CN114438077A - 一种提高痕量dna提取收率的试剂、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于提高生物药样本中痕量DNA提取收率的试剂及其使用方法,可以大大提高生物药样本中的痕量DNA的提取收率。同时避免由于提取不完整带来的提取收率不稳定、PCR及荧光定量PCR检测结果不稳定、扩增效率低等问题。可以在生物医药质量检测过程中减少样品使用量,并大大提高检测的灵敏度。同时,由于使用本试剂,可以减少核酸提取的流程,大大减少提取过程的时间,提高提取效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高痕量DNA提取收率的试剂、试剂盒及应用。
背景技术
在生物药产品质量检查中,宿主细胞残留DNA的量,受到严格的控制(参考《中国药典通则3407外源性DNA残留量测定法第三法公示稿》)。由于qPCR方法检测灵敏度高,检测结果可靠,检测速度快,因此,FDA,欧洲食品药品管理局,CFDA,都将其列为生物医药中宿主细胞残留DNA的标准检测方法之一。然而,由于生物药大部分都为蛋白类物质,比如抗体药,融合蛋白,疫苗等等,其药物本身会跟残留的DNA类物质进行非特异性结合,使其无法自然游离于液体体系中,从而无法用于qPCR的检测。虽然,使用酶解法搭配磁珠法可以对生物药中的残留DNA进行提取。但是,随着生物药物纯化工艺的改进和优化,其制剂中残留的DNA物质越来越少。面对现阶段生物药物中的痕量DNA,现存的试剂和方法,都存在提取效果不稳定,提取收率偏低,提取后的样本,荧光定量PCR扩增效率偏低等问题,导致生物药品质检数据的不稳定性。从而导致质量管理中出现假阴性,危害患者的生命安全。而且,现有的提取流程操作复杂,操作时间长,使用效率低下。因此,发明一种可以有效的、稳定的、灵敏的、收率高的生物药痕量DNA提取试剂及其提取方法,对于整个生物医药行业,变得极为迫切。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中痕量DNA提取收率低的缺陷,提供一种提高痕量DNA提取收率的试剂、试剂盒及应用。
为了解决上述技术问题,本发明提供了如下的技术方案:
一种提高痕量DNA提取收率的试剂,其特征在于,包括盐类、酸类和化学品类的水相缓冲液;该试剂的pH为6-10;
所述的盐类为氯化钠、硫酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钾、硝酸钾、乙二胺四乙酸纳、尿素、盐酸胍、碳酸钠、碳酸氢钠中的任意一种或多种;优选为乙二胺四乙酸纳,更优选的,乙二胺四乙酸钠的浓度为0.5mmol/L-5mmol/L。
所述的酸类为盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、甲酸或硼酸中的任意一种或多种;优选为盐酸。
化学品类的水相缓冲液中的化学品为二乙醇胺、丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、丁二酸丁二醇酯、聚乙二醇辛基苯基醚、聚山梨醇酯-20或聚山梨醇酯-80中的任意一种或多种。优选为三羟甲基氨基甲烷和聚乙二醇辛基苯基醚。
其中三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.5mmol/L-50mmol/L。其中聚乙二醇辛基苯基醚的浓度为0.01%-50%。本试剂的最终pH为6-10。优选的pH为7.5-8.5。
优选的,包括0.5mmol/L-5mmol/L的乙二胺四乙酸纳、盐酸、0.5mmol/L-50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷和0.01wt%~50wt%聚乙二醇辛基苯基醚。
优选的,包括0.5mmol/L-3mmol/L的乙二胺四乙酸纳、盐酸、10mmol/L-50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷和0.01wt%~50wt%聚乙二醇辛基苯基醚。
更优选的,包括0.5mmol/L-2mmol/L的乙二胺四乙酸纳、盐酸、10mmol/L-50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷和0.01wt%~1wt%聚乙二醇辛基苯基醚。
该试剂的制备方法,包括如下步骤:
S1、将盐类和三羟甲基氨基甲烷用超纯水搅拌溶解,得到原液一;
优选的,超纯水的量不高于所需配制的试剂总量的70%。
S2、配置聚乙二醇辛基苯基醚原液;
S3、将原液一与原液二混合,加入盐酸,调整pH为6-10,然后使用超纯水液配平到所需配制的试剂的量。
进一步的,S2中配置聚乙二醇辛基苯基醚原液时先称取聚乙二醇辛基苯基醚,然后再加入超纯水。
进一步的,S2中配置聚乙二醇辛基苯基醚原液时,可称取若干倍所需的聚乙二醇辛基苯基醚的质量,稀释配置后再量取相应所需的体积。
优选的,S2配置时,采用的搅拌方式为转子磁力棒搅拌溶解,搅拌转速为1000RPM-50RPM。采用磁力棒搅拌溶解可以很好的避免溶解不完全或者产生大量气泡,进而导致浓度不标准的问题。
进一步的,S2中磁力棒长径达到容器底部直径的2/3或以上时,搅拌转速≤不超过150RPM;磁力棒长径短于容器底部直径的1/5时搅拌转速≤300RPM。
否则转速太快会起泡。转速太慢的话就会特别粘稠,难以溶解。
可将本发明的试剂应用在试剂盒中,或者DNA的提取中。
本发明所达到的有益效果是:本发明的试剂,可以防止痕量的DNA吸附在试管壁,容器壁,枪头等实验过程中必须使用的耗材上。而痕量DNA本身就浓度很低很低,量很少。一旦有一些的吸附,就根本提取不到了。而且,一旦有吸附,就会产生实验结果不稳定,实验无法重复。实验结果就不可信,本发明的试剂通过降低DNA吸附在其他东西上,可以稳定的以游离态存在于试剂中,从而可提高核酸提取的收率,提高了核酸提取实验的可重复性,并且大大提高了核酸提取后样本的稳定性。同时,使用本新型核酸提取试剂后,样本用于荧光定量PCR,扩增效率大大提高,扩增稳定性,扩增曲线标准程度,都获得了较大程度的提高。使整个流程满足且远远超出了生物药品质量控制的要求。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与本发明的实施例一起用于解释本发明,并不构成对本发明的限制。在附图中:
图1是TE buffer稀释标准品,经qPCR扩增检测的扩增曲线;
图2是TE Buffer稀释标准品,经qPCR扩增检测的标准曲线;
图3本试剂稀释标准品,经qPCR扩增检测的扩增曲线;
图4是本试剂稀释标准品,经qPCR扩增检测的标准曲线;
图5是模拟宿主细胞残留DNA的加标提取使用TE buffer洗脱后,进行qPCR的检测扩增曲线(重复10次);
图6是模拟宿主细胞残留DNA的加标提取使用本发明试剂洗脱后,进行qPCR的检测扩增曲线(重复10次);
图7是H公司生物药不同样本的宿主细胞残留DNA的加标提取,使用TE buffer进行洗脱后,进行qPCR的检测扩增曲线。
图8是H公司生物药不同样本的宿主细胞残留DNA的加标提取,使用本发明试剂进行洗脱后,进行qPCR的检测扩增曲线。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明,应当理解,此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1
一种提高痕量DNA提取收率的试剂,包括1mmol/L的乙二胺四乙酸纳、10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷和0.1wt%聚乙二醇辛基苯基醚,用盐酸调节pH为8
实施例2:
一种提高痕量DNA提取收率的试剂,包括0.5mmol/L的乙二胺四乙酸纳、10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷和0.1wt%聚乙二醇辛基苯基醚,用盐酸调节pH为7.5
实施例3:
一种提高痕量DNA提取收率的试剂,包括1mmol/L的乙二胺四乙酸纳、40mmol/L的三羟甲基氨基甲烷和0.1wt%聚乙二醇辛基苯基醚,用盐酸调节pH为8.5
实施例4:
一种提高痕量DNA提取收率的试剂,包括1mmol/L的乙二胺四乙酸纳、10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷和0.3wt%聚乙二醇辛基苯基醚,用盐酸调节pH为8
实施例1-4的制备方法如下:
称取乙二酸四乙酸纳和三羟甲基氨基甲烷。然后将上述称取的物质加入相应量的超纯水中,超纯水的量不高于所需配制的试剂总量的70%。搅拌溶解,设为为原液一。同时,根据需要配制的试剂总量,称取所需的聚乙二醇辛基苯基醚的量的10倍的质量。然后将所需的试剂总量的超纯水加入到称取的聚乙二醇辛基苯基醚中,搅拌溶解,为聚乙二醇辛基苯基醚原液。然后,将10%的聚乙二醇辛基苯基醚原液,加入到溶解好的原液一中。最后,使用盐酸调整溶液的pH。然后使用超纯水将溶液配平到所需配制的试剂的量。
聚乙二醇辛基苯基醚原液配制时,必须首先称取聚乙二醇辛基苯基醚,然后再加入超纯水。如果先加入水,再加入本化学品,则会影响本化学品在水中的溶解。当然也可以先加入,再加本化学品。但是,会产生气泡。而且,由于化学品浓度低,先加水称量会很不准确。
配置时使用无腰带的平滑圆头磁力搅拌棒在室温下,采用100RPM搅拌过夜。
本试剂的使用方法,包括如下步骤:
S1、向离心管中加入100μL样本,做好标记和记录;
S2、加入10μL裂解液,充分涡旋混匀10s后,瞬时离心;
S3、加入20μL裂解液,充分涡旋混匀25s,瞬时离心;
若样本蛋白浓度高于100mg/mL,需增加裂解液的投入量以及延长消化时间,推荐投入40μL裂解液,消化时间延长至1h;
S4、56℃消化30min;
S5、待样本消化完毕后,瞬时离心,待用;
S6、加入360μL裂解液,涡旋混匀10s,瞬时离心;
S7、加入30μL磁珠悬浮液以及300μL异丙醇,充分涡旋混匀5min,瞬时离心后待用;
磁珠悬浮液使用前请务必充分涡旋混匀,加样过程中间隔2-3个样本需将磁珠再次涡旋混匀,以保证每次加入的磁珠量的一致性。
S8、将离心管置于磁力架上至磁珠吸附完全,保持离心管固定于磁力架上,用移液器吸弃上清液,期间避免接触磁珠;
磁珠完全分离时间约5min。
S9、将离心管从磁力架上取下,加入300μL洗涤液,充分涡旋混匀10s,瞬时离心后重新置于磁力架上磁性分离,待磁珠吸附完全后,保持离心管固定于磁力架上,用移液器吸弃上清液,期间避免接触磁珠。
□磁珠完全分离时间约2~3min。
S10、将离心管从磁力架上取下,再次加入300μL洗涤液,充分涡旋混匀25s,瞬时离心后重新置于磁力架上磁性分离,待磁珠吸附完全后,保持离心管固定于磁力架上,用移液器吸弃上清液,期间避免接触磁珠。
□磁珠完全分离时间约1min。
S11、为保证液体充分移除,需将离心管再次短暂离心10s,重新置于磁力架上磁性分离,待磁珠完全分离后,用10μL移液器小心的将残余液体吸弃干净。
□磁珠完全分离时间约1min。
S12、从磁力架上取下离心管,打开管盖在室温下干燥3min。
□此步骤应该在通风情况良好的环境下操作,注意避免磁珠过分干燥。
S13、沿离心管壁加入50μL-100μL本发明试剂,充分涡旋混匀10s,瞬时离心后置于70℃温浴7min,期间间隔2~3min涡旋混匀1次。本发明试剂加入体积为50-100μL,实验者可根据实际情况设定本试剂加入体积。
S14、孵育完成后,将离心管12000rpm离心3min,然后静置于磁力架上,待磁珠分离后,用移液器小心转移溶液到干净的离心管中,所得液体即为样本纯化液。可直接用于qPCR或者普通PCR等多种应用。
□磁珠完全分离时间约2~3min。
使用实施例1-4的试剂进行洗脱,并进行模拟宿主细胞残留DNA的加标提取,并进行qPCR检测,具体操作步骤同实验3,模拟宿主细胞残留DNA的加标提取使用如下试剂洗脱后,qPCR测得的提取收率。
以下采用实施例1制备的实际进行验证实验
实验1:使用TE Buffer稀释CHO DNA定量参考品(20ng/μL),稀释后做qPCR检测,具体操作如下:
(1)TE Buffer配制
提供的原材料何配方,按下表进行配制。然后调节pH至8,获得普通TE Buffer。
TE Buffer配制表
1L TE Buffer配制(PH=8.0)
*使用1mol/L HCL溶液将PH调至8.0
(2)标准品稀释
①取7支低吸附离心管,分别标记为ST0、ST1、ST2、ST3、ST4、ST5、ST6。
②每管分别加入90μL TE Buffer。
③取10μL的CHO DNA定量参考品,加入ST0管,振荡混匀后短时间快速离心5s,重复3次以确保定量参考品与DNA稀释液充分混匀。
④按表1依次进行6次稀释操作,稀释步骤同上。
表1.DNA定量参考品的稀释
稀释管 | 稀释步骤 | 浓度(pg/μL) |
ST0 | 10μLDNA定量参考品+90μL稀释液 | 2000 |
ST1 | 10μLST0+90μL稀释液 | 200 |
ST2 | 10μLST1+90μL稀释液 | 20 |
ST3 | 10μLST2+90μL稀释液 | 2 |
ST4 | 10μLST3+90μL稀释液 | 0.2 |
ST5 | 10μLST4+90μL稀释液 | 0.02 |
ST6 | 10μLST5+90μL稀释液 | 0.002 |
上述CHO DNA定量参考品来源于南京正扬生物科技有限公司生产的CHO细胞残留DNA检测试剂盒(荧光法)。
(3)qPCR工作液配制
共检测21个样品,取315μL qPCR Master Mix、105μL引物探针混合液混合成qPCR工作液,qPCR Master Mix和引物探针混合液均来源于南京正扬生物科技有限公司生产的CHO细胞残留DNA检测试剂盒(荧光法)。
(4)qPCR加样
1、取96孔PCR板,在所需各孔内先加入20μL反应混合液。
2、分别加入10μLST1、ST2、ST3、ST4、ST5、ST6 DNA标准品溶液、TE Buffer,所有加样均为3复孔。
3、粘性膜封板,离心,确保试管中无气泡,待测。
(5)qPCR扩增检测
qPCR仪为AB公司7500qPCR仪、软件版本2.0:
1、创建新运行程序,实验类型选择定量—标准曲线,试剂类型选择TaqMan。
2、选择检测探针,命名为CHO-DNA,选择报告荧光集团为FAM,猝灭荧光基团为TAMRA。
3、根据样品加样位置选择相应孔位,标准品在Task一栏设置为Standard,并在Quantity一栏中输入对应的浓度(单位为pg/μL),其余测试品在Task一栏均设置为Unknown
4、检测参比荧光为ROX。
5、设置三步法反应程序:37℃2min;95℃30s;95℃10s,60℃30s采集荧光,40个循环;反应体积为30μL。
具体检测结果:扩增曲线及标准曲线见附图1、附图2。
实验2:
模拟宿主细胞残留DNA的加标提取,使用TE buffer进行洗脱,并进行qPCR检测,具体操作方法同实验1,其不同在于定量参考品稀释液是本试剂。其配制方法为:
提供原材料,然后按下表所述配方将各原料进行混合,然后调节pH至8,获得本研发试剂。
本试剂配制表
1L本研发试剂配制(PH=8)
*使用HCL溶液将PH调至8
然后,按照同实验1的方法使用本试剂进行标准品的稀释制备,然后进行qPCR的检测。具体检测结果:扩增曲线及标准曲线见附图3、附图4。
由实验1和实验2可以看出,使用本试剂后,qPCR的扩增曲线更加平滑,重复性更好,标准曲线的扩增效率,从使用TE buffer的82%(图2),上升到99%。标准差值从0.998(图2)上升到1。常规情况下,标准曲线的扩增效率在90%以下,则认为实验不准确,结果不可用。因此,使用本试剂很好的保证了实验的稳定性,准确性,可重复性。
实验3模拟宿主细胞残留DNA的加标提取,使用TE Buffer进行洗脱,并进行qPCR检测。
使用BSA溶液和CHO DNA标准品配制加标回收测试样品,提取步骤的洗脱环节使用TE Buffer进行洗脱,得到的样品纯化液做qPCR检测。具体操作如下:
(1)TE Buffer溶液配制;
(2)标准品稀释;
(3)加标回收样品制备:称量0.04g BSA溶解于2mLPBS溶液中,然后取990μLBSA溶液至洁净的EP管中,再向EP管中加入110μL ST5 DNA标准品溶液,振荡混匀后以100μL每管分装10管,进行残留DNA提取;
(4)向样本中加入10μL裂解液1,充分涡旋混匀。加入20μL裂解液2,充分涡旋混匀。56℃消化30min。加入360μL裂解液3,涡旋混匀。加入30μL磁珠悬浮液、300μL异丙醇,充分涡旋混匀5min,将离心管置于磁力架上至磁珠吸附完全,用移液器吸弃上清液。将离心管从磁力架上取下,加入300μL洗涤液,充分涡旋混匀后重新置于磁力架上磁性分离,待磁珠吸附完全后,用移液器吸弃上清液。将离心管从磁力架上取下,再次加入300μL洗涤液,充分涡旋混匀25s,瞬时离心后重新置于磁力架上磁性分离,待磁珠吸附完全后,保持离心管固定于磁力架上,用移液器吸弃上清液,期间避免接触磁珠。将离心管再次短暂离心10s,重新置于磁力架上磁性分离,待磁珠完全分离后,用10μL移液器小心的将残余液体吸弃干净。从磁力架上取下离心管,打开管盖在室温下干燥3min。沿离心管壁加入100μL TE Buffer,充分涡旋混匀后置于70℃温浴7min,期间间隔2~3min涡旋混匀1次,孵育完成后,将离心管12000rpm离心3min,然后静置于磁力架上,待磁珠分离后,用移液器小心转移溶液到干净的离心管中,所得液体即为样本纯化液。
(5)qPCR加样
取96孔PCR板,在所需各孔内先加入20μL反应混合液。
分别加入10μLST1、ST2、ST3、ST4、ST5、ST6 DNA标准品溶液、TE Buffer、样品纯化液,所有加样均为3复孔。
粘性膜封板,离心,确保试管中无气泡,待测。
qPCR扩增检测,操作步骤同实验1的(5),检测结果见附图5。
模拟宿主细胞残留DNA的加标提取使用TE buffer洗脱后,测得的提取收率(重复10次)
实验4:模拟宿主细胞残留DNA的加标提取,使用本发明试剂进行洗脱,并进行qPCR检测,具体操作步骤同实验3,不同之处于洗脱步骤使用本发明试剂进行洗脱。
模拟宿主细胞残留DNA的加标提取使用TE buffer洗脱后,测得的提取收率(重复10次)
由实验3和实验4可见,在痕量DNA提取过程中,非常容易受到其他物质的干扰。整个检测过程也多个步骤。任何一个步骤的微量干扰偏差,都有可能导致最终结果产生巨大偏差。国家药监局对于这一类实验的国标是50%-150%,而本发明可以将收率维持在100%上下。
实验5:使用H公司提供的生物药样本做加标回收测试,按照100uL样本加10uL0.02pg/μL CHO DNA的操作步骤制备加标回收测试样本,制备完成后,进行DNA提取,具体操作步骤同实验4。具体检测结果见附图6和附图7。
由图5可以看出,使用常规的TE buffer洗脱时,会出现后续qPCR检测的不稳定。10次重复后曲线并不能很好的重合。离散度较大。由图6可以看出,采用本发明的试剂后,重复时曲线的重合度较好,说明qPCR检测稳定。
实验6:使用H公司提供的生物药样本做加标回收测试,按照100uL样本加10uL0.02pg/μL CHO DNA的操作步骤制备加标回收测试样本,制备完成后,进行DNA提取,具体操作步骤同实验4,不同之处在于洗脱步骤使用本发明试剂作为洗脱液进行洗脱,得到的样本纯化液在ABI 7500荧光定量PCR仪中扩增检测。具体检测结果见附图8。
由图7和图8可以看出,采用生物样本进行的真实检测过程中,本发明的试剂可以不受样品复杂度的干扰,比TE更稳定,更精准,曲线重合度高。
H公司生物药不同样本的宿主细胞残留DNA的加标提取,使用不同试剂进行洗脱后,测得的DNA残留浓度。
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种提高痕量DNA提取收率的试剂,其特征在于,包括盐类、酸类和化学品类的水相缓冲液;该试剂的pH为6-10;
所述的盐类为氯化钠、硫酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钾、硝酸钾、乙二胺四乙酸纳、尿素、盐酸胍、碳酸钠、碳酸氢钠中的任意一种或多种;
所述的酸类为盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、甲酸或硼酸中的任意一种或多种;
化学品类的水相缓冲液中的化学品为二乙醇胺、丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、丁二酸丁二醇酯、聚乙二醇辛基苯基醚、聚山梨醇酯-20或聚山梨醇酯-80中的任意一种或多种。
2.如权利要求1所述的提高痕量DNA提取收率的试剂,其特征在于,包括0.5mmol/L-5mmol/L的乙二胺四乙酸纳、盐酸、0.5mmol/L-50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷和0.01wt%~50wt%聚乙二醇辛基苯基醚。
3.如权利要求1所述的提高痕量DNA提取收率的试剂,其特征在于,包括0.5mmol/L-2mmol/L的乙二胺四乙酸纳、盐酸、10mmol/L-50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷和0.01wt%~1wt%聚乙二醇辛基苯基醚。
4.权利要求2所述的提高痕量DNA提取收率的试剂的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1、将盐类和三羟甲基氨基甲烷用超纯水搅拌溶解,得到原液一;
S2、配置聚乙二醇辛基苯基醚原液;
S3、将原液一与原液二混合,加入盐酸,调整pH为6-10,然后使用超纯水液配平到所需配制的试剂的量。
5.如权利要求3所述的制备方法,其特征在于,S2中配置聚乙二醇辛基苯基醚原液时先称取聚乙二醇辛基苯基醚,然后再加入超纯水。
6.如权利要求4或5所述的制备方法,其特征在于,S2中配置聚乙二醇辛基苯基醚原液时,可称取若干倍所需的聚乙二醇辛基苯基醚的质量,稀释配置后再量取相应所需的体积。
7.如权利要求4或5所述的制备方法,其特征在于,S2配置时,采用的搅拌方式为转子磁力棒搅拌溶解,搅拌转速为1000RPM-50RPM。
8.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,S2中磁力棒长径达到容器底部直径的2/3或以上时,搅拌转速≤150RPM;磁力棒长径短于容器底部直径的1/5时搅拌转速≤300RPM。
9.一种试剂盒,其特征在于,包含权利要求1或2所述的试剂。
10.权利要求1或2所述的试剂在DNA提取中的应用。
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