KR102354410B1 - 눈 질환 치료제, 이의 스크리닝 방법, 및 망막 색소 상피 세포 이식과 연관된 거부 반응의 예측 방법 - Google Patents

눈 질환 치료제, 이의 스크리닝 방법, 및 망막 색소 상피 세포 이식과 연관된 거부 반응의 예측 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 눈 질환 치료제 및 눈 질환 치료제의 스크리닝 방법 등을 제공한다. 또한, 본 발명은 눈 질환 환자에 대한 망막 색소 상피 세포의 이식과 연관된 거부반응의 예측 방법을 제공한다.

Description

눈 질환 치료제, 이의 스크리닝 방법, 및 망막 색소 상피 세포 이식과 연관된 거부 반응의 예측 방법 {EYE DISEASE TREATMENT AGENT, SCREENING METHOD THEREFOR, AND METHOD FOR PREDICTING REJECTION RESPONSE ASSOCIATED WITH RETINAL PIGMENT EPITHELIAL CELL TRANSPLANT}
본 발명은 눈 질환 치료제, 이의 스크리닝 방법 및 망막 색소 상피 세포 이식과 연관된 거부 반응의 예측 방법에 관한 것이다.
주요 조직 적합 항원(MHC)은 인간의 HLA(Human leukocyte antigen: 인간 백혈구 항원)로 공지되어 있고, 대부분의 세포와 조직에서 발현된다. HLA는 주로 A, B, C DR, DQ, DP의 6유전자좌 항원이 있고, 이들 각각은 수십 종류의 상이한 유형(대립유전자)의 복잡한 조합으로 구성되어 있으며, 그 조합은 수만 가지 존재한다. HLA는 인간의 체내에서 중요한 면역 메커니즘을 담당하고 있고, 그 주요 역할은 자타 인식을 하기 위한 항원 제시이다. 만약 타인으로부터 자기 이외의 세포·조직을 이식받은 경우(동종이계 이식: allogeneic transplantation), 이 HLA가 가장 중요한 항원(이물질)으로 T 세포 등의 면역 담당 세포에 인식되어, 거부가 성립하고 이식이 생착되지 (enfrafted) 않게 된다.
통상의 장기 이식, 특히 골수 이식에 있어서는, 원칙적으로 HLA의 각 항원인 A, B, C, DR, DQ 및 DP의 6유전자좌 모두를 일치시킬 필요가 있다고 생각되고, 일치할 수 없는 경우는 심각한 거부 반응이 발생할 위험이 있으며, 또한 이식후 예후도 나빠지는 것으로 알려져 있다.
망막 색소 상피 세포는 안내에 침투하는 염증 세포(Th1 세포, CD8 양성 세포, 대식세포, B 세포 등)을 억제하는 분자를 발현·생산하고, 동종의 자동 염증성 세포에 대하여 억제 시그날을 부여하는 것으로 공지되어 있다(예를 들면, 비특허문헌 1, 2). 한편, 동일한 조건하에서 제어성 T 세포는 촉진 시그날을 제공하는 것으로 공지되어 있다(비특허문헌 3, 4). 한편, 망막 색소 상피 세포는 이종 T 세포(Th22 세포)를 억제하는 것으로 공지되어 있고(비특허문헌 5), 망막 색소 상피 세포 자체는 면역 억제 기능이 존재하며, 이로 인해 망막 색소 상피 세포 주변의 환경은 면역 반응이 억제되는 경향이 있는 것으로 공지되어 있다. 또한, IFN-γ 또는 마크로파지로 전처리된 인간 망막 색소 상피 세포를 동종이계 T 세포와 공배양하면, IL-2 등의 생산 상승에 따라 T 세포가 활성화되는 것으로 공지되어 있다(비특허문헌 6). 또한, IFN-γ는 MHC 클래스 II 분자의 발현에 중요한 역할을 하는 것으로 공지되어 있다(비특허문헌 7). 그러나, 현재까지 망막 색소 상피 세포(이하 "RPE 세포"라고 기재한다)를 이용한 망막 질환 환자에 대한 이식에서 HLA 적합성을 고려한 동종이계 이식 전략은 없었다.
비특허문헌 1: Sugita S et al, J Immunol. 2004, 172: 4184-4194.
비특허문헌 2: Sugita S et al, J Immunol. 2006, 176: 118-127.
비특허문헌 3: Sugita S et al, J Immunol 2008, 181: 7525-7536.
비특허문헌 4: Sugita S et al, J Immunol 2009, 183: 5013-5022.
비특허문헌 5: Sugita S et al, IOVS 2013, vol. 54, No. 10: 6926-6933.
비특허문헌 6: Enzmann V et al. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2001 Jul; 239(6): 445-51
비특허문헌 7: Enzmann V. Transplant Immunology 7: 9-14, 1999
본 발명의 목적은 눈 질환 치료제 및 눈 질환 치료제 등의 스크리닝 방법 등을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 다른 목적은 눈 질환 환자에 대한 망막 색소 상피 세포 이식과 연관된 면역 거부 반응의 예측 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 복수의 피시험자로부터 수득한 T 세포, iPS 세포 유래 망막 색소 상피(RPE) 세포를 취득하고, HLA 타이핑을 수행한 후, 상기 T 세포와 RPE 세포를 접촉 배양하는 것으로, T 세포에서 분비되는 사이토킨 농도를 측정한 결과, 상기 T 세포의 HLA-A, HLA-B, HLA-DR의 3 유전자좌의 대립유전자가 HLA-A, HLA-B, HLA-DR의 3 유전자좌에서 유전자형이 각각 동형접합형인 망막 색소 상피 세포의 각 유전자좌에서 대립유전자와 일치하는 경우, 사이토킨 농도가 T 세포 단독의 경우와 동등하거나 그보다 저하된다는 지견을 수득했다.
본 발명자는 이러한 지견에 기초하여 추가 연구를 거듭한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하에 관한 것이다.
[1] 각각의 유전자좌가 동형접합 유전자형을 갖는 HLA-A 유전자좌, HLA-B 유전자좌 및 HLA-DR 유전자좌를 갖는 망막 색소 상피 세포를 포함하는 눈 질환 치료제로서, 각각의 대응하는 유전자좌에서 적어도 하나의 대립유전자가 상기 망막 색소 상피 세포의 상기 유전자좌에서 대립유전자와 동일한 조합을 갖는 눈 질환 환자를 위한, 안구 질환 치료제.
[2] 이식후의 면역 거부 반응을 억제하는, [1]에 기재된 치료제.
[3] 상기 망막 색소 상피 세포가 다능성 줄기세포로부터 유래하는, [1] 또는 [2]에 기재된 치료제.
[4] 상기 다능성 줄기세포가 iPS 세포인, [3]에 기재된 치료제.
[5] 상기 눈 질환이 망막 변성 또는 망막 변성과 연관된 질환인, [1] 내지 [4]의 어느 하나에 기재된 치료제.
[6] 눈 질환 환자에 대한 눈 질환 치료제를 선택하는 방법으로서,
(i) 환자 유래 T 세포의 HLA-A 유전자좌, HLA-B 유전자좌 및 HLA-DR 유전자좌의 유전자형을 조사하는 단계,
(ii) 단계 (i)에서 판명된 각 유전자좌에서 대립유전자와 일치하는 대립유전자를 갖는 망막 색소 상피 세포를 선택하는 단계
를 포함하는, 방법.
[7] 단계 (ii)에서 상기 망막 색소 상피 세포가 HLA-A 유전자좌, HLA-B 유전자좌 및 HLA-DR 유전자좌를 갖고, 각 유전자좌의 유전자형이 동형접합형인, [6]에 기재된 방법.
[8] 눈 질환 환자에 대한 눈 질환 치료제를 선택하는 방법으로서,
(1) 환자 유래 T 세포를 망막 색소 상피 세포와 접촉 배양하는 단계,
(2) 단계 (1)에서 배양 상청액 중에 분비된 염증성 사이토킨 농도를 측정하는 단계 및
(3) 단계 (2)의 염증성 사이토킨 농도가 환자 유래 T 세포를 단독으로 배양하여 수득한 배양 상청액 중의 염증성 사이토킨 농도와 동일한 정도이거나 그 이하인 경우에, 상기 망막 색소 상피 세포가 눈 질환 환자에 대한 눈 질환 치료제의 유효 성분으로 사용될 수 있는 것으로 판정하는 단계
을 포함하는, 방법.
[9] 상기 망막 색소 상피 세포가 HLA-A 유전자좌, HLA-B 유전자좌 및 HLA-DR 유전자좌를 갖고, 각 유전자좌의 유전자형이 동형접합형인, [8]에 기재된 방법.
[10] 단계 (1)에서 환자 유래 T 세포가 항-CD3 항체를 사용하여 활성화되는, [8] 또는 [9]에 기재된 방법.
[11] 단계 (1)에서 환자 유래 T 세포가 CD4 양성이고, 단계 (2)에서 측정하는 염증성 사이토킨이 IFN-γ인, [8] 내지 [10] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[12] 단계 (1)에서 환자 유래 T 세포가 CD8 양성이고, 단계 (2)에서 측정하는 염증성 사이토킨이 그랜자임 B인, [8] 내지 [10] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[13] 이식용 망막 색소 상피 세포를 이식하는 안관 질환 환자의 거부 반응을 예측하기 위한 시험 방법으로서,
(A) 환자 유래 T 세포를 상기 망막 색소 상피 세포와 접촉 배양하는 단계,
(B) 단계 (A)에서 배양 상청액 중에 분비된 염증성 사이토킨 농도를 측정하는 단계 및
(C) 단계 (B)에서 염증성 사이토킨 농도가 환자 유래 T 세포를 단독으로 배양하여 수득한 배양 상청액 중의 염증성 사이토킨 농도보다 유의적으로 높은 경우에, 상기 망막 색소 상피 세포에 대한 거부 반응이 발생하는 것으로 판정하는 단계
를 포함하는, 방법.
[14] 상기 이식용 망막 색소 상피 세포가 HLA-A 유전자좌, HLA-B 유전자좌 및 HLA-DR 유전자좌를 갖고, 각 유전자좌의 유전자형이 동형접합형인, [13]에 기재된 방법.
[15] 단계 (A)에서 상기 환자 유래 T 세포가 항-CD3 항체를 사용하여 활성화되는, [13] 또는 [14]에 기재된 방법.
[16] 단계 (A)에서 환자 유래 T 세포가 CD4 양성이고, 단계 (B)에서 측정하는 염증성 사이토킨이 IFN-γ인, [13] 내지 [15] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[17] 단계 (A)에서 환자 유래 T 세포가 CD8 양성이고, 단계 (B)에서 측정하는 염증성 사이토킨이 그랜자임 B인, [13] 내지 [15] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[18] 각각의 유전자좌가 동형접합 유전자형을 갖는 HLA-A 유전자좌, HLA-B 유전자좌 및 HLA-DR 유전자좌를 갖는 망막 색소 상피 세포의 시트를 형성하는 단계 및 각각의 대응하는 유전자좌에서 적어도 하나의 대립유전자가 상기 망막 색소 상피 세포의 상기 유전자좌에서 대립유전자와 동일한 조합을 갖는 눈 질환 환자에게 상기 시트를 이식하는 단계를 포함하는, 눈 질환의 치료 방법.
[19] 상기 망막 색소 상피 세포가 다능성 줄기세포 유래인, [18]에 기재된 방법.
[20] 상기 다능성 줄기세포가 iPS 세포인, [19]에 기재된 방법.
[21] 상기 눈 질환이 망막 변성 또는 망막 변성과 연관된 질환인, [18] 내지 [20] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[22] 각각의 유전자좌가 동형접합 유전자형을 갖는 HLA-A 유전자좌, HLA-B 유전자좌 및 HLA-DR 유전자좌를 갖는 망막 색소 상피 세포로서, 각각의 대응하는 유전자좌에서 적어도 하나의 대립유전자가 상기 망막 색소 상피 세포의 상기 유전자좌에서 대립유전자와 동일한 조합을 갖는 눈 질환 환자의 눈 질환의 치료에 사용하기 위한, 망막 색소 상피 세포.
[23] 상기 망막 색소 상피 세포가 다능성 줄기세포 유래인, [22]에 기재된 망막 색소 상피 세포.
[24] 상기 다능성 줄기세포가 iPS 세포인, [23]에 기재된 망막 색소 상피 세포.
[25] 상기 눈 질환이 망막 변성 또는 망막 변성과 연관된 질환인, [22] 내지 [24] 중의 어느 하나에 기재된 망막 색소 상피 세포.
[26] 각각의 유전자좌가 동형접합 유전자형을 갖는 HLA-A 유전자좌, HLA-B 유전자좌 및 HLA-DR 유전자좌를 갖는 망막 색소 상피 세포로서, 각각의 대응하는 유전자좌에서 적어도 하나의 대립유전자가 상기 망막 색소 상피 세포의 상기 유전자좌에서 대립유전자와 동일한 조합을 갖는 눈 질환 환자의 눈 질환의 치료제를 제조하기 위한, 망막 색소 상피 세포.
[27] 상기 망막 색소 상피 세포가 다능성 줄기세포 유래인, [26]에 기재된 망막 색소 상피 세포.
[28] 상기 다능성 줄기세포가 iPS 세포인, [27]에 기재된 망막 색소 상피 세포.
[29] 상기 눈 질환이 망막 변성 또는 망막 변성과 연관된 질환인, [26] 내지 [28] 중의 어느 하나에 기재된 망막 색소 상피 세포.
종래의 동종이계 이식에서는 기증자와 수용자의 HLA형을 최대한 일치시키는 것이 요구되었다. 특히, 골수 이식에서는, HLA형으로 공지된 6개 유전자좌의 항원의 대립유전자 모두를 일치시키는 것이 필요하다고 생각되어 왔다. 그러나, 본 발명에 의하면, RPE 세포 이식에서 기증자 측의 HLA-A, HLA-B 및 HLA-DR의 3개 유전자좌에서 유전자형이 동형접합형인 경우, 수용자의 HLA좌의 한쪽 매칭만으로 거부 반응을 억제하는 것이 가능하게 된다. 따라서, 환자로부터 사전 채혈하여 면역학적으로 적합하지 않는 이식 세포를 판별·선택할 수 있기 때문에, 부적합 세포의 이식을 회피함으로써 환자의 부담을 경감할 수 있다. 이 방법에 의해 선택된 RPE 세포는 이식에 사용하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명을 면역 억제제의 요부 판정에 이용함으로써 치료 방침의 선택에 기여한다. 따라서, 본 발명은 동종이계 이식에 의한 치료 효율을 크게 향상시키는데 기여하고, 게다가 이식에 적합하지 않은 세포의 제조 비용 절감 등의 효과도 나타낸다.
　또는, HLA-A, HLA-B 및 HLA-DR의 3개 유전자좌에서 유전자형이 동형접합형인 RPE 세포는 상기 3개 유전자좌에서 적어도 하나의 대립유전자가 상기 망막 색소 상피 세포의 대립유전자와 일치하는 조합을 갖는 환자용의 눈 질환 치료제로 사용할 수 있다.
도 1은 CD4 양성 T 세포 현탁액(TLHD-1, TLHD-2)과 454E2-iPS 유래 RPE 세포를 공배양한 경우에서 배양 상청액 중의 IFN-γ의 농도를 나타낸다.
도 2는 CD4 양성 T 세포 현탁액(TLHD-2, TLHD-3, TLHD-4, TLHD-6, TLHD-7, TLHD-8, TLHD-9)과 454E2-iPS 유래 RPE 세포를 공배양한 경우, 및 TLHD-1 유래 T 세포 현탁액 및 TLHD-1 유래 iPS 세포 유래 RPE 세포를 공배양한 경우에서 배양 상청액 중의 IFN-γ의 농도를 나타낸다.
도 3은 CD4 양성 T 세포 현탁액(TLHD-1)과 각종 RPE 세포(표 2에서 번호 1 내지 3, 6 내지 10) 또는 마우스 섬유아세포를 공배양한 경우에서 배양 상청액 중의 IFN-γ의 농도를 나타낸다.
도 4는 CD4 양성 T 세포 현탁액(TLHD-1, TLHD-8, TLHD-14, TLHD-21)과 453F2-iPS 유래 RPE 세포를 공배양한 경우에서 배양 상청액 중의 IFN-γ의 농도를 나타낸다.
도 5는 CD8 양성 T 세포 현탁액(TLHD-1, TLHD-8, TLHD-14, TLHD-22)과 453F2-iPS 유래 RPE 세포를 공배양한 경우에서 배양 상청액 중의 그랜자임 B의 농도를 나타낸다.
도 6은 CD4 양성 T 세포 현탁액(TLHD-1)과 454E2-iPS 유래 RPE 세포를 공배양한 경우에서 IL-2, IFN-γ, IL-17, TNF-α, IL-22을 생산하는 CD4 양성 T 세포의 비율을 FACS로 나타낸다.
도 7은 CD4 양성 T 세포 현탁액(TLHD-1, TLHD-10)과 454E2-iPS 유래 RPE 세포를 공배양한 경우에서 각종 사이토킨의 생산량을 나타낸다.
도 8은 CD8 양성 T 세포 현탁액(TLHD-1)과 454E2-iPS 유래 RPE 세포를 공배양한 경우에서 그랜자임 B, 페르포린, TNF-α를 생산하는 CD8 양성 T 세포의 비율을 FACS로 나타낸다.
도 9는 CD8 양성 T 세포 현탁액(TLHD-1, TLHD-3)과 454E2-iPS 유래 RPE 세포를 공배양한 경우에서 배양 상청액 중의 그랜자임 B의 농도를 나타낸다.
도 10은 CD8 양성 T 세포 현탁액(TLHD-2, 4, 5, 8, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20)과 454E2-iPS 유래 RPE 세포를 공배양한 경우에서 배양 상청액 중의 그랜자임 B의 농도를 나타낸다.
본 발명은 각각의 유전자좌가 동형접합 유전자형인 HLA-A 유전자좌, HLA-B 유전자좌 및 HLA-DR 유전자좌를 갖는 망막 색소 상피 세포를 포함하는, 각각의 대응하는 유전자좌에서 적어도 하나의 대립유전자가 상기 망막 색소 상피 세포의 상기 유전자좌에서 대립유전자와 동일한 조합을 갖는 눈 질환 환자를 위한 안구 질환 치료제(이하, "본 발명의 치료제")를 제공한다.
본 발명의 치료제는 망막 색소 상피 세포를 함유한다. 본 발명에서 "망막 색소 상피 세포"는 망막 색소 상피를 구성하는 상피 세포 및 그 전구세포를 지칭한다. 망막 색소 상피 세포인지의 여부는, 예를 들면, 세포 마커(RPE65, CRALBP, MERTK, BEST1 등)의 발현과 세포의 형태(세포내 멜라닌 색소 침착, 다각형 편평상의 세포 형태, 다각형의 액틴속의 형성 등) 등에 의해 확인할 수 있다. 또한, 망막 색소 상피 세포의 전구세포는 망막 색소 상피 세포로의 분화 유도가 동일 방향으로 향하게 한 세포를 의미하고, 상기 전구세포의 여부는 세포 마커(Mitf, Pax6, Rx, Crx 등)의 발현 등에 의해 확인할 수 있다. 또한, 망막 색소 상피 세포의 기능 평가, 예를 들면, 사이토킨(VEGF, PEDF 등)의 분비능과 식세포 활동 등을 지표로서 확인할 수 있다. 이러한 기능 평가 및 확인 조작은 당업자에 의해 적절한 조건을 설정하여 실시하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 망막 색소 상피 세포는, 예를 들면, 포유동물에서 유래하는 망막 색소 상피 세포를 사용할 수 있다. 포유동물로는, 예를 들면, 마우스, 쥐, 기니아 피그, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 염소, 원숭이, 및 인간을 들 수 있다. 인간에 대한 이식 등을 목적으로 망막 색소 상피 세포를 제조하는 경우 등에는 인간 망막 색소 상피 세포가 바람직하게 사용된다.
상기 "막 색소 상피 세포"는 직접 채취한 일차 세포 (primary cell)일 수도 있고, 또는 그들을 수세대 계대시킨 것일 수도 있다. 일차 망막 색소 상피 세포는 공지된 방법으로 분리할 수 있으며, 예를 들면, 망막 색소 상피 세포는 사체 안구 적출 후, 즉시 적도부에서 안구를 분할하고, 유리체와 망막을 제거한 후, 필요에 따라 콜라게나제와 히알루로니다제 등으로 처리하고, 셀 스크레이퍼에 의한 찰과 또는 트립신과 EDTA 용액으로 세포를 브루흐 막 (Bruch's membrane)으로부터 유리시켜 회수한 후, 배양액에서 정치하여 배양 접시에 부착, 증식을 유도함으로써 필요한 양의 세포를 증식시켜, 트립신 처리 등으로 적절히 계대하여 세포수를 확보할 수 있다.
또한, 상기 "망막 색소 상피 세포"는 다능성 줄기세포, 신경 줄기세포 등의 체세포 줄기세포를 포함한 줄기세포 또는 신경 전구세포, 망막 전구세포를 포함한 전구세포를 분화 유도함으로써 수득할 수 있는 세포일 수도 있지만, 다능성 줄기세포를 분화 유도하여 수득한 세포가 바람직하다.
본 발명에서 "다능성 줄기세포"는 자기 복제 능력과 분화 다능성을 갖는 줄기세포를 의미하며, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 배아 줄기세포(ES 세포), iPS 세포(유도 다능성 줄기세포) 등이 광범위하게 이용된다. 바람직하게는, 인간 ES 세포 또는 인간 iPS 세포가 이용되고, 더욱 바람직하게는 인간 iPS 세포가 이용된다.
본 발명에서 "iPS 세포"는 체세포(예: 섬유아세포, 피부 세포, 림프구 등)에 핵 초기화 인자를 접촉시킴으로써 인위적으로 자기 복제 기능 및 분화 다능성을 획득한 세포를 의미한다. iPS 세포는 체세포(예: 섬유아세포, 피부 세포 등)에 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc로 이루어진 핵 초기화 인자를 도입하는 방법으로 최초 발견되었다[참조: Cell 126 : p. 663-676, 2006]. 그 후, 많은 연구자에 의해 재프로그램 인자의 조합과 인자의 도입 방법에 대해 여러가지 개량이 진행되고 있으며, 다양한 유도 다능성 줄기세포의 제조 방법이 보고되어 있다. 그러나, 본 발명에서 iPS 세포의 제조 방법은 특별히 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 "망막 색소 상피 세포"에서 HLA-A 유전자좌, HLA-B 유전자좌 및 HLA-DR 유전자좌의 유전자형은 각각 동형접합형인 것이 바람직하다. 유전자형이 동형접합형이라는 것은 2개의 대립유전자가 동일한 염기 서열을 갖는 유전자끼리인 것을 가리킨다. 후술하는 실시예에서, 피시험자로부터 채취한 T 세포와 iPS 세포를 분화 유도하여 수득한 망막 색소 상피 세포를 공배양한 결과, HLA-A 유전자좌, HLA-B 유전자좌 및 HLA-DR 유전자좌에서 유전자형이 각각 동형접합형인 망막 색소 상피 세포에 대하여, 대응하는 유전자좌에서 적어도 하나의 대립유전자가 상기 망막 색소 상피 세포의 상기 유전자좌에서 대립유전자와 일치하는 조합을 갖는 T 세포는 사이토킨 생산이 대조군(T 세포 단독의 경우)과 동일한 정도이거나, 놀랍게도 억제되는 것을 발견했다.
종래, 망막 색소 상피 세포는 T 세포를 포함하는 염증 세포를 억제하는 분자를 발현하고, 제어성 T 세포는 촉진적 시그날을 제공하는 것으로 공지되었다. 그러나, 이들의 대부분은 동종이계의 자동 세포에 대한 결과였다(예를 들면, 배경기술의 비특허문헌 1 내지 4). 한편, 망막 색소 상피 세포가 이종 (xonogeneic) T 세포를 억제하는 것도 발명자들에 의해 보고되어 있지만(예를 들면, 배경기술의 비특허문헌 5), 이것은 단순히 망막 색소 상피 세포 자체의 기능을 나타내는 데에 불과하다. 실제로, 이종 이식에서 급성 거부 반응이 큰 문제가 되고, 망막 색소 상피 세포가 항원 제시하는 것은 아니기 때문에, 발명자에 의한 이러한 보고는 본 발명을 전혀 시사하는 것은 아니다.
이상으로부터, 망막 색소 상피 세포 이식에서 기증자 측의 HLA-A, HLA-B 및 HLA-DR의 3개 유전자좌에서 유전자형이 동형접합형인 경우, 수용자의 HLA 유전자좌의 한쪽 대립유전자의 매칭만으로 거부 반응을 억제하는 것이 가능하게 되고, 망막 색소 상피를 이식할 필요가 있는 눈 질환 환자에게 신속하게 이식용 세포를 공급할 수 있다. 본 발명은 동종이계의 망막 색소 상피 세포 이식에서 기증자 측의 HLA-A, HLA-B 및 HLA-DR의 3개 유전자좌에서 유전자형이 동형접합형인 경우, 수용자의 HLA좌의 한쪽 매칭만으로 거부 반응을 억제할 수 있는 것을 발견한 것에 기인하여 완성된 발명이며, 그 발견에 큰 의의가 있다. 또한, 본 발명의 궁극적인 목표는 망막 색소 상피 세포의 동종이계 이식에서 발생할 수 있는 면역 거부 반응을 최대한 억제하는 것에 있다. 이러한 관점에서 본 발명에서 눈 질환 환자에게 투여하는 눈 질환 치료제의 유효 성분인 HLA-A 유전자좌, HLA-B 유전자좌 및 HLA-DR 유전자좌에서 유전자형이 각각 동형접합형인 망막 색소 상피 세포는 타가 세포이며, 상기 유전자좌에서 유전자형이 동형접합형인 다양한 망막 색소 상피 세포로부터 상기 환자에게 적합한 망막 색소 상피 세포가 선택된다.
눈 질환 환자에서 취득한 T 세포의 HLA-A 유전자좌, HLA-B 유전자좌 및 HLA-DR 유전자좌에서 유전자형은 공지된 방법으로 확인할 수 있고, 예를 들면, 후술하는 실시예와 같이, HLA 타이핑을 실시함으로써 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 본 발명의 치료제에 사용되는 망막 색소 상피 세포의 각 유전자좌에서 유전자형도 동일한 방법으로 조사할 수 있지만, 미리 각 유전자좌에서 유전자형이 동형접합형으로 구체적인 대립유전자도 판명되어 있는 다양한 망막 색소 상피 세포를 저장하여 놓고, 이 중에서 안관 질환 환자에게 적절한 세포를 선택하여 사용하는 등의 사용법이 바람직하다.
본 발명의 치료제를 적용할 수 있는 눈 질환의 예로는 망막 변성 및 망막 변성과 연관된 질환을 들 수 있다. 망막 변성 또는 망막 변성과 연관된 질환으로는, 예를 들면, 연령관련-황반변성, 망막 색소 변성증, 당뇨병성 망막증 및 망막 박리 등의 망막 변성 질환을 들 수 있다.
본 발명의 치료제를 적용할 수 있는 눈 질환 환자는 본 발명의 치료제에 포함된 망막 색소 상피 세포의 HLA-A 유전자좌, HLA-B 유전자좌 및 HLA-DR 유전자 좌에서 동형접합형으로 유지되어 있는 대립유전자에 대하여, 대응하는 유전자좌에서 적어도 하나의 대립유전자가 일치하는 조합을 갖는 눈 질환 환자인 것이 바람직하다.
본 발명의 치료제를 적용할 수 있는 눈 질환 부위의 범위는 대상 질환, 투여 대상의 동물종, 연령, 성별, 체중, 증상 등에 따라 적절히 선택된다.
본 발명의 치료제의 사용 방법은, 예를 들면, 시트상으로 하여 이식할 수 있다. 망막 색소 상피 세포를 시트화하는 방법은 공지되어 있고, 예를 들면, 제WO 2012/115244호에 기재되어 있다. 망막 색소 상피 세포 시트는 한 번에 또는 수회로 나누어 이식할 수 있다. 이식의 적용 회수는 질환에 따라 의료 종사자, 지침에 따라 결정된다. 예를 들면, 질환이 연령-관련 황반변성인 경우에는 이식용 세포 시트를 그 중증도에 의해 2회 이상 이식할 수 있다. 복수회 이식을 수행할 경우, 간격은 특별히 한정되지 않지만, 수일 또는 수주간의 기간이 제공될 수 있다. 또는, 본 발명의 치료제는 세포를 분산시킨 상태에서 직접 대상 부위에 이식할 수도 있다. 이식의 적용 회수는 시트의 경우와 마찬가지로 지침 등에 따라 결정되며, 이식 기간 등도 시트의 경우와 마찬가지로 적절하게 결정된다.
본 발명은 또한 눈 질환 환자에 대한 눈 질환 치료제를 선택하는 방법을 제공한다.
구체적으로는, 본 발명의 눈 질환 치료제를 선택하는 방법(이하, "본 발명의 방법(1)"이라 한다)은 이하의 단계를 포함한다:
(i) 환자 유래 T 세포의 HLA-A 유전자좌 , HLA-B 유전자좌 및 HLA-DR 유전자좌에서 유전자형을 조사하는 단계,
(ii) 단계 (i)에서 판명된 각 유전자좌에서 대립유전자와 일치하는 대립유전자를 갖는 망막 색소 상피 세포를 선택하는 단계.
본 발명의 방법(1)의 단계 (i)에서 눈 질환 환자로부터 취득한 T 세포의 HLA-A 유전자좌, HLA-B 유전자좌 및 HLA-DR 유전자좌에서 유전자형은 공지의 방법으로 조사 수 있고, 예를 들면, 후술하는 실시예와 같이, HLA 타이핑을 실시함으로써 용이하게 결정할 수 있다. 본 발명의 방법(1)에서 T 세포의 유래로 되는 환자의 눈 질환은 본 발명의 치료제의 적용 대상으로 되는 눈 질환과 동일할 수 있다.
본 발명의 방법(1)의 단계 (i)에서 선택되는 상기 단계 (ii)에서 판명된 각 유전자좌의 대립유전자와 일치하는 대립유전자를 갖는 망막 색소 상피 세포는 눈 질환 환자에 적용할 때에 거부 반응이 발생하지 않는 눈 질환 치료제로서 유용하다. 또한, 본 발명의 방법(1)에서 망막 색소 상피 세포가 갖는 HLA-A 유전자좌, HLA-B 유전자좌 및 HLA-DR 유전자좌의 유전자형은 각각 동형접합형인 것이 바람직하다. 본 발명의 방법(1)에서 망막 색소 상피 세포의 제조는 본 발명의 치료제에 포함된 망막 색소 상피 세포의 제조와 동일할 수 있다.
본 발명은 또한 다른 눈 질환 환자에 대한 눈 질환 치료제를 선택하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 눈 질환 치료제를 선택하는 방법(이하, "본 발명의 방법(2)"라 한다)은 다음의 단계를 포함한다:
(1) 환자 유래 T 세포를 망막 색소 상피 세포와 접촉 배양하는 단계,
(2) 단계(1)의 배양 상청액 중에 분비되는 염증성 사이토킨 농도를 측정하는 단계 및
(3) 단계(2)의 염증성 사이토킨 농도가 환자 유래 T 세포를 단독으로 배양한 배양 상청액 중의 염증성 사이토킨 농도와 동일한 정도 또는 그 이하인 경우에, 상기 망막 색소 상피 세포를 상기 환자에 대한 눈 질환 치료제의 유효 성분으로 사용될 수 있는 것으로 판정하는 단계.
본 발명의 방법(2)의 단계(1)에서 환자 유래 T 세포와 망막 색소 상피 세포와의 접촉 배양은 후술하는 실시예에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다. 구체적으로는, 96-웰 플레이트에 환자 유래 T 세포를 파종하고, 망막 색소 상피 세포를 첨가하고 혼합물을 배양한다. 본 단계에서 환자 유래 T 세포는 미리 활성화될 수 있다. T 세포의 활성화 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 항-CD3 항체를 첨가하여 실시할 수 있다. 또한, T 세포는 CD4 양성 세포와 CD8 양성 세포에 미리 분리하여 제조할 수도 있다.
또한, 본 단계에서 사용되는 망막 색소 상피 세포에 대하여, 배양 중에 망막 색소 상피 세포가 증식하는 것을 피하기 위해, 미리 방사선 처리할 수 있다. 또한, 배양에 사용되는 망막 색소 상피 세포는 HLA-A 유전자좌, HLA-B 유전자좌 및 HLA-DR 유전자좌에서 유전자형은 각각 동형접합형인 것이 바람직하다.
배양 배지는 당해 기술분야에서 통상적으로 사용되는 세포 배양용 배지이면 특별히 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들면, F-10 배지, F12 배지, MEM, BME 배지, DMEM, αMEM, IMD 배지, ES 배지, DM-160 배지, 피셔(Fisher) 배지, WE 배지 및 RPMI1640 배지 등의 기초 배지를 사용할 수 있다. 또한, 기초 배지에 필요에 따라 혈청(소 태아 혈청 등), 각종 성장 인자(EGF, FGF, HGF, PDGF 등), 항생제, 아미노산 등을 첨가할 수 있다. 배지의 pH는 바람직하게는 약 6 내지 8이다. 배양은, 예를 들면, 통상 약 30 내지 40℃에서 약 15 내지 60시간, 바람직하게는 48시간으로 할 수 있다. 또한, 배양시 환자 유래 T 세포와 망막 색소 상피 세포의 세포수의 비율은 일반적으로 500:1 내지 10:1, 바람직하게는 400:1 내지 25:1, 보다 바람직하게는 200:1 내지 50:1이다. 환자 유래 T 세포와 망막 색소 상피 세포의 세포수의 비율을 이 범위로 설정함으로써 T 세포가 적절한 양의 염증성 사이토킨 또는 세포독성 물질을 분비하기 위한, 대상으로 되는 망막 색소 상피 세포가 상기 환자에게 적용할 수 있는지를 보다 명확하게 판정할 수 있게 된다.
본 발명의 방법(2)에서 T 세포의 유래로 되는 환자의 눈 질환은 본 발명의 치료제의 적용 대상으로 되는 눈 질환과 동일할 수 있고, 망막 색소 상피 세포의 제조는 본 발명의 치료제에 포함된 망막 색소 상피 세포의 제조와 동일할 수 있다.
본 발명의 방법(2)의 단계 (2)에서 배양 상청액 중에 분비되는 염증성 사이토킨 농도의 측정은 후술하는 실시예에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다. 구체적으로는, ELISA, 웨스턴 블롯, FACS 등으로 측정할 수 있다. 또한, 본 단계에서 측정하는 염증성 사이토킨은 거부 반응에 관여하는 사이토킨이면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 단계 (1)에서 환자 유래 T 세포로서 CD4 양성 세포를 사용한 경우는 IFN-γ, IL-17 및 TNF-α를 들 수 있으며, 그 중에서도 IFN-γ가 보다 바람직하다. 또한, 단계 (1)에서 환자 유래 T 세포로서 CD8 양성 세포를 사용한 경우는 그랜자임(Granzyme) B, 페르포린(Perforin), TNF-α를 들 수 있으며, 그 중에서도 그랜자임 B가 보다 바람직하다.
후술하는 실시예와 같이, 피시험자로부터 채취한 T 세포와 iPS 세포를 분화 유도하여 수득한 망막 색소 상피 세포를 공배양한 결과, HLA-A 유전자좌, HLA-B 유전자좌 및 HLA-DR 유전자좌에서 유전자형이 각각 동형접합형인 망막 색소 상피 세포에 대하여, 대응하는 유전자좌의 적어도 하나의 대립유전자가 상기 망막 색소 상피 세포의 상기 유전자좌에서 대립유전자와 일치하는 조합을 갖는 T 세포는 사이토킨 생산이 대조군과 동일한 정도이거나 억제되는 것을 발견했다. 따라서, 본 발명의 방법(2)의 단계 (3)에서, 단계 (2)에서 측정된 염증성 사이토킨 농도가 환자 유래 T 세포를 단독으로 배양한 배양 상청액 중의 염증성 사이토킨 농도와 동일한 정도 또는 그 이하인 경우에, 상기 망막 색소 상피 세포를 상기 환자에 대한 눈 질환 치료제의 유효 성분으로 사용될 수 있는 것으로 판정할 수 있다.
본 발명은 또한 이식용 망막 색소 상피 세포를 이식하는 눈 질환 환자에서 거부 반응을 예측하기 위한 시험 방법을 제공한다. 구체적으로는, 본 발명의 거부 반응을 예측하는 방법(이하, "본 발명의 방법(3)"이라 한다)은 이하의 단계를 포함한다:
(A) 환자 유래 T 세포를 상기 망막 색소 상피 세포와 접촉 배양하는 단계,
(B) 단계 (A)의 배양 상청액 중에 분비되는 염증성 사이토킨 농도를 측정하는 단계 및
(C) 단계 (B)에서 염증성 사이토킨 농도가 환자 유래 T 세포를 단독으로 배양한 배양 상청액 중의 염증성 사이토킨 농도보다 유의적으로 높은 경우에, 상기 망막 색소 상피 세포에 대한 거부 반응을 발생하는 것으로 판정하는 단계.
본 발명의 방법(3)의 단계 (A)와 (B)는 본 발명의 방법(2)의 단계 (1) 및 (2)와 동일하게 실시할 수 있다. 또한, 후술하는 실시예와 같이, 피시험자로부터 채취한 T 세포와 iPS 세포를 분화 유도하여 수득한 망막 색소 상피 세포를 공배양한 결과, HLA-A 유전자좌, HLA-B 유전자좌 및 HLA-DR 유전자좌에서 유전자형이 각각 동형접합형인 망막 색소 상피 세포에 대하여, 대응하는 유전자좌에서 적어도 하나의 대립유전자가 상기 망막 색소 상피 세포의 상기 유전자좌에서 대립유전자와 불일치하는 조합을 갖는 T 세포는 사이토킨 생산을 대조군보다도 상승하는 것을 나타냈다. 따라서, 본 발명의 방법(3)의 단계 (C)에서, 단계 (B)에서 측정된 염증성 사이토킨 농도가 환자 유래 T 세포를 단독으로 배양한 배양 상청액 중의 염증성 사이토킨 농도보다 유의적으로 높은 경우에, 상기 망막 색소 상피 세포에 대한 거부 반응을 발생시키는 것으로 판정할 수 있다.
실시예
이하에 실시예를 나타내어, 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 이들은 단순한 예시이며, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 한정하는 것은 아니다.
(제조예 1) 인간 iPS 세포 유래 RPE 세포의 제조
iPS 세포로서 문헌[참조: Nature Methods 8, 409-412 2011]에 개시된 iPS 세포주 454E2 또는 453F2(교토 대학으로부터 제공)를 이용하여, 문헌[참조: J Cell Sci (2009) 122: 3169-3179]에 기재의 분화 유도 방법에 준하여, 454E2-iPS 세포 유래 RPE 세포 및 453F2-iPS 세포 유래 RPE 세포(양 세포는 HLA-A, -B, -DR3 유전자좌에서 유전자형이 동형접합형이다)를 제조하였다.
또한, iPS 세포주로서 454E2 또는 453F2 대신 피시험자명 TLHD-1의 인간 피부 유래 섬유아세포보다 문헌[참조: Nature (2011) 474: 225-229]에 기재된 방법에 준하여 수립된 iPS 세포를 이용하여, 동일한 방법으로 TLHD-1-iPS 세포 유래 RPE 세포를 제조하였다.
(제조예 2) 인간 T 세포 현탁액의 제조
인간 말초 혈액(피시험자명; TLHD-1 내지 TLHD-22)으로부터 MACS 자기 세포 분리 장치를 이용하여 CD4 양성 T 세포 및 CD8 양성 T 세포를 분리하고, 100U/ml rhIL-2 함유 RPMI 배양액(RPMI 1640 445ml, FBS 50ml, 페니실린 - 스트렙토마이신 5ml)에 현탁하여 각 세포 현탁액을 제조하였다.
(참고 1) HLA 타이핑
실시예 1 내지 8에 이용된 세포의 HLA 타이핑을 관용의 방법으로 실시한 결과를 이하의 표에 나타낸다. 제조예 2에서 수득된 피시험자에서 각 T 세포의 HLA 타이핑 결과를 표 1-1, 1-2에, 그리고 제조예 1과 다른 iPS 세포로부터 유도된 인간 iPS 유래 RPE 세포의 HLA 타이핑 결과를 표 2에 나타냈다.
454E2-iPS 세포 유래 RPE 세포(HLA-A, HLA-B, HLA-DR의 3개 유전자좌에서 동형접합)에 대하여, 피시험자명 TLHD-10 및 TLHD-21은 HLA-A, HLA-B, HLA-DR의 3개 유전자좌에서 유전자형의 전부 대립유전자가 일치하고, 피시험자명 TLHD-6, 18은 HLA-B, HLA-DR의 2개 유전자좌에서 유전자형에 대립유전자가 일치, 피시험자명 TLHD-2, 5, 7, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 20, 22는 HLA-A의 1개 유전자좌의 유전자형 만에서 대립유전자가 일치, 피시험자명 TLHD-19은 HLA-DR의 1개 유전자좌의 유전자형 만에서 대립유전자가 일치했다.
또한, 453F2-iPS 세포 유래 RPE 세포(HLA-A, HLA-B, HLA-DR의 3개 유전자좌에서 동형접합)에 대하여, 피시험자명 TLHD-1, 4, 18은 2개 유전자좌에서 유전자형에 대립유전자가 일치하고, 피시험자명 TLHD-6는 HLA-A의 1개 유전자좌의 유전자형 만에서 대립유전자가 일치했다.
[표 1-1]
Figure 112016091155596-pct00001
Figure 112016091155596-pct00002
* 454E2에 대한 T 세포 반응: 망막 색소 상피 세포 없이 각 T 세포(CD4 양성 또는 CD8 양성)을 배양한 경우의 사이토킨 농도를 대조군으로서 채용하고, 상기 농도보다 높은 경우를 (+), 동일한 농도이거나 그보다 낮은 경우를 (-)로 했다. Nt는 측정하지 않은 것을 나타낸다.
[표 2]
Figure 112016091155596-pct00003
(제조예 3) 원숭이 iPS 세포 유래 RPE 세포의 제조
마카카 원숭이의 피부 유래 섬유아세포보다 문헌[참조: Nature (2011) 474: 225-229 (GLIS1 사용)]에 기재된 방법에 준하여 iPS 세포를 수립하고, 문헌[참조: J Cell Sci (2009) 122: 3169-3179]에 기재된 분화 유도 방법에 준하여, 건강한 원숭이(A, B) 및, 한쪽 눈에 망막 광 응고 요법을 실시하여 망막 광 응고 반점을 형성시킴으로써 생성된 질환 모델 원숭이(C)에 대해 각각 원숭이 iPS 세포 유래 RPE 세포를 제조하였다.
(제조예 4) 원숭이 T 세포 현탁액의 제조
질환 모델 원숭이(C) 말초 혈액으로부터, MACS 자기 분리 장치를 이용하여 CD4 양성 T 세포 및 CD8 양성 T 세포를 분리하고, 100U/ml rhIL-2 함유 RPMI 배양액(RPMI 1640 445ml, FBS 50ml 페니실린 - 스트렙토마이신 5ml)에 현탁하여 각 T 세포 현탁액을 제조하였다.
(참고 2) MHC 타이핑
실시예 9, 10에 이용하는 세포의 MHC 타이핑을 관용의 방법으로 실시했다. 건강한 원숭이 A는 iPS 세포 유래 RPE 세포(Mafa-A, -B, -DRA, -DRB, -DQA, -DQB, -DPA, -DPB좌 중의 3개 유전자좌에서 동형접합)에 대하여, 질환 모델 원숭이(C)는 3개 유전자좌에서 동형접합에서 대립유전자가 일치한다. 건강한 원숭이 B의 iPS 세포 유래 RPE 세포는 질환 모델 원숭이(C)와는 MHC 모든 유전자형이 일치했다.
( 실시예 1)
96-웰 플레이트에 제조예 2에서 수득한 CD4 양성 T 세포 현탁액(TLHD-1 및 TLHD-2)에 항-CD3 항체를 1㎍/ml 첨가하고, 현탁액을 5 × 105 세포/웰의 농도로 웰에 분주했다. 각 웰에 제조예 1에서 수득한 454E2-iPS 유래 RPE 세포를 3가지 농도, 1 × 103/웰, 5 × 103/웰, 1 × 104/웰로 가하고, 무첨가의 현탁액을 대조군으로 하여 배양하였다. 48시간 배양 후, 배양 상청액을 회수하고, 배양 상청액 중의 IFN-γ의 농도를 ELISA를 이용하여 측정하였다. 결과를 도 1에 나타낸다.
이 결과, TLHD-1 및 TLHD-2 모두 3종류 농도 모두에서 대조군과 비교하여 IFN-γ의 생산이 상승했다. 따라서, 454E2-iPS 유래 RPE 세포를, 피시험자 TLHD-1 및 TLHD-2에 이식한 경우에는 거부 반응이 발생할 가능성이 높은 것으로 판정할 수 있다.
TLHD-1 및 TLHD-2의 HLA 항원은 454E2-iPS 유래 RPE 세포의 HLA-DR 항원(Class-II)와 일배체형 (haploid))이 불일치였다. 또한, HLA-A 항원 및 HLA-B 항원(Class-I)에 대해서는 TLHD-2의 HLA-A의 대립유전자가 일치하지만, 그 이외의 일배체형은 전부 불일치하며, TLHD-1에서는 모든 불일치했다(표 3).
[표 3]
Figure 112016091155596-pct00004
( 실시예 2)
T 세포 현탁액으로, 제조예 2에서 수득한 CD4 양성 T 세포 현탁액(피시험자명: TLHD-2, TLHD-3, TLHD-4, TLHD-6, TLHD-7, TLHD-8, TLHD-9)를 이용하여, 제조예 1에서 수득한 454E2-iPS 유래 RPE 세포를 1 × 104/웰의 농도로 사용한 점을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여, IFN-γ의 생산량을 측정했다. 또한, T 세포 현탁액 및 iPS 세포 유래 RPE 세포를, 함께 TLHD-1 유래의 세포를 이용하여, 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여, IFN-γ의 생산량을 측정했다. 결과를 도 2에 나타낸다.
이 결과, TLHD-1의 T 세포 현탁액과 TLHD-1의 iPS 세포 유래 RPE 세포의 조합, 및 TLHD-6의 T 세포 현탁액과 454E2-iPS 유래 RPE 세포의 조합에서 대조군과 비교하여 IFN- γ의 생산이 억제되었다.
따라서, 자가 이식 또는 454E2-iPS 유래 RPE 세포를 피시험자 TLHD-6에 이식 한 경우에는 거부 반응이 발생할 가능성이 낮은 것으로 판정할 수 있다. 즉, 이 454E2-iPS 유래 RPE 세포는 피시험자 TLHD-6 또는 피시험자 TLHD-6와 동일한 HLA 일배체형을 갖고, 대립유전자도 일치하는 환자의 눈 질환 치료제로서 사용할 수 있다.
한편, 상기 이외의 조합에서는, 대조군과 비교하여 IFN-γ의 생산량이 상승했다. 따라서, TLHD-6와 동일한 HLA 일배체형을 갖고, 대립유전자도 일치하는 눈 질환 환자 이외의 환자에 454E2-iPS 세포 유래 RPE 세포를 이식한 경우에는 거부 반응이 발생할 가능성이 높은 것으로 판정할 수 있다. 이 경우, 454E2-iPS 세포 유래 RPE 세포를 이식에 이용하지 않거나 면역억제제를 병용한 이식을 검토할 필요가 있다.
사이토킨의 생산이 억제되어 있던 TLHD-6는 454E2-iPS 세포 유래 RPE 세포의 HLA-DR 및 HLA-B에서 대립유전자가 일치하였다. 한편, 사이토킨 생산이 높은 TLHD-7은 HLA-A에서 대립유전자가 일치하고 있었지만, HLA-DR에서 대립유전자는 불일치하였다. 또한, TLHD-8은 454E2-iPS 세포 유래 RPE 세포 및 대립유전자는 불일치하였다. 사이토킨 생산이 높은 다른 세포는 454E2-iPS 세포 유래 RPE 세포 및 일배체형이 불일치하였다(표 4).
[표 4]
Figure 112016091155596-pct00005
( 실시예 3)
세포 현탁액으로서, 제조예 2에서 수득한 CD4 양성 T 세포 현탁액(TLHD-1)을 이용하여, 제조예 1에서 수득한 454E2-iPS 유래 RPE 세포 대신에, 표 2에 나타내는 No.1 내지 3, 6 내지 10 및 마우스 섬유아세포를 1 × 104/웰의 농도로 사용한 점을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여, IFN-γ의 생산량을 측정했다. 결과를 도 3에 나타낸다.
따라서, 인간 섬유아세포를 제외한 모든 세포에 대한 IFN-γ의 생산량이 상승했다. 따라서, 454E2-iPS 세포 유래 RPE 세포를 상기 인간 섬유아세포와 동일한 HLA 일배체형을 갖고, 대립유전자도 일치하는 눈 질환 환자 이외의 환자에게 이식한 경우에는 거부 반응이 발생할 가능성이 높은 것으로 판정할 수 있다. 이 경우, 454E2-iPS 세포 유래 RPE 세포를 이식에 이용하지 않거나 면역억제제를 병용한 이식을 검토할 수 있다.
ES 유래 RPE 세포 및 인간 섬유아세포의 HLA-DR 항원에 대하여, TLHD-1은 대립유전자가 일치하고 나머지는 일배체형이 불일치하였다(표 5).
[표 5]
Figure 112016091155596-pct00006
( 실시예 4)
T 세포 현탁액으로서, 제조예 2에서 수득한 CD4 양성 T 세포 현탁액(피시험자명: TLHD-1, TLHD-8, TLHD-14, TLHD-21)를 이용하여, 제조예 1에서 수득한 454E2-iPS 유래 RPE 세포 대신에, 표 2에 나타내는 453F2-iPS 유래 RPE 세포를 이용한 것 이외에는 동일한 실험을 실시했다. 결과를 도 4에 나타낸다.
또는, 실시예 1에서 T 세포 현탁액으로서, 제조예 2에서 수득한 CD8 양성 T 세포 현탁액(피시험자명: TLHD-1, TLHD-8, TLHD-14, TLHD-22)를 이용하여, 제조예 1 에서 수득한 454E2-iPS 유래 RPE 세포 대신에, 표 2에 나타내는 453F2-iPS 유래 RPE 세포를 이용한 것 이외에는 동일한 실험을 실시했다. 결과를 도 5에 나타낸다.
이 결과, TLHD-1의 CD8 양성 T 세포 현탁액과 453F2-iPS 유래 RPE 세포의 조합에서, 대조군과 비교하여 그랜자임 B의 생산이 억제되었다. 따라서, 453F2-iPS 유래 RPE 세포를 피시험자 TLHD-1에 이식한 경우에는 거부 반응이 발생할 가능성이 낮은 것으로 판정할 수 있다. 즉, 이 453F2-iPS 유래 RPE 세포는 피시험자 TLHD-1 또는 피시험자 TLHD-1과 동일한 HLA 일배체형을 갖고, 대립유전자도 일치하는 환자의 눈 질환 치료제로서 이용될 가능성이 있다.
( 실시예 5)
96-웰 플레이트에, 제조예 2에서 수득한 CD4 양성 T 세포 현탁액(TLHD-1)에 항-CD3 항체를 1㎍/ml 첨가하여 5 × 105 세포/웰의 농도로 웰에 분주했다. 각 웰에 제조예 1에서 수득한 HLA의 3개 유전자좌에서 동형접합 454E2-iPS 유래 RPE 세포를 1 × 104/웰의 농도로 첨가하고, 무첨가의 경우를 대조군으로 하여 배양하였다. 48시간 배양 후, 세포를 회수하고, CD4 양성 T 세포에서 IL-2, IFN-γ, IL-17, TNF-α, IL-22의 생산을 FACS를 이용하여 각각 측정했다. 결과를 도 6에 나타낸다.
그 결과, IFN-γ, IL-17 및 TNF-α가 항-CD4 양성 T 세포의 사이토킨 생산의 지표로서 사용할 수 있는 것으로 나타났다.
또한, 추가로 제조예 2에서 수득한 CD4 양성 T 세포 현탁액(TLHD-1 및 TLHD-10)를 사용하여 동일한 시험을 실시하여, 다양한 사이토킨 생산량의 비교를 수행했다(도 7a 및 b).
그 결과, 다수의 사이토킨 중에서 IFN-γ 만이 454E2-iPS 세포 유래 RPE 세포(HLA-A, HLA-B, HLA-DR의 3개 유전자형에서 동형접합)에 대하여, 피시험자명 TLHD-10의 T 세포(HLA-A, HLA-B, HLA-DR의 3개 유전자좌에서 유전자형의 모든 대립유전자가 일치)를 이용한 경우에 발현량이 감소했다. 따라서, 거부 반응이 발생하는지 여부의 지표로서는 IFN-γ가 적절한 것으로 나타났다.
( 실시예 6)
제조예 2에서 수득한 CD8 양성 T 세포 현탁액(TLHD-1)에 항-CD8 항체를 1㎍/ml 첨가하여 1 × 105 세포/웰의 농도로 웰에 분주했다. 각 웰에 제조예 1에서 수득한 454E2-iPS 유래 RPE 세포를 1 × 104/웰로 가하고, 무첨가의 경우를 대조군으로 하여 배양하였다. 48 시간 배양 후, 세포를 회수하고, CD8 양성 T 세포의 그랜자임 B, 페르포린, TNF-α의 생산을 ELISA를 이용하여 각각 측정했다. 더블 포지티브 세포의 비율을 도 8에 나타낸다.
이 결과, CD8 양성 T 세포가 생산하는 세포독성 물질은 거부 반응의 스크리닝에 사용되는 것이 시사되었다.
( 실시예 7)
CD4 양성 T 세포 대신에 CD8 양성 T 세포 현탁액(피시험자명: TLHD-1, TLHD-3)를 이용하여, IFN-γ 대신에 그랜자임 B의 생산을 측정한 점을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법을 실시했다. 결과를 도 9에 나타낸다.
이 결과, TLHD-1 및 TLHD-3 모두 2가지 농도 모두에서 대조군과 비교하여 그랜자임 B의 생산이 상승했다. 따라서, 454E2-iPS 유래 RPE 세포를 피시험자 TLHD-1 및 TLHD-3에 이식한 경우에는 거부 반응이 발생할 가능성이 높은 것으로 판정할 수 있다.
TLHD-1 및 TLHD-3의 HLA 항원은 454E2-iPS 유래 RPE 세포의 HLA-A 항원, HLA-B 항원과 함께 일배체형 불일치였다(표 6).
[표 6]
Figure 112016091155596-pct00007
( 실시예 8)
CD4 양성 T 세포 대신에 CD8 양성 T 세포 현탁액(피시험자명; TLHD-2, 4, 5, 8, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20 )를 이용하여, IFN-γ 대신에 그랜자임 B의 생산을 측정한 점 이외에는 실시예 1과 동일한 방법을 실시했다. 결과를 도 10에 나타낸다.
이 결과, TLHD-10, TLHD-18, TLHD-2, TLHD-14, TLHD-12, TLHD-13, TLHD-17의 T 세포 현탁액과 454E2-iPS 유래 RPE 세포의 조합에서, 대조군과 비교하여 그랜자임 B의 생산이 억제되었다. 따라서, 454E2-iPS 유래 RPE 세포를 피시험자 TLHD-10, TLHD-18에 이식한 경우에는 거부 반응이 발생할 가능성이 낮은 것으로 판정할 수 있다. 또한, TLHD-2, TLHD-14, TLHD-12, TLHD-13, TLHD-17은 HLA-A 대립유전자 만이 일치하지 않지만, 거부 반응이 발생할 가능성에 대해 검토할 여지가 있다.
한편, 상기 이외의 조합에서는 대조군과 비교하여 그랜자임 B의 생산량이 상승했다. 따라서, 해당하는 피시험자에 454E2-iPS 세포 유래 RPE 세포를 이식한 경우에는 거부 반응이 발생할 가능성이 높은 것으로 판정할 수 있다. 이 경우, 454E2-iPS 세포 유래 RPE 세포를 이식에 이용하지 않거나 면역억제제를 병용한 이식을 검토할 수 있다.
그랜자임 B의 생산이 억제되어 있던 TLHD-10 및 TLHD-18에서는 HLA-A 또는 HLA-B와, HLA-DR에서, 일배체형과 대립유전자가 함께 일치하였다. 한편, TLHD-2, TLHD-14, TLHD-12, TLHD-13은 454E2-iPS 세포 유래 RPE 세포의 HLA-A 또는 HLA-B에서 일배체형과 대립유전자가 일치하였다. 한편, 그랜자임 B 생산이 상승한 TLHD-5, TLHD-20에서도, 454E2-iPS 세포 유래 RPE 세포와 HLA-A 또는 HLA-B의 일배 체형과 대립유전자가 일치하고, TLHD-8은 HLA-DR 일배체형만 일치했다(표 7).
이와 같이 대립유전자 및 일배체형이 부분적으로 일치해도, 그랜자임 B 생산이 상승하는 경우가 있다. 그러나, 적어도 HLA-A, HLA-B 또는 HLA-DR 대립유전자 중 적어도 하나의 대립유전자가 일치하면, 거부 반응을 일으킬 가능성이 낮은 것으로 판단할 수 있다. 또한, HLA-A, HLA-B 또는 HLA-DR 대립유전자 중의 적어도 임의의 2개의 대립유전자가 일치하면, 보다 거부 반응을 일으킬 가능성이 낮고, HLA-A, HLA-B 및 HLA-DR의 모든 대립유전자가 일치하면, 이식에 적합한 것으로 판단할 수 있다. 한편, 그렇지 않으면, 이식에 이용하지 않거나 면역억제제를 병용한 이식을 검토하는 지표로 할 수 있다. 그랜자임 B 생산이 높은 다른 세포는 454E2-iPS 세포 유래 RPE 세포 및 일배체형 자체가 불일치했다.
[표 7]
Figure 112016091155596-pct00008
(실시예 9)
(예측 시험)
96-웰 플레이트에 제조예 4에서 수득한 CD4 양성 T 세포 현탁액(원숭이 질환 모델 C)에 항-CD3 항체를 1㎍/ml 첨가하여 5 × 105 세포/웰의 농도로 웰에 분주한다. 각 웰에 제조예 3에서 수득한 건강한 원숭이 B-iPS 유래 RPE 세포 또는 질환 모델 원숭이 C-iPS 유래 RPE 세포를 1 × 104/웰로 가하고, 무첨가의 경우를 대조군으로 하여 배양한다. 48 간 배양 후, 배양 상청액을 회수하고, 배양 상청액 중의 IFN-γ의 농도를 ELISA를 이용하여 측정한다.
전술의 방법에 있어서, CD4 양성 T 세포 대신에 CD8 양성 T 세포 현탁액(원숭이 질환 모델 C)를 이용하여, IFN-γ 대신에 그랜자임 B의 생산을 측정한 점 이외는 전술과 동일한 방법을 수행한다.
건강한 원숭이 B-iPS 유래 RPE 세포의 경우는 대조군과 비교하여 IFN-γ 및 그랜자임 B의 생산량이 함께 상승하는 반면, 질환 모델 원숭이 C-iPS 유래 RPE 세포는 대조군과 비교하여 IFN-γ 및 그랜자임 B의 생산량이 모두 억제된다.
(이식 시험)
건강한 원숭이 B-iPS 유래 RPE 세포 또는 질환 모델 원숭이 C-iPS 유래 RPE 세포를 문헌[참조: Invest Ophthalmol Vis Sci.1995 Feb; 36 (2): 381-90.]에 기재된 방법에 준하여 질환 모델 원숭이 C의 한쪽 눈에 이식한다. 이식 후 28일째에, 안저 사진 및 OCT(Optical coherence tomograph) 광 간섭 단층계를 이용하여 안저의 단면을 조직 절편같이 이미지화하고, 망막의 상태를 확인한다.
건강한 원숭이 B-iPS 유래 RPE 세포를 이용한 동종이계 이식을 실시한 경우에는 이식편 주위의 섬유성 변화와 형광 안저 조영술에 의한 형광 누출, OCT에서는 망막하의 고휘도 병변 등의 명백한 거부 반응이 보인다. 질환 모델 원숭이 C-iPS 유래 RPE 세포를 이용한 자가 이식을 실시한 경우에는 이러한 명백한 거부 반응은 인정되지 않고, 형광 안저 조영술에 의한 형광 누출은 없으며, 이식편은 생착하여 있고, 감각 망막의 박막화 등의 장애는 일어나지 않는다.
( 실시예 10)
(예측 시험)
실시예 8에서 iPS 유래 RPE 세포로서, 제조예 3에서 수득한 건강한 원숭이 A-iPS 유래 RPE 세포(MHC의 3개 유전자와에서 동형접합) 또는 질환 모델 원숭이 C-iPS 유래 RPE 세포를 1 × 104/웰의 농도로 사용한 점을 제외하고는 실시예 8과 유사한 방법을 수행하여, IFN-γ의 생산량을 측정한다.
전술의 방법에 있어서, CD4 양성 T 세포 대신에 CD8 양성 T 세포 현탁액(원숭이 질환 모델 C)를 이용하여, IFN-γ 대신에 그랜자임 B의 생산을 측정한 점 이외는 전술과 동일한 방법을 수행한다.
건강한 원숭이 A-iPS 유래 RPE 세포 및 질환 모델 원숭이 C-iPS 유래 RPE 세포 모두는, 대조군과 비교하여 IFN-γ 및 그랜자임 B의 생산량이 모두 억제된다.
(이식 시험)
실시예 8의 이식 시험에서, iPS 유래 RPE 세포로서, 건강한 원숭이 A-iPS 유래 RPE 세포(3개 유전자좌에서 동형접합) 또는 질환 모델 원숭이 C-iPS 유래 RPE 세포를 이용한 점 이외에는, 실시예 8에 기재된 방법에 따라 질환 모델 원숭이 C의 한쪽 눈에 iPS 유래 RPE 세포를 이식한다. 이식 후 28일째에, 안저 사진 및 OCT(Optical coherence tomograph) 광 간섭 단층계를 이용하여 안저의 단면을 조직 절편같이 이미지화하고, 망막의 상태를 확인한다.
건강한 원숭이 A-iPS 유래 RPE 세포(3개 유전자좌에서 동형접합)을 이용한 동종이계 이식을 실시한 경우, 질환 모델 원숭이 C-iPS 유래 RPE 세포를 이용한 자가 이식을 실시한 경우와 유사하게 명백한 거부 반응은 확인되지 않고, 형광 안저 조영술에 의한 형광 누출은 없으며, 이식편은 생착하고 있고, 감각 망막의 박막화 등의 장애는 일어나지 않는다.
산업상 이용가능성
본 발명에 의하면, RPE 세포 이식에서 기증자 측의 HLA-A, HLA-B 및 HLA-DR의 3개 유전자좌에서 유전자형이 동형접합형인 경우, 수용자의 HLA좌의 한쪽 매칭만으로 거부 반응을 억제하는 것이 가능하게 된다. 따라서, 사전에 채혈하여 면역학적으로 적합하지 않은 세포를 판별·선택할 수 있기 때문에, 부적합 세포의 이식을 회피함으로써 환자의 부담을 경감할 수 있다. 이 방법에 의해 선택된 세포는 RPE 세포 이식에 사용하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명을 면역억제제의 여부 판정에 이용함으로써 치료 방침의 선택에 기여한다. 따라서, 본 발명은 동종이계 이식에 의한 치료 효율을 현저히 향상하는데 기여하고, 게다가 이식에 적합하지 않은 세포의 제조 비용 절감 등의 효과도 나타낸다.
본 출원은 일본에서 출원된 특허출원 제2014-032325호(출원일: 2014년 2월 21일)을 기초로 하고 있으며, 그 내용은 모두 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.

Claims (29)

  1. 각각의 유전자좌가 동형접합 유전자형을 갖는, HLA-A 유전자좌, HLA-B 유전자좌 및 HLA-DR 유전자좌를 갖는 망막 색소 상피 세포를 포함하는 눈 질환 치료제로서, 눈 질환을 갖는 환자에 이식가능하고, 상기 환자가, 상기 망막 색소 상피 세포의 유전자좌에 상응하는 각각의 유전자좌에 있는 대립유전자의 적어도 하나의 유전자형이 상기 망막 색소 상피 세포의 각각의 유전자좌에 있는 대립유전자의 유전자형과 동일하고, HLA-C 유전자좌, HLA-DQ 유전자좌, 및 HLA-DP 유전자좌 중 하나 이상에서, (1) 망막 색소 상피 색소의 유전자좌가 이형접합의 경우, 상기 망막 색소 상피 색소의 유전자좌에 있는 대립유전자의 유전자형과 일치하지 않는 적어도 하나의 대립유전자의 유전자형, 및 (2) 망막 색소 상피 색소의 유전자좌가 동형접합인 경우, 상기 망막 색소 상피 색소의 유전자좌에 있는 대립유전자의 유전자형과 일치하지 않는 두 대립유전자의 유전자형을 갖는 환자이고, 상기 눈 질환이 망막 변성, 연령-관련 황반 변성, 망막 색소변성증, 당뇨병성 망막증 및 망막 박리로부터 선택되는 하나 이상인, 눈 질환 치료제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 망막 색소 상피 세포의 이식 후 면역거부 반응을 억제하는, 눈 질환 치료제.
  3. 제1항에 있어서, 눈 질환을 갖는 환자가 상기 망막 색소 상피 세포의 유전자좌에 상응하는 각각의 유전자좌에 있는 대립유전자 중 단 하나의 유전자형이 상기 망막 색소 상피 세포의 각각의 유전자좌에 있는 대립유전자의 유전자형과 동일한 환자인 것인, 눈 질환 치료제.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 망막 색소 상피 세포가 다능성 줄기세포로부터 유래하는 것인, 눈 질환 치료제.
  6. 제5항에 있어서, 다능성 줄기세포가 iPS 세포인 것인, 눈 질환 치료제.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 시트 형태로 망막 상피 색소 세포를 포함하는, 눈 질환 치료제.
  10. 눈 질환을 갖고, 제1항 내지 제3항, 제5항, 제6항, 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 눈 질환 치료제에 포함된 망막 색소 상피 세포가 이식될 환자를 선택하기 위한 정보를 제공하는 방법으로서, 상기 망막 색소 상피 세포는 각각의 유전자좌가 동형접합 유전자형을 갖는, HLA-A 유전자좌, HLA-B 유전자좌 및 HLA-DR 유전자좌를 가지며, 상기 방법이
    환자로부터 단리된 샘플에서 상기 망막 색소 상피 세포의 유전자좌에 상응하는 유전자좌에 있는 대립유전자의 유전자형을 조사하는 단계, 및
    망막 색소 상피 세포가 이식될 환자로서, 상기 망막 색소 상피 세포의 유전자좌에 상응하는 각각의 유전자좌에 있는 대립유전자의 적어도 하나의 유전자형이 상기 망막 색소 상피 세포의 각각의 유전자좌에 있는 대립유전자의 유전자형과 동일하고, HLA-C 유전자좌, HLA-DQ 유전자좌, 및 HLA-DP 유전자좌 중 하나 이상에서, (1) 망막 색소 상피 색소의 유전자좌가 이형접합인 경우, 상기 망막 색소 상피 색소의 유전자좌에 있는 대립유전자의 유전자형과 일치하지 않는 적어도 하나의 대립유전자의 유전자형, 및 (2) 망막 색소 상피 색소의 유전자좌가 동형접합인 경우, 상기 망막 색소 상피 색소의 유전자좌에 있는 대립유전자의 유전자형과 일치하지 않는 두 대립유전자의 유전자형을 갖는 환자를 선택하는 단계를 포함하고,
    상기 눈 질환이 망막 변성, 연령-관련 황반 변성, 망막 색소변성증, 당뇨병성 망막증 및 망막 박리로부터 선택되는 하나 이상인, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 선택된 환자에 대해 면역억제제가 동시에 사용되지 않거나 사용되는 면역억제제의 양이 감소되는 것인, 방법.
  12. 삭제
  13. 제10항에 있어서, 상기 망막 색소 상피 세포의 유전자좌에 상응하는 각각의 유전자좌에 있는 대립유전자의 하나의 유전자형이 상기 망막 색소 상피 세포의 각각의 유전자좌에 있는 대립유전자의 유전자형과 동일한 환자를 망막 색소 상피 세포가 이식될 환자로 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 하기를 포함하는 키트:
    제1항 내지 제3항, 제5항, 제6항, 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 눈 질환 치료제에 포함된 망막 색소 상피 세포로서, HLA-A 유전자좌, HLA-B 유전자좌 및 HLA-DR 유전자좌를 갖고, 상기 각각의 유전자좌가 동형접합 유전자형을 갖는, 망막 색소 상피 세포,
    눈 질환을 갖는 환자에서 상기 망막 색소 상피 세포의 유전자좌에 상응하는 유전자좌에 있는 대립유전자의 유전자형을 조사하기 위한 HLA 타이핑 시약으로서, 상기 눈 질환이 망막 변성, 연령-관련 황반 변성, 망막 색소변성증, 당뇨병성 망막증 및 망막 박리로부터 선택되는 하나 이상인, HLA 타이핑 시약, 및
    상기 망막 색소 상피 세포의 유전자좌에 상응하는 각각의 유전자좌에 있는 대립유전자의 적어도 하나의 유전자형이 상기 망막 색소 상피 세포의 각각의 유전자좌에 있는 대립유전자의 유전자형과 동일하고, HLA-C 유전자좌, HLA-DQ 유전자좌, 및 HLA-DP 유전자좌 중 하나 이상에서, (1) 망막 색소 상피 색소의 유전자좌가 이형접합인 경우, 상기 망막 색소 상피 색소의 유전자좌에 있는 대립유전자의 유전자형과 일치하지 않는 적어도 하나의 대립유전자의 유전자형, 및 (2) 망막 색소 상피 색소의 유전자좌가 동형접합인 경우, 상기 망막 색소 상피 색소의 유전자좌에 있는 대립유전자의 유전자형과 일치하지 않는 두 대립유전자의 유전자형을 갖는 환자에 대해, (1) 면역억제제가 사용되지 않거나 (2) 사용되는 면역억제제의 양이 감소됨을 설명하는 지침, 지시, 부가 서류, 또는 제품 라벨.
  20. 제19항에 있어서, 지침, 지시, 부가 서류, 또는 제품 라벨이 상기 망막 색소 상피 세포의 유전자좌에 상응하는 각각의 유전자좌에 있는 대립유전자의 하나의 유전자형이 상기 망막 색소 상피 세포의 각각의 유전자좌에 있는 대립유전자의 유전자형과 동일한 환자의 경우 (1) 면역억제제가 사용되지 않거나 (2) 사용되는 면역억제제의 양이 감소됨을 설명하는 것인, 키트.
  21. 제19항에 있어서, HLA-C 유전자좌, HLA-DQ 유전자좌 및 HLA-DP 유전자좌에 있는 대립유전자의 유전자형을 조사하기 위한 HLA 타이핑 시약을 포함하지 않는, 키트.
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