CN114480372B - 一种通用型核酸提取试剂盒及核酸提取方法 - Google Patents

一种通用型核酸提取试剂盒及核酸提取方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114480372B
CN114480372B CN202210240819.XA CN202210240819A CN114480372B CN 114480372 B CN114480372 B CN 114480372B CN 202210240819 A CN202210240819 A CN 202210240819A CN 114480372 B CN114480372 B CN 114480372B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
acid extraction
extraction kit
vol
magnetic beads
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210240819.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN114480372A (zh
Inventor
柳梦思
石磊
王菁
刘桐山
时国强
董振国
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hebei Sanshi Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Hebei Sanshi Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hebei Sanshi Biotechnology Co ltd filed Critical Hebei Sanshi Biotechnology Co ltd
Priority to CN202210240819.XA priority Critical patent/CN114480372B/zh
Publication of CN114480372A publication Critical patent/CN114480372A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114480372B publication Critical patent/CN114480372B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体公开一种通用型核酸提取试剂盒及核酸提取方法。所述核酸提取试剂盒的裂解液包括如下工作浓度的组分：异硫氰酸胍2mol/L‑5mol/L、三羟甲基氨基甲烷15mmol/L‑80mmol/L、醇类化合物27vol％‑40vol％、200nm‑450nm的四氧化三铁羟基磁珠5vol％‑10vol％、Triton X‑100 8vol％‑15vol％和NP‑40 3vol％‑5vol％。采用本发明提高的核酸提取试剂盒以及核酸提取方法，可实现对多种生物样本核酸的快速提取，通用性较高，且提取出来的核酸片段完整、纯度高、得率高，PCR检测效果更好，具有较高的推广应用价值。

Description

一种通用型核酸提取试剂盒及核酸提取方法
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种通用型核酸提取试剂盒及核酸提取方法。
背景技术
近年来，PCR检测技术的应用越来越普遍，广泛应用于医药、食品、畜牧、水产等多个领域。核酸提取是各种分子生物学检测方法的基础，获得有效、可靠的核酸是PCR检测技术的关键。
随着检测技术和样本类型的增多，现在市面上存在多种核酸检测试剂盒，如细菌提取试剂盒、组织提取试剂盒、全血提取试剂盒等，且每种试剂盒的提取方法也不尽相同。目前，商品化的磁珠法核酸提取试剂盒大部分都需要使用蛋白酶对样本预处理10-30min，操作复杂，耗时较长。而且，现有各种核酸试剂盒为了提高核酸的提取效果，主要是将精力集中在提取样本类型单一化、引入大量的蛋白变性剂、增加洗涤步骤及洗涤时间、只针对DNA或RNA单一种类核酸进行提取等方面，虽然这在一定程度上保证了提取核酸的浓度和质量，但是却导致磁珠法核酸提取试剂盒适用范围较窄，不适用于自动化操作，提取效果不稳定等问题的出现。因此，研发一种适用范围广、适用于自动化操作，提取效果稳定的通用型核酸提取试剂盒及核酸提取方法是本领域亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术中核酸提取试剂盒存在的适用范围较窄，不适用于自动化操作，提取效果不稳定等问题，本发明提供一种通用型核酸提取试剂盒及核酸提取方法。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
一种通用型核酸提取试剂盒，所述核酸提取试剂盒的试剂包括裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液和核酸洗脱液，所述裂解液包括如下工作浓度的组分：
异硫氰酸胍2mol/L-5mol/L、三羟甲基氨基甲烷15mmol/L-80mmol/L、醇类化合物27vol％-40vol％、四氧化三铁羟基磁珠5vol％-10vol％、Triton X-100 8vol％-15vol％和NP-40 3vol％-5vol％；
所述四氧化三铁羟基磁珠的粒径为200nm-450nm；所述裂解液的pH为6.5-8。
相对于现有技术，本发明提供的通用型核酸提取试剂盒，通过特定的裂解液，实现了对各种生物样本中核酸的充分提取；其中，异硫氰酸胍能够快速破坏细胞膜，快速释放核酸，避免核酸的降解，从而有利于确保提取核酸的完整性，同时，异硫氰酸胍还能变性蛋白质，使蛋白质变性沉淀，从而使核酸能够摆脱蛋白质的缠绕；选择Triton X-100和NP-40复配，有利于使核酸在裂解液中沉淀富集，配合特定粒径的四氧化三铁羟基磁珠，更有利于提高吸附核酸的选择性，减少磁珠吸附的杂质，从而提高核酸的提取率和纯度，实现了边裂解边吸附，更适用于全自动化核酸提取应用，有利于核酸提取效率的大幅度提高，具有较高的应用前景。
优选的，所述四氧化三铁羟基磁珠为南京东纳生物科技有限公司的Mag9210型号磁珠。
优选的纳米级磁珠对各种核酸具有较高的吸附性，有利于试剂盒通用型功能的实现，且有利于富集裂解液中的核酸，保证所提取的核酸纯度好、浓度高。
采用本发明独特的裂解液、洗涤液以及洗脱液，配合优选的纳米级磁珠，可使核酸充分从细胞内释放，并有效与磁珠结合，同时，还能最大限度地去除样本的蛋白质、色素、脂类及其他抑制性杂质污染，减少磁珠吸附的杂质，提高提取核酸的纯度和得率。
优选的，所述醇类化合物为乙醇或异丙醇中的一种或两种。
优选的，所述第一洗脱液包括如下工作浓度的组分：异硫氰酸胍2mol/L-4mol/L，三羟甲基氨基甲烷10mmol/L-100mmol/L和乙醇55vol％-60vol％。
在第一洗脱液中加入异硫氰酸胍能够使蛋白质变性沉淀，从而使核酸能够摆脱蛋白质的缠绕，充分洗掉核酸上残存的蛋白质等杂质，提高提取的核酸的纯度。
优选的，所述第二洗涤液为体积百分含量为70％-80％乙醇水溶液。
优选的第二洗脱液有利于充分解离核酸表面的盐离子及其它杂质，提高提取核酸的纯度。
优选的，所述核酸洗脱液为DEPC水。
进一步地，所述核酸洗脱液中还包括0-100mmol/L的三羟甲基氨基甲烷。
优选的洗脱液可以将核酸从核酸吸附物上洗脱，提高洗脱效率。
本发明还提供了一种利用上述任一项所述的通用型核酸提取试剂盒提取核酸的方法，至少包括以下步骤：
步骤a、将核酸提取裂解液与生物样本混合，于70℃-80℃裂解2min-4min，磁吸，得磁珠-核酸复合物；
步骤b、向所述磁珠-核酸复合物中加入所述第一洗涤液，振荡混匀，磁吸，收集洗涤后的磁珠-核酸复合物；
步骤c、向洗涤后的磁珠-核酸复合物中加入所述第二洗涤液，振荡混匀，磁吸，收集洗涤后的磁珠-核酸复合物，干燥；
步骤d、向步骤c所得磁珠-核酸复合物中加入所述核酸洗脱液，70℃-80℃洗脱20s-40s，磁吸使核酸与所磁珠分离，得提取核酸。
本发明所提供的提取核酸的方法，核酸提取时间短，裂解与吸附步骤一步完成，减少了操作步骤，更适用于全自动化核酸提取应用，有利于大幅度提高样本处理效率，实现快速高通量提取出生物样品中的核酸，可广泛应用于全血、血清、组织匀浆液、拭子保存液、细菌等多种样本核酸的提取，具有较高的临床应用前景。
优选的，步骤a至步骤d中，磁吸次数均为2-3次。
优选的，所述提取核酸的方法所用仪器为全自动核酸提取仪。
采用现有市售的全自动核酸提取仪均可达到基本相当的提取效果，优选，所述全自动核酸提取仪包括预分板，如湾区生物BBEX-32型、拜耳ZK-01型、河北三狮ES08型等均可。
采用本发明提高的核酸提取试剂盒以及核酸提取方法，可实现对多种生物样本核酸的快速提取，仪器通用性较高，采用不同核酸提取仪均可获得稳定的提取效果，且提取出来的核酸片段完整、纯度高、得率高，PCR检测效果更好，具有较高的推广应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的核酸提取试剂盒与市售中科拜耳核酸提取试剂盒提取核酸的实时荧光定量PCR扩增曲线对比图，其中，曲线1为实施例1试剂盒所提取的核酸的实时荧光定量PCR扩增曲线，曲线2为市售中科拜耳试剂盒所提取的核酸的实时荧光定量PCR扩增曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例1-3中所用四氧化三铁羟基磁珠为南京东纳生物科技有限公司的Mag9210型号磁珠，提取核酸所用仪器为河北三狮ES08全自动核酸提取仪。
实施例1
本发明实施例提供一种通用型核酸提取试剂盒，所述核酸提取试剂盒的试剂包括裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液和核酸洗脱液；
所述裂解液包括如下工作浓度的组分：异硫氰酸胍2.6mol/L、三羟甲基氨基甲烷55mmol/L、异丙醇30vol％、200nm的四氧化三铁羟基磁珠5.0vol％、Triton X-100 10vol％和NP-40 3vol％；所述裂解液的pH为6.5-8；
第一洗脱液包括如下工作浓度的组分：异硫氰酸胍2.25mol/L，三羟甲基氨基甲烷30mmol/L和乙醇56vol％；
第二洗涤液为体积百分含量为75％乙醇水溶液；
核酸洗脱液为DEPC水。
利用上述通用型核酸提取试剂盒提取猪全血核酸的方法，包括如下步骤：
步骤a，将所述通用型核酸提取试剂盒中的试剂加入到预分装板中，孔位1加入500μL裂解液，孔位3加入700μL第一洗涤液，孔位4加入7000μL第二洗涤液，孔位6加入100μL核酸洗脱液；
步骤b，将200μL样本溶液加入到含裂解液的孔位1中，然后将预分装板放入全自动核酸提取仪中，将对应的磁套头插入磁套卡槽中，设定程序：
孔位1升温至70℃，振荡混匀2min，磁吸2次，完成样本裂解，以及磁珠与核酸结合反应；
移磁珠至孔位3，振荡混匀1min，磁吸2次，完成第一次洗涤，去除核酸中蛋白质和盐类杂质；
移磁珠至孔位4，振荡混匀1min，磁吸2次，完成第二次洗涤，去除核酸中剩余盐类杂质；
移磁珠至预分装板上方，室温晾干1min，使醇类化合物挥发；
移磁珠至孔位6，将核酸洗脱液升温至70℃，振荡洗脱20s，磁吸2次，移磁珠至孔位1，程序运行结束，孔位6中的溶液即为样本核酸溶液，可直接用于后续检测或保存-20℃备用。
采用市售中科拜尔的核酸提取纯化试剂盒(K.QX01B10)作为对照，采用其试剂盒的说明书对猪全血的核酸进行提取，试验证明采用对照试剂盒需要60-70min才能完成核酸提取。并将本发明提供的核酸提取试剂盒提取的核酸与对照提取的核酸在相同条件下进行实时荧光定量PCR检测，结果如图1所示。
试验结果证明，采用本发明提供的核酸提取试剂盒进行猪全血核酸提取，提取时间更短，且提取的核酸PCR检测效果更好。
实施例2
本发明实施例提供一种通用型核酸提取试剂盒，所述核酸提取试剂盒的试剂包括裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液和核酸洗脱液；
所述裂解液包括如下工作浓度的组分：异硫氰酸胍3.5mol/L、三羟甲基氨基甲烷15mmol/L、异丙醇40vol％、200nm的四氧化三铁羟基磁珠6.5vol％、Triton X-100 8vol％和NP-40 5vol％；所述裂解液的pH为6.5-8；
第一洗脱液包括如下工作浓度的组分：异硫氰酸胍3.63mol/L，三羟甲基氨基甲烷100mmol/L和乙醇60vol％；
第二洗涤液为体积百分含量为70％乙醇水溶液；
核酸洗脱液为DEPC水和100mmoL/L三羟甲基氨基甲烷。
利用上述通用型核酸提取试剂盒提取猪全血核酸的方法，所用仪器为河北三狮ES08全自动核酸提取仪，包括如下步骤：
步骤a，将所述通用型核酸提取试剂盒中的试剂加入到预分装板中，孔位1加入500μL裂解液，孔位3加入700μL第一洗涤液，孔位4加入7000μL第二洗涤液，孔位6加入100μL核酸洗脱液；
步骤b，将200μL样本溶液加入到含裂解液的孔位1中，然后将预分装板放入全自动核酸提取仪中，将对应的磁套头插入磁套卡槽中，设定程序：
孔位1升温至72℃，振荡混匀4min，磁吸2次，完成样本裂解，以及磁珠与核酸结合反应；
移磁珠至孔位3，振荡混匀1min，磁吸2次，完成第一次洗涤，去除核酸中蛋白质和盐类杂质；
移磁珠至孔位4，振荡混匀1min，磁吸2次，完成第二次洗涤，去除核酸中剩余盐类杂质；
移磁珠至预分装板上方，室温晾干1min，使醇类化合物挥发；
移磁珠至孔位6，将核酸洗脱液升温至72℃，振荡洗脱30s，磁吸2次，移磁珠至孔位1，程序运行结束，孔位6中的溶液即为样本核酸溶液，可直接用于后续检测或保存-20℃备用。
实施例3
本发明实施例提供一种通用型核酸提取试剂盒，所述核酸提取试剂盒的试剂包括裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液和核酸洗脱液；
所述裂解液包括如下工作浓度的组分：异硫氰酸胍4.8mol/L、三羟甲基氨基甲烷80mmol/L、异丙醇27vol％、200nm的四氧化三铁羟基磁珠9.8vol％、Triton X-100 15vol％和NP-40 4vol％；所述裂解液的pH为6.5-8；
第一洗脱液包括如下工作浓度的组分：异硫氰酸胍3.86mol/L，三羟甲基氨基甲烷10mmol/L和乙醇55vol％；
第二洗涤液为体积百分含量为80％乙醇水溶液；
核酸洗脱液为DEPC水和50mmoL/L三羟甲基氨基甲烷。
利用上述通用型核酸提取试剂盒提取猪全血核酸的方法，所用仪器为河北三狮ES08全自动核酸提取仪，包括如下步骤：
步骤a，将所述通用型核酸提取试剂盒中的试剂加入到预分装板中，孔位1加入500μL裂解液，孔位3加入700μL第一洗涤液，孔位4加入7000μL第二洗涤液，孔位6加入100μL核酸洗脱液；
步骤b，将200μL样本溶液加入到含裂解液的孔位1中，然后将预分装板放入全自动核酸提取仪中，将对应的磁套头插入磁套卡槽中，设定程序：
孔位1升温至80℃，振荡混匀2min，磁吸3次，完成样本裂解，以及磁珠与核酸结合反应；
移磁珠至孔位3，振荡混匀2min，磁吸3次，完成第一次洗涤，去除核酸中蛋白质和盐类杂质；
移磁珠至孔位4，振荡混匀2min，磁吸3次，完成第二次洗涤，去除核酸中剩余盐类杂质；
移磁珠至预分装板上方，室温晾干1min，使醇类化合物挥发；
移磁珠至孔位6，将核酸洗脱液升温至80℃，振荡洗脱40s，磁吸3次，移磁珠至孔位1，程序运行结束，孔位6中的溶液即为样本核酸溶液，可直接用于后续检测或保存-20℃备用。
将实施例2-3提取的核酸按照与实施例1相同的方法进行行实时荧光定量PCR检测，均可达到与实施例1基本相当的检测效果。
实施例4
采用实施例1中的核酸提取试剂盒以及市售中科拜尔的核酸提取纯化试剂盒，分别对猪全血(试剂盒型号K.QX01B10)、猪肉组织液(试剂盒型号K.QX01B10)、虾肝胰腺肠肝胞虫病毒(试剂盒型号K.BD02B10)、鸭肉拭子(试剂盒型号K.QX01B10)、大肠杆菌(试剂盒型号K.XJ01B10)进行核酸提取，其中，市售核酸提取试剂盒按照其说明书进行提取，本发明提供的试剂盒按照与实施例1完全相同的提取方法进行提取，提取仪器为湾区生物BBEX-32全自动核酸提取仪。
将各样本提取的核酸进行实时荧光定量PCR检测，结果如表1所示。
表1
Figure BDA0003541512070000091
由上表可以看出，采用本发明提供的核酸提取试剂盒对各种样本进行核酸提取，提取时间更短，且提取核酸的PCR检测效果更好。
实施例5
本实施例提供一种通用型核酸提取试剂盒，所述核酸提取试剂盒中各试剂的组成均与实施例1相同，不同的仅是四氧化三铁羟基磁珠的厂家型号不同。
采用的磁珠分别为：西安亚博生物技术有限公司MS004、西安亚博生物技术有限公司MS006。
采用各核酸提取试剂盒同时提取相同的大肠杆菌溶液样本200μL，提取方法与实施例1完全相同，将提取的核酸通过超微量紫外分光光度计检测，结果如表2所示。
表2
Figure BDA0003541512070000092
由上表可以看出，不同厂家磁珠对同一样本提取效果相差较大，即便是同一公司不同型号磁珠提取效果也不相同，东纳Mag9210和亚博MS004磁珠对大肠杆菌样本提取效果较好。
采用由东纳Mag9210和亚博MS004磁珠组成的核酸提取试剂盒对猪全血核酸进行提取，提取方法与实施例1完全相同，将提取的核酸通过超微量紫外分光光度计检测和实时荧光定量PCR检测，结果如表3所示.
表3
磁珠厂家 OD值(ng/μL) <![CDATA[A<sub>260</sub>/A<sub>280</sub>]]> <![CDATA[A<sub>260</sub>/A<sub>230</sub>]]> Ct值
东纳Mag9210 35.12 1.930 1.989 21.57
亚博MS004 27.12 1.904 1.732 22.21
由上表可以看出，采用东纳Mag9210磁珠的核酸提取试剂盒，提取的核酸的浓度、纯度以及实时荧光定量PCR检测效果均优于亚博MS004，且对不同样本的提取效果更加稳定，通用性更高。
对比例1
本对比例提供一种通用型核酸提取试剂盒，提取样本为猪肝脏组织提取液，核酸提取试剂盒中各试剂的组成与实施例1完全相同，核酸提取方法也与实施例1相同，不同的仅是步骤b中孔位1的升温温度不同，将步骤b中孔位1的升温温度分别改成65℃、90℃。
将提取的核酸通过超微量紫外分光光度计检测，结果如表4所示。
表4
Figure BDA0003541512070000101
Figure BDA0003541512070000111
由上表可以看出，当裂解温度、洗脱温度不在本发明限定的范围内时，低于或者高于本发明限定的温度范围，都会导致提取核酸的纯度达不到要求。
对比例2
本对比例提供一种通用型核酸提取试剂盒，提取样本为猪肉组织提取液，核酸提取试剂盒中各试剂的组成与实施例1相同，不同的仅是裂解液中Triton X-100的体积百分含量为5％，核酸提取方法也与实施例1相同。
将提取的核酸通过超微量紫外分光光度计检测和实时荧光定量PCR检测，结果如表5所示。
表5
猪肉组织提取液 OD值(ng/μL) <![CDATA[A<sub>260</sub>/A<sub>280</sub>]]> <![CDATA[A<sub>260</sub>/A<sub>230</sub>]]> Ct值
5％ 30.4 1.856 0.962 16.31
10％ 47.5 1.870 1.861 15.95
由上表可以看出，改变裂解液中Triton X-100含量会导致提取的核酸的浓度和纯度明显降低，达不到使用要求。
对比例3
本对比例提供一种通用型核酸提取试剂盒，提取样本为鸭肝组织提取液，核酸提取试剂盒中各试剂的组成与实施例1相同，不同的仅是将裂解液中NP-40替换为等量的SDS，核酸提取方法也与实施例1相同。
将提取的核酸通过超微量紫外分光光度计检测和实时荧光定量PCR检测，结果如表6所示。
表6
Figure BDA0003541512070000112
Figure BDA0003541512070000121
试验过程发现，选择SDS与Triton X-100复配，核酸提取效果并不能达到NP-40与Triton X-100复配的效果，且在提取过程中会析出白色结晶，影响提取效果。
对比例4
本对比例提供一种通用型核酸提取试剂盒，所述核酸提取试剂盒中各试剂的组成均与实施例1相同，不同的仅是四氧化三铁羟基磁珠的厂家型号不同。
采用的磁珠分别为：苏州知益微球科技有限公司KBsphere MagSil 1μm羟基磁珠和上海涛宇国际贸易有限公司AMSCIUM-10 1μm羟基磁珠。
采用各核酸提取试剂盒同时提取相同的大肠杆菌溶液样本200μL，提取方法与实施例1完全相同，将提取的核酸通过超微量紫外分光光度计检测，结果如表7所示。
表7
磁珠厂家 OD值(ng/μL) <![CDATA[A<sub>260</sub>/A<sub>280</sub>]]> <![CDATA[A<sub>260</sub>/A<sub>230</sub>]]>
知益 76.95 1.989 1.102
涛宇 101.1 1.879 1.361
综上所述，本发明提供的核酸提取试剂盒及核酸提取方法，广泛使用于多种样本的核酸提取，且试剂中不含有氯仿等有毒试剂，不需要加入蛋白酶K对样本进行预处理，实现了边裂解边吸附，适用于多种自动化核酸提取仪，自动化程度高，最快仅需16min就可以完成提取，极大地提高了核酸提取效率，且提取的核酸PCR检测效果更好，具有较高的推广应用价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.利用通用型核酸提取试剂盒提取核酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤a、将核酸提取裂解液与生物样本混合，于70℃-80℃裂解2min-4min，磁吸，得磁珠-核酸复合物；
步骤b、向所述磁珠-核酸复合物中加入第一洗涤液，振荡混匀，磁吸，收集洗涤后的磁珠-核酸复合物；
步骤c、向洗涤后的磁珠-核酸复合物中加入第二洗涤液，振荡混匀，磁吸，收集洗涤后的磁珠-核酸复合物，干燥；
步骤d、向步骤c所得磁珠-核酸复合物中加入核酸洗脱液，70℃-80℃洗脱20s-40s，磁吸使核酸与所磁珠分离，得提取核酸；
所述通用型核酸提取试剂盒的试剂包括裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液和核酸洗脱液，所述裂解液由如下工作浓度的组分组成：
异硫氰酸胍2mol/L-5mol/L、三羟甲基氨基甲烷15mmol/L-80mmol/L、异丙醇27vol%-40vol%、四氧化三铁羟基磁珠5vol%-10vol%、Triton X-100 8vol%-15vol%和NP-40 3vol%-5vol%；
所述四氧化三铁羟基磁珠的粒径为200nm-450nm；所述裂解液的pH为6.5-8；
所述四氧化三铁羟基磁珠为南京东纳生物科技有限公司的Mag9210型号磁珠；
所述第一洗涤液由如下工作浓度的组分组成：异硫氰酸胍2mol/L-4mol/L，三羟甲基氨基甲烷10mmol/L-100mmol/L和乙醇55vol%-60vol%；
所述第二洗涤液为体积百分含量为70%-80%乙醇水溶液。
2.如权利要求1所述的利用通用型核酸提取试剂盒提取核酸的方法，其特征在于，所述核酸洗脱液为DEPC水。
3.如权利要求1所述的利用通用型核酸提取试剂盒提取核酸的方法，其特征在于，所述核酸洗脱液中还包括0-100mmol/L的三羟甲基氨基甲烷。
4.如权利要求1所述的提取核酸的方法，其特征在于，步骤a至步骤d中，磁吸次数均为2-3次。
5.如权利要求1所述的提取核酸的方法，其特征在于，所述提取核酸的方法所用仪器为全自动核酸提取仪。
CN202210240819.XA 2022-03-10 2022-03-10 一种通用型核酸提取试剂盒及核酸提取方法 Active CN114480372B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210240819.XA CN114480372B (zh) 2022-03-10 2022-03-10 一种通用型核酸提取试剂盒及核酸提取方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210240819.XA CN114480372B (zh) 2022-03-10 2022-03-10 一种通用型核酸提取试剂盒及核酸提取方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114480372A CN114480372A (zh) 2022-05-13
CN114480372B true CN114480372B (zh) 2023-04-07

Family

ID=81486201

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210240819.XA Active CN114480372B (zh) 2022-03-10 2022-03-10 一种通用型核酸提取试剂盒及核酸提取方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114480372B (zh)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103789297A (zh) * 2012-10-26 2014-05-14 上海医脉赛科技有限公司 快速纯化核酸的方法及试剂盒
CN107043766A (zh) * 2017-02-08 2017-08-15 上海纽思格生物科技有限公司 一种即用型的核酸磁珠提取试剂
CN113652420A (zh) * 2021-08-18 2021-11-16 深圳职业技术学院 一种通用型快速提取生物样本总核酸的试剂盒及方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114480372A (zh) 2022-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106574265B (zh) 高产量分离rna的方法
CN110684764B (zh) 用于核酸提取的裂解液、核酸提取试剂盒及核酸提取方法
US7078224B1 (en) Cell concentration and lysate clearance using paramagnetic particles
US20150275269A1 (en) Method for purifying nucleic acid and kit
CN107937391B (zh) 人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液及其制备方法和应用
CN109022420B (zh) 一种基于磁珠的dna提取方法、裂解液及试剂盒
CN109694863B (zh) 用于核酸提取的裂解液、清洗液、核酸提取试剂盒及核酸的提取方法
CN111961663A (zh) 一种基因组磁珠提取试剂盒和提取方法
CN110452902B (zh) 一种革兰氏阴性菌全基因组dna提取试剂盒
CN112326395A (zh) 一种快速提取生物dna的样品处理方法
US20230203476A1 (en) Nucleic acid extraction method and application
CN110628762A (zh) 一种基于纳米磁珠的核酸提取方法及应用
JP2013042750A (ja) 核酸抽出方法、核酸抽出試薬キットおよび核酸抽出用試薬
CN114480372B (zh) 一种通用型核酸提取试剂盒及核酸提取方法
CN112941067A (zh) 一种全血核酸提取用裂解结合液及其试剂盒和应用
CN113355320A (zh) 用于分离和/或纯化核酸的裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂
CN116162618A (zh) 一种从核酸溶液中分离dna和rna的方法及试剂组合
CN113308459A (zh) 一种磁珠法全血核酸提取裂解液、试剂盒及提取方法
CN113846088B (zh) 一种提取质粒dna的试剂盒及方法
CN115247171A (zh) 一种适用于咽拭子、唾液、血清、血浆中病原体核酸提取的裂解结合液、试剂盒及提取方法
CN114317527A (zh) 用于从样本中提取核酸的方法和试剂盒
CN114350649A (zh) 一种核酸提取试剂盒及核酸提取方法
CN113652420A (zh) 一种通用型快速提取生物样本总核酸的试剂盒及方法
CN114317519A (zh) 一种血液基因组dna提取试剂盒及其使用方法
CN112481252A (zh) 一种大规模提取用于转染哺乳动物细胞的无内毒素质粒的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant