盖上，以防交叉污染。8000rpm的速度是为了限制噪音，全速离心也是可以的，不会影响产物。如果溶液没有完全透过膜，可以更高的速度再次离心，直到溶液完全透过）。
7)      小心的打开column的盖子，重复第6步。（如果样品量超过了140ul，那么重复此步骤，直到所有的裂解液都上柱）。
8)      小心的打开column盖子，加入500ul buffer AW1。盖上盖子，8000rpm离心，1min。将column放入新的2ml收集管（Kit提供）中，弃去旧的收集管。（即使样品量大于140ul，也无需增加buffer AW1的量）。
9)      小心的打开column盖子，加入500ul buffer AW2。盖上盖子，全速离心（14000rpm），3min。接着进行第11步，或者先进行第10步，以避免buffer AW2残留，然后再进行第11步。（buffer AW2残留会影响下游实验。有些离心机在减速时会发生振动，导致回流，使得buffer AW2接触到column。将column和收集管从离心机里拿出来时也可能会导致该现象产生，因此，最好先进行第10步）。
10)  推荐：将column放入新的2ml收集管（Kit中未提供）中，弃去旧的收集管，全速离心1min。
11)    将column放在1.5ml离心管（kit中未提供）中。弃去旧的收集管。小心的打开column，加入60ul 室温的buffer AVE。盖上盖子，室温放置1min。8000rpm离心1min。
2.将步骤1中的所得RNA用随机引物逆转录为cDNA，再使用2对引物及探针对得到的cDNA进行实时荧光定量PCR检测。
其中逆转录的具体方法：向10ul RNA中加入1ul 100uM Primer Mix，将混合液至于65℃，5min后，冰浴2min。向上述混合液加入4ul 5*RT-Buffer，4ul DEPC水，1ul 100U/ul ReverTra Ace逆转录酶，混匀，37℃ 60min，95℃ 5min，获得cDNA -20℃备用。
其中实时荧光定量PCR检测的具体方法：使用2对引物及相应探针在单管PCR反应体系中对步骤(2)得到的cDNA进行实时荧光定量PCR检测（每批次检测中，需进行H7和N9阳性质控的检测）；PCR检测体系为25ul，其中包括12.5ul qPCR Mix，10 uM探针各0.4ul（探针分别为H7-probe、N9-probe）；10uM 正向引物各0.8ul（正向引物分别为H7-F、N9-F）；10uM 反向引物各0.8ul（反向引物分别为H7-R、N9-R）；50×ROX 0.5ul，cDNA 2ul，ddH2O 6ul。
实时荧光定量PCR反应程序：95℃ 10min 预变性；95℃ 15sec，58℃ 35sec，39个循环。
3.结果分析，具体方法为：在H7阳性质控和N9的阳性质控都有扩增曲线，且Ct值≤38的前提下，1）检测样本的一管PCR反应体系中，如果FAM标记的探针和HEX标记的探针都产生扩增曲线，且Ct值≤38，则判定样本是H7N9病毒阳性；2）如果检测样本的一管PCR反应体系中，FAM标记的探针和HEX标记的探针都无明显扩增曲线，或者只有其中一条探针有扩增曲线，则判定样本是H7N9阴性
图1是样本A实时荧光定量PCR检测结果。由图可知，该样本H7和N9都产生扩增曲线，因此样本A为H7N9禽流感病毒阳性。
图2是样本B实时荧光定量PCR检测结果。该样本只有H7产生扩增曲线，因此样本B为H7N9禽流感病毒阴性。
图3是样本C实时荧光定量PCR检测结果。该样本只有N9产生扩增曲线，因此样本C为H7N9禽流感病毒阴性。
图4是样本D实时荧光定量PCR检测结果。该样本H7和N9都无扩增曲线，因此样本D为H7N9禽流感病毒阴性。
  SEQUENCE LISTING
 
<110>  杭州艾迪康医学检验中心有限公司
 
<120>  一种利用实时荧光定量PCR检测H7N9禽流感病毒的引物及方法
 
<130> 
 
<160>  6    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
gggwttcacm tacagyggaa taag                                            24
 
 
<210>  2
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
acaggarcca tttcatctcy gc                                              22
 
 
<210>  3
<211>  31
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
caacsagtgc atgtaggaga tcaggwtctt c                                    31
 
 
<210>  4
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
tgartgcagg ttctatgctc tca                                             23
 
 
<210>  5
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  5
tgtatactgt gggyggtgat ga                                              22
 
 
<210>  6
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  6
ctcaaacgga acaatacacg ataggtccca                                      30
 
 

Claims (3)

1.一种利用实时荧光定量PCR检测H7N9禽流感病毒的引物，其特征在于，所述引物包括：
(1) 检测H7N9禽流感病毒包膜表面血凝素H7的引物及探针：
H7-F: GGGWTTCACMTACAGYGGAATAAG
H7-R: ACAGGARCCATTTCATCTCYGC
H7-probe: FAM-CAACSAGTGCATGTAGGAGATCAGGWTCTTC-TAMARA；
(2) 检测H7N9禽流感病毒神经氨酸酶N9的引物及探针：
N9-F: TGARTGCAGGTTCTATGCTCTCA
N9-R: TGTATACTGTGGGYGGTGATGA
N9-Probe: HEX-CTCAAACGGAACAATACACGATAGGTCCCA-TAMARA。
2.利用实时荧光定量PCR检测H7N9禽流感病毒的方法，其特征在于，所述包括以下步骤：
(1) 用RNA提取试剂提取呼吸道标本的RNA；
(2) 用逆转录试剂将步骤(1)中得到的RNA进行反转录为cDNA；
(3) 使用引物H7-F、H7-R和N9-F、N9-R及相应探针H7-probe、N9-probe在单管PCR反应体系中对步骤(2)得到的cDNA进行实时荧光定量PCR检测；其中
H7-F: GGGWTTCACMTACAGYGGAATAAG
H7-R: ACAGGARCCATTTCATCTCYGC
H7-probe: FAM-CAACSAGTGCATGTAGGAGATCAGGWTCTTC-TAMARA；
N9-F: TGARTGCAGGTTCTATGCTCTCA
N9-R: TGTATACTGTGGGYGGTGATGA
N9-Probe: HEX-CTCAAACGGAACAATACACGATAGGTCCCA-TAMARA。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，实时荧光定量PCR反应程序：95℃ 10min 预变性；95℃ 15sec，58℃ 35sec，39个循环。
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