JPH01289499A - 分離による核酸検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、高感度用プローブを用いる核酸配列の検出に
関する。

〔従来の技術及び解決すべき課題〕

今日、生物学は、多くの点でタンパク質と核酸の化学と
言える。核酸は全ての生体に見出される。

種又は宿主ごとに、その特定の宿主の遺伝子型及び表現
型を提供する独特の配列が存在する。従って、特定の配
列の存在を特定の菌株又は種の目安として利用すること
ができる。多くの場合、数多くの菌株が他の菌株又は種
と異なる共通の配列を共有しているので、特定の菌株を
検出できるだけでなく、必要に応じて、亜種、種又は属
を検出することが可能である。更に、ＲＮＡ又はＤＮＡ
を識別して、特定の遺伝子が発現するかどうか、−種以
上の対立遺伝子の存在、発現レベル等を決定することが
できる。Ｂ細胞及びＴ細胞等の細胞がゲノムの組換えに
関与する場合、プローブを用いてこのような組換えの有
無を検出することができる。このようなことから、特定
の核酸配列を検出することは、病気の状態の診断、細胞
のセット又はサブセットの存在、バクテリア、原生生物
又はビールス等の病原体の特定の菌株又は種等の存在等
の決定の強力な手段となる。

配列の検出分離は、分子生物学の分野においても重要で
ある。従って、構造遺伝子、調節遺伝子、イントロン、
エクソン、翻訳及び未翻訳双方のリーダー配列をはじめ
とする意図する種々の配列等の検出に、プローブを使用
することが考えられる。

又、遺伝子工学における配列の検出もかなり注目されて
いる。転写レベルの監視、造成物の完全性の検出、突然
変異、切除等のレベルの監視等により核酸のスクリーニ
ング及び検出が可能となる。

多くの場合、意図する配列は、核酸の総量のうちの非常
に小さな部分としてそして／又は微量、例えば、アトモ
ルレベルで存在する。更に、意図する配列は、それに対
して実質的に相同性を有する多数の配列が付随している
場合がある。従って、必要としないヘテロ二本鎖が確実
に存在しないようにするために比較的高いストリンジエ
ンシーが要求されることがあり、これにより、意図する
配列の有効濃度がさらに制限される場合がある。

更に、同様又は類似の配列が異なるサイズの核酸断片に
あられれることがあり、又、特定のサイズの断片の配列
の出現は特定の表現型の存在と相互関係がある場合があ
る。このような解析には、通常の操作であるサザンプロ
ットがよく行われるが、これにはある種の固有の問題が
ある。即ち、プロノティング工程中、脆いゲル及び膜の
取扱をはじめとして多くの手動操作が必要である。又、
サザンプロットにおいてハイブリダイゼーションがフィ
ルター上で起こり、これが、反応速度を低下させたり、
大きなバックグランドの原因となったり、又、このため
大容量のプローブ溶液（放射性が高いことが多い）や大
容量の洗浄液を必要とすることがある。

又、技術者に要求される時、間及びエネルギーを最少銀
とするとともに手動操作で生じる場合がある誤差を最小
にするように自動化できる分析システムの開発にも関心
が集まっている。他にも、サイズ決定、特に標準に関連
するバンドの検出を容易するような試料を提供できるこ
と等が望まれている。

これらに関連する技術を開示している文献としては下記
のものが挙げられる。

ヨーロッパ特許出願公開筒０２３７８３３号には、ハイ
ブリダイゼーションアッセイが記載されている。サザン
、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　、１９７５年、第９
８巻、第５０３〜５２７頁には、フィルターに移した制
限断片のハイブリダイゼーション解析の最初の方法が記
載されている。マニッグ等、バイオケミストリー、１９
７７年、第１６巻、第１３６４〜１３７０頁には、アビ
ジン−ビオチン相互作用による遺伝子の純化法が記載さ
れている。トンプソン、バイオクロマトグラフィー、１
９８７年、第２巻、第６８〜７９頁には、核酸断片の分
離に高速液体クロマトグラフィーを使用することが記載
されている。ジョーンズ等、ジーン、１９８５年、第３
９巻、第７７〜８３頁には、１２Ｎ八−ＤＮＡハイブリ
ッドを電気泳動後検出することが記載されている。パー
ソンズ及びフィン、バイオテクニクス、１９８６年、第
４巻、第４０４〜４０６頁には、少量のポリペプチドを
解析するための免疫吸着操作が記載されている。ケンベ
（Ｋｅｍｐｅ　）等、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ
、、１９８５年、第１３巻、第４５〜５７頁には、リガ
ーゼによりＤＮＡ断片に結合せしめたビオチニル化オリ
ゴヌクレオチドが記載されている。ガンパー（Ｇａｍｐ
ｅｒ）等、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、。

１９８５年、第１４巻、第９９４３〜９９５４頁には、
ソラレン官能化オリゴマーを、ハイブリダイゼーション
及び光化学架橋が生じるときに標的ＤＮＡを標識するプ
ローブとして用いることが記載されている。

ザポルスキ（Ｚａｐｏｌｓｋｉ）等、エレクトロフォレ
シス、１９８７年、第８巻、第２５５〜２６１頁には、
サザン型核酸ハイブリダイゼーション解析を自動化する
ための自動機械システムに関する記載がある。

ゴールドコーン（Ｇｏｌｄｋｏｒｎ　）及びプロッコッ
プ（Ｐｒｏｃｋｏｐ）　、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅｓ、、１９８６年、第１４巻、第９１７１〜９１９１
頁には、ハイブリダイゼーション・制限解析用セルロー
ス性支持体にＤＮＡプローブを共有結合的に連結する技
術が記載されている。シバネン（Ｓｙｖａｎｅｎ　）等
、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１９８６年、第
１４巻、第５０３７〜５０４８頁には、親和性に基づい
てハイブリッドを採取して核酸ハイブリッドを定量化す
ることが記載されている。フォースター（Ｆｏｒｓ　ｔ
ｅｒ　）等、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１９
８５年、第１３巻、第７４５〜７６１頁には、光化学的
に、ビオチンで核酸を共有結合で標識することが記載さ
れている。プラケスレイ（Ｂｌａｋｅｓｌｅｙ）及びト
ンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）　、ＰＣＴ／ＩＪＳ８４
１００５０８（Ｗ０８５１０４６７４）には、核酸を固
定化する新規な技術についての記載がある。ガンパー（
Ｇａｍｐｅｒ）等、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、
１９８６年、第１４巻、第９９４３〜９９５４頁には、
リバースサザンハイプリダイゼーションについての記載
がある。ホニクベルグ（）Ｉｏｎｉｇｂｅｒｇ）等、Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、米国、
１９８６年、第８３巻、第９５８６〜９５６０頁には、
ｒｅｃＡタンパク質を用いて少量の二本鎖ＤＮＡの配列
を探索することが記載されている。

〔課題を解決するための手段〕

固体支持体連結要素を有するプローブを用いて核酸を検
出しサイズ分離する。核酸試料が標識され、そしてこの
標識鎖は便利には一本鎖として提供され、そしてプロー
ブとハイブリダイズされる。

二本鎖及び過剰のプローブを固体要素により、貯蔵し、
そして更なるアッセイに使用することができる液相と、
例えば、電気泳動により、二本鎖試料を検出し、分離し
そしてサイズ決定するために使用することができる固相
に分離する。

又、他の態様では、プローブがｒｅｃＡタンパク質と結
合され、標識された標的配列を有する配列特異的な複合
体が生成される。

本発明によれば、試料中の核酸配列の存在を検出するた
めの方法及び組成物が提供される。本発明の方法は、検
出要素とカップリング要素を用いることを包含し、ここ
で試料核酸を検出要素で標識し、カップリング要素をプ
ローブに結合させる。

複合体を形成した試料核酸とプローブは、固体成分によ
り、複合体を形成していない試料核酸から分離する。次
に、試料核酸とプローブとの二本鎖は、固体成分から分
離（化学的開裂又は変性）することができ、又、標識試
料核酸は、必要に応じて、例えばサイズ分離及び検出等
の操作を行うことができる。

試料源は、核酸を包含するいずれの材料又は物質でもよ
い。核酸は天然の核酸である必要がなく、化学的、酵素
的又は生物学的に合成したものでもよく、又、天然のプ
リン及びピリミジンとは異なるものを有していてもよい
。試料源は、細胞質でも非細胞質でもよく、臨床試料で
も分離株でもよく、血液、血清、血漿、便、膿、スクラ
ッピング（ｓｃｒａｐｉｎｇｓ）　、洗液、尿等の生理
学的媒体由来のものでもよく、新生物細胞、リンパ球（
例えば、Ｔ細胞若しくはＢ細胞）、単核細胞、好中球等
の細胞セット又はサブセットに関連するものでもよく、
ビールス、バクテリア、マイコプラズマ、菌類、原生動
物等の病原体でもよく、又、プラスミド、ビールス又は
ＤＮＡ若しくはＲＮＡ断片等を包含する造成物でもよい
。この核酸試料は、染色体性又は染色体外性でもよいＤ
ＮＡ、例えば、プラスミド、ビールス、合成造成物等又
はメツセンジャーＲＮＡ、転移ＲＮＡ、　リポソームＲ
ＮＡ。

ビールス等のＲＮＡを包含していてもよい。核酸配列は
、構造遺伝子、未翻訳領域、調節領域、イントロン、エ
クソン等を包含していてもよい。

核酸配列の検出は種々の目的に用いることができる。例
えば、核酸の検出は、新生物若しくは他の異常な細胞状
態等の植物又は動物種の病気の状態の診断、種々の分別
段階でのリンパ球等の細胞のセット又はサブセットの検
出、病原体の菌株又は種の検出、遺伝子操作の監視等に
用いられる。

本発明において、試料を使用する前に、タンパク質分解
、抽出、沈澱、脂質若しくはタンパク質等の他の成分か
らの核酸の分離、ＲＮＡの加水分解、ヌクレアーゼの不
活性化、濃縮、クロマトグラフィー、脱水、加熱等種々
の化学的又は物理的処理を施してもよい。試料は、妨害
物質の除去、保存又は輸送準備、濃縮等の種々の理由で
処理を行ってもよい。

多くの場合、特に試料が大きな核酸分子を包含する場合
には、その組成物を通常断片化（特に制限酵素を用いて
）する。この際、一種又は複数種の制限酵素を用いるこ
とができ、試料の性質に応じて断片の大きさは、５０塩
基対〜１００キロ塩基対、より一般的には約０．５〜２
５塩基対の範囲とすることができる。種々の制限酵素を
用いて、平よっては、粘着端が連結に特異な部位として
存在することが好ましいであろう。

又、場合によっては、混合物がＤＮＡ及びＲＮＡの比較
的小さな配列であるときには、サンプルはメツセンジャ
ーＲＮＡの逆転写生成物を含むことができる。必要に応
じて、ＲＮＡを加水分解してＤＮＡ配列のみを残すよう
にしてもよい。この方法では、−本積ＤＮＡだけの組成
物が得られる。

試料を予め調製した後、すぐに標識ができる。

標識は、種々の方法で行うことができる。標識の方法は
特定のものには限定されず、多数の考慮事項により決ま
り、効率、感度、経済性等の面で好ましい技術が存在す
る。考慮事項の一つとして、用いる標識剤の検出感度、
核酸配列を次に処理又は解析する方法、等が挙げられる
。

鎖は、−本積か二本鎖であるかで多少異なるが、種々の
技術により延長することができる。異なるヌクレオチド
を種々の方法、例えば、放射性物質で標識したヌクレオ
チド又は他の成分で標識したヌクレオチドを用いて標識
することのできる場合、ターミナルデオキシトランスフ
ェラーゼを用いて、鎖の３′端を延長してもよい。

二本鎖Ｄ　Ｎ　Ａの場合、相補端を有する種々の分子、
例えば、短い二本鎖配列で特に制限酵素で生成される粘
着端又はこのような末端と同一の、例えば、平滑端を有
するものを用いて、二本鎖に連結し一方若しくは両方の
鎖を標識することができる。過剰の標識成分を用いて、
試料ＤＮＡの連結をできるだけ少なくしてもよい。特に
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等の連結酵素を用いることが非常
に好ましい。下記に示す具体例のように、その少なくと
も一方が核酸試料に付加すべき標識剤、ここでは色素、
を含有する２つのオリゴヌクレオチドを合成する。この
例では、制限酵素旧ｎｄｍを用いて、５′端が突出して
いる粘着端を有する断片を生成している。

上記のオリゴヌクレオチドは、互いに相補的配列を有し
、且つ互いにハイブリダイズしたときに、標識すべき試
料核酸断片の粘着端と相補的な突出端を有するように合
成される。合成オリゴヌクレオチドは、互いにハイブリ
ダイズしたとき、特定の制限酵素切断部位に適した５′
突出端又は３′突出端を有するものでよい。又、これら
の合成オリゴヌクレオチドは、互いにハイブリダイズし
たときに、平滑末端断片に連結できるような平滑末端を
有するものでもよい。いずれの場合でも、連結酵素を添
加すると、標識オリゴヌクレオチドが試料核酸断片に接
着末端結合するようになる。合成オリゴヌクレオチドの
場合には、合成片上に５′リン酸塩が存在しないので互
いに連結しない。

上記で示した例では、オリゴヌクレオチドの配列は、正
しい連結が生じた後酵素の認識配列が破壊されるような
ものを選択した。このように選択すると、連結標識化を
用いる際に独特の利点が生じる。即ち、認識制限酵素が
存在し、それが連結時に機能的である場合、試料核酸自
体の連結のいずれもが再切断される。この特性により次
の２つの利点が生じる。第一に、制限活性と連結標識化
を同じ容器内で同時に生じさせることができ、取扱及び
操作を最小限にすることができる。第二に、大過剰モル
量の標識成分を用いて試料核酸自体の連結を防止する必
要がなくなる。上記で示した標識化の例は、制限酵素切
断部位に連結され得る合成オリゴヌクレオチドが酵素の
認識部位を破壊する配列を含有する場合のいずれの制限
酵素にも適用できる。このような配列は、例えば、シト
シンからチミジンへの塩基の変更、又はおそらく５−メ
チルシトシンのような誘導塩基の置換、又はイツリンの
ような類似体の置換によるるものを含むことができる。

制限酵素が核酸鎖の特定された認識配列を切断するのに
用いられる上記及び下記の全ての例において、天然生成
物類似体、金属イオン錯体、ペプチド断片等の配列特異
的ＤＮＡ開裂分子を用いることもできる〔例えば、モサ
ー（Ｍｏｓｅｒ）及びダーバン（Ｄｅｒｖａｎ）　、サ
イエンス、１９８７年、第２３８巻、第６４５〜６５０
頁；並びにスル力（Ｓｌｕｋａ）等、サイエンス、１９
８７年、第２３８巻、第１１２９〜１１３２真参照）。

リン酸基が、例えば、放射活性により検出できる場合、
キナーゼを用いてリン酸化してもよい。

メチル基が放射性の場合、アルキル化、例えば、メチル
化を用いることができる。

又、個々の鎖と反応することのできる光活性化分子を用
いてもよい。このような分子の具体例としては、プソラ
レン、フェニルジアゾニウムビサルファイト、フェニル
アジド等が挙げられる。

ＤＮＡをリボヌクレオチドで延長し、そのリボヌクレオ
チドを次に酸化して、別の分子に結合するためのアルデ
ヒド官能基を生成してもよい。このアルデヒドは、還元
アミノ化条件下でアミノ含有成分と結合させるのが適当
である。

標識は、直接である必要がなく、間接的でもよい。即ち
、核酸配列は、検出信号を提供する第二分子に結合する
ことのできる分子で修飾することができる。例えば、核
酸配列をビオチンで修飾し、続いてその核酸配列を、種
々の検出可能の標識を接合することのできるアビジン又
はストレプトアビジンと結合させてもよい。又、ビオチ
ン以外の種々のりガントを、それらの天然受容体又は該
リガンドに対して特異的なイムノグロブリンと組み合わ
せて使用してもよい。

種々の検出可能な標識剤、特に簡便に検出可能な標識剤
を用いることができる。検出は、放射活性、紫外若しく
は可視範囲の光吸収、蛍光、化学発光等の電磁線、検出
可能生成物を生成するか又は検出可能な基質を破壊する
酵素、安定なフリーラジカル等によりなされる。これら
の性質を提供する種々の分子を、従来の方法により、標
識の具体的方法に応じて、直接又は間接的に配列に接合
させることができる。

標識剤として、３２ｐ、　１２？１．１４（：、　ＩＨ
，３ＳＳ等の種々の放射性元素；フルオレセイン、ロー
ダミン、フィコビリン、希土類キレート、それらの誘導
体等の蛍光剤〔これらの蛍光剤は、個々の分子でもよい
し、又は核酸又は非（核酸）主鎖に縦に接合してもよい
〕　；ホースラデイツシュペルオキシダーゼ等の酵素（
それ自体又はブレコースオキシダーゼ、ウレアオキシダ
ーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、グルコース−６−ホ
スフェ−トチヒドロゲナーゼ等と結合状態で）、通常は
基質と反応して蛍光又は光吸収生成物を生成する酵素；
ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン等のりガン
ト・受容体対；及び検出が可能であり本発明に用いるこ
とのできる他の標識剤も用いることができる。

標識化の具体例として、末端デオキシトランスフェラー
ゼを用いて、ビオチニル置換ヌクレオチド、例えば、Ｂ
ｌｏ−１ｌ−ｄＵＴＰ　（−’−ニー　ヨーク州−ｓ−
ヨークにあるエンゾ・バイオケム（Ｅｎｚｏ　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ）社製〕でＤＮＡ鎖を延長することが挙げられる
。

標識された鎖は次の工程に用いられる。検出には、検出
可能標識剤と結合したアビジンを添加し、非特異的結合
アビジンを洗い流し、検出可能標識を検出する。複数の
ビオチニル化ヌクレオチドで鎖を延長することにより、
大きく増幅することができる。ある場合には、天然ヌク
レオチドを含む混合物を用いて、鎖中のビオチニル化ヌ
クレオチドを分離するようにしてもよい。

又、リガーゼを用いて、リボ核酸でＤＮＡ鎖を延長して
もよい。得られる一本鎖を、次に、過ヨウ素塩塩で酸化
してジアルデヒドを生成することができる。このジアル
デヒドは、フィコエリトリン単量体又は重合体と縮合し
て、蛍光性標識を生成することができる。又、ＤＮＡポ
リメラーゼでのニックトランスレーション又はランダム
プライミングを利用して放射性標識を導入してもよい。

更に、ポリメラーゼ連鎖反応法〔サイキ（Ｓａｉｋｉ）
等、サイエンス、１９８５年、第２３０巻、第１３５０
頁〕を利用して、プライマーに又は組み込まれるヌクレ
オチドに放射性又は非放射性標識を組み込んでもよい。

核酸配列を標識する方法に関しては、例えば、マニアチ
ス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、モレキュラークローニング
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、第１０９
〜１３２Ｌコールド　スプリング　ハーバ−ラボラトリ
−社、ニューヨーク州コールド　スプリングハーバ−１
１９８２年を参照のこと。

はとんどの場合、標識された試料を変性して、プローブ
と接触させるための一本鎖ＤＮＡを生成するが、下記す
るようにプローブをｒｅｃ　Ａタンパク質、例えば、大
腸菌ｒｅｃＡ　（ホニクベルグ（Ｈｏｎｉｇ−ｂｅｒｇ
）等、ブロク　ナトル　アカド　サイ（Ｐｒｏｃ。

Ｎａ’ｔ１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、米国、１９８
６年、第８３巻、第９５８６〜９５９０頁及びリガス（
Ｒｉｇａｓ）等、プロフナトル　アカド　サイ（Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、米国、１
９８６年、第８３巻、第９５９１〜９５９５頁〕と結合
させることにより、標識された二本鎖を用いることもで
きる。ホニクベルグ等、前掲、ではｒｅｃＡタンパク質
を、ＡＴＰ含有（０，５〜２．５ｍＡ）緩衝媒体（ｐＨ
７〜Ｂ）（ＡＴＰ発生発生例えば、ホスホクレアチン及
びクレアチンキナーゼをも含有）中でプローブとともに
インキュベートしている。次に、ｄｓＤＮＡとプローブ
・ｒｅｃＡ複合体とを結合させ、そして塩化マグネシウ
ム組成を約１０倍に増加する。リガス（Ｒ４ｇａｓ）等
においては、ＡＴＰ発生発生例用されていなかった。得
られる二本鎖を、下記する一本鎖核酸試料に関する操作
と同様にして処理することができる。このように、ｒｅ
ｃＡを使用すると、標的ＤＮＡ断片を変性しなくともプ
ローブの配列に対して相補的な配列を含有する２本鎖Ｄ
ＮＡの断片を取り出すことのできる手段が堤供される。

上記に示した場合以外では、標識され変性された核酸試
料をプローブと結合せしめる。プローブは、ｄｓ若しく
は５ｓＤＮＡ、　ＲＮＡ又は他の天然若しくは合成核酸
でよ（、そして有機的、酵素的又は生物学的に合成して
もよい。プローブは、意図する試料配列に対してホモ若
しくはヘテロ二本鎖でハイブリダイズするための意図す
る配列を包含している。あるいは、プローブは、特定の
配列を認識する非核酸分子、例えば抗体又は特異的ＱＮ
Ａ結合タンパク質、例えば、リプレッサー、インデュー
サー、制限酵素等であってもよい〔ダーバン（Ｄｅｒｖ
ａｎ）　、’サンエンス、１９８６年、第２３２巻、第
４６４〜４７１頁参照〕、更に、プローブは、固体要素
にプローブを連結するための連結要素（プローブ自体又
は標識された試料類に対して２本鎖を形成しているもの
の両方）を有する。連結要素は、抗体若しくは特定の受
容体に結合するりガント若しくはエピトープ、メルカプ
ト基と反応してチオエステルを生成することのできるマ
レイミド、ジアゾ官能基と反応することのできるフェノ
ール性基、特に還元性アミノ化条件下でアミノ官能基と
反応することができるアルデヒド基等の化学反応性種の
形態をとることができる。又、連結要素は、例えば、支
持体に結合する相補配列に結合するヌクレオチド配列で
あってもよい。プローブを固体要素に連結する方法は、
その後の条件下でその一体性を維持し且つ種々の段階を
妨害しない限り、特定のものには限定されない。結合は
、不都合のない限り、共有結合でも非共有結合でもよく
、必要に応じて、鎖状結合、例えば、固体要素−ビオチ
ン−アビジン−ビオチン−プローブ又は固体要素−アビ
ジンービオチンーｒｅＣ＾−プローブを包含していても
よい。

ビオチンとアビジン若しくはヒトレプトアビジン、抗体
とハブテン若しくは抗原、表面膜若しくは細胞質受容体
とホルモン、酵素と基質若しくは変性基質、例えば、自
己不活性インヒビター、レクチンと糖、キレートとイオ
ン、例えば、金属イオン等の受容体とリガンドとの種々
の組み合わせを用いることができる。

プローブは、従来法のいずれで製造してもよい。

即ち、プローブは、上記したニックトランスレーション
、連結若しくはランダムプライミング法を用いるか又は
市販の核酸合成器のいずれかを使用して合成し標識され
る。従って、連結用の一種以上の基を末端又は鎖の途中
に導入することができる。例えば、末端トリチル基を残
して抗体用リガンドとして機能させることができる。Ｒ
ＮＡを添加し、上記した方法により開裂することができ
る。

又、ビオチル化ヌクレオチドを鎖の末端又は途中に組み
入れて、１個又は複数個のビオチンを有するプローブを
生じさせることができる。

プローブは、通常少なくとも８ヌクレオチド、より一般
的には少なくともＩＯヌクレオチド、好ましくは少なく
とも１２ヌクレオチドであるが、１０キロヌクレオチド
以上、通常約２キロヌクレオチド未満であってもよい。

プローブの大きさは、標的配列の性質、試料中の標的配
列の量及び検出工程において用いられる条件により異な
る。

プローブと試料を適当なストリンジエンシー性条件下で
混合し、相補的配列の適切な選択を許容する。この際、
水性塩溶液、水と極性有機溶媒、例えば、ジメチルホル
ムアミド、との混合溶液等を用いることができる。高温
を用いることができるが、通常、変性は１１０°Ｃ以下
、ハイブリダイゼーションは８０″Ｃ以下で行う。塩濃
度は、一般的に約４．０Ｍ以下である。ストリンジエン
シーは、使用する溶液のｐｎにより制御することができ
る。

このストリンジエンシーは、プローブと試料を接触させ
るための溶液中に提供してもよいし、又はそれに続く洗
浄において提供してもよい。この際、固体要素上でも固
体要素から分離した状態であってもよい。適切な配列の
相同性を伴わないで生じる結合を減少させたり又は反応
速度を高めるために、未標識キャリマーＤＮＡ、又はポ
リエチレングリコール、ヘパリン、デキストランサルフ
ェート等の重合体を添加することが望ましい。

この段階で、二本鎖プローブ及び全ての未反応プローブ
を、連結基により、固体要素を含んで成る分離手段に連
結することができる。この固体要素は、多数の適当な形
態の内ののいずれの形態であってもよい。固体要素は、
天然又は合成粒子、例えば、アガロース、セルロース、
セファデックス、セファロース、ポリアクリレート、ポ
リスチレン、親水性ポリマー、調節ボアガラス、ナイロ
ン、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）等か
らなる重合体粒子でよく、種々の支持体がプローブの連
結要素の性質に応じて官能化される。粒子の大きさは、
一般的に０．５〜１００＃ＩＩの範囲である。粒子は、
磁気手段による分離が可能なように常磁性であるのがよ
い。粒子が常磁性でない場合、遠心分離、濾過、不混和
相への抽出若しくは不混和相聞の抽出、電気泳動分離、
遠心分離と濾過等の手段の組み合わせ又は他の分離手段
を用いることができる。又、固体要素は、マイクロタイ
タープレートウェル、ミクロフユージ管、インテグラル
フィルター付ミクロフユージ管、吸収性パッド付フィル
ター、毛細管、カラム等又は固体支持体の組み合わせ等
の種々の容器のいずれか一つでよい。支持体は、誘導化
若しくは誘導性表面又は膜、例えば、ガラス；ニトロセ
ルロース；誘導化ナイロン、例えば、ニューヨーク州グ
レンコッペにあるボール社のバイオデイン（Ｂｉｏｄｙ
ｎｅ）　（商標）；誘導化セルロースポリマー、例えば
、マサチューセッツ州のビレリカにあるメムテク（Ｍｅ
ｍｔｅｋ）社のメムテスト（Ｍｅ糟ｔｅｓ　ｔ）　（商
標）；又は誘導化ポリビニリデンシフロリド、例えば、
マサチューセ・ン°ン州のベツドフォードにあるミリボ
アー社のイモピロン（Ｉｍｎ＋ｏｂｉｌｏｎ）若しくは
ニューヨーク州グレンコッペにあるポール社のイムノア
フィニティー（Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ）　（商
標）メンブレン等を用いることができる。固体成分の性
質に応じて、媒体を固体成分と接触させて、連結要素を
固体成分に結合させる。粒子の場合、媒体を粒子と共に
攪拌し、次に粒子を分離して、液相上清及び固体粒子相
を生成することができる。種々の容器の場合、媒体を容
器に導入し、攪拌し、上清を容器から除去することがで
きる。カラム又は管の場合、媒体をカラム又は管に導入
し、反応が生じるに充分な時間接触状態を維持し、次に
液相を除去する。膜又は表面を用いるとき、媒体を膜又
は表面を通すか又はそれに沿って通過させて反応を生じ
させ、未反応物を除去する。この場合では、未標識ＤＮ
Ａを添加するのが、適当な配列の相同性なしに生じる結
合をブロックするために望ましい。

次に、固体要素を処理して、標識された核酸の非特異的
結合を除去する。洗浄は、固体要素へのプローブ及び相
同な二本鎖の保持を妨害しない種々の溶液のいずれでも
よい。従って、一般的に塩濃度が１．０Ｍ以下で、ｐＨ
が約１３〜５の範囲の種々の緩衝水溶液を８０〜２０°
Ｃの温度で用いることができる。時間は、数秒〜１時間
以上でよい、非特異的結合又はヘテロ二本鎖（部分的に
相補的）標識核酸を除去後、固体要素上の標識された核
酸の存在を検出して、試料媒体中に存在するプローブに
対して相補な配列の存在を実証する。この方法のこの時
点で、支持体に結合した標識された試料核酸は、未組み
込み標識分子を実質的に含んでいてはならない。

次の工程で、特異的に結合した標識された核酸断片を、
検出に先立ち支持体から溶離する。これにより、さらに
別のレベルの特異性が全体プロセスに加わり、プローブ
に対して所望の相同性の核酸断片だけが検出される。プ
ローブ及びその連結要素を介して支持体に結合した標識
された核酸のみを選択的に放出する溶離方法を利用する
。

より一般的には、標識された試料核酸を支持体及びプロ
ーブから、変性により分離してもよい。

この変性及び溶離工程中の塩濃度は、通常的０．２Ｍ未
満である。効率的に溶離するには、ＮａｏＨｆｉ度が１
０ｍＭ以上、通常的５０〜２００ｆｆ１Ｍ、一般的には
約３００ｍＭ以下のＮａＯＨ溶液を使用して、ｐＨを通
常１０以上、好ましくは約１２〜１３にするのがよい。

この際、ＫＯＨ又はグアニジン等の他の塩基を用いるこ
ともできる。一般的に９０〜１００％、通常的９９％の
ホルムアミドを使用して溶離を行ってもよい。

又、高温での変性を単独で又は上記した他の変性法との
組み合わせにより溶離を行ったりあるいは促進したりし
てもよい。温度だけで行う場合には、プローブの長さに
により異なるが、通常少なくとも６０°Ｃの高温でなけ
ればならない。化学変性を同時に行う場合には、より低
温で充分である。万一連結要素が核酸の場合には、同様
な手段を利用して標識標的を支持体から放出する。

又、固体要素に対して化学的に開裂可能な結合を利用す
ると、プローブ・標的複合体を固体要素から、適当な開
裂剤を用いて分離することができる〔例えば、バーマン
（Ｈｅｒｍａｎ）等、アナリテイ力ル　バイオケム（Ａ
ｎａｌｙｔｉｃａｌ　ＢｉｏｃｈｅＩｌｌ、）、１９８
６年、第１５６巻、第４８〜５５頁参照〕。又、溶離を
、リガンド・受容体相互作用を妨害する条件を用いて、
例えば、少な（とも４０°Ｃの高温で１００＋＊ＭＮａ
ＯＨ等の変性条件を導入したり、又はリガンド結合部位
に関してリガンドで標識されたプローブと競合する多量
の化合物を系に注ぐことにより溶離してもよい。更なる
別法として、イオン濃度を変化して、タンパク質ＤＮＡ
複合体を放出してもよい〔ホニクベルグ（Ｈｏｎｉｇｂ
ｅｒｇ）等、前掲）。又、更なる別法として、２つの核
酸鎖の相補的結合を切断したり防止したりするようにＤ
ＮＡ又はＲＮＡを化学的に修飾するグリオキサル等の試
薬を使用してもよい〔例えば、カーミカエル（Ｃａｒａ
＋１ｃｈａｅｌ）及びマツクマスター（ＭｃＭａｓｔｅ
ｒ）　、メソッズ　オブ　エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１９８０年、
第６５巻、第３８０〜３９１頁〕。

次に、溶離した標識核酸を、従来技術により検出するこ
とができる。又、この溶離した標識された核酸を、最終
検出の前にサイズ分離してもよい。

このサイズ分離工程により、意図する断片についての具
体的且つ重要な情報がもたらされるだけでなく、支持体
から溶離した非特異的又は部分的に相同性の標識核酸に
対する別のレベルの識別をも生じる。サイズ分離は、電
気泳動、密度勾配遠心分離、液体クロマトグラフィー等
により行うことができる。標識が存在するとハンドの検
出が可能となり、又、標準物をサイズの比較に利用して
もよい。核酸が変性状態にある場合、このような変性を
ｐＨ、グリオキサル若しくは同様な誘導化処理、強力な
水素結合剤の使用等により行う場合には、このサイズ分
離を行うことが望ましい。便利には、標準は、対照標識
、例えば、標識された試料で得られる信号とは波長が異
なる信号を提供する色素又は蛍光剤で標識することがで
きる。この方法では、比較が簡単で、且つ標準と試料と
の関係が容易に決定できる。デンシトメータ若しくはゲ
ルスキャナー若しくはカルフォルニア州のフォスター市
にあるアプライド　バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅ
ｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、）の３７０型ＡＢ
１等の自動化蛍光ゲル電気泳動スキャナー等の機器を用
いて、バンド強度及び位置を測定してもよい。又、像を
、適当な染料を用いて写真記録してもよい。

ここで、上記した操作により、サイズ分離、トランスフ
ァー及びその後のブロービングを包含するサザンプロッ
ト又は他の類似の手法により普通得られる全ての情報を
得ることができる。本発明により、プロッティング工程
なしで、ゲル操作なしで、大容量のプローブ及び洗浄液
なしで且つ固体支持体上でのハイブリダイゼーションな
しでプローブが結合する核酸断片の長さを測定すること
ができる（従って、速度が早まり、そしてバックグラウ
ンド及び非特異的結合が少なくなる）。従って、本発明
は、従来のサザンプロット操作よりもはるかに自動化し
易い。

固相及び液相分離後残存する上清は、異なるプローブで
繰り返し試験して他の配列を検出することができる。こ
のようにして、対立遺伝子、擬似遺伝子（ｐｓｅｄｏｇ
ｅｎｅ）　、マルチコピー遺伝子における障害、ジャー
１、ラインのＭｉ換え等の存在又は完全に独立した配列
でさえ検出することができる。

〔実施例〕

１、製造業者記載の使用法に準じて、フォトプローブ（
商標）ビオチン（カルフォルニア州パーリンゲームにあ
るベクターラボラトリーズ社）を蒸留水で１■／ｒｄの
濃度に溶解する。

２、　フェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈
澱（マニアチス等、同書参照）後、核酸試料を０．１　
ｍＭ　ＥＤＴＡに溶解して最終濃度を１■／パとする。

３、　同容量の溶解したフォトプローブ（商標）ビオチ
ンを前記の溶解した核酸に添加し、ゼネラルエレクトリ
ック社製１１ＲＳＭ型２７５ワットの太陽灯下１０ｃｍ
の氷上で、１５分間該太陽灯に照射する。

４、　次に、０．１　ｍＭ　）リス−〇ＣＩ　（ｐＨ９
，０）を添加して総容量１ＯＯＩｊＩとする。ＤＮＡの
総量が１０Ｊｒｇ未満である場合、サケの清液ＤＮＡ等
のキャリヤーＤＮＡを添加する。

５．２−ブタノール（１００ｊ１１）を添加し、混合物
を穏やかに攪拌し、簡単に遠心分離し、上相を捨てる。

この抽出を２回繰り返す。

６、　５ＭＮａＣ１（０，６Ａｌｌ）及び９５％エタノ
ール１００　ｄを添加し、混合物を穏やかに攪拌後、暗
所に１時間放置して沈澱を生成させる。混合物を遠心分
離し、得られるペレットを７０％エタノールで洗浄し、
残留溶媒を真空遠心分離で除去後、ペレットを緩衝液に
再懸濁してその後の標識プローブの使用に備える。

１、　製造業者記載の使用法に準じて、アプライド　バ
イオシステム３８１型ＤＮＡ合成装置で構造Ｉ及び■を
有するオリゴヌ久しオチドを合成する。

構造■を、図示した位置ＸにＣ（シトシン）を用いて合
成する。次に、このＣを、ドラパー（Ｄｒａｐｅｒ）、
ヌクレオチド　アシッド　リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　、１９８４年、第１２
巻、第９８８頁以降に記載されているようにして行うア
ミノ基転移反応によりＸの構造に転化後、製造業者記載
の使用法（イリノイ州のロックフォードにあるピアース
　ケミカル社）に準じて長鎖アームビオチンと反応させ
る。

２、　下記の試薬を混合して反応混合物を調製する。

・ＩＯ＋＋＋Ｍトリス）ＩＣＩ　、　　１ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ　、　ｐＨ８，０（ＴＥ）に１ピコモル／ｊ１１のｐ
ＳＰ６４プラスミド（ウイスコン州のマディソンにある
プロメガ社製）を溶解したもの１ｍ ・１０ｘミーデイアム　サルト　バッファー（マニアチ
ス等、同書）１１１！ ・１０ｍＭ　ＡＴＰＩ　ｔｄ ・１単位／１ｄＴ４リガーゼ〔インデイアナ州のインデ
イアナポリスにあるベーリンガー　マンハイム（Ｈｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社製〕１１１１・
ビオチニル化オリゴヌクレオチド１ｌＩＩ（構造体Ｉ；
ＴＥに２．５ピコモル含有） ・相補オリゴヌクレオチド１ｍ（構造体ＩＩ；ＴＨに２
．５ピコモル含有） ・水３μｌ ・ｌＯ単位／ｐｌ　ＨｉｎｄＩ［［制限酵素（インデイ
アナ州のインデイアナポリスにあるベーリンガー　マン
ハイム社製） ３、　混合物を３７°Ｃにて１時間インキュベートする
。

４、　０．２ＭＥＤＴ八をＩＩＪＩ添加して反応を停止
する。

構１１Ｌ−１ ５’　＞ＴＸＸＸＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＴＴ
ＡＴＧＡＴＧＴＴＧＴ　＜　３　’藷１１（−１ ５’　　−ＡＧＣＴＡＣＡＡＣＡＴＣＡＴＡＡＣＴ本実
施例では、制限酵素ＨｉｎｄｌＩ本実施用する。ある状
況下では、より多く切断してより短い断片からなるプロ
ーブを生成してハイブリダイゼーション速度を早めるＡ
ｌｕ　　Ｉのごとき制限酵素を使用する方が有利である
場合がある。異なった制限酵素を使用すると、通常、異
なったバッファー条件が必要であるばかりでなく、この
ような酵素の制限認識部位と一致するオリゴヌクレオチ
ドを使用することが必要となる。

１、　ランダム配列の６量体を、製造業者記載の市鵜法
に準じて、アプライド　バイオシステム３８１Ａ型ＤＮ
Ａ合成装置により合成する。６量体は、４塩基全ての各
位置が完全な縮重の状態で合成される。これらの６量体
は、次に、製造業者記載の使用法（アプライド　バイオ
システム）に準じて、アミノ・リンク（商標）でキャッ
ピングし、精製した。その後、製造業者記載の使用法（
ピアースケミカル）に準じて、長鎖アームビオチンで標
識して、構造体■を製造する。

盪盈生−１ ２、混合物を下記のように調製する。

−ＴＥ中１０ｎｇ／ＩＩＩのラムダ１Ｉｉｎｄｌ［Ｉ制
限断片のを１０分間煮沸後氷で急冷したもの１１１１・
０．５　ｍＭ　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰの１
：１：１混合物１．５　ｕｌ ・５ｘランダムプライミングバツフアー〔フエインヘル
グ（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ）及びボゲルシュタイン（Ｖｏｇ
ｅｌｓｔｅｉｎ）　、アナル　バイオケム（Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ）、１９８３年第１３２巻、第６〜１３
頁及びフエインベルグ（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ　）及びボゲ
ルシュタイン（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ）　、アナル　バ
イオケム（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ）、１９８４年
、第１３７巻、第２６６〜２６７頁、１２．０ｍ ・構造体■のビオチン６量体（水に２．５ｔｓ／１ｄ）
２、ＯＩ ・ｌＯμＣｉ　ＡＴ”Ｐ　（プラウエア州のウィルミン
トンにあるデュポンＮＥＮ社製）２．５ｕＩ・水０．５
　ｐｉ ・ベッセスダ　リサーチ　ラボラトリ−（Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ）から人手した７単位
／Ｉ大腸菌ポリメラーゼＩクレノー断片０．５　ｌＩ！
３、３７°Ｃで３０分間インキュベートする。

４、　過剰のランダムプライマー及びヌクレオチドを、
セファデックスＧ−５０バイオスピンカラム（ＢｉｏＳ
ｐｉｎ　ｃｏｌｕｎ＋ｎ）（ペンシルベニア州のパオリ
にある５プライム→３プライム社製）を用いて、製造業
者記載の使用法に準じて除去する。

・精製混合物のアリコツトを８％ポリアクリルアミドゲ
ルに付し、オートラジオグラフ分析した。

高分子量放射性物質の存在より、ランダムプライミング
がうまくいったことが確認される。

ス１１」（ １、アプライド　バイオシステラ３８１型ＤＮＡ合成装
置を用いて、製造業者記載の方法に準じて、■８ヌクレ
オチドオリゴマーを合成し、精製する。

その５′端をアミン・リンク（商標）（アプライドバイ
オシステム）を用いて、アミノ末端とする。

このアミノ基を、製造業者記載の方法（アプライド　バ
イオシステム）に準じて、フルオレセインＮ−ヒドロキ
シザクシンイミドに結合する。

２、　アプライド　バイオシステム３８１型ＤＮＡ合成
装置を用いて、製造業者記載の方法に準じて、２０ヌク
レオチドオリゴマーを合成し、精製する。

合成した配列は下記の通りである。

５　′　＾ＧＣＴＡＣＡＡＣＧＴＣＧＴＣＡＣＴ　　Ｇ
Ｇ　　３’この配列は、最初の１４個のヌクレオチド（
５′端から）がフルオレセインで標識された１８　　ｖ
ａｅｒの３′端と相補であり、１８−　ｎ＋ｅｒの３′
端の４個のヌクレオチドが制限酵素旧ｎｄｌｌｌより生
じる５′粘着末端突出部と相補的である゛ように選択さ
れる。

１８−ｍｅｒ　／２０−ｍｅｒ二本鎖を生成し制限酵素
旧ｎｄ■で切断した標的ＤＮＡの粘着末端に連結すると
、この特定の配列が旧ｎｄＩ［［の認識配列を破壊する
。

３、下記の試薬を混合して反応混合物を調製する。

・標識ＤＮＡＩＩＩｇの水１μ！溶液 ・１０ｘ　Ｈｉｎｄｌ［Ｉ反応バッファー（ＢＲＬガイ
ザースベルグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ）　、Ｍ　Ｄ
　）　０．９　ｔｄ１８　　ｍａｒの水溶液３．　Ｏｉ
ｔｌ　；モル数は、ＨｉｎｄＩＩＩが標的ＤＮＡＩＡ＋
を消化するとき生じる粘着末端の准定数の２倍でなけれ
ばならない。

・２Ｏ−Ｉｌｅｒの水溶液２．　ＯＪｌｌ；モル数は、
１８−ｓ＋ｅｒのモル数と等しくなければならない。

・１０ｍＭジチオスレイトール１．０μ！・３ｍＭリボ
ースＡＴＰ１．０１１１ ・Ｈｉｎｄｎｌ酵素（１２単位／ｍ）０．５Ｊｔ！・リ
ガーゼ酵素（０，５単位）０．５ｍ４、３７°Ｃで１時
間インキュベートする。

５、　０．２ＭＥＤＴＡ０．５１１１及び２０躍／Ｉグ
リコーゲンの水溶液１．　ＯＩｌｌを添加する。

６、　フェノール／クロロホルム抽出を２回行い混合物
をクリーンアップする。フェノール及びクロロホルムを
各々１０ｍ添加する。混合し遠心分離する。下層を除去
し捨てる。繰り返す。（マニアチス等、前掲） ７、　３　Ｍ　ＮａＡｃ　（ｐＨ５，５）を１１１１以
下及び９５％エタノールを２５Ｊ１１添加する。混合す
る。３０分間放置する。遠心分離する。

８、　沈澱を７０％エタノール５００Ｉで洗浄する。

９、　真空遠心分離により試料を乾燥する。

１０．１０ｍＭ）リス、１ｍＭＥＤＴ＾、ｐＨ８，０５
０Ｉに再懸濁する。

１１、反応混合物のアリコツトを、ｌｘ　ＴＢＥ　（）
リス・ボーレートＥＤＴＡ）バッファーにおいて３ボル
ト／ｃｍで操作する０、６％　アガロースゲルに附する
。ゲルを通って移動する蛍光バンドを、水平面上のアガ
ロースゲルを読み取れるようになっているアプライド　
バイオシステム３７０Ａ　ＤＮＡシークエンサーにより
検出する。ランダファージＤＮＡを標的として使用する
とき、ＨｉｎｄｌｌＩ切断ラムダＤＮＡにおいて、５６
０．２０２７．２３２２．４３６１．６５５７．９４１
６及び２３．１３０塩基対に相当する蛍光ピークが検出
される（ラムダにおいてＣＯＳ部位が存在すると、２３
．１３０塩基対への４３６１塩基対断片の連結が生じる
）。

実施例５ キ　−ゼ　−　　いてｉ　け　　　・　ｉ　るゲル電気
泳動で厳密に晴製した脱リン化ＤＮＡ（アルカリ製ホス
ファターゼ処理）（５′端：１〜５０ピコモル）、１０
ｘキナーゼバツフアーＩ５Ｉ、　１５０μＣｉ　（ｒ　
−”Ｐ　）　ＡＴＰ　５０ピコモル、Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ１０〜２０単位及び水５０Ｉを混合し、３
７°Ｃで３０分間インキュベートする。混合物に０．５
Ｍ　ＥＤＴＡ２　Ｉｌ！添加し、混合物をフェノール／
クロロホルムで抽出後、エタノールでＤＮＡを沈澱させ
る。ＤＮＡをＴＥ　　５０１１１に再溶解し、標識ＤＮ
Ａを未取り込み（Ｔ　−”Ｐ　）　ＡＴＰから、Ｇ−２
５スピンカラムクロマトグラフイーにより分離する（マ
ニアチス等、同書）。

スＪＬｆ汁灸 １、　ラムダＤＮＡを含んでなる試料ＤＮＡ及びｐＧＥ
Ｍ−３ＤＮＡ　（ウイスコン州のマディソンにあるプロ
メガ社製）の両方を、旧ｎｄｌ制限酵素で切断し、実施
例５で述べた方法により３ｔｐで標識する。

２、　アジピン被覆磁気ビーズ〔マサチューセッツ州の
ケンブリッジにあるアドバンスト　マグネチフス（Ａｄ
ｖａｎｃｅｄ　Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ）社製］を、０．２
ＭＮａＣ１０，０１Ｍ　　）リス、０．００１Ｍ　ＥＤ
Ｔ＾、ｐｕａ、ｏで３回洗浄後、１ｔｐｇ／ｌｄデキス
トランサルフェートを含有する洗浄バッファーに、３０
０μ！当たり充填ビーズ１６％の濃度で再懸濁する。

３、製造業者記載の使用方法（プロメガ　バイオチク社
）に準じて、プローブとして使用するためのｐＧＥＭ−
３のＲＮＡ）ランスクリプトを調製する。

次に、プローブＲＮＡを、実施例１と同様の方法により
光化学的にビオチンで標識する。プローブＲＮＡを、１
６０ｎｇ／ｍの濃度でＴＥに再懸濁する。

４．　１，５Ｉ！１１ポリプロピレン管において下記の
成分を混合して調製したビオチニル化ｐＧＥＭ−３ＲＮ
Ａプローブを用いて、試料ＤＮＡ混合物から特定のｐＧ
ＥＭ−３ＤＮＡをプローブする。

・ホルムアミド７４．５ｍ ・５Ｍ　ＮａＣ１Ｂ、ＯｐＩ ・濃度１６０ｎｇ／ｊｌ！の光ビオチニル化プローブＲ
ＮＡのＴＥ液２．０　ｐｉ ・濃度Ｂｎｇ／ｐ１の３２Ｐ標識ｐＧＥＭ−３ＤＮＡ０
．５，１１７、３ｔｐ標識ラムダ（ＨｉｎｄｌＩＩ切断
）ＤＮＡ３ｎｇを含有するＴＥ液７．５　Ｉｌ！ ・剪断、変性及び急冷したサケの精液ＤＮＡ３．０ｍ（
１，ｇ／、Ｊ） ・シトレート・ホスフェートバッファー、ｐｕａｔ４、
０　ｍ ・２００ｍＭ　ＥＤＴＡ　０．５μ！ 容量を水で１００１１１とする。

５、混合物の入った管を沸騰水中に４分間吊るして、混
合物を変性する。

６、　次に、混合物を４５°Ｃに冷却し、４５°Ｃに２
時間保持して培養する。

７、　ハイブリダイゼーション混合物の２５Ｊ１１アリ
コツトを、２００＋＋＋Ｍ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　トリ
ス、１ｍＭＥＤＴＡ、　ｐｆ１８．０のＩＭｌに加えて
希釈する。

８、　　ｍ気ビーズ５０ｍを添加して、静かに振盪し、
４０分間培養する。

９、　製造業者記載の使用方法に準じて、ビーズを溶液
から分離し、上清を除去する。

１０、ビーズを２０Ｏｎ＋Ｍ　ＮａＣ１のＴＥ液で２回
洗浄し、再懸濁を繰り返し、磁気分離及び上清の除去を
行って結合の弱い物質を除去する。

１１、次に、２００ｍＭ　ＮａＣ１の１ＯＯＩＩｌに、
ビーズを再懸濁し、ＲＮＡ　−ＤＮＡ二本鎖の変性及び
ＲＮＡの分離により標的ＤＮＡを釈放する。釈放された
物質を、２０ｔｒｇ／Ｉグリコーゲン１１１１．３．　
ＯＭ　ＮａＡｃ（ｐＨ５，５）　ｌ　Ｏｐｌ及び９５％
エタノール２５０　ＪＩＩを添加して沈澱させる。混合
後、この沈澱を、エッペンドルフミクロフユージ（商標
）において、最大速度で１０分間回転し、７０％エタノ
ール５００Ｉで洗浄し、サバントスビードバック　（Ｓ
ａｖａｎｔＳｐｅｅｄ　Ｖａｃ）　（商標）において乾
燥し、得られるペレットを、アルカリ性ローティングバ
ッファー（マニアティス等、同書）に再懸濁する。

１２、アルカリ性アガロースゲル、０．７％アガロース
、をマニアチス等、同書、第１７１頁以降に記載の方法
により調製する。試料混合物のアリコツト、上清及び溶
離液をアガロースゲルに３時間８ボルト／　ｃｍの条件
で附する。次に、ゲルを乾燥し、オートラジオグラフ分
析を行う。試料混合物を含むレーンには、種々の断片全
てが存在する。上清を含有するレーンでは、ｐＧＥＭ−
３プローブが大部分除去されている。溶離液を含有する
レーンでは、２、９　ｋｂ　ｐＧＥＭ−３ＤＮＡ　、即
ち、ＲＮＡプローブにより特異的に引き出された断片の
み顕著なピークとして現れる。このようにして、上記操
作により、プローブと相補的な断片が検出され且つこの
断片の長さが測定できる。

ス２ １、　ビオチンで標識したＲＮＡプローブを実施例１及
び６に記載の方法で調製する。

２、　ラムダＤＮＡ　６フ工ムトモル及びｐＧＥＭ−３
ＤＮＡ１００アトモルからなる試料を旧ｎｄｎｌ制限酵
素で切断後、適当な規模で、実施例４に記載の方法によ
り連結してフルオルセインで標識する。

３、試料及びプローブの変性、ハイブリダイゼーション
、分離、洗浄及び溶離操作を、下記の点を除いて実施例
６と同様の方法により行った：全溶液とも１％トウイー
ン（Ｔｗｅｅｎ）　２０及び０．１ｎ／Ｉデキストラン
サルフエートを含有している；最初の２回の洗浄をＩＭ
　ＮａＣ１のＴＥバッファーで行う；更なる３回の洗浄
は、溶離前に０．１　ｘ　５ＳＰＥで行う；使用される
ビーズは、５０％充填ビーズを含有するストックからの
ストレプトアビジン・アガロース（ピアースケミカル社
製）である；及びビーズは磁性体ではないので、遠心分
離を用いて分離する。

４、　アルカリ性アガロースゲル、０．６％アガロース
、をマニアチス等、前掲、第１７１頁以降に記載の方法
で調製する。試料混合物の希釈液のアリコツト、上清及
び溶離液を４時間３ポル）　／　ｃｏ＋の条件でアガロ
ーズゲルに附する。ゲルを通って移動する蛍光バンドを
、水平面上のアガロースゲルを読み取れるようになって
いるアプライド　バイオシステム３７０　ＯＮＡシーク
エンサーにより検出する。

５、　試料混合物を含有するレーンでは、種々の断片全
てが相対的に存在する。上清を含有するレーンでは、ｐ
ＧＥＭ−３ＲＮＡプローブが、プローブに対して相補的
な鎖に対応するｐＯＥＭ−３ＤＮＡの半分を移動させて
いる。溶離液を含有するレーンでは、２、９　ｋｂ　ｐ
ＧＥＭ−３ＤＮＡ　、即ち、ＲＮＡプローブに相補な断
片が、最も顕著なバンドとして現れる。このようにして
、上記操作により、プローブと相補的な断片が特異的に
検出され且つこの断片の長さが測定できる。

実施例８゜ １、ｐＧＥＭ−３プラスミド（プロメガ社製）からなる
ＤＮＡプローブを、実施例２に記載の方法による連結に
よって、ビオチンで標識する。

２、　ラムダＤＮＡ　６フ工ムトモル及びｐＧＥＭ−３
ＤＮＡ１００アトモルからなる試料を旧ｎｄＩ［Ｉ制限
酵素で切断後、適当な規模で、実施例４に記載の方法に
より連結してフルオルセインで標識する。

３、試料の他にプローブＤＮＡ　２フ工トモルを、１％
トウイーン（Ｔｗｅｅｎ）　２０及びＯ，ｌｐｇ／Ｉデ
キストランサルフェートを含有している１、５　ｘ　５
ＳＰＥ２００ＩｌＩ中で、９５℃で５分間変性後、６５
°Ｃで２時間ハイブリダイゼーションを行う。５０％ス
トレプトアビジン・アガローズビーズ懸濁液を２０４添
加し、混合物を３７゛Ｃで１時間培養する。

４１、分離、洗浄及び溶離を、実施例７に記載の方法で
行う。アルカリ性アガロースゲル、０．６％アガロース
、をマニアチス等、前掲、第１７１頁以降に記載の方法
で調製する。試料混合物のアリコツト、上清及び溶離液
を４時間３ポル）７ｃｍの条件でアガローズゲルに附す
る。ゲルを通って移動する蛍光バンドを、水平面上のア
ガローズゲルを読み取ることができるアプライド　バイ
オシステム３７０　ＯＮＡ　シークエンサーにより検出
する。

５、試料混合物を含有するレーンでは、種々の断片全て
が適量存在する。上清を含有するレーンでは、ｐＧＥＭ
−３１１ＮＡプローブが、標的ｐＧＥＭ−３ＤＮＡのほ
とんどを除去する。溶離液を含有するレーンでは、ｐＧ
ＥＭ−３ＤＮＡ、即ち、ｐＧＥＭ−３プローブにより特
異的に引き出された断片が、最も顕著なバンドとして現
れる。このようにして、上記操作により、プローブと相
補的な断片が検出され且つこの断片の長さが測定できる
。

スＪｌ汁男 １、　　Ｂｉｎｄｌ［Ｉの代わりにＡｌｕ　　１制限酵
素を使用し、そしてバッファー条件を適当に調製するこ
と以外は実施例２と同様な方法により、ｐＳＰ６４プラ
スミド（プロメガ社製）からなるＤＮＡプローブをビオ
チンで標識する。１％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）　２０
を含有するＴＥを添加して、プローブ濃度を、１０Ｊ１
１当たり各ｐＳＰ６４プラスミド断片９フェムトモルに
調整する。

２、　ラムダＤＮＡ　１００フェムトモル及びｐＳＰ６
４　ＤＮＡ１００アトモルからなる試料を旧ｎｄＩ［Ｉ
制限酵素で切断し、適当な規模で、実施例４に記載の方
法により連結してフルオルセインで標識後、１％トウィ
ーン（Ｔｗｅｅｎ）　２０を含有するＴＥで希釈して総
量９０ｄとする。

３、　試料及びプローブを混合して下記のハイブリダイ
ゼーション混合物とする。

上記工程２の試料・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・９０ｕ１上記工程ｌのプローブ・・・・
・・・・・・・・・・・・・・１０ＩＩＩホルムアミド
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・１４μ！２．０Ｍりん酸ナトリウム（ｐＨ７
，０）　、０．１％硫酸ラウリルナトリウム及びｌｘ／
６０ｍテキストランサルフェートからなる水溶液・・・
・・・３７μ！４、　ハイブリダイゼーション混合物を
１０２°Ｃで１０分間インキュベートして試料及びプロ
ーブを変性後、６５°Ｃで２０分間インキュベートして
ハイブリダイゼーションを生じさせる。次に、試料を３
７°Ｃまで冷却し、ストレプトアビジンで被覆した磁気
ビーズ〔マサチューセッツ州のケンブリッジにあるアド
バンスト　マグネチフス（ＡｄｖａｎｃｅｄＭａｇｎｅ
ｔｉｃｓ）社製）の５　ｍｇ／ｄ懸濁液２０ＩＩＩを添
加後、混合物を３７°Ｃで更に１５分間インキュベート
した。（ビーズは、１％トウィーン２０、ｌ１１ｇ／６
０μ！デキストランサルフェート及び０．１％硫酸ラウ
リルナトリウムを含有する０、　５　ｘ　５ＳＰＥで２
回予め洗浄する。） ５、　製造業者記載の方法により、磁気ビーズを磁気分
離し、上清を除去後、ビーズを次のようにして洗浄する
。

１％トウイーン２０、Ｉｎ／６０ｍデキストランサルフ
ェート及び０．１％硫酸ラウリルナトリウムを含有する
０、　１　ｘ　５ＳＰＥで２回洗浄（各６５°Ｃ）； ０．１　ｘ　５ＳＰＥで室温にて１回洗浄。

６、　最終洗浄溶液を除去後、ビーズを１００ｍＭＮａ
ＯＨ，５％フィコル（Ｆｉｃｏｌｌ）及びデキストラン
サルフェート０．３ｄ／ｄの混合物６Ｉに再懸濁する。

１０分後、ビーズ懸濁液を直接アルカリ性アガロースゲ
ルのくぼみ（ｗｅｌｌ）に装填する。アガロースゲルの
操作及びバンド検出条件は、実施例８と同様である。

７、　ビーズを装填したゲルのレーンでは、ｐＳＰ６４
の断片のみが検出される。ラムダＤＮＡに相当する断片
はなにも検出されない。このように、上記操作全体によ
り、プローブに対して構造が相補的な断片のみが特異的
に検出される。

本明細書において述べた刊行物及び特許出願は、本発明
に関連する当該技術分野における技術水準を示すもので
ある。上記した刊行物及び特許出願の内容は、全て本発
明に用いることができる。

また、上記において、本発明を明瞭に理解できるように
、図及び実施例をもってかなり詳細に説明したが、請求
の範囲内において修正及び変更ができることは明らかで
ある。

〔発明の効果〕

上記の説明から明らかなように、本発明の方法によれば
、低レベルの核酸配列、特に複雑な混合物中の核酸配列
が感度よく且つ迅速に検出される。

更に、配列のサイズが重要である場合、本発明により、
標識試料の単離及びそのサイズの測定が可能である。又
、本発明の方法は非常に適応性があり、自動化が可能で
あるので、技術者による誤差を実質的になくすことがで
きる。更に、本発明の方法は、標識及び支持体への連結
の方法を変更することができるので、種々の条件及び試
料が可能となる。又、本発明の工程で、全ての妨害物と
ともに非特異的結合物質が実質的に除去されるので、信
顛性が高く、正確で感度の良いアッセイが提供される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、意図する配列を有すると思われる核酸を標識剤で標
   識し、 前記核酸を、前記の意図する配列に特異的に結合するこ
   とのできる配列及び分離手段への連結のためのカップリ
   ング要素を含有するプローブと、前記の意図する配列と
   前記相補配列との複合体を形成所定のストリンジエンシ
   ー条件下で結合せしめ、但し該核酸が二本鎖である場合
   には核酸プローブをｒｅｃタンパク質と複合体化せしめ
   、前記プローブ及び複合体を前記分離手段により非相補
   配列から分離し； 前記標識された核酸を前記分離手段から解離させて結合
   していない標識された核酸を生成せしめ；そして、 前記結合していない標識された核酸を前記標識剤で検出
   する；工程を含んで成る核酸配列の検出方法。 ２、前記結合していない核酸をサイズ分離する工程を更
   に含んで成る請求項１に記載の方法。 ３、前記サイズ分離を電気泳動により行う請求項２に記
   載の方法。 ４、ゲノムＤＮＡを含有する試料中の意図する核酸配列
   を検出する方法であって、 該ゲノムＤＮＡを断片化して約５０キロ塩基対未満の核
   酸断片を生成し； 標識剤で前記核酸を標識し； 一本鎖形の前記核酸断片を、前記の意図する配列と相補
   的な核酸配列及び粒子への連結のためのカップリング要
   素を含有するプローブと、前記の意図する配列と前記相
   補的配列との二本鎖を形成する所定のストリンジェンシ
   ー条件下で結合せしめ；前記プローブ及び二本鎖を前記
   粒子により非相補的配列から分離し； 前記標識された核酸を前記分離手段から化学的及び／又
   は熱的変性により解離させ； 前記解離した標識された核酸をサイズ分離し；そして 前記サイズ分離した核酸を検出する；ことを含んで成る
   試料中の意図する核酸配列の検出方法。 ５、前記サイズ分離を電気泳動で行う請求項第４に記載
   の方法。 ６、前記標識化が、前記ＤＮＡ断片を前記ＤＮＡ断片の
   末端と相補的な末端を有するｄｓＤＮＡ標識分子と連結
   することを含んで成る請求項５に記載の方法。 ７、前記ＤＮＡ断片の前記相補的末端が制限部位を制限
   酵素で消化して生成したものであり、そして前記相補的
   末端の連結により前記制限酵素により開裂する配列以外
   の配列を生じる請求項６に記載の方法。 ８、前記ＤＮＡ断片の前記相補的末端が平滑末端である
   請求項７に記載の方法。 ９、前記標識化が、前記ＤＮＡ断片の鎖を標識されたヌ
   クレオチドで延長することを含んで成る請求項４に記載
   の方法。 １０、前記標識剤が放射性核種、蛍光剤、化学発光剤、
   特異的結合対のリガンド又は酵素である特許請求の範囲
   第４項に記載の方法。 １１、連結要素に接合した核酸配列、前記連結要素に特
   異的に結合することができる固体成分、核酸配列を標識
   するための試薬及び核酸断片をサイズ分離するための手
   段を含んで成るキット。 １２、前記連結要素が特異的結合対の構成員であり、前
   記固体成分が前記特異的結合対の相補的構成員を含んで
   成り、前記試薬が標識されたヌクレオチドを含んで成り
   、そして前記サイズ分離手段が電気泳動ゲルを含んで成
   る請求項１１に記載のキット。 １３、特異的結合対が受容体とリガンドとの組み合わせ
   からなり、該記組み合わせがアビジン若しくはストレプ
   トアジピンとビオチン；抗体とハプテン若しくは抗原；
   核酸の相補鎖；受容体とホルモン；レクチンと糖；又は
   キレートとイオン、から実質的になる請求項１２に記載
   のキット。