CN115093996B - 一种耐氨产甲烷菌及其冻干剂和应用 - Google Patents

一种耐氨产甲烷菌及其冻干剂和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种耐氨产甲烷菌，命名为甲烷囊菌(Methanoculleus sp.)SEU003，于2022年03月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.40092。本发明通过驯化提纯同步培养的方式，得到一株产甲烷性能良好且耐氨效果优异的耐氨产甲烷菌，并对该耐氨产甲烷菌进行冻干，首次制备产甲烷菌冻干生物制剂，可以长期保存并保持其生物活性，在有机废弃物资源化领域具有巨大的应用潜力。

Description

一种耐氨产甲烷菌及其冻干剂和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种耐氨产甲烷菌及其冻干剂和应用。
背景技术
目前，全球每年有13到16亿吨的食物废弃物，占到全球供人类食用食物的三分之一，每年经济损失约9900亿美元；浪费了四分之一的农业用水；导致的温室气体排放量占人类活动温室气体总排放量的8％；致使生物多样性丧失。人口增长和生活水平的提高使有机废弃物的产量持续升高，目前我国餐厨废弃物产量约1.95亿吨/年，给垃圾收运处置工作带来了巨大挑战。简单粗放式的有机垃圾处置方式不仅是资源与能源的浪费，同时也将带来环境风险。因此，有机废物能源化、资源化利用视角下的可持续管理是十分必要的，其中又以厌氧消化技术为佳，因为厌氧技术的环境足迹最短、能源回收率潜力最大且能够产生优质生物肥料。
厌氧处理又称厌氧消化，是在无氧条件下由多种微生物共同作用，使有机物分解并生成CH4、CO2、H2O、H2S和NH3的过程，有机物的厌氧处理过程可分为三个阶段：(1)水解、发酵阶段，复杂的有机物被微生物的胞外酶分解为小分子化合物后，进入发酵细菌的细胞内，并在其中转化为更加简单的化合物，同时，细菌利用部分物质合成新的细胞物质；(2)产氢产乙酸阶段，由产氢产乙酸细菌将丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸和乙醇等转化为乙酸、H2和CO2；(3)产甲烷阶段，由产甲烷的细菌利用乙酸、H2和CO2产生甲烷CH4。厌氧生物反应器作为厌氧消化技术的载体，多种因素会影响其高效运行，包括：氨浓度、温度、原料差异、初始污泥微生物种群差异、挥发性脂肪酸浓度、水力停留时间、搅拌强度、重金属和其他有毒化合物等许多化合物会影响厌氧消化过程并导致反应器产甲烷性能不稳定。其中，来自于尿素和蛋白质降解的氨氮，是厌氧消化反应器中主要的微生物毒性物质，高浓度导致甲烷的实际产量大幅下降。因此，有必要寻找一种能够有效驯化耐氨产甲烷菌的方法。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种驯化提纯同步培养的方式，对耐氨产甲烷菌的培养工艺进行了改进，得到一株产甲烷性能良好且耐氨效果优异的耐氨产甲烷菌，并对该耐氨产甲烷菌进行冻干，首次制备产甲烷菌冻干生物制剂，可以长期保存并保持其生物活性。
本发明的第一个目的是提供一种耐氨产甲烷菌，命名为甲烷囊菌(Methanoculleus sp.)SEU003，于2022年03月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.40092。
进一步地，上述耐氨产甲烷菌的驯化培养方法，包括以下步骤：
S1、以未经耐氨驯化的发酵沼液为接种物在培养基上进行第一代培养；
S2、待产气结束，取第一代培养后的发酵沼液与培养基混合，按浓度梯度添加氮源，开始第二代至第六代培养；其中，第二代至第六代培养的氨氮浓度梯度分别为0g/L、3.0g/L、4.0g/L、5.0g/L、6.0g/L，得到所述耐氨产甲烷菌。
进一步地，氮源为氯化铵或尿素。
进一步地，每代培养中，发酵沼液与培养基的体积比为1:3-6。
进一步地，培养基由储备液A、B、C、D、NaHCO3溶液和水组成。其中，储备液A由NH4Cl、NaCl、MgCl2·6H2O、CaCl2·2H2O溶于水得到；储备液B由K2HPO4·3H2O溶于水得到；储备液C由刃天青溶于水得到；储备液D由FeCl2·4H2O、HCl、H3BO3、ZnCl2、CuCl2、MnCl2·4H2O、(NH4)6Mo7O24·4H2O、AlCl3、CoCl2·6H2O、NiCl2、EDTA和H2SeO3溶于水得到。
进一步地，培养时向培养基中添加维生素溶液和Na2S溶液，其中，维生素溶液由生物素，维生素B7，叶酸，维生素B6，维生素B2，维生素B1，维生素B12，烟酸，对氨基苯甲酸，硫辛酸和DL-泛酸溶于水得到。
本发明的第二个目的是提供上述耐氨产甲烷菌在有机物甲烷化中的应用，如用于提高厌氧生物反应器在高氨氮条件下的产甲烷效率。
进一步地，有机物可为餐厨垃圾、有机废水、生活污水等。
本发明的第三个目的是提供一种包含上述耐氨产甲烷菌的培养物或其加工物。
本发明的第四个目的是提供一种耐氨产甲烷冻干菌剂，其通过将上述耐氨产甲烷菌进行发酵获得发酵液，经冷冻干燥获得冻干菌剂。
进一步地，所述的冷冻干燥为：在真空条件下，在第一温度下保温第一时间后，降温至第二温度保温第二时间，随后降温至第三温度保温第三时间，再降温至第四温度保温第四时间，并降温至第五温度保温第五时间，最后降温至第六温度保温第六时间；其中，第一温度≤-80℃，第一时间为10～15h；第二温度为-60～-40℃，第二时间为1～2h；第三温度为-40～-30℃，第三时间为0.5～1.5h；第四温度为-25～-15℃，第四时间为10～30min；第五时间为15～25℃，1.5～2.5h；第六温度≥40℃，第六时间为1～3h。
进一步地，冷冻干燥时，发酵液厚度为40-60mm，优选为50mm。
进一步地，冷冻干燥时，冻干保护剂包括脱脂牛奶、蔗糖和可溶性淀粉。
进一步地，冻干保护剂中，以总重量计，10％脱脂牛奶+5％蔗糖+15％可溶性淀粉，其余为水。
进一步地，上述耐氨产甲烷冻干菌剂的保存条件为3-5℃。
生物强化是将特定微生物添加到生物系统中以改善特定功能的过程。这种创新的方法面临着一个关键的挑战。生物强化过程需要大量的活性氨耐受产甲烷生物量(即“临界生物量”)，尤其是新鲜生物接种制剂的制备和使用需要大量的生物富集培养液，同时受时间限制(需要在新鲜的时候快速加入)。然而，产甲烷菌是环境挑剔的、生长缓慢的微生物，其培养和保存要求高，通过定期运输和使用储存的培养物来大规模应用于生产是不切实际的。延长耐氨菌接种剂的“货架时间”是解决这个难题的一种策略，其中关键点在于耐氨菌群，特别是耐氨产甲烷菌的活性保存，以及提高其应用于生物强化时的效率。因此有必要提供一种能够保证必要生物量的耐氨产甲烷菌群的保存方法。本发明的针对上述现有厌氧耐氨菌群制备、运输、保存困难的问题，提供稳定可靠且简单易行的方法来制备和保存耐氨产甲烷菌群，将它们制备、存储为现成的产品(冻干形式)，以实现低成本的商业应用。使用冻干保存的生物制剂作为生物强化接种物，可以有效化解实际生产中的厌氧反应器中的氨抑制，提高甲烷产量，带来客观的经济和环境效益。
本发明的第五个目的是提供上述耐氨产甲烷冻干菌剂在有机物甲烷化中的应用。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
(1)本发明对比了多种不同的耐氨产甲烷菌培养工艺，并对比了后续制备成冻干菌剂后的综合效果。提出驯化提纯同步培养且为1.0g/L氨氮浓度添加梯度的培养方式下所产生的耐氨产甲烷菌冻干菌粉耐氨效果较佳且具有实际应用价值。
(2)厌氧发酵的氨抑制问题严重限制了厌氧发酵技术的工业化应用，生物强化法作为缓解厌氧发酵过程的氨抑制的有效措施，但需要大量具有高活性的新鲜接种物。因为产甲烷菌是对环境敏感、保存时间短、培养周期长，现有的接种物产品制备周期长、难以长期储存，当沼气厂厌氧反应器发生氨抑制时，难以迅速采取生物强化措施。本发明首次冻干产甲烷菌生物制剂，制备了可以长期保存并保证生物活性的生物强化添加剂产品，通过高通量测序，证实冻干生物制剂产品仍然保有与冻干前液态菌剂相似的微生物群落结构，克服了液态生物强化接种物无法长期保存和即时投产的缺点。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
生物材料保藏
甲烷囊菌(Methanoculleus sp.)SEU003，所述甲烷囊菌(Methanoculleus sp.)SEU003已于2022年03月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.40092，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明的耐氨产甲烷菌培养流程示意图；
图2为A1方式下反应器系统的产甲烷量及甲烷浓度，其中，(a)TAN为0g/L，(b)TAN为3.0g/L，(c)TAN为4.0g/L，(d)TAN为5.0g/L，(e)TAN为6.0g/L；
图3为A2方式下反应器系统的产甲烷量及甲烷浓度，其中，(a)TAN为0g/L，(b)TAN为3.0g/L，(c)TAN为4.5g/L，(d)TAN为6.0g/L；
图4为B1方式下反应器系统的产甲烷量及甲烷浓度，其中，(a)TAN为0g/L，(b)TAN为3.0g/L，(c)TAN为4.0g/L，(d)TAN为5.0g/L，(e)TAN为6.0g/L；
图5为B2方式下反应器系统的产甲烷量及甲烷浓度，其中，(a)TAN为0g/L，(b)TAN为3.0g/L，(c)TAN为4.5g/L，(d)TAN为6.0g/L；
图6为培养物与反应器系统的日产甲烷量以及甲烷浓度；
图7为温度与不同保存时间下产甲烷菌粉的含水率；
图8为不同冻干条件下的产甲烷菌粉；
图9为冻干菌剂生物强化结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1菌剂培养材料预处理
餐厨垃圾预处理过程如下：餐厨垃圾挑拣分选除去纸类、骨头等干扰物；油脂过高会对厌氧消化过程产生抑制作用，故加自来水搅拌，重复冲洗，通过过滤进行除油预处理；将处理后的餐厨垃圾进行称重，称重完加入适量去离子水，搅拌，用食品粉碎机将其粉碎成浆状，过2mm筛；通入氮气15min后置于4℃冰箱中保存。为防止粉碎后的餐厨垃圾因放置过久导致进一步发酵，每次所取餐厨垃圾及粉碎的量仅供一周或一个周期的进料量。
污泥在长期处理餐厨垃圾的厌氧消化罐内，反应罐处理温度为37℃。污泥加少量沼液稀释后，采用2mm筛网过滤，去除大颗粒的无机物及秸秆等杂质，再采用破碎机进一步破碎筛下秸秆后与污泥混合均匀。随后通入氮气15min后置于4℃冰箱中保存。为避免污泥产气对实验的干扰，故需对接种污泥进行前期驯化。将预接种污泥放入反应器中，加餐厨垃圾发酵液，进料周期为3d。驯化初期产气滞后时间较长且产气无规律，随着驯化的进行，产气曲线逐渐显现规律并稳定。重复加入餐厨垃圾发酵液，观察到产气滞后时间明显变短直到无滞后，累计产气量达到最大值并趋于稳定即污泥驯化完成。
将餐厨垃圾与接种污泥混合，按设定的TS混合比混合均匀，用去离子水调节，使混合物料含水率保持在85％，若pH过低需加NaOH溶液调至7.0左右。所配置餐厨垃圾、接种污泥及混合物料的主要性质见表1。
表1餐厨垃圾、接种污泥及混合物料的性质
Figure BDA0003703769210000061
Figure BDA0003703769210000071
提纯培养过程采用BA厌氧培养基，培养基由储备液A、B、C、D、NaHCO3溶液和水组成，具体含量如表2所示。各储备液成分含量如下：①储备液A：NH4Cl，100g；NaCl，10g；MgCl2·6H2O，10g；CaCl2·2H2O，5g。溶于水，总体积1L。②储备液B：K2HPO4·3H2O，200g。溶于水，总体积1L。③储备液C：刃天青0.5g。溶于水，总体积1L。④储备液D：FeCl2·4H2O，2g；浓HCl，2mL；H3BO3，50mg；ZnCl2，50mg；CuCl2，30mg；MnCl2·4H2O，50mg；(NH4)6Mo7O24·4H2O，50mg；AlCl3，50mg；CoCl2·6H2O，50mg；NiCl2，50mg；EDTA，500mg；H2SeO3，49mg。溶于水，总体积1L。⑤NaHCO3溶液：NaHCO3，52g。溶于水，总体积1L。将配置完成的BA前培养基与混合气体(20％CO2，80％N2)一起充气不少于15min，并在121℃高压灭菌20min。高压灭菌后，混合物(BA前培养基)可保存在4℃下。培养时，向BA前培养基中添加维生素溶液和Na2S溶液各1mL(每100ml BA前培养基)。其中：①维生素溶液：生物素，维生素B7，20mg；叶酸，20mg；维生素B6，100mg；维生素B2，50mg；维生素B1，50mg；维生素B12，1mg；烟酸，50mg；对氨基苯甲酸，50mg；硫辛酸，50mg；DL-泛酸，50mg。溶于水，总体积1L。②Na2S溶液：Na2S·7-9H2O，25g。溶于水，总体积1L。实验中按体积比发酵沼液:培养基＝1:4混合。每个反应器中添加2.4g葡萄糖。
表2培养基各成分的含量
Figure BDA0003703769210000072
实施例2液态菌剂培养方法比选
通过对比实验确定了液态菌剂的培养方式，比选出产甲烷效果最好，且消化过程最稳定的培养方式，实验过程如下：
A组(先驯化再提纯培养)：
添加餐厨垃圾与接种污泥混合得到的混合物料，后续根据培养周期添加氯化铵。其中A1组设置五个驯化培养周期，氨氮浓度梯度为0g/L、3.0g/L、4.0g/L、5.0g/L、6.0g/L，A2组氨设置四个驯化培养周期，氨氮浓度梯度为0g/L、3.0g/L、4.5g/L、6.0g/L。驯化完成后A1和A2进行相同的提纯培养，即在6.0g/L氨氮浓度下，用葡萄糖作为基质，富集培养。A1和A2每组分别设三个平行反应器。
具体步骤如下：
(1)定量添加餐厨垃圾与接种污泥混合得到的混合物料，添加蒸馏水定容至800mL，底物浓度为15g VS/L。从进料口充入氮气10min，在35℃水浴锅中恒温培养，开始第一批次发酵。观察产气变化，待产气结束之后，静置沉淀30min，排掉上清液，第一批培养结束，测定此时反应器中氨氮浓度。继续加入相同质量的餐厨垃圾发酵底物，按氨氮浓度梯度添加氯化铵到反应器中，并定容至800mL，调节pH，充入氮气10min，开始第二批次的培养。之后分别按照设定的氨氮浓度梯度添加氯化铵重复以上操作，进行第三、四、五、六批次的驯化培养。
(2)取耐氨驯化后沼液160mL，混合640mL培养基，定容至800mL，从进料口充入氮气10min，放置在35℃水浴锅中恒温，开始第一代提纯培养。观察产气变化，待产气结束，即第一代培养结束。取第一代沼液160mL，混合640mL培养基，定容至800mL，开始第二、三代提纯培养。先驯化再提纯培养实验流程如图1所示。
B组(驯化与提纯同步培养)：
取没有经过耐氨驯化的餐厨垃圾初发酵后沼液，按体积比沼液:培养基＝1:4与培养基进行富集提纯培养，后续根据培养周期添加氯化铵。其中B1组氨氮浓度梯度按照五个培养周期分别设置为0g/L、3.0g/L、4.0g/L、5.0g/L、6.0g/L，B2组氨氮浓度梯度按照四个培养周期分别设置为0g/L、3.0g/L、4.5g/L、6.0g/L。每组分别设三个重复组。
具体步骤如下：
取没有经过耐氨驯化的餐厨垃圾初发酵沼液160mL，混合640mL培养基，定容至800mL，从进料口充入氮气10min，放置在35℃水浴锅中恒温，开始第一代提纯培养。观察产气变化，待产气结束，即第一代培养结束，测定第一代沼液氨氮浓度。取第一代沼液160mL，混合640mL培养基，按氨氮浓度梯度添加氯化铵到反应器中，定容至800mL，开始第二代培养。之后分别按照设定的氨氮浓度梯度添加氯化铵重复以上操作，进行第三、四、五、六代驯化提纯培养。
对A组和B组培养过程中产沼气和甲烷进行测定，结果分别如图2-5所示。从图中可见，B1组的产甲烷量最高，反应器最稳定。
实施例3菌株的获取
测定上述培养得到的微生物溶液的生物质，将B1耐氨菌群在氮气顶空条件下以4500rpm转速离心10min，去除上清液，重复这一离心步骤，直至B1菌液被浓缩16倍，获得耐氨产甲烷菌，经测序分析后，送至保藏，命名为SEU003。
使用制备得到菌剂接种氨抑制条件下的厌氧反应器，结果见图6，发现各种培养物的耐氨性效果由强到弱为B1>A1>B2>A2>对照组，总甲烷产量分别为7496.07mL、4486.49mL、2579.86mL、1551.21mL和1045.55mL，即驯化提纯同步培养方式优于先驯化再提纯培养方式，1.0g/L氨氮浓度添加梯度的培养方式优于1.5g/L氨氮浓度添加梯度的培养方式。
实施例4冻干工艺比选
将培养完成的产甲烷菌菌液在5000rpm条件下离心8min，再将等体积浓度的保护剂与菌体沼液混匀，放入冻干机中进行真空冷冻干燥(冷阱温度-80℃，真空度≤10Pa)。本实验选用的冻干机为Biosafer-10F，该冻干机的优势是温度可以实现动态变化，即干燥过程的温度控制可以是全自动化渐变过程。根据冻干机Biosafer-10F的使用守则及相关成功案例，本实验设置的温度变化为-80℃、-50℃、-30℃、-20℃、20℃、40℃。
冻干过程具体为：(1)初始隔板温度为8.3℃，冷阱温度为9.0℃浮动，样品温度10.0℃，箱真空110000.0Pa，二级启动温度为8.2℃。(2)B设定温度为-80℃，全程15h。隔板温度由8.3℃逐渐降低到-80℃，时间为45min，之后在-80℃浮动。冷阱温度由9.7℃逐渐降低到-80℃，大约2h之后上下浮动。样品温度由10.0℃逐渐下降，最低在-70℃。箱真空维持在110000.0Pa，二级启动温度也逐渐下降后维持。(3)设定温度为-50℃，全程1.5h。隔板温度逐渐升高到-50℃，之后在-50℃浮动。冷阱温度继续下降。样品温度逐渐升高到-50℃上下浮动。箱真空依然维持在110000.0Pa，二级启动温度也逐渐下降后维持。(4)设定温度为-30℃，全程1h。隔板温度逐渐升高，冷阱温度继续下降，下降到最低为-100℃，之后维持在-100℃。样品温度逐渐升高。箱真空突然下降剧烈，由110000.0Pa下降到180.0Pa，考虑可能是开始进行抽真空状态，之后逐渐下降，有少量回升。二级启动温度也逐渐下降后维持。(5)设定温度为-20℃，全程10min。隔板温度逐渐升高，冷阱温度维持在-100℃，样品温度逐渐升高，箱真空少量升高，二级启动温度也基本维持。(6)设定温度为20℃，全程2h。隔板温度逐渐升高，冷阱温度维持在-100℃，样品温度逐渐升高，箱真空逐渐升高，二级启动温度也基本维持。(7)设定温度为40℃，全程2h。隔板温度逐渐升高，冷阱温度维持在-100℃，样品温度逐渐升高，箱真空少量波动，二级启动温度也基本维持。
先在-80℃下预冻15h，因为在该温度下结冰速度快且坚实，不易损伤细胞；-50℃、-30℃、-20℃和40℃分别设置1.5h、1h、10min、2h。在干燥过程中，0℃前后(-20℃到20℃)的冻干时间很关键，设置实验组为20℃，1h和20℃，2h。菌液厚度为50mm和80mm。实验组设置为D1：20℃1h，50mm；D2：20℃2h，50mm；D3：20℃1h，80mm；D4：20℃2h，80mm。观察最终样品的冻干粉状性质，并测定样品中菌粉活菌数以及含水率，从而确定适宜的冻干时间和菌液厚度。其中冻干保护剂选用10％脱脂牛奶+5％蔗糖+15％可溶性淀粉，该复合保护剂冻干存活率较高。
冻干菌粉的保存：将制好的冻干菌粉在西林瓶中密封，分别置于4℃、常温(20-25℃)和35℃常压条件下保存，每20d测一次活菌数和含水率，共60d，通过比较不同温度下冻干产甲烷菌菌粉活菌数和含水率(见图7)随保存时间的变化，确定最佳保存条件。
表1温度与不同保存时间下产甲烷菌粉的活菌数
Figure BDA0003703769210000111
表2温度与不同保存时间下产甲烷菌粉的含水率
Figure BDA0003703769210000112
不同冻干条件下冻干产甲烷菌菌粉活菌数及含水率如下表所示。由表可以看出，当菌液在20℃下冻干2h，厚度为50mm的时候冻干产甲烷菌菌粉活菌数最高，为4.2×1010。含水率在1％-3％的有D1和D2组，分别为2.9％和1.3％。综合比较，选择20℃下冻干2h，厚度为50mm的冻干条件更优。
表3冻干条件与产甲烷菌粉的活菌数
Figure BDA0003703769210000113
表4冻干条件与产甲烷菌粉的含水率
Figure BDA0003703769210000121
不同冻干条件下产甲烷菌菌粉如图8所示。由图8可以看出，D1和D2组，即菌液厚度为50mm条件下冻干出来的菌粉粉质较细，尤其是D2组，粉质密实干燥，D1菌粉偏松软，而菌液厚度为80mm条件下冻干出来的菌粉稀薄潮湿。从形态来看也是20℃下冻干2h，厚度为50mm的冻干条件更优。
因此，最优冻干工艺为：-80℃，15h；-50℃，1.5h；-30℃，1h；-20℃，10min；20℃，2h；40℃，2h；菌液厚度：50mm；10％脱脂牛奶+5％蔗糖+15％可溶性淀粉；真空度5-10mTorr。
最优保存工艺为：4℃、0.1MPa。
实施例5冻干菌剂复水
在本产品冻干后，保存10天和保存6个月后分别进行复水实验，提取DNA后选取通用引物515F/806R对16S rRNA基因的V4区进行聚合酶链反应(PCR)扩增，使用IlluminaMiSeq平台(Majorbio,Shanghai,China)进行高通量测序。测序结果的原始序列被提交到Sequence Read Archive数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)，命名为SUB11568997。在操作分类单元(OTU)聚类之前，通过计算三个平行样中每个OTU序列读数的平均数将三份样本合并。基于美国国家生物技术信息中心网站的16S核糖体RNA序列(Bacteria and Archaea)数据库，以97％的序列相似性定义OTU聚类。关键的OTUs的相对丰度(对丰度高于0.5％的细菌和相对丰度高于0.01％古菌)。结果证实冻干生物制剂产品仍然保有与冻干前液态菌剂相似的微生物群落结构。
实施例6冻干菌剂生物强化案例
使用按实施例4的最优冻干工艺制备，以及用最优保存工艺保存了180天的冻干菌剂对受氨抑制的高温厌氧反应器进行生物强化，相比对照组，冻干耐氨菌剂显著提高厌氧产甲烷率，并缩短产甲烷周期。
搭建9个1L序批式高温厌氧反应器，工作容积400mL，分为A、B、C三组，每组3个。A组每瓶加:400mL的BA培养基(制备方法同实施例1)，1.5克葡萄糖，5mL液态新鲜沼液；B组每瓶加:400mL的BA培养基，1.5克葡萄糖，5mL液态新鲜沼液，5.7克氯化铵NH4Cl；C组每瓶加:400mL的BA培养基，1.5克葡萄糖，5mL液态新鲜沼液，5.7克氯化铵NH4Cl，0.6克的冻干菌剂。结果见图9，表明冻干耐氨菌剂的投加有效提高了甲烷生产速率，并提升了44.3％的最大产甲烷量。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种耐氨产甲烷菌，其特征在于：所述耐氨产甲烷菌命名为甲烷囊菌（Methanoculleus sp.）SEU003，于2022年03月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.40092。
2.权利要求1所述的耐氨产甲烷菌在有机物厌氧消化中的应用。
3.一种包含权利要求1所述耐氨产甲烷菌的培养物或其加工物。
4.一种耐氨产甲烷冻干菌剂，其特征在于：所述耐氨产甲烷冻干菌剂通过将权利要求1所述耐氨产甲烷菌进行发酵获得发酵液，再经冷冻干燥获得。
5.根据权利要求4所述的耐氨产甲烷冻干菌剂，其特征在于，所述冷冻干燥为：在真空条件下，在第一温度下保温第一时间后，降温至第二温度保温第二时间，随后降温至第三温度保温第三时间，再降温至第四温度保温第四时间，并降温至第五温度保温第五时间，最后降温至第六温度保温第六时间；其中，第一温度≤-80℃，第一时间为10~15h；第二温度为-60 ~ -40℃，第二时间为1~2h；第三温度为-40 ~ -30℃，第三时间为0.5~1.5h；第四温度为-25 ~ -15℃，第四时间为10~30min；第五时间为15~25℃，1.5~2.5h；第六温度≥40℃，第六时间为1~3h。
6.根据权利要求4所述的耐氨产甲烷冻干菌剂，其特征在于：冷冻干燥时，发酵液厚度为40-60mm。
7.根据权利要求4所述的耐氨产甲烷冻干菌剂，其特征在于：冷冻干燥时，冻干保护剂包括脱脂牛奶、蔗糖和可溶性淀粉。
8.根据权利要求4所述的耐氨产甲烷冻干菌剂，其特征在于：所述耐氨产甲烷冻干菌剂的保存条件为3-5℃。
9.权利要求4所述的耐氨产甲烷冻干菌剂在有机物厌氧消化中的应用。
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