CN118209721A - 一种甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸及其制备方法，包括如下制备步骤：步骤一：胶体金稀释液制备；步骤二：胶体金颗粒溶液制备；步骤三：胶体金标记蛋白结合物溶液的制备；步骤四：样品垫制备；步骤五：标记垫制备；步骤六：反应垫制备；步骤七：吸水垫制备；步骤八：组装，得甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸。本申请提供的一种甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸的制备方法，能够制得与甲型各常见亚型(H1N1、H2N2和H3N2)的血凝素均反应的高敏感性的快速检测试纸，且在室外环境下较长时间存放仍保持高有效性。
Description
技术领域
本申请涉及传染病诊断、生物检测技术领域，尤其涉及一种甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸及其制备方法。
背景技术
流行性感冒病毒(简称流感病毒)是引起流行性感冒的病原体，流行性感冒是由甲、乙、丙三型流感病毒分别引起的急性呼吸道传染病，它传染性强、传播快、潜伏期短、发病率高，其中以甲型流感病毒感染为主。预防流感，就必须尽快筛选出感染者，然后对传染源进行控制，从而防止流感的大范围暴发。
流感病毒是一种变异速率非常快的RNA病毒，自然界中像流感病毒这样变异频繁、变异幅度大的生物是少有的。在流感病毒的8个基因中，HA变异最快，其次是NA。如甲型流感病毒的HA基因每年每个核苷酸变异的概率为3～4x10-3，而细胞染色体DNA的突变率仅为10-8～10-10。每当因病毒抗原变异而出现新的病毒品种时，原有的检测方法和预防手段失效而不能及时控制疾病的发生和传播。以禽流感为例，1968年以来所发生的流行事件的不只是H5N1亚型毒株，还包括有H7N2，H7N3，H7N7和H9N2毒株等它们均可以感染人类。
目前实时荧光定量PCR方法是检测流感病毒灵敏度和准确率都比较高的方法，该方法已经是鉴定流感感染阳性病例的确诊性方法。但是实时荧光定量PCR方法的实验检测条件限制了该方法只能用于流感病毒的最终实验室确定性检测。而敏感度、准确率低于实时荧光定量PCR技术的免疫胶体金技术、酶联免疫检测技术等方法由于操作简便、成本低廉、对实验条件要求低等特点被广泛应用在流感病毒检测的第一线。但是，目前市场上销售的流感病毒免疫胶体金检测试剂盒区分甲型或者乙型流感病毒用的是抗流感病毒核蛋白的单克隆抗体，优点在于可以很好地区分甲型和乙型流感病毒，但缺点在于核蛋白位于病毒核心内，临床标本直接检测敏感度低，容易出现漏检。流感病毒血凝素位于流感病毒表面，是进行快速检测的理想靶点，但是由于流感病毒血凝素易于突变，常用于作为流感病毒亚型分类的依据，检测试纸作为检测试剂盒的核心部分，是否可以制备出与甲型各常见亚型(H1N1、H2N2和H3N2)的血凝素均反应的高敏感性的快速检测试纸是本领域技术人员亟需解决的技术问题。
另一方面，疾病的不可预期性导致检测机构往往需要提前囤积大量检测试纸，大部分的检测站无法提供恒温恒湿的仓储环境，因此也需要检测试纸仅依靠塑封包装袋能够在室外环境下较长时间存放且保持有效。
发明内容
为了解决上述问题，本发明目的是提供一种甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸及其制备方法，包括：
一方面，本申请提供了一种甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：胶体金稀释液制备：
每100ml胶体金稀释液中包括2.3g鱼胶蛋白粉、7.5g蔗糖、0.1g吐温-20、1g叠氮钠和0.02molpH为7.4的Tris缓冲液，其余部分用纯化水补足；
步骤二：胶体金颗粒溶液制备：
取质量浓度为0.01％的氯金酸水溶液500ml，倒入真空分散机，红外辅助加热至87℃，加入质量浓度为4.3％的还原型谷胱甘肽水溶液76mL，搅拌分散15min至出现深酒红色，得到47nm胶体金颗粒溶液；
步骤三：胶体金标记蛋白结合物溶液的制备：
将胶体金颗粒溶液加入碱性鱼精蛋白调节胶体金溶液的pH值到8.7，然后经静态混合器循环混合的状态下加入38ml甲流病毒血凝素抗体溶液，红外辅助加热至36℃，循环34分钟，再加入鱼胶蛋白粉23g，循环23分钟，分步离心，先2000rpm离心10分钟，上清继续8700rpm离心10分钟，两次离心的沉淀混合到一起，用胶体金稀释液复溶至原体积的1/13制成胶体金标记蛋白结合物溶液，2℃暂存；
步骤四：样品垫制备；步骤五：标记垫制备；步骤六：反应垫制备；步骤七：吸水垫制备；步骤八：组装，得甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸。
进一步地，所述样品垫制备包括：
将玻璃纤维膜切成大小合适的条状，并用样品垫处理液处理切好的条状玻璃纤维膜，然后进行干燥处理并保存。
进一步地，所述标记垫制备包括：
将玻璃纤维膜切成大小合适的条状，将其浸泡到胶体金标记蛋白结合物溶液中，然后进行干燥处理并保存。
进一步地，所述反应垫制备包括：
用PBS溶液调节甲流病毒血凝素抗体溶液，并将其分别包被在裁剪好的硝酸纤维素膜上的检测线T线、对照线C线上，烘干备用。
进一步地，所述吸水垫制备和组装包括：
吸水垫制备：将吸水滤纸按30cm*1.7cm的规格裁切成条状备用；
组装：吸水纸一端扣压在硝酸纤维素膜一端上，胶体金垫一端扣压在硝酸纤维素膜另一端上，样品垫一端扣压在胶体金垫另一端上，得甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸。
进一步地，所述真空分散机的分散盘转速2100rpm，真空泵抽气至0.8bar。
进一步地，所述静态混合器的空隙率设为88％，所述循环的液体流量为0.97m3/h。
另一方面，本申请提供了一种利用上述制备方法制备获得的甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸。
通过本申请能够带来如下有益效果：
本申请提供的一种甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸的制备方法，真空分散机与红外辅助加热、生物性还原剂(还原型谷胱甘肽)配合，能够充分且稳定地促进金盐还原并形成稳定的胶体金颗粒溶液；静态混合器配合红外辅助加热、碱性鱼精蛋白和鱼胶蛋白粉，不仅使胶体金颗粒和甲流病毒血凝素抗体和鱼胶蛋白粉充分混合接触，而且本申请中静态混合器的特定空隙率使液体通过时产生湍流，方便热传递，使热量充分且均匀的，能够制得与甲型各常见亚型(H1N1、H2N2和H3N2)的血凝素均反应的高敏感性的快速检测试纸，且在室外环境下较长时间存放仍保持高有效性。
具体实施方式
此处为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面以实施例的方式对本发明的整体方案进行详细说明；在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解；然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施；在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
本申请中鱼胶蛋白粉购自湖北紫晶源生物科技有限公司，货号0192；真空分散机购自安徽聚铬机械设备有限公司，型号SM-540；还原型谷胱甘肽购自四川省维克奇生物科技有限公司，编号WKQ-0002025；碱性鱼精蛋白购自山西信诺生物科技有限公司，货号XN-0613-702；静态混合器购自上海重野实业有限公司，型号SV-2.3；甲流病毒血凝素抗体溶液购自梵态生物，包含H1N1、H2N2和H3N2型的血凝素抗体。
如未特殊说明，下述实施例中各原料组分均可通过商业途径购得，所使用的实验仪器均为实验室常规实验仪器，性能测试方法为本领域已知测试方法。
优选的实施方式如下：
采用以下方法制备获得甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸：
步骤一：胶体金稀释液制备：
混合鱼胶蛋白粉、蔗糖、吐温-20、叠氮钠、Tris缓冲液和纯化水；
步骤二：胶体金颗粒溶液制备：
取氯金酸水溶液，倒入真空分散机，红外辅助加热，加入还原型谷胱甘肽水溶液，搅拌分散，得到胶体金颗粒溶液；
步骤三：胶体金标记蛋白结合物溶液的制备：
将胶体金颗粒溶液加入碱性鱼精蛋白调节胶体金溶液的pH值，然后经静态混合器循环混合的状态下加入甲流病毒血凝素抗体溶液，红外辅助加热，循环，再加入鱼胶蛋白粉，循环，分两步离心，两次离心的沉淀混合到一起，用胶体金稀释液复溶制成胶体金标记蛋白结合物溶液，2℃暂存；
步骤四：样品垫制备：将玻璃纤维膜切成大小合适的条状，并用样品垫处理液处理切好的条状玻璃纤维膜，然后进行干燥处理并保存。
步骤五：标记垫制备：将玻璃纤维膜切成大小合适的条状，将其浸泡到胶体金标记蛋白结合物溶液中，然后进行干燥处理并保存。
步骤六：反应垫制备：用PBS溶液调节甲流病毒血凝素抗体溶液，并将其分别包被在裁剪好的硝酸纤维素膜上的检测线T线、对照线C线上，烘干备用。
步骤七：吸水垫制备：将吸水滤纸按30cm*1.7cm的规格裁切成条状备用；
步骤八：组装：吸水纸一端扣压在硝酸纤维素膜一端上，胶体金垫一端扣压在硝酸纤维素膜另一端上，样品垫一端扣压在胶体金垫另一端上，得甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸。
实施例1
采用以下方法制备获得甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸：
步骤一：胶体金稀释液制备：
每100ml胶体金稀释液中包括2.3g鱼胶蛋白粉、7.5g蔗糖、0.1g吐温-20、1g叠氮钠和0.02molpH为7.4的Tris缓冲液，其余部分用纯化水补足；
步骤二：胶体金颗粒溶液制备：
取质量浓度为0.01％的氯金酸水溶液500ml，倒入真空分散机，红外辅助加热至87℃，加入质量浓度为4.3％的还原型谷胱甘肽水溶液76mL，搅拌分散15min至出现深酒红色，得到47nm胶体金颗粒溶液，真空分散机的分散盘转速2100rpm，真空泵抽气至0.8bar；
步骤三：胶体金标记蛋白结合物溶液的制备：
将胶体金颗粒溶液加入碱性鱼精蛋白调节胶体金溶液的pH值到8.7，然后经静态混合器循环混合的状态下加入38ml甲流病毒血凝素抗体溶液，静态混合器的空隙率设为88％，所述循环的液体流量为0.97m3/h，红外辅助加热至36℃，循环34分钟，再加入鱼胶蛋白粉23g，循环23分钟，分步离心，先2000rpm离心10分钟，上清继续8700rpm离心10分钟，两次离心的沉淀混合到一起，用胶体金稀释液复溶至原体积的1/13制成胶体金标记蛋白结合物溶液，2℃暂存；
步骤四：样品垫制备：将玻璃纤维膜切成大小合适的条状，并用样品垫处理液处理切好的条状玻璃纤维膜，然后进行干燥处理并保存；样品垫处理液为：质量分数为0.5％的海藻糖、0.05％的聚乙烯吡咯烷酮、0.05％的Tween-20和0.05％的TritonX-100溶解于pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液中制成。
步骤五：标记垫制备：将玻璃纤维膜切成大小合适的条状，将其浸泡到胶体金标记蛋白结合物溶液中，然后进行干燥处理并保存。
步骤六：反应垫制备用PBS溶液调节甲流病毒血凝素抗体溶液，并将其分别包被在裁剪好的硝酸纤维素膜上的检测线T线、对照线C线上，烘干备用。
步骤七：吸水垫制备：将吸水滤纸按30cm*1.7cm的规格裁切成条状备用；
步骤八：组装：吸水纸一端扣压在硝酸纤维素膜一端上，胶体金垫一端扣压在硝酸纤维素膜另一端上，样品垫一端扣压在胶体金垫另一端上，得甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸。
实施例2-4
实施例2-4与实施例1的区别仅在于组分的不同；实施例2中鱼胶蛋白粉换为BSA(牛血清白蛋白)；实施例3中还原型谷胱甘肽换为柠檬酸三钠；实施例4中碱性鱼精蛋白换为碳酸钾。
实施例5
实施例5与实施例1的区别仅在于：
实施例5的步骤二中不使用真空分散机和红外辅助加热，改为普通搅拌机并直接电加热至相同温度。
实施例6
实施例6与实施例1的区别仅在于：
实施例6的步骤三中不使用静态混合器和红外辅助加热，改为普通搅拌机并直接电加热至相同温度。
实施例7
实施例7与实施例1的区别仅在于：
实施例7中鱼胶蛋白粉、还原型谷胱甘肽和碱性鱼精蛋白的使用的重量比实施例1高一倍。
对比例1
对比例1为购自广州健仑生物科技有限公司的甲型流感病毒抗原检测试剂盒(胶体金法)。
对上述各示例制成的甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸进行与甲型各常见亚型(H1N1、H2N2和H3N2)的血凝素反应灵敏度和在室外环境下较长时间存放后有效性的性能测试。
各实施例、对比例与甲型各常见亚型(H1N1、H2N2和H3N2)混合的血凝素反应灵敏度性能测试结果见表1。在表1中，反应灵敏度性能以肉眼观测的检测线T线的颜色深浅为准，由浅到深分为1～5，5个等级。
表1
| 示例 | 颜色等级 |
| 实施例1 | 5 |
| 实施例2 | 3 |
| 实施例3 | 3 |
| 实施例4 | 4 |
| 实施例5 | 2 |
| 实施例6 | 2 |
| 实施例7 | 3 |
| 对比例1 | 2 |
由表1中的数据可知，相较于市售的商品化甲型流感病毒抗原检测试剂盒(胶体金法)、现有技术中直接将全部组分混合均匀制成的甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸和不同重量份的组分的甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸，本申请提供的甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸的制备方法制备的甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸的与甲型各常见亚型(H1N1、H2N2和H3N2)混合的血凝素反应灵敏度性能最好。
各实施例、对比例在室外环境(30℃，空气湿度60％，3个月)下较长时间存放后有效性的性能测试结果见表2。在表2中，反应灵敏度性能以肉眼观测的检测线T线的颜色深浅为准，由浅到深分为1～5，5个等级。
表2
| 示例 | 颜色等级 |
| 实施例1 | 5 |
| 实施例2 | 2 |
| 实施例3 | 4 |
| 实施例4 | 3 |
| 实施例5 | 3 |
| 实施例6 | 4 |
| 实施例7 | 3 |
| 对比例1 | 3 |
由表2中的数据可知，相较于市售的商品化甲型流感病毒抗原检测试剂盒(胶体金法)、现有技术中直接将全部组分混合均匀制成的甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸和不同重量份的组分的甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸，本申请提供的甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸的制备方法制备的甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸的在室外环境(30℃，空气湿度60％，3个月)下较长时间存放后有效性保持的更好。
综合上述可知，本申请提供的一种甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸的制备方法，真空分散机与红外辅助加热、生物性还原剂(还原型谷胱甘肽)配合，能够充分且稳定地促进金盐还原并形成稳定的胶体金颗粒溶液；静态混合器配合红外辅助加热、碱性鱼精蛋白和鱼胶蛋白粉，不仅使胶体金颗粒和甲流病毒血凝素抗体和鱼胶蛋白粉充分混合接触，而且本申请中静态混合器的特定空隙率使液体通过时产生湍流，方便热传递，使热量充分且均匀的，能够制得与甲型各常见亚型(H1N1、H2N2和H3N2)的血凝素均反应的高敏感性的快速检测试纸，且在室外环境下较长时间存放仍保持高有效性。
以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请；对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化；凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。
Claims (8)
1.一种甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：胶体金稀释液制备：
每100ml胶体金稀释液中包括2.3g鱼胶蛋白粉、7.5g蔗糖、0.1g吐温-20、1g叠氮钠和0.02molpH为7.4的Tris缓冲液，其余部分用纯化水补足；
步骤二：胶体金颗粒溶液制备：
取质量浓度为0.01％的氯金酸水溶液500ml，倒入真空分散机，红外辅助加热至87℃，加入质量浓度为4.3％的还原型谷胱甘肽水溶液76mL，搅拌分散15min至出现深酒红色，得到47nm胶体金颗粒溶液；
步骤三：胶体金标记蛋白结合物溶液的制备：
将胶体金颗粒溶液加入碱性鱼精蛋白调节胶体金溶液的pH值到8.7，然后经静态混合器循环混合的状态下加入38ml甲流病毒血凝素抗体溶液，红外辅助加热至36℃，循环34分钟，再加入鱼胶蛋白粉23g，循环23分钟，分步离心，先2000rpm离心10分钟，上清继续8700rpm离心10分钟，两次离心的沉淀混合到一起，用胶体金稀释液复溶至原体积的1/13制成胶体金标记蛋白结合物溶液，2℃暂存；
步骤四：样品垫制备；步骤五：标记垫制备；步骤六：反应垫制备；步骤七：吸水垫制备；步骤八：组装，得甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸。
2.根据权利要求1所述的甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸的制备方法，其特征在于，所述样品垫制备包括：
将玻璃纤维膜切成大小合适的条状，并用样品垫处理液处理切好的条状玻璃纤维膜，然后进行干燥处理并保存。
3.根据权利要求2所述的甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸的制备方法，其特征在于，所述标记垫制备包括：
将玻璃纤维膜切成大小合适的条状，将其浸泡到胶体金标记蛋白结合物溶液中，然后进行干燥处理并保存。
4.根据权利要求3所述的甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸的制备方法，其特征在于，所述反应垫制备包括：
用PBS溶液调节甲流病毒血凝素抗体溶液，并将其分别包被在裁剪好的硝酸纤维素膜上的检测线T线、对照线C线上，烘干备用。
5.根据权利要求4所述的甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸的制备方法，其特征在于，所述吸水垫制备和组装包括：
吸水垫制备：将吸水滤纸按30cm*1.7cm的规格裁切成条状备用；
组装：吸水纸一端扣压在硝酸纤维素膜一端上，胶体金垫一端扣压在硝酸纤维素膜另一端上，样品垫一端扣压在胶体金垫另一端上，得甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸。
6.根据权利要求1所述的甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸的制备方法，其特征在于，所述真空分散机的分散盘转速2100rpm，真空泵抽气至0.8bar。
7.根据权利要求1所述的甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸的制备方法，其特征在于，所述静态混合器的空隙率设为88％，所述循环的液体流量为0.97m3/h。
8.一种如权利要求1-7任一所述的制备方法制备得到的甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202310206758.XA CN118209721A (zh) | 2023-02-28 | 2023-02-28 | 一种甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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2023
- 2023-02-28 CN CN202310206758.XA patent/CN118209721A/zh active Pending
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