CN1821265A - 一种古代人类遗存物质dna的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种古代DNA的提取方法，该方法采用等离子体等处理骨骼样品，使骨骼样品的内表面的有机污染物质被分解，快速清除骨骼样品的表面和内表面污染，然后进行DNA的提取；包括打磨骨骼样品表面，次氯酸处理，紫外照射，70％乙醇洗涤两次，去除外源微生物DNA污染，进一步用Ar/O2 (9∶1)离子体处理样品，最后在液氮中研磨成粉末作为提取样品。样品消化裂解后，通过分三步完成的酚氯仿抽提方法去除被消化掉的有机分子，通过采用二氧化硅吸附柱吸附及超滤离心管(3kDa)过滤，得到古代DNA模板。本发明的方法能极快对表面和内表面污染进行有效的清除。显著提高了古代DNA提取成功率及模板含量。
Description
技术领域
本发明涉及古代人类DNA提取与纯化，特别涉及一种古代人类遗存物质DNA的提取方法，该方法能够防止内源性和外源性污染和提高提取成功率。
背景技术
目前，古DNA提取方法主要是借鉴法医学上的一些提取方法，这些提取方案一般首先通过打磨样品表面或者用线锯锯掉样品表面1-2mm，紫外照射，70％乙醇洗涤去除样品表面外源DNA污染，然后将样品在液氮中研磨成粉末进行样品前期处理。具体来说主要有以下三种不同的提取方案：蛋白酶K/苯酚—氯仿法、二氧化硅法及异硫氰酸胍—二氧化硅法。
I.蛋白酶K/酚—氯仿法(ThomasWKetal.1990)的步骤是：
1.称取样品0.5g，加入50ml离心管中，并加入EDTA(0.5MpH8.0)溶液15ml，在室温下振荡脱钙处理过夜(24h)；
2.2500rpm离心10min，弃去上层溶液，重新加入15mlEDTA溶液，于室温下振荡过夜；
3.2500rpm离心去除上层溶液，用重蒸水洗涤去除残留的EDTA；
4.向各样品中加入5ml蛋白酶K缓冲液，于55℃振荡过夜；
5.90℃放置5min使蛋白酶K失活，2500rpm离心10min，保留上清液，用等体积平衡酚抽提一次，再用等体积苯酚/氯仿(1∶1)抽提一次，最后用等体积氯仿/异戊醇(24∶1)抽提，每次都取上层溶液；
6.向各管中加入等体积的80％冰乙醇，摇匀静置5min。用滤除分子量30kDa的超滤离心管离心过滤，加100μlTE缓冲液洗脱，收集洗脱液，即为含有古DNA片段的提取液。
II.二氧化硅法(CarterMJetal.1993；YangDYetal.1998)的步骤是：
1.在装有0.5g骨粉的离心管中加入提取缓冲液8ml，于55℃水浴中振荡5-6h；
2.样品液于37℃水浴中继续振荡温育24h，90℃放置5min使蛋白酶K失活；
3.离心：3000rpm离心3min，弃去沉淀，保留上清液；
4.用等体积平衡酚抽提一次，再用等体积苯酚/氯仿(1∶1)抽提一次，最后用等体积氯仿/异戊醇(24∶1)抽提，每次都取上层溶液；
5.将二氧化硅悬浮液(1/10体积)加入样品液，加入2倍体积6M碘化钠，混匀后，室温放置5min吸附DNA，3500rpm离心30s，将上清液重新吸附一次；
6.3500rpm离心30s，弃上清。用等体积80％冰乙醇溶液重悬沉淀，3500rpm离心30s，弃上清，重复洗涤一次。45℃干燥3min，烘干沉淀。
7.100μlTE重悬沉淀，45℃温育3min，5000rpm离心30s，收集上清即为DNA溶液。
III.异硫氰酸胍—二氧化硅法(Hss.Metal.1993；Baron.Hetal.1996)的步骤是：
1.称取0.5g骨粉，加入10ml0.5MEDTApH8.0溶液，在室温下振荡7h；
2.3400rpm离心10min，弃去上清液，加入4ml消解缓冲液，于56℃振荡温育12h；
3.3400rpm离心10min，保留上清液，向每个离心管中加入1/10体积的二氧化硅悬浮液，充分摇匀，在室温下缓慢振荡10-20min；
4.1500rpm离心2min，使二氧化硅完全沉积于底部，弃去上清液；
5.用1.5ml提取缓冲液洗涤二氧化硅沉淀，将洗涤悬浊液移入经紫外照射的1.5ml离心管；
6.分别用70％冰乙醇和丙酮洗涤二氧化硅沉淀，每次于1300rpm离心4min，弃去上清液；
7.二氧化硅沉淀于室温下干燥15min，加入120μ1TE缓冲液重悬二氧化硅沉淀，56℃温育10min，然后于13000rpm离心5min，使二氧化硅完全沉淀，吸取上清液，即为含有DNA片段的提取液。
但是通过上述这些提取方案得到的DNA片段提取液，成功率都低于30％(Herrmann.Betal.1994；MacHughDeetal.2000)，究其原因，其主要缺陷就是不能有效地去除裂解液中残留的蛋白、有机试剂等，不能充分的回收裂解液中的DNA片断；并且这些提取方案在控制内源性和外源性污染上表现一般，容易在提取过程出现假阳性的情况。随着古DNA技术的深入发展，迫切需要开发防止污染和提高提取成功率的技术方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的古代人类遗存物质DNA提取方法，该方法结合等离子体处理有效地防止骨骼内源性和外源性微生物污染，降低假阳性出现几率；通过采用二氧化硅吸附柱吸附及超滤离心管(3kDa)过滤，显著地提高了古代DNA模板含量，为后续进行的目的片断扩增、序列分析、基因克隆等分子生物学操作打下良好的基础。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
一种古代人类遗存物质DNA的提取方法，其特征在于，该方法采用等离子体等处理骨骼样品，使骨骼样品的内表面的有机污染物质被分解，快速清除骨骼样品的表面和内表面污染，然后通过二氧化硅吸附柱吸附及超滤离心管(3kDa)过滤等过程进行DNA的提取；具体包括下列步骤：
1)对打磨表面后经次氯酸处理表面的骨骼样品进行紫外线照射30min，然后用70％的乙醇洗涤两次，去除外源微生物DNA污染；
2)将骨骼样品放置在等离子体处理反应器中，采用外电极、射频功率发生器进行流动式射频放电，放电时间1～10min；同时在等离子体处理反应器中加入Ar/O2为9∶1的等离子体对骨骼样品处理，处理后的骨骼样品从等离子体处理反应器中取出，在空气中放置10min，然后进行古DNA提取；
3)液氮处理骨骼样品，把骨骼样品研磨成粉末，作为DNA提取样品；
4)取DNA提取样品，加入提取缓冲液5ml，于37℃振荡过夜；过夜后的DNA提取样品转入空气浴内振荡，于55℃继续振荡温育6h，然后于95℃放置5min，使多余的蛋白酶K失活；
5)2500rpm离心10min，吸出上清液，移入至另一经消毒的50ml离心管中；
6)用和上清液等体积的平衡酚、苯酚/氯仿、氯仿/异戊醇三种溶剂依次各抽提一次，每次都取上层溶液，合并抽提液，振荡放置10min，然后于2500rpm离心5min，得到上清液；
7)将上清液置于真空旋转蒸发仪中浓缩至300μl，加入等体积100％冰乙醇，充分混匀，将其加入二氧化硅吸附柱，于12000rpm离心30s，弃掉废液，得到含有遗存物质DNA的溶质；
8)用500μl的80％冰乙醇对溶质漂洗两次，12000rpm离心2min，然后于室温下放置10min，使残留的乙醇完全挥发；
9)将吸附柱转入一个经消毒的离心管中，加入160μlTE洗脱液，在60～70℃水浴中预热，室温放置5min，12000rpm离心30s，保留洗脱液；
10)将洗脱液再次加入二氧化硅吸附柱中，室温放置10min，12000rpm的离心机中离心30s，保留洗脱液；
11)将步骤12)的洗脱液转入1.5ml超滤离心管中，于5000rpm离心10min；向超滤离心管中加入100μlTE缓冲液，室温放置2min，收集洗脱液，即为含有古DNA片段的溶液。
等离子体是气体经电离产生大量带电粒子(离子、电子)和中性粒子(原子、分子)所组成的正负电荷的数目相等的集合体，一般等离子气体有CF4、C2H6、CF3H、CF3Cl、NH3、N2、NO、O2、H2O、CO2、SO2、H2/N2、CF4/O2、O2/He、He、Ar、Kr、Ne、空气等。
本发明的方法由于采用了等离子体等处理骨骼样品，可以对骨骼多孔结构的内表面产生作用，可以对骨骼表面层深度几十到几百纳米之间产生作用，使内表面可能的有机污染物质被分解。能极快对表面和内表面污染进行有效的清除。通过采用二氧化硅吸附柱吸附及超滤离心管(3kDa)过滤，显著提高了古代DNA模板含量。
具体实施方式
为了更清楚的理解本发明，申请人给出以下的实施例和与原有的方法进行比较，对本发明作进一步的详细说明。以下是发明人给出的实施例。
实施例1：
按照本发明的方法，采用等离子体等处理骨骼样品，使骨骼样品的内表面的有机污染物质被分解，快速清除骨骼样品的表面和内表面污染，然后进行DNA的提取；具体包括下列步骤：
1.古代人类的样品，选用骨骼和牙齿，打磨表面5mm，再经次氯酸处理表面。
2.进行30min紫外(λ＝254nm)照射，70％乙醇洗涤两次，去除外源微生物DNA污染。
3.将样品放置在等离子体处理反应器中，体系真空度达到10-1Pa，等离子体处理反应器内部包括样品台、外电极(AI)、真空计，离子体处理反应器上连接有射频功率发生器、真空泵、Ar等离子体(图1)。射频功率发生器对离子体处理反应器进行流动式射频放电，其频率13.56MHz，放电压强50Pa，功率40W，放电时间5min。用Ar/O2(9∶1)等离子体处理骨骼样品。处理后的骨样品从反应器中取出，在空气中放置10min再进行古DNA提取实验。
4.液氮处理骨骼和牙齿样品，在玛铑研钵中把骨骼或牙齿样品研磨成粉末，作为实验样品。
5.取骨粉和牙齿粉样品各0.5g，加入提取缓冲液5ml(50mMTrispH8.0，0.2MEDTApH8.0，1mMNaCl，1.2mg/mlDTT，0.5％SDS，500μg/mlProteinaseK)，于37℃振荡过夜。
6.将各样品转入空气浴振荡，于55℃继续振荡温育6h，然后于95℃放置5min，使多余的蛋白酶K失活。
7.2500rpm离心10min，小心吸出上清液，移入另一经经消毒的50ml离心管。
8.用等体积平衡酚(Tris-Hcl饱和PH8.0)、苯酚/氯仿(1∶1)、氯仿/异戊醇(24∶1)各抽提一次，每次都取上层溶液，加入抽提液后必须振荡放置10min，然后于2500rpm离心5min。
9.将上清液于真空旋转蒸发仪中浓缩至300μl，加入等体积100％冰乙醇，充分混匀，将其加入二氧化硅吸附柱，于12000rpm离心30s，弃掉废液。
10.用500μl80％冰乙醇漂洗两次，12000rpm离心2min，然后于室温下放置10min，让残留的乙醇完全挥发。
11.将吸附柱转入一个经消毒的离心管中，加入160μlTE洗脱液(60～70℃水浴预热)，室温放置5min，12000rpm离心30s，保留洗脱液。
12.将洗脱液再加入二氧化硅吸附柱中，室温放置10min，12000rpm离心30s，保留洗脱液。
13.将上述洗脱液转入1.5ml超滤离心管(型号为3kDa，商品化产品)，于5000rpm离心10min。
14.向超滤离心管中加入100μl的TE缓冲液，室温放置2min，收集洗脱液，即为含有古DNA片段的溶液。
实施例2：
本实施例与实施1所不同的是：射频功率发生器的放电时间10min，其余均同实施例1，同样可以达到实施例1的目的。
实施例3：
本实施例与实施1所不同的是：射频功率发生器的放电时间1min，其余均同实施例1，同样可以达到实施例1的目的。
上述实施例可以列举很多，经多次实验证明，射频功率发生器的放电时间在1min～10min，均可以较好的达到本发明的目的。
本发明的方法和传统的提取方法结果对比：
| 方案与对比变量 | 提取液UV检测(λ260) | DNA浓度(μg/ml) | 纯 度(A260/A280) | 一批样品平均提取成功率 |
| 蛋白酶K/苯酚—氯仿法 | 骨骼：0.188 | 骨骼：376 | 骨骼：1.72 | 骨骼：25％ |
| 牙齿：0.203 | 牙齿：406 | 牙齿：1.82 | 牙齿：28％ | |
| 二氧化硅法 | 骨骼：0.192 | 骨骼：384 | 骨骼：1.78 | 骨骼：22％ |
| 牙齿：0.201 | 牙齿：402 | 牙齿：1.78 | 牙齿：25％ | |
| 异硫氰酸胍—二氧化硅法 | 骨骼：0.101 | 骨骼：203 | 骨骼：1.79 | 骨骼：20％ |
| 牙齿：0.191 | 牙齿：382 | 牙齿：1.79 | 牙齿：27％ | |
| 本发明方法 | 骨骼：0.320 | 骨骼：640 | 骨骼：1.87 | 骨骼：40％ |
| 牙齿：0.345 | 牙齿：690 | 牙齿：1.84 | 牙齿：46％ |
通过上表可以看出：本发明方法在提取液浓度(λ＝260)、纯度(A260/A280)上具有明显优势，并且在提取成功率上远远超出传统提取方法。
Claims (5)
1.一种古代人类遗存物质DNA的提取方法，其特征在于，该方法对古代人类的骨骼样品，采用等离子体等处理，使骨骼样品的内表面的有机污染物质被分解，快速清除骨骼样品的表面和内表面污染，然后进行DNA的提取；具体包括下列步骤：
1)对打磨表面后经次氯酸处理表面的骨骼样品进行紫外线照射30min，然后用70％的乙醇洗涤两次，去除外源微生物DNA污染；
2)将骨骼样品放置在等离子体处理反应器中，采用外电极、射频功率发生器进行流动式射频放电，放电时间1～10min；同时在等离子体处理反应器中加入Ar/O2为9∶1的等离子体对骨骼样品处理，处理后的骨骼样品从等离子体处理反应器中取出，在空气中放置10min，然后进行古DNA提取；
3)液氮处理骨骼样品，把骨骼样品研磨成粉末，作为DNA提取样品；
4)取DNA提取样品，加入提取缓冲液5ml，于37℃振荡过夜；过夜后的DNA提取样品转入空气浴内振荡，于55℃继续振荡温育6h，然后于95℃放置5min，使多余的蛋白酶K失活；
5)2500rpm离心10min，吸出上清液，移入至另一经消毒的50ml离心管中；
6)用和上清液等体积的平衡酚、苯酚/氯仿、氯仿/异戊醇三种溶剂依次各抽提一次，每次都取上层溶液，合并抽提液，振荡放置10min，然后于2500rpm离心5min，得到上清液；
7)将上清液置于真空旋转蒸发仪中浓缩至300μ1，加入等体积100％冰乙醇，充分混匀，将其加入二氧化硅吸附柱，于12000rpm离心30s，弃掉废液，得到含有遗存物质DNA的溶质；
8)用500μl的80％冰乙醇对溶质漂洗两次，12000rpm离心2min，然后于室温下放置10min，使残留的乙醇完全挥发；
9)将吸附柱转入一个经消毒的离心管中，加入160μlTE洗脱液，在60～70℃水浴中预热，室温放置5min，12000rpm离心30s，保留洗脱液；
10)将洗脱液再次加入二氧化硅吸附柱中，室温放置10min，12000rpm的离心机中离心30s，保留洗脱液；
11)将步骤12)的洗脱液转入1.5ml超滤离心管中，于5000rpm离心10min；向超滤离心管中加入100μlTE缓冲液，室温放置2min，收集洗脱液，即为含有古DNA片段的溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的射频功率发生器的频率为13.56MHz，放电压强为50Pa，功率40W。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的平衡酚的pH值为8.0，苯酚/氯仿的比例为1∶1，氯仿/异戊醇的比例为24∶1。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的骨骼样品包括骨骼和牙齿。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的提取缓冲液的配方为：50mM的Tris，pH8.0，0.2M的EDTA，pH8.0，1mM的NaCl，1.2mg/ml的DTT，0.5％SDS，500μg/ml的ProteinaseK。
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| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20080130 Termination date: 20110321 |