ES2859023T3 - Agente para el tratamiento de enfermedades oculares, método de detección por ello y método para predecir la respuesta al rechazo asociado con el trasplante de células epiteliales de pigmento retinal - Google Patents

Agente para el tratamiento de enfermedades oculares, método de detección por ello y método para predecir la respuesta al rechazo asociado con el trasplante de células epiteliales de pigmento retinal Download PDF

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Abstract

Un método para seleccionar un agente terapéutico para la desnaturalización de la retina o una enfermedad asociada con la desnaturalización de la retina para un paciente con desnaturalización de la retina o la enfermedad asociada con la desnaturalización de la retina, que comprende (i) una etapa para examinar los genotipos del locus del gen HLA-A, el locus del gen HLA-B y el locus del gen HLA- DR de las células T derivadas del paciente, (ii) una etapa para seleccionar una célula epitelial del pigmento retiniano que tiene un alelo que coincide con el alelo en cada locus génico clarificado en la etapa (i), en el que la célula epitelial del pigmento de la retina en la etapa (ii) tiene un locus del gen HLA-A, un locus del gen HLA-B y un locus del gen HLA-DR, y un genotipo de cada locus es homocigoto.

Description

DESCRIPCIÓN
Agente para el tratamiento de enfermedades oculares, método de detección por ello y método para predecir la respuesta al rechazo asociado con el trasplante de células epiteliales de pigmento retinal
Campo técnico
La presente invención se refiere a un agente para el tratamiento de enfermedades oftálmicas y a un método de detección de las mismas.
Antecedentes de la técnica
El complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) se conoce como HLA (antígeno leucocitario humano) en humanos y se expresa en casi todas las células y tejidos. HLA contiene principalmente 6 loci génicos de antígenos de A, B, C, DR, DQ y DP, cada uno de los cuales está constituido por combinaciones complicadas de varias docenas de tipos diferentes (alelos) en decenas de miles de combinaciones. El HLA es responsable de un importante mecanismo inmunológico en el cuerpo humano y la función principal del mismo es la presentación del antígeno para reconocerse o no a sí mismo. Cuando una persona recibe un trasplante de una célula o tejido derivado de otra persona (trasplante alogénico), las células inmunocompetentes tales como las células T y similares reconocen e1HLA como el antígeno más importante (sustancia extraña), por lo que se forma el rechazo y el trasplante no se injerta.
En el trasplante normal de órganos, en particular el trasplante de médula ósea, se considera que los 6 loci génicos de los respectivos antígenos A, B, C, DR, DQ y DP de HLA deberían coincidir en principio; cuando no coinciden, es previsible un riesgo de respuesta de rechazo grave y mal pronóstico después del trasplante.
Se sabe que las células epiteliales de pigmento de la retina expresan o producen una molécula que suprime las células inflamatorias que se infiltran intraocularmente (células Th1, células CD8 positivas, macrófagos, células B y similares), y proporcionan una señal supresora sobre las células inflamatorias autólogas alogénicas (por ejemplo, documentos no-Patente 1,2). Por otro lado, se sabe que la célula epitelial del pigmento de la retina proporciona una señal promotora en las células T reguladoras en condiciones similares (documentos no-Patente 3, 4). Por otro lado, también se sabe que las células epiteliales pigmentarias de la retina suprimen las células T xenogénicas (células Th22) (documento no-Patente 5), y se sabe que las células epiteliales del pigmento de la retina tienen en sí mismas una función inmunosupresora, debido a que el entorno alrededor de las células epiteliales del pigmento de la retina tiende a suprimir la reacción inmunitaria. Además, se sabe que el co-cultivo de una célula epitelial del pigmento de la retina humana pre-tratada con IFN-y o macrófagos con células T alogénicas activa las células T ya que aumenta la producción de IL-2 y similares (documento no-Patente 6). También se sabe que el IFN-y juega un papel importante en la expresión de la molécula de MHC de clase II (documento no-Patente 7). Sin embargo, hasta la fecha no ha existido una estrategia de trasplante alogénico teniendo en cuenta la compatibilidad con HLA en el trasplante a pacientes con enfermedad de la retina mediante el uso de una célula epitelial del pigmento de la retina (en lo sucesivo, se indicará como "célula RPE").
Lista de documentos
Documentos no Patente
Documento no Patente 1: Sugita S et al.,
Figure imgf000002_0001
Immunol. 2004, 172: 4184-4194.
Documento no Patente 2: Sugita S et al.,
Figure imgf000002_0002
Immunol. 2006, 176: 118-127.
Documento no Patente 3: Sugita S et al.,
Figure imgf000002_0003
Immunol, 2008, 181: 7525-7536.
Documento no Patente 4: Sugita S et al.,
Figure imgf000002_0004
Immunol, 2009, 183: 5013-5022.
Documento no Patente 5: Sugita S et al, IOVS, 2013, vol. 54, No. 10: 6926-6933.
Documento no Patente 6: Enzmann V et al. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2001 Jul; 239 (6): 445-51
Documento no Patente 7: Enzmann V. Transplant Immunology 7: 9-14, 1999
Compendio de la invención
Problemas que debe resolver la invención
Un objetivo de la presente invención es proporcionar un agente para tratar enfermedades oftálmicas y un método de selección de un agente para tratar enfermedades oftálmicas y similares.
Medios para resolver los problemas
Los presentes inventores obtuvieron células T de varios sujetos de prueba y células epiteliales del pigmento de la retina (RPE) derivadas de células iPS, realizaron la tipificación de HLA y luego el cultivo por contacto de las células T y las células RPE antes mencionadas, y midieron la concentración de citocina producida a partir de las células T para encontrar que, cuando los alelos de 3 loci génicos de HLA-A, HLA-B y HLA-DR de las células T antes mencionadas coinciden con los alelos en los 3 loci génicos respectivos de HLA-A, HLA-B y HLA-DR de una célula epitelial del pigmento de la retina en la que el genotipo de los 3 loci génicos es cada uno homocigótico, la concentración de citocinas es igual o menor que la de las células T solas.
Los presentes inventores han realizado más estudios basados en estos hallazgos y han completado la presente invención.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a lo siguiente.
[1] Un método para seleccionar un agente terapéutico para la desnaturalización de la retina o una enfermedad asociada con la desnaturalización de la retina para un paciente con desnaturalización de la retina o la enfermedad asociada con la desnaturalización de la retina, que comprende
[1] una etapa de examinar los genotipos del locus del gen HLA-A, del locus del gen HLA-B y del locus del gen HLA-DR de las células T derivadas del paciente,
(ii) una etapa para seleccionar una célula epitelial del pigmento retiniano que tiene un alelo que coincide con el alelo en cada locus del gen clarificado en la etapa (i),
en la que la célula epitelial del pigmento de la retina en la etapa (ii) tiene un locus del gen HLA-A, un locus del gen HLA-B y un locus del gen HLA-DR, y un genotipo de cada locus es homocigoto.
[2] El método según [1], en el que la desnaturalización de la retina o la enfermedad asociada con la desnaturalización de la retina es degeneración macular relacionada con la edad, retinitis pigmentosa, retinopatía diabética o desprendimiento de retina.
[3] Una célula epitelial de pigmento de la retina para su uso en el tratamiento de la desnaturalización de la retina o una enfermedad asociada con la desnaturalización de la retina en un paciente con desnaturalización de la retina o una enfermedad asociada con la desnaturalización de la retina
en el que la célula epitelial del pigmento retiniano tiene un locus del gen HLA-A, un locus del gen HLA-B y un locus del gen HLA-DR y cada locus tiene un genotipo homocigoto; y
el paciente tiene una combinación en la que al menos uno de los alelos en cada locus del gen correspondiente es el mismo que un alelo que es homocigoto en el locus del gen HLA-A, el locus del gen HLA-B y el locus del gen HLA-DR de la célula epitelial del pigmento retiniano.
[4] La célula epitelial de pigmento retiniano para su uso según [3], en la que la célula epitelial de pigmento retiniano se deriva de una célula madre pluripotente.
[5] La célula epitelial de pigmento retiniano para su uso según [4], en la que la célula madre pluripotente es una célula iPS.
[6] La célula epitelial de pigmento de la retina para su uso según uno cualquiera de [3] a [5], en la que la desnaturalización de la retina o la enfermedad asociada con la desnaturalización de la retina es degeneración macular relacionada con la edad, retinitis pigmentosa, retinopatía diabética o desprendimiento de retina.
Efecto de la invención
En el trasplante alogénico convencional, se solicita que el tipo de HLA de un donante y el de un receptor coincidan en la medida de lo posible. En particular, en el trasplante de médula ósea, se considera necesario hacer coincidir todos los alelos de los antígenos de 6 loci génicos conocidos como tipo HLA. Sin embargo, según la presente divulgación, cuando el genotipo de 3 loci génicos de HLA-A, HLA-B y HLA-DR en el lado del donante es homocigótico en el trasplante de células RPE, la respuesta de rechazo se puede suprimir simplemente haciendo coincidir uno de los loci de HLA del receptor. Dado que las células inmunológicamente incompatibles para el trasplante se pueden distinguir y seleccionar mediante la recogida previa de muestras de sangre del paciente, la carga sobre los pacientes se puede reducir evitando las células incompatibles para el trasplante. Las células del RPE seleccionadas por este método pueden usarse para trasplante.
Además, el presente aspecto utilizado para determinar si es necesario un inmunosupresor puede contribuir a la selección de un plan de tratamiento. Por tanto, la presente divulgación contribuye a una mejora notable de la eficacia del tratamiento mediante el trasplante alogénico y también proporciona efectos tales como la reducción de los costes de preparación de las células no aptas para el trasplante y similares.
Las células RPE en las que el genotipo de 3 loci génicos de HLA-A, HLA-B y HLA-DR es homocigoto pueden usarse como agentes terapéuticos para enfermedades oftálmicas para pacientes que tienen una combinación en la que al menos uno de los alelos en los 3 loci génicos coincide con el alelo de la célula epitelial del pigmento de la retina.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra la concentración de IFN-y en un sobrenadante de cultivo cuando se co-cultivaron una suspensión de células T CD4 positivas (TLHD-1, TLHD-2) y células RPE derivadas de 454E2-iPS.
La Figura 2 muestra la concentración de IFN-y en un sobrenadante de cultivo cuando se co-cultivaron una suspensión de células T CD4 positivas (TLHD-2, TLHD-3, TLHD-4, TLHD-6, TLHD-7, TLHD-8, TLHD-9) y células RPE derivadas de 454E2-iPS, y cuando se co-cultivaron la suspensión de células T derivadas de TLHD-1 y las células RPE derivadas de células iPS derivadas de TLHD-1.
La Figura 3 muestra la concentración de IFN-y en un sobrenadante de cultivo cuando se co-cultivaron una suspensión de células T CD4 positivas (TLHD-1) y varias células RPE (No. 1 -3, 6-10 en la Tabla 2) o fibroblasto de ratón.
La Figura 4 muestra la concentración de IFN-y en un sobrenadante de cultivo cuando se co-cultivaron una suspensión de células T CD4 positivas (TLHD-1, TLHD-8, TLHD-14, TLHD-21) y células RPE derivadas de 453F2-iPS.
La Figura 5 muestra la concentración de Granzima B en un sobrenadante de cultivo cuando se co-cultivaron una suspensión de células T CD8 positivas (TLHD-1, TLHD-8, TLHD-14, TLHD-22) y células RPE derivadas de 453F2-iPS.
La Figura 6 muestra la proporción de células T CD4 positivas que produjeron IL-2, IFN-y, IL-17, TNF-a, IL-22 por FACS cuando se co-cultivaron la suspensión de células T CD4 positivas (TLHD-1) y células RPE derivadas de 454E2-iPS.
La Figura 7 muestra la cantidad de producción de diversas citocinas cuando se co-cultivaron la suspensión de células T CD4 positivas (TLHD-1, TLHD-10) y las células RPE derivadas de 454E2-iPS.
La Figura 8 muestra la proporción de células T CD8 positivas que produjeron Granzima B, Perforina y TNF-a por FACS cuando se co-cultivaron la suspensión células T CD8 positivas (TLHD-1) y las células RPE derivadas de 454E2-iPS.
La Figura 9 muestra la concentración de Granzima B en un sobrenadante de cultivo cuando se co-cultivaron una suspensión de células T CD8 positivas (TLHD-1, TLHD-3) y células RPE derivadas de 454E2-iPS.
La Figura10 muestra la concentración de Granzima B en el sobrenadante de un cultivo cuando se co-cultivaron la suspensión de células T CD8 positivas (TLHD-2, 4, 5, 8, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20) y las células RPE derivadas de 454E2-iPS.
Descripción detallada
La presente divulgación proporciona un agente terapéutico para enfermedades oftálmicas, que comprende una célula epitelial del pigmento retiniano que tiene un locus génico de HLA-A, un locus génico de HLA-B y un locus génico de HLA-DR, en donde cada locus tiene un genotipo homocigoto, cuyo agente es para un paciente con una enfermedad oftálmica y que tiene una combinación en la que al menos uno de los alelos en cada locus génico correspondiente es el mismo que un alelo en el locus génico de la célula epitelial del pigmento retiniano (en lo sucesivo denominado como "el agente terapéutico de la presente divulgación ").
El agente terapéutico de la presente divulgación contiene una célula epitelial del pigmento retiniano. La "célula epitelial del pigmento retiniano" en la presente descripción se refiere a una célula epitelial que constituye el epitelio del pigmento de la retina y una célula progenitora de la misma. Si una célula epitelial del pigmento de la retina o no se puede confirmar mediante, por ejemplo, la expresión de marcadores celulares (RPE65, CRALBP, MERTK, BEST1, etc.), formas celulares (deposiciones de colorante de melanina intracelular, forma celular poligonal y plana, formación de un haz poligonal de actina, etc.) y similares. La célula progenitora de la célula epitelial del pigmento retiniano significa una célula dirigida a ser inducida a diferenciarse en la célula epitelial del pigmento retiniano, y si una célula progenitora puede confirmarse o no mediante la expresión de marcadores celulares (Mitf, Pax6, Rx, Crx, etc.) y similares. La evaluación funcional de las células epiteliales del pigmento de la retina se puede confirmar usando, por ejemplo, la capacidad de secreción de citocinas (VEGF, PEDF, etc.), la capacidad fagocítica o similares como un índice. Estas operaciones de evaluación y confirmación funcionales pueden ser realizadas por los expertos en la técnica estableciendo las condiciones apropiadas.
Como la célula epitelial del pigmento retiniano en la presente divulgación, pueden usarse células epiteliales del pigmento retiniano derivadas de un mamífero. Los ejemplos del mamífero incluyen ratón, rata, cobaya, hámster, conejo, gato, perro, oveja, cerdo, bovino, caballo, cabra, mono y ser humano. La célula epitelial pigmentaria de la retina humana se usa preferiblemente cuando se producen células epiteliales pigmentarias de la retina con el propósito de trasplantar a un ser humano y similares.
La "célula epitelial de pigmento de la retina" antes mencionada puede ser una célula primaria recogida directamente o una célula después del paso por varias generaciones. La célula epitelial de pigmento de la retina primaria se puede aislar mediante un método conocido y, por ejemplo, se puede obtener una célula epitelial de pigmento de la retina aislando un globo ocular de un cadáver, dividiendo rápidamente el globo ocular en la parte ecuatorial, separando el cuerpo vítreo y la retina, tratándolas si es necesario con colagenasa, hialuronidasa, etc., y recuperando las células por abrasión con un raspador de células o separándolas de la membrana de Bruch con tripsina o una solución de EDTA, después de lo cual las células se colocan en un medio de cultivo, se induce a adherirse y crecer en una placa de cultivo para lograr el crecimiento de las mismas en una cantidad necesaria, que va seguido de un paso apropiado por un tratamiento con tripsina y similares para asegurar el número de células.
Además, la "célula epitelial de pigmento de la retina" anteriormente mencionada puede ser una célula obtenida por inducción de diferenciación de una célula madre que incluye células madre somáticas tales como células madre pluripotentes, células madre neural y similares, o una célula progenitora que incluye célula progenitora neural, progenitora de la retina, y es preferible una célula obtenida por inducción de diferenciación de una célula madre pluripotente.
La "célula madre pluripotente" en la presente invención significa una célula madre que tiene competencia de autorreplicación y pluripotencia de diferenciación y no está particularmente limitada. Por ejemplo, las células madre embrionarias (células ES), las células iPS (células madre pluripotentes inducidas) y similares se utilizan ampliamente. Preferiblemente, se utiliza una célula ES humana o una célula iPS humana, y se utiliza más preferiblemente una célula iPS humana.
La "célula iPS" en la presente invención significa una célula que adquirió artificialmente competencia de autorreplicación y pluripotencia de diferenciación al poner en contacto un factor de reprogramación nuclear con una célula somática (por ejemplo, fibroblasto, célula de piel, linfocito, etc.). La célula iPS se encontró por primera vez mediante un método que incluye la introducción de un factor de reprogramación nuclear que consiste en Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc en una célula somática (por ejemplo, fibroblasto, célula de la piel, etc.) (Cell, 126: pág. 663-676, 2006). A partir de entonces, muchos investigadores están trabajando en varias mejoras en la combinación de factores de reprogramación y un método de introducción de los factores, y se ha reportado una variedad de métodos de producción de células madre pluripotentes inducidas. Sin embargo, el método de producción de células iPS en la presente invención no está particularmente limitado.
En la "célula epitelial del pigmento de la retina" de la presente divulgación, el genotipo del locus del gen HLA-A, del locus del gen HLA-B y del locus del gen HLA-DR es preferiblemente cada uno homocigoto. Que el genotipo sea homocigoto significa que dos alelos son genes que tienen la misma secuencia de bases. En los ejemplos que se mencionan a continuación, se co-cultivaron células epiteliales del pigmento retiniano obtenidas por inducción de diferenciación de células T y células iPS recogidas de un sujeto de prueba y se encontró que las células T que tienen una combinación en la que al menos uno de los alelos en cada locus génico correspondiente es el mismo que un alelo en el locus del gen de la célula epitelial del pigmento retiniano que tiene un locus del gen HLA-A, un locus del gen HLA-B y un locus del gen HLA-DR, en donde cada locus tiene un genotipo homocigoto, muestra el mismo nivel de producción de citocinas que el control (células T solas), o sorprendentemente suprimió la producción de citocinas.
Convencionalmente, se sabe que la célula epitelial del pigmento de la retina expresa una molécula que suprime las células inflamatorias, incluyendo las células T, y proporciona una señal promotora en las células T reguladoras. Sin embargo, muchos de estos son los resultados en células autólogas alogénicas (por ejemplo, documentos no Patente 1 - 4 en los antecedentes de la técnica). Por otro lado, los presentes inventores han reportado que las células epiteliales del pigmento de la retina suprimen las células T xenogénicas (por ejemplo, el documento no Patente 5 en los antecedentes de la técnica); sin embargo, esto simplemente muestra la función de la propia célula epitelial del pigmento retiniano. De hecho, en el trasplante xenogénico, una respuesta de rechazo aguda plantea un gran problema y, dado que la célula epitelial del pigmento de la retina no presenta un antígeno, estos informes de los presentes inventores no sugieren la presente invención en absoluto.
De lo anterior, cuando el genotipo de 3 loci génicos de HLA-A, HLA-B y HLA-DR en el lado del donante es homocigótico en el trasplante de células epiteliales del pigmento de la retina, la respuesta de rechazo se puede suprimir simplemente haciendo coincidir un alelo del loci génico de HLA del receptor, y las células para trasplante se pueden suministrar rápidamente a pacientes con enfermedades oftálmicas que necesitan un trasplante de epitelio pigmentario retiniano. La presente invención es una invención completada basada en el hallazgo de que cuando el genotipo de 3 loci génicos de HLA-A, HLA-B y HLA-DR en el lado del donante es homocigoto en el trasplante alogénico de células epiteliales del pigmento retiniano, la respuesta de rechazo puede ser suprimida. simplemente haciendo coincidir uno de los loci de HLA del receptor, y el hallazgo es muy significativo. El objetivo final de la presente invención es suprimir la respuesta de inmunorechazo que puede ocurrir en el trasplante alogénico de células epiteliales del pigmento retiniano tanto como sea posible. A partir de tales aspectos, una célula epitelial del pigmento retiniano que tiene un locus del gen HLA-A, un locus del gen HLA-B y un locus del gen HLA-DR, en donde cada locus tiene un genotipo homocigoto, que es el ingrediente activo de un agente terapéutico para enfermedades oftálmicas se puede administrar a pacientes con enfermedades oftálmicas en la presente divulgación es una célula alogénica, y una célula epitelial del pigmento retiniano adecuada para el paciente se selecciona de varias células epiteliales del pigmento retiniano en las que un genotipo del locus génico es homocigoto.
El genotipo del locus del gen HLA-A, el locus del gen HLA-B y el locus del gen HLA-DR de las células T obtenidas de un paciente con una enfermedad oftálmica pueden examinarse mediante un método conocido y, por ejemplo, como se muestra en los Ejemplos siguientes, y se puede determinar fácilmente mediante la realización de la tipificación de HLA. Además, el genotipo en cada locus génico de la célula epitelial del pigmento retiniano que se utilizará para el agente de la presente invención también puede examinarse mediante un método similar. Es deseable un método de uso en el que se almacenan varias células epiteliales del pigmento de la retina cuyo genotipo en cada locus génico es homocigoto y cuyo alelo específico se ha clarificado previamente, y se selecciona y utiliza a partir de las mismas una célula apropiada para un paciente con una enfermedad oftálmica.
Los ejemplos de enfermedades oftálmicas a las que se puede aplicar el agente terapéutico de la presente divulgación incluyen desnaturalización de la retina y enfermedades asociadas con la desnaturalización de la retina. Ejemplos de desnaturalización de la retina y enfermedades asociadas con la desnaturalización de la retina incluyen enfermedades por desnaturalización de la retina tales como degeneración macular relacionada con la edad, retinitis pigmentosa, retinopatía diabética, desprendimiento de retina y similares.
Los pacientes con enfermedad oftálmica a quienes se puede aplicar el agente terapéutico de la presente divulgación son preferiblemente pacientes con enfermedad oftálmica que tienen una combinación en la que al menos uno de los alelos en cada locus génico correspondiente es el mismo que un alelo que es homocigoto en el locus del gen HLA-A, locus del gen HLA-B y locus del gen HLA-DR de la célula epitelial del pigmento retiniano.
El rango del sitio de la enfermedad oftálmica al que se puede aplicar el agente terapéutico de la presente divulgación se determina apropiadamente según la enfermedad diana, la especie animal, la edad, el sexo, el peso corporal, los síntomas del sujeto de administración y similares.
Como un método de uso del agente terapéutico de la presente divulgación, se puede trasplantar en forma de lámina. Se conoce un método para formar una lámina de una célula epitelial del pigmento retiniano y, por ejemplo, se describe en el documento de Patente WO 2012/115244. Una lámina de células epiteliales del pigmento retiniano puede trasplantarse de una vez o varias veces por porciones. El número de trasplantes a aplicar se determina según la enfermedad y según los trabajadores médicos y las directrices. Por ejemplo, cuando la enfermedad es una degeneración macular relacionada con la edad, se puede trasplantar una lámina de células para trasplante dos o más veces según la gravedad. Cuando el trasplante se va a realizar varias veces, el intervalo no está particularmente limitado y se puede proporcionar un período de varios días, varias semanas. Alternativamente, el agente terapéutico de la presente divulgación con las células dispersas en el mismo se puede trasplantar directamente al sitio diana. El número de trasplantes a aplicar se determina según las directrices y similares, de manera similar al caso de la lámina, y el período de trasplante y similares también se determinan según corresponda, de manera similar al caso de la lámina.
La presente divulgación también proporciona un método para seleccionar un agente terapéutico para enfermedades oftálmicas para pacientes con enfermedades oftálmicas.
Específicamente, el método para seleccionar un agente terapéutico para enfermedades oftálmicas de la presente divulgación (en lo sucesivo denominado "el método (1) de la presente divulgación") incluye las siguientes etapas:
(i) una etapa para examinar los genotipos del locus del gen HLA-A, el locus del gen HLA-B y el locus del gen HLA-DR de las células T derivadas del paciente,
(ii) una etapa para seleccionar una célula epitelial del pigmento retiniano que tiene un alelo que coincide con el alelo en cada locus génico clarificado en la etapa (i).
En el método (1) de la presente divulgación, la etapa (i), se puede examinar el genotipo del locus del gen HLA-A, el locus del gen HLA-B y el locus del gen HLA-DR de las células T obtenido de un paciente con una enfermedad oftálmica. mediante un método conocido y, por ejemplo, como se muestra en los Ejemplos siguientes, y puede determinarse fácilmente realizando la tipificación de HLA. La enfermedad oftálmica del paciente del que derivan las células T en el método (1) de la presente divulgación puede ser la misma que las enfermedades oftálmicas que van a ser el objetivo de aplicación del agente terapéutico de la presente divulgación.
La célula epitelial del pigmento retiniano que tiene un alelo que coincide con el alelo en cada locus génico clarificado en la etapa (i), que se selecciona en el método (1) de la presente divulgación, etapa (ii), es útil como un agente terapéutico para enfermedades oftálmicas que no provoca una respuesta de rechazo en la aplicación a pacientes con enfermedades oftálmicas. En el método (1) de la presente divulgación, los genotipos del locus del gen HLA-A, el locus del gen HLA-B y el locus del gen HLA-DR de la célula epitelial del pigmento retiniano son preferiblemente homocigotos. La célula epitelial del pigmento de la retina en el método (1) de la presente divulgación puede prepararse de la misma manera que en la preparación de la célula epitelial del pigmento de la retina que va a estar contenida en el agente terapéutico de la presente divulgación.
La presente divulgación también proporciona un método para seleccionar un agente terapéutico para enfermedades oftálmicas para otros pacientes con enfermedades oftálmicas.
Específicamente, el método de selección de un agente terapéutico para enfermedades oftálmicas de la presente divulgación (en lo sucesivo denominado "el método (2) de la presente divulgación") incluye las siguientes etapas: (1) una etapa para realizar un cultivo por contacto de células T derivadas del paciente con células epiteliales del pigmento retiniano,
(2) una etapa para medir la concentración de citocinas inflamatorias secretadas en el sobrenadante del cultivo en la etapa (1), y
(3) una etapa para considerar que la célula epitelial del pigmento retiniano pueda usarse como ingrediente activo de un agente terapéutico para enfermedades oftálmicas de un paciente, cuando la concentración de citocinas inflamatorias en la etapa (2) es del mismo nivel o no más que una concentración de una citocina inflamatoria en un sobrenadante de cultivo obtenido cultivando las células T derivadas del paciente solas.
En el método (2) de la presente divulgación, etapa (1), el cultivo de contacto de las células T derivadas del paciente y la célula epitelial del pigmento retiniano se puede realizar según el método descrito en los Ejemplos mencionados a continuación. Específicamente, las células T derivadas del paciente se siembran en una placa de 96 pocillos, se añaden células epiteliales del pigmento retiniano y la mezcla se cultiva. En esta etapa, las células T derivadas del paciente pueden activarse previamente. Aunque un método de activación de células T no está particularmente limitado, por ejemplo, se puede añadir un anticuerpo anti-CD3. Las células T pueden prepararse separándolas previamente en células CD4 positivas y células CD8 positivas.
Las células epiteliales del pigmento retiniano que se utilizarán en esta etapa pueden tratarse con radiación previamente para evitar el crecimiento de células epiteliales del pigmento de la retina en el cultivo. Además, los genotipos del locus del gen HLA-A, el locus del gen HLA-B y el locus del gen HLA-DR de la célula epitelial del pigmento retiniano que se va a usar para el cultivo son preferiblemente homocigotos cada uno.
Se puede utilizar un medio de cultivo sin ninguna limitación particular siempre que sea un medio de cultivo celular que se utilice generalmente en el campo pertinente. Por ejemplo, se pueden utilizar medios basales tales como medio F-10, medio F12, MEM, medio BME, DMEM, aMEM, medio IMD, medio ES, medio DM-160, medio Fisher, medio WE y medio RPMI1640 y similares. Además, se pueden añadir al medio basal, si fuese necesario, suero (suero fetal bovino, etc.), diversos factores de crecimiento (EGF, FGF, HGF, PDGF y similares), antibióticos, aminoácidos y similares. El pH del medio es preferiblemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 8. El cultivo se puede realizar, por ejemplo, generalmente a aproximadamente 30 - aproximadamente 40°C durante aproximadamente 15 -aproximadamente 60 h, preferiblemente 48 h. Para el cultivo, la proporción de células T derivadas del paciente y células epiteliales del pigmento retiniano es generalmente 500: 1 - 10: 1, preferiblemente 400: 1 - 25: 1, más preferiblemente 200: 1 - 50: 1. Al establecer la proporción entre el número de células de las células T derivadas del paciente y las células epiteliales del pigmento retiniano dentro de este rango, las células T secretan una cantidad adecuada de citocina inflamatoria o sustancia de daño celular, lo que permite una determinación más definitiva de si la célula epitelial del pigmento retiniano que va a ser el objetivo se puede aplicar a los pacientes.
La enfermedad oftálmica de un paciente que es la derivación de las células T en el método (2) de la presente divulgación puede ser la misma que la enfermedad oftálmica que va a ser el objetivo de aplicación del agente terapéutico de la presente divulgación, y la célula epitelial del pigmento retiniano se puede preparar de la misma manera que la célula epitelial de pigmento de la retina que va a estar contenida en el agente terapéutico de la presente divulgación.
En la etapa (2) del método (2) de la presente divulgación, la concentración de citocina inflamatoria secretada en el sobrenadante del cultivo se puede medir según el método descrito en los Ejemplos mencionados a continuación. Para ser específico, se puede medir mediante ELISA, transferencia de Western, FACS y similares. La citocina inflamatoria que se va a medir en esta etapa no está particularmente limitada mientras esté implicada en la respuesta de rechazo. Por ejemplo, cuando se usa una célula CD4 positiva como célula T derivada del paciente en la etapa (1), se pueden mencionar IFN-y, IL-17 y TNF-a, de los cuales IFN-y es más preferible. Cuando se usa una célula CD8 positiva como célula T derivada del paciente en la etapa (1), se pueden mencionar Granzima B, Perforina y TNF-a, de las cuales Granzima B es más preferible.
Como se muestra en los Ejemplos que se mencionan a continuación, las células epiteliales del pigmento de la retina obtenidas por inducción de diferenciación de células T y células iPS recolectadas de un sujeto de prueba se co­ cultivaron, y se encontró que las células T que tienen una combinación en la que al menos uno de los alelos en cada locus del gen correspondiente es el mismo que un alelo en dicho locus del gen de la célula epitelial del pigmento retiniano que tiene un locus del gen HLA-A, un locus del gen HLA-B y un locus del gen HLA-DR, en donde cada locus tiene un genotipo homocigoto, muestra el mismo nivel de producción de citocinas que el control, o producción de citocinas suprimida. Por lo tanto, en la etapa (3) del método (2) de la presente divulgación, se puede considerar que la célula epitelial del pigmento retiniano se puede usar como un ingrediente activo de un agente terapéutico para enfermedades oftálmicas de un paciente, cuando la concentración de la citocina inflamatoria medida en la etapa (2) es del mismo nivel o no más que la concentración de una citocina inflamatoria en un sobrenadante de cultivo obtenido cultivando las células T derivadas del paciente solas.
La presente divulgación también proporciona un método de prueba para predecir una respuesta de rechazo en un paciente con enfermedad oftálmica que va a ser trasplantado con una célula epitelial del pigmento retiniano para trasplante. Específicamente, el método de prueba para predecir una respuesta de rechazo de la presente divulgación (en lo sucesivo denominado "el método (3) de la presente divulgación") incluye las siguientes etapas:
(A) una etapa para realizar un cultivo por contacto de células T derivadas del paciente con dichas células epiteliales del pigmento retiniano,
(B) una etapa para medir una concentración de citocina inflamatoria secretada en el sobrenadante del cultivo en la etapa (A), y
(C) una etapa para considerar que se produce una respuesta de rechazo a la célula epitelial del pigmento retiniano, cuando la concentración de citocinas inflamatorias en la etapa (B) es significativamente más alta que una concentración de una citocina inflamatoria en un sobrenadante de cultivo obtenido mediante el cultivo de células T solas.
Las etapas (A) y (B) del método (3) de la presente divulgación se pueden realizar de manera similar a las etapas (1) y (2) del método (2) de la presente divulgación. Como se muestra en los ejemplos que se mencionan a continuación, las células epiteliales del pigmento de la retina obtenidas por inducción de diferenciación de las células T y células iPS recogidas de un sujeto de prueba se co-cultivaron, y se encontró que las células T que tienen una combinación en la que al menos uno de los alelos en el locus del gen correspondiente no es el mismo que un alelo en dicho locus del gen de la célula epitelial del pigmento retiniano que tiene un locus del gen HLA-A, un locus del gen HLA-B y un locus del gen HLA-DR, en donde cada locus tiene un genotipo homocigoto, muestra una mayor producción de citocinas que el control. Por lo tanto, en la etapa (C) del método (3) de la presente divulgación, se puede considerar que ocurre una respuesta de rechazo a la célula epitelial del pigmento retiniano, cuando la concentración de citocinas inflamatorias en la etapa (B) es significativamente mayor que una concentración de una citocina inflamatoria en un sobrenadante de cultivo obtenido cultivando las células T derivadas del paciente solas.
Ejemplos
(Ejemplo de preparación 1) Preparación de células RPE derivadas de células iPS humanas
Usando la línea de células iPS 454E2 o 453F2 (proporcionada por Kyoto University) descrita en Nature Methods 8, 409-412 2011 como células iPS, y según el método de inducción de diferenciación descrito en J Cell Sci (2009) 122: 3169-3179, se prepararon células RPE derivadas de células 454E2-iPS y células RPE derivadas de células 453F2-iPS (ambas células tienen genotipo homocigoto en los loci del gen HLA-A, -B, -DR3).
Además, usando, como línea de células iPS, células iPS establecidas a partir de fibroblasto derivado de piel humana de un sujeto de prueba denominado TLHD-1 según el método descrito en Nature (2011) 474: 225-229 en lugar de 454E2 o 453F2, se prepararon células RPE derivadas de células TLHD-1-iPS mediante un método similar.
(Ejemplo de preparación 2) Preparación de una suspensión de células T humanas
Las células T CD4 positivas y las células T CD8 positivas se separaron a partir de la sangre periférica humana (nombres de los sujetos de prueba; TLHD-1 - TLHD-22) utilizando un clasificador magnético de células MACS, se suspendieron en 100U/ml de medio de cultivo RPMI que contiene rhIL-2 (RPMI 1640 445 ml, FBS 50 ml, penicilinaestreptomicina 5 ml) para preparar cada suspensión celular.
(Referencia 1) Tipificación de HLA
Los resultados de la tipificación de HLA de las células utilizadas en los Ejemplos 1 - 8 mediante un método convencional se muestran en la siguiente Tabla. Los resultados de la tipificación de HLA de las células T respectivas de los sujetos de prueba obtenidos en el Ejemplo de preparación 2 se muestran en las Tablas 1-1, 1-2, y los resultados de la tipificación de HLA de las células RPE derivadas de iPS humanas del Ejemplo de preparación 1 y las inducidas de otras células iPS se muestran en la Tabla 2.
En relación con las células RPE derivadas de células 454E2-iPS (homocigotas en 3 loci de genes HLA-A, HLA-B, HLA-DR), los nombres de los sujetos de prueba TLHD-10 y TLHD-21 tenían los mismos alelos en el genotipo de 3 loci de genes HLA-A, HLA-B, HLA-Dr , los nombres de los sujetos de prueba TLHD-6, 18 tenían los mismos alelos en el genotipo de 2 loci de genes HLA-B, HLA-DR, los nombres de los sujetos de prueba TLHD-2, 5, 7, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 20, 22 tenían los mismos alelos solo en el genotipo de 1 locus del gen HLA-A, y el nombre del sujeto de prueba TLHD-19 tenía los mismos alelos sólo en el genotipo de 1 locus del gen HLA-DR.
En relación con las células del RPE derivadas de células 453F2-iPS (homocigotas en 3 loci de genes HLA-A, HLA-B, HLA-DR), los nombres de los sujetos de prueba TLHD-1,4, 18 tenían los mismos alelos solo en el genotipo de 2 loci de genes, y el nombre del sujeto de prueba TLHD-6 tenía los mismos alelos solo en el genotipo de 1 locus de gen HLA-A.
[Tabla 1-1]
Respuesta
HLA
No. Células T Origen HLA-A HLA-B HLA-DRB1 de las coincidente células T a 454E2* con 454E2
DR9/DR16 CD4(+)/CD8
1 TLHD1 PBMCs A11/-(11: 01/-) B62/B67
(15:01/67: 01) (09:01/16: 02) (+)
A24/33 B44/B55 DR4/DR13 CD4 (+)/CD8
2 TLHD2 PBMCs A24:02
(24:02/33: 03) (44:03/55: 02) (04:05/13: 02) (-)
A2/A26 B44/B61 DR4/DR8 (04: CD4(+)/CD8
3 TLHD3 PBMCs (02:01/26: 03) (40:06/44: 03) 05/08:03) (+) DQB1 06:01
4 TLHD4 PBMCs A2/A3 (02: B62/B51 DR4/DR4 (04: CD4(+)/CD8
01/03:01) (15:01/51: 01) 02/04:06) (+)
5 TLHD5 PBMCs A24/A33 B7/B44 DR1/DR13 CD4(+)/CD8
(24:02/33: 03) (07:02/44: 03) (01:01/13: 02) (+) A24:02
B52:01 6 TLHD6 PBMCs A11/A26 B39/B52 DR8/DR15 CD4(-)/CD8,
(11:01/26: 02) (39:01/52: 01) (08:03/15: 02) nt
DRB1 15:02
B35/B54 DR14/DR15
7 TLHD7 PBMCs A24/A26 CD4(+)/CD8,
(24:02/26: 01) (35:01/54: 01) (14:05/15: 01) nt A24:02
A26/A26 B13/B35 DR12/DR15 CD4(+)/CD8
8 TLHD8 PBMCs (26:01/26: 03) (13:01/35: 01) (12:02/15: 01) (+)
9 TLHD9 PBMCs A24/A26 B51/B54 DR4/DR12 CD4(+)/CD8, A24:02 (24:02/26: 03) (51:01/54: 01) (04:05/12: 01) nt
A24: 10 TLHD10 PBMCs A24/A31 B61/B52 DR15/DR15 CD4 (-)/CD8 02/B52:01
(24:02/31: 01) (40:02/52: 01) (15:01/15: 02) (-)
DRB1 15:02 11 TLHD11 PBMCs A24/-(24: 02/-) B7/B59 DR4/DR9 (04: CD4, nt/CD8
(07:02/59: 01) 05/09:01) (-) A24:02
A24/A26 B51/B54 DR14/DR14
12 TLHD12 PBMCs CD4, nt/CD8
(24:02/26: 01) (51:01/54: 01) (14:03/14: 05) (-) A24:02
A24/A26 B61/B56 DR4/DR14 CD4 (+)/CD8
13 TLHD13 PBMCs (24:02/26: 01) (40:02/56: 01) (04:05/14: 54) (-) A24:02
14 TLHD14 PBMCs A1/A24 B37/B51 DR9/DR10 CD4 (+)/CD8 A24:02 (01:01/24: 02) (37:01/51: 01) (09:01/10: 01) (-)
15 TLHD15 PBMCs A2/A24 (02: B48/B54 (48: DR4/-(04: 05/-) CD4,
01/24: 02) 01/54: 01) nt/CD8, nt A24:02 A2/A31 (02: B62/B61 (15: CD4 (+)/CD8
16 TLHD16 PBMCs 01/31: 01) 01/40: 02) DR9/-(09: 01/-) (+)
17 TLHD17 PBMCs A24/A31 (24: B54/B55 DR4/DR9 (04 CD4 (+)/CD8 A24:02
02/31: 01) (54:01/55: 02) 05/09:01) (-)
18 TLHD18 PBMCs B52:01 Respuesta
de las HLA No. Células T Origen HLA-A HLA-B HLA-DRB1 células T a coincidente con 454E2 454E2*
A2/A11 (02: B62/B52 DR14/DR15 CD4(-)/CD8 DRB1 15:02
01/11:01) (15:01/52: 01) (14:54/15:02) (-)
19 TLHD19 PBMCs A2/A33 (02: B35/B44 DR13/DR15 CD4(-)/CD8 DRB1 15:02
01/33:03) (35:01/44: 03) (13:02/15:02) (+)
20 TLHD20 PBMCs A2/A24 (02: B44/B51 DR9/DR13 (09: CD4 (+)/CD8 A24:02
01/24:02) (44:03/51: 01) 01/13:02) (+)
21 TLHD21 PBMCs A24/A24 (24: B39/B52 DR9/DR15 CD4 (-)/CD8 A24: 02/B52:01
02/24:20) (39:01/52: 01) (09:01/15:02) (-)
DRB1 15:02
22 TLHD22 PBMCs A24/A26 (24: B39/B61 DR8/DR14 CD4 (-)/CD8 A24:02
02/26:02) (39:01/40: 06) (08:03/14:06) (+)
* Respuesta de las células T a 454E2: concentración de citocinas cuando se cultiva cada célula T (CD4 positiva o CD8 positiva) sin célula epitelial del pigmento retiniano se toma como control, la concentración superior a la indicada es (+) y la concentración igual o inferior a la indicada es (-). nt indica sin medición.
Tabla 2
No. RPE y células de Origen HLA-A HLA-B HLA-DR Referencia control
1 Células 836B1iPS- CélulasiPS A2/-(02: 01/-) B27/B50 (27: DR1/13 (01
RPE (fibroblastos 03/50:01) 01/13:03)
cutáneos de HD)
2 Células 101G26 CélulasiPS A11/A24 B60/B54 (40: DR4/DR8 (04
iPS-RPE (fibroblastos (11:01/24: 02) 01/54:01) 05/08:03)
cutáneos de RP)
3 Células 454E2 células iPS A24/- B52/- DR15/- donante HLA iPS-RPE homocigoto (células de la pulpa (24:02/-) (52:01/-) (15:02/-) dental de HD)
4 Células 453F2 iPS- células iPS A11/- B62/- DR4/- donante HLA RPE homocigoto (células de la pulpa (11:01/-) (15:01/-) (04:06/-) dental de HD)
5 Células TLHD1 células iPS A11/- B62/B67 DR9/DR16 TLHD1 autólogo iPS-RPE
(fibroblastos (11:01/-) (15:01/67:01 (09:01/16:02)
cutáneos de HD)
6 Células ES-RPE Células ES A2/A24 B35/B39 (35: DR9/DR14 (09
(02:06/24: 02) 01/39:01) 01/14:05)
No. RPE y células de Origen HLA-A HLA-B HLA-DR Referencia control
7 Células RPE Células oculares A3/A24 B35/B60 (35 DR1/-primarias fetales (03:01/24: 02) 01/40:01)
(01:01/-)
8 Líneas celulares Células oculares A2/A3 B7/B65 DR13/DR15
RPE (ARPE19) adultas
(02:01/03: 01) (07:02/14:02) (13:02/15:01)
9 Células Células CE humanas A24/A68 B27/B51 DR7/DR11
endoteliales de la primarias (24:02/68: 01)
córnea (27:03/51:01) (07:01/11:01)
10 Células de Tejidos cutáneos A24/A26 B61/B52 DR9/DR15
fibroblastos (HD)
(24:02/26: 02) (40:02/52:01) (09:01/15:02)
(Ejemplo de preparación 3) Preparación de células RPE derivadas de células iPS de mono
Las células iPS se establecieron a partir del fibroblasto derivado de la piel de Macaca fascicularis según el método descrito en Nature (2011) 474: 225-229 (GLIS1 use), y las células RPE derivadas de células iPS de mono se prepararon según el método de inducción de diferenciación descrito en J Cell Sci (2009) 122: 3169-3179 de cada uno de los monos normales (A, B) y un modelo de enfermedad del mono (C) preparado formando una mancha de fotocoagulación retiniana en un ojo mediante un procedimiento de fotocoagulación retiniana.
(Ejemplo de preparación 4) Preparación de la suspensión de células T de mono
Las células T CD4 positivas y las células T CD8 positivas se separaron de la sangre periférica del modelo de enfermedad (C) del mono utilizando un clasificador magnético de células MACS y se suspendieron en 100 U/ml de medio de cultivo RPMI que contenía rhIL-2 (RPMI 1640 445 ml, FBS 50 ml, penicilina-estreptomicina 5 ml) para preparar cada suspensión de células T.
(Referencia 2) Tipificación del MHC
La tipificación del MHC de las células utilizadas en los Ejemplos 9, 10 se realizó mediante un método convencional. El modelo de enfermedad (C) del mono tenía los mismos alelos en 3 loci de genes en relación con las células RPE derivadas de células iPS (homocigotas en 3 loci de genes de entre los loci de gen Mafa-A, -B, -DRA, -DRB, -DQA, -DQB, -DPA, -DPB) del mono normal A. Las células RPE derivadas de células iPS del mono normal B eran diferentes en todos los genotipos del MHC del modelo de enfermedad (C) del mono .
(Ejemplo 1)
En una placa de 96 pocillos, se añadió un anticuerpo anti-CD3 (1 pg/ml) a las suspensiones de células T CD4 positivas (TLHD-1 y TLHD-2) obtenidas en el Ejemplo de preparación 2 y las suspensiones se dispensaron al pocillo a una concentración de 5 x 105 células/pocillo. Se añadieron a cada pocillo células RPE derivadas de 454E2-iPS obtenidas en el Ejemplo de preparación 1 a 3 concentraciones de 1 x 103/ pocillo, 5 x 103/ pocillo, 1 x 104/ pocillo y se cultivaron, en donde la suspensión sin adición se utilizó como control. Después del cultivo durante 48 horas, se recuperó el sobrenadante del cultivo y se midió la concentración de IFN-y en el sobrenadante del cultivo mediante ELISA. Los resultados se muestran en la Figura 1.
Como resultado, tanto TLHD-1 como TLHD-2 mostraron una producción aumentada de IFN-y en los 3 tipos de concentraciones en comparación con el control. Por lo tanto, se puede considerar que el trasplante de células RPE derivadas de 454E2-iPS a sujetos de prueba TLHD-1 y TLHD-2 tiene una alta posibilidad de provocar una respuesta de rechazo.
Los antígenos HLA de TLHD-1 y TLHD-2 mostraron un haplotipo diferente al del antígeno HLA-DR (Clase II) de las células del RPE derivadas de 454E2-iPS. Si bien el antígeno HLA-A y el antígeno HLA-B (Clase I) tenían los mismos alelos que el HLA-A de TLHD-2, otros haplotipos eran completamente diferentes y todos eran diferentes en TLHD-1 (Tabla 3).
Tabla 3
Figure imgf000012_0001
(Ejemplo 2)
Mediante un método similar al del Ejemplo 1, excepto que la suspensión de células T CD4 positivas (nombres de los sujetos de prueba: TLHD-2, TLHD-3, TLHD-4, Tl HD-6, TLh D-7, TLHD-8, TLHD-9) obtenida en el Ejemplo de preparación 2 se usó como suspensión de células T, y se usaron células RPE derivadas de 454E2-iPS obtenidas en el Ejemplo de preparación 1 a una concentración de 1 x 104/ pocillo, se midió la cantidad de producción de IFN-y. Además, utilizando células derivadas de TLHD-1 en lugar de la suspensión de células T y células RPE derivadas de células i PS y mediante un método similar al del Ejemplo 1, se midió la cantidad de producción de IFN-y. Los resultados se muestran en la Figura 2.
Como resultado, se suprimió la producción de IFN-y en comparación con el control en una combinación de la suspensión de células T de TLHD-1 y células RPE derivadas de células iPS de TLHD-1, y una combinación de la suspensión de células T de TLHD-6 y células RPE derivadas de 454E2-iPS.
Por tanto, se puede considerar que el trasplante autólogo o el trasplante de células RPE derivadas de 454E2-iPS al sujeto de prueba TLHD-6 tiene una baja posibilidad de provocar una respuesta de rechazo. Es decir, las células RPE derivadas de 454E2-iPS pueden usarse como un agente terapéutico para una enfermedad oftálmica del sujeto de prueba TLHD-6 o un paciente que tiene el mismo haplotipo de HLA que el sujeto de prueba TLHD-6, y los mismos alelos que el sujeto de prueba TLHD-6.
Por otro lado, en las combinaciones distintas de las anteriores, la cantidad de producción de IFN-y aumentó en comparación con el control. Por lo tanto, el trasplante de células RPE derivadas de células 454E2-iPS a pacientes que no sean pacientes con una enfermedad oftálmica y que tengan el mismo haplotipo de HLA que TLHD-6 y los mismos alelos que TLHD-6 puede considerarse que tiene una alta posibilidad de provocar una respuesta de rechazo. En este caso, las células RPE derivadas de células 454E2-iPS no se utilizan para el trasplante o debe considerarse para el trasplante el uso combinado de un inmunosupresor.
En TLHD-6 que mostró producción de citocinas suprimida, los alelos eran los mismos en HLA-DR y HLA-B de células RPE derivadas de células 454E2-iPS. Por otro lado, en TLHD-7 que mostró una alta producción de citocinas, los alelos fueron los mismos en HLA-A, pero diferentes en HLA-DR. En TLHD-8, los alelos eran diferentes de las células RPE derivadas de células 454E2-iPS. Otras células que mostraron una alta producción de citocinas fueron diferentes en el haplotipo de las células RPE derivadas de células 454E2-iPS (Tabla 4).
Tabla 4
Figure imgf000012_0002
Figure imgf000013_0001
(Ejemplo 3)
Mediante un método similar al del Ejemplo 1, excepto que se usó la suspensión de células T CD4 positivas (TLHD-1) obtenida en el Ejemplo de preparación 2 como suspensión de células T, y los números 1 -3, 6-10 mostrados en la Tabla 2 y fibroblasto de ratón se utilizaron a una concentración de 1 x 104/ pocillo en lugar de las células RPE derivadas de 454E2-iPS obtenidas en el Ejemplo de preparación 1, se midió la cantidad de producción de IFN-y. Los resultados se muestran en la Figura 3.
Como resultado, en todas las células distintas del fibroblasto humano, aumentó la cantidad de producción de IFN-y. Por lo tanto, el trasplante de células RPE derivadas de células 454E2-iPS a pacientes que no sean pacientes con una enfermedad oftálmica y que tengan el mismo haplotipo de HLA que el fibroblasto humano mencionado anteriormente y los mismos alelos que el fibroblasto humano mencionado anteriormente se puede considerar tienen una alta posibilidad de provocar una respuesta de rechazo. En este caso, las células RPE derivadas de células 454E2-iPS no se utilizan para el trasplante o se puede considerar el trasplante con el uso combinado de un inmunosupresor.
En relación con el antígeno HLA-DR de células RPE derivadas de ES y fibroblasto humano, TLHD-1 tenía los mismos alelos y otros eran diferentes en haplotipo (Tabla 5).
[Tabla 5]
Figure imgf000013_0002
(Ejemplo 4)
Se realizó un experimento similar excepto que la suspensión de células T CD4 positivas (nombres de los sujetos de prueba: TLHD-1, TLHD-8, TLHD-14, TLHD-21) obtenida en el Ejemplo de preparación 2 se usó como suspensión de células T, y se utilizaron células RPE derivadas de 453F2-iPS mostradas en la Tabla 2 en lugar de células RPE derivadas de 454E2-iPS obtenidas en el Ejemplo de preparación 1. Los resultados se muestran en la Figura 4.
Alternativamente, se realizó un experimento similar excepto que la suspensión de células T CD8 positivas (nombres de los sujetos de prueba: TLHD-1, TLHD-8, TLHD-14, TLHD-22) obtenida en el Ejemplo de preparación 2 se usó como suspensión de células T en el Ejemplo 1, y se utilizaron células RPE derivadas de 453F2-iPS que se muestran en la Tabla 2 en lugar de células RPE derivadas de 454E2-iPS obtenidas en el Ejemplo de preparación 1. Los resultados se muestran en la Figura 5.
Como resultado, se suprimió la producción de Granzima B en comparación con el control en una combinación de la suspensión de células T CD8 positivas de TLHD-1 y células RPE derivadas de 453F2-iPS. Por lo tanto, se puede considerar que el trasplante de células RPE derivadas de 453F2-iPS al sujeto de prueba TLHD-1 tiene una baja posibilidad de provocar una respuesta de rechazo. Es decir, las células RPE derivadas de 453F2-ÍPS pueden usarse como un agente terapéutico para una enfermedad oftálmica del sujeto de prueba TLHD-1 o un paciente que tiene el mismo haplotipo de HLA que el sujeto de prueba TLHD-1, y los mismos alelos que el sujeto de prueba TLHD-1.
(Ejemplo 5)
En una placa de 96 pocillos, se añadió un anticuerpo anti-CD3 a 1 pg/ml a la suspensión de células T CD4 positivas (TLHD-1) obtenida en el Ejemplo de preparación 2 y se dispensó al pocillo a una concentración de 5 x 105 células/pocillo. Se añadieron a cada pocillo células RPE derivadas de 454E2-iPS homocigóticas en 3 loci de genes HLA obtenidos en el Ejemplo de preparación 1 a una concentración de 1 x 104/ pocillo y se cultivaron, en el que la suspensión sin adición se utilizó como control. Después del cultivo durante 48 horas, se recuperaron las células y se midió la producción de IL-2, IFN-y, IL-17, TNF-a, IL-22 en células T CD4 positivas, respectivamente, mediante FACS. Los resultados se muestran en la Figura 6.
Como resultado, se encontró que I FN-y, IL-17 y TNF-a se pueden utilizar como un índice de la producción de citocinas en células T anti-CD4 positivas.
Además, se realizó un experimento adicional similar utilizando las suspensiones de células T CD4 positivas (TLHD-1 y TLHD-10) obtenidas en el Ejemplo de preparación 2, y se compararon varias cantidades de producción de citocinas (Figuras 7a y b).
Como resultado, entre muchas citocinas, el nivel de expresión de I FN-y solo disminuyó cuando se usaron células RPE derivadas de células 454E2-iPS (homocigotas en 3 loci de genes de HLA-A, HLA-B, HLA-DR) para células T (los alelos de todos los genotipos de 3 loci de genes de HLA-A, HLA-B, HLA-DR son los mismos) del nombre del sujeto de prueba TLHD-10. Por tanto, se encontró que el I FN-y es adecuado como un índice de si se produce o no una respuesta de rechazo.
(Ejemplo 6)
En una placa de 96 pocillos, se añadió un anticuerpo anti-CD8 a 1 pg/ml a suspensiones de células T CD8 positivas (TLHD-1) obtenidas en el Ejemplo de preparación 2 y se dispensó en el pocillo a una concentración de 1 x 105 células/pocillo. Se añadieron a cada pocillo células RPE derivadas de 454E2-iPS obtenidas en el Ejemplo de preparación 1 a concentraciones de 1 x 104/pocillo y se cultivaron, en el que la suspensión sin adición se utilizó como control. Después del cultivo durante 48 h, se recuperaron las células y se midió mediante ELISA la producción de Granzima B, Perforina, TNF-a en las células T CD8 positivas. La proporción de células dobles positivas se muestra en la Figura 8.
Como resultado, se sugirió que una sustancia citotóxica producida por células T CD8 positivas se puede usar para la detección de una respuesta de rechazo.
(Ejemplo 7)
Se realizó un método similar al del Ejemplo 1, excepto que se usaron suspensiones de células T CD8 positivas (nombres de los sujetos de prueba: TLHD-1, TLHD-3) en lugar de células T CD4 positivas y se midió la producción de Granzima B en lugar de I FN-y. Los resultados se muestran en la Figura 9.
Como resultado, tanto TLHD-1 como TLHD-3 mostraron una mayor producción de Granzima B en los 2 tipos de concentraciones en comparación con el control. Por lo tanto, se puede considerar que el trasplante de células l RPE derivadas de 454E2-iPS a los sujetos de prueba TLHD-1 y TLHD-3 tiene una alta posibilidad de provocar una respuesta de rechazo.
Los antígenos HLA de TLHD-1 y TLHD-3 mostraron un haplotipo diferente del antígeno HLA-A y del antígeno HLA-B de las células RPE derivadas de 454E2-iPS (Tabla 6).
[Tabla 6]
Figure imgf000014_0001
(Ejemplo 8)
Se realizó un método similar al del Ejemplo 1, excepto que se utilizaron las suspensiones de células T CD8 positivas (nombres de los sujetos de prueba: Tl Hd -2, 4, 5, 8, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20 ) en lugar de células T CD4 positivas y se midió la producción de Granzima B en lugar de IFN-y. Los resultados se muestran en la Figura 10.
Como resultado, se suprimió la producción de Granzima B en comparación con el control en una combinación de suspensiones de células T de t Lh D-10, TLHD-18, TLHD-2, TLHD-14, TLHD-12, TLHD-13, TLHD-17 y células RPE derivadas de 454E2-iPS. Por lo tanto, se puede considerar que el trasplante de células RPE derivadas de 454E2-iPS a los sujetos de prueba TLHD-10, TLHD-18 tiene una baja posibilidad de provocar una respuesta de rechazo. Si bien TLHD-2, TLHD-14, TLHD-12, TLHD-13, TLHD-17 solo coincidían con los alelos de HLA-A, se debe considerar la posibilidad de no provocar una respuesta de rechazo.
Por otro lado, en las combinaciones distintas de las anteriores, la cantidad de producción de Granzima B aumentó en comparación con el control. Por lo tanto, se puede considerar que el trasplante de células del RPE derivadas de células 454E2-iPS a los sujetos de prueba correspondientes tiene una alta posibilidad de provocar una respuesta de rechazo. En este caso, las células del RPE derivadas de células 454E2-iPS no se utilizan para el trasplante o se puede considerar el trasplante con el uso combinado de un inmunosupresor.
En TLHD-10 y TLHD-18 que mostraron una producción suprimida de Granzima B, tanto los haplotipos como los alelos coincidían en HLA-A o h La -B y HLA-DR. Por otro lado, en TLHD-2, TLHD-14, TLHD-12, TLHD-13, el haplotipo y los alelos eran los mismos en HLA-A o HLA-B de las células del RPE derivadas de células 454E2-iPS. Por otro lado, también en TLHD-5 y TLHD-20 que mostraron una mayor producción de Granzima B, el haplotipo y los alelos fueron los mismos en HLA-A o HLA-B de células RPE derivadas de células 454E2-iPS, y en TLHD- 8, solo el haplotipo de HLA-DR era el mismo (Tabla 7).
Por tanto, incluso cuando el alelo y el haplotipo coinciden parcialmente, la producción de Granzima B puede aumentar. Sin embargo, cuando al menos uno de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-DR es el mismo, se puede considerar que la posibilidad de provocar una respuesta de rechazo es baja. Además, cuando al menos dos de los alelos de HLA-A, HLA-B o HLA-DR son iguales, se puede considerar que la posibilidad de provocar una respuesta de rechazo es menor, y cuando todos los alelos de HLA-A, HLA-B y HLA-DR son iguales, se puede considerar que las células son adecuadas para trasplante. En el caso contrario, las células no se utilizan para el trasplante o el caso se puede utilizar como un índice para considerar el trasplante con el uso combinado de un inmunosupresor. Otras células que mostraron una alta producción de Granzima B fueron diferentes en el haplotipo de las células RPE derivadas de células 464E2-iPS.
[Tabla 7]
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000016_0001
(Ejemplo 9)
prueba de predicción
En una placa de 96 pocilios, se añade un anticuerpo anti-CD3 a 1 pg/ml a la suspensión de células T CD4 positivas (modelo C de la enfermedad del mono) obtenida en el Ejemplo de preparación 4 y la suspensión se dispensó en el pocillo a una concentración de 5 x 105 células/pocillo. Se añaden a cada pocillo células RPE derivadas de B-iPS de mono normales o células RPE derivadas de C-iPS del modelo de enfermedad del mono obtenidas en el Ejemplo de preparación 3 a 1 x 104/pocillo y se cultivaron, en el que la suspensión sin adición se utilizó como control. Después del cultivo durante 48 h, se recupera el sobrenadante del cultivo y se mide la concentración de IFN-y en el sobrenadante del cultivo mediante ELISA.
Se realiza un método similar al método mencionado anteriormente, excepto que se usa una suspensión de células T CD8 positivas (modelo C de la enfermedad del mono) en lugar de células T CD4 positivas y se mide la producción de Granzima B en lugar de IFN-y.
En el caso de células RPE derivadas de B-iPS de mono normales, las cantidades de producción tanto de IFN-y como de Granzima B aumentan en comparación con el control, mientras que en el caso de células RPE derivadas de C-iPS del modelo de enfermedad del mono, las cantidades de producción tanto de IFN-y como de Granzima B se suprimen en comparación con el control.
prueba de trasplante
Las células RPE derivadas de B-iPS de mono normales o células RPE derivadas de C-iPS del modelo de enfermedad del mono se trasplantan a un ojo del modelo C de enfermedad del mono, según el método descrito en Invest Ophthalmol Vis Sci. Feb.1995; 36 (2): 381-90. El día 28 después del trasplante, se obtiene una imagen de una sección del fondo de ojo como una sección de tejido utilizando una fotografía de fondo de ojo y OCT (tomógrafo de coherencia óptica), y se confirma el estado de la retina.
El trasplante alogénico de células RPE derivadas de B-iPS de mono normales muestra claras respuestas de rechazo, tales como cambio fibrótico de la periferia del injerto, pérdida de fluorescencia por angiografía del fondo de ojo con fluoresceína y lesión de alta intensidad debajo de la retina en OCT. El trasplante alogénico de células RPE derivadas de C-iPS del modelo de enfermedad del mono no muestra dicha respuesta de rechazo tan clara, no hay pérdida de fluorescencia por angiografía del fondo de ojo con fluoresceína, se injerta el injerto y no se producen trastornos tales como reducción de la retina sensorial y similares.
(Ejemplo 10)
prueba de predicción
Se lleva a cabo un método similar al del Ejemplo 8, excepto que se utilizan células RPE derivadas de A-iPS de mono normales (homocigotas en 3 loci génicos de MHC) obtenidas en el Ejemplo de preparación 3 o células RPE derivadas de C-iPS del modelo de enfermedad del mono a una concentración de 1 x 104/pocillo, y se mide la cantidad de producción de IFN-y.
Se realiza un método similar al método mencionado anteriormente, excepto que se usa una suspensión de células T CD8 positivas (modelo C de enfermedad del mono) en lugar de células T CD4 positivas y se mide la producción de Granzima B en lugar de IFN-y.
Tanto en células RPE derivadas de A-iPS de mono normales como en células RPE derivadas de C-iPS del modelo de enfermedad del mono, las cantidades de producción tanto de IFN-y como de Granzima B se suprimen en comparación con el control.
prueba de trasplante
Se realiza un método similar a la prueba de trasplante del Ejemplo 8, excepto que se utilizan células RPE derivadas de A-iPS de mono normales (homocigotas en 3 loci génicos) o células RPE derivadas de C-iPS del modelo de enfermedad del mono como células RPE derivadas de iPS, las células RPE derivadas de iPS se trasplantan a un ojo de un modelo C de enfermedad del mono. El día 28 después del trasplante, se obtiene una imagen de una sección del fondo de ojo como una sección de tejido utilizando una fotografía de fondo de ojo y OCT (tomógrafo de coherencia óptica), y se confirma el estado de la retina.
El trasplante alogénico de células RPE derivadas de A-iPS de mono normales (homocigotas en 3 loci génicos) no muestra una respuesta de rechazo clara, como el trasplante autólogo de células RPE derivadas de C-iPS del modelo de enfermedad del mono, ausencia de pérdida de fluorescencia por angiografía de fondo de ojo con fluoresceína , el injerto está injertado y no se producen trastornos tales como la reducción de la retina sensorial y similares.
Aplicabilidad industrial
Según la presente invención, sin embargo, cuando el genotipo de 3 loci génicos de HLA-A, HLA-B y HLA-DR en el lado del donante es homocigoto en el trasplante de células RPE, el rechazo se puede suprimir simplemente haciendo coincidir uno de los loci de HLA del receptor. Dado que las células inmunológicamente incompatibles para el trasplante pueden distinguirse y seleccionarse mediante la recogida previa de muestras de sangre, la carga para los pacientes puede reducirse evitando las células incompatibles para el trasplante. Las células seleccionadas por este método se pueden utilizar para el trasplante de células RPE. Por tanto, la presente invención contribuye a una mejora notable de la eficacia del tratamiento mediante trasplante alogénico, y también proporciona efectos tales como la reducción de los costes de preparación de células no adecuadas para trasplante y similares.
Esta solicitud se basa en la solicitud de Patente No. 2014-032325 presentada en Japón (fecha de presentación: 21 de febrero de 2014).

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un método para seleccionar un agente terapéutico para la desnaturalización de la retina o una enfermedad asociada con la desnaturalización de la retina para un paciente con desnaturalización de la retina o la enfermedad asociada con la desnaturalización de la retina, que comprende
(i) una etapa para examinar los genotipos del locus del gen HLA-A, el locus del gen HLA-B y el locus del gen HLA-DR de las células T derivadas del paciente,
(ii) una etapa para seleccionar una célula epitelial del pigmento retiniano que tiene un alelo que coincide con el alelo en cada locus génico clarificado en la etapa (i),
en el que la célula epitelial del pigmento de la retina en la etapa (ii) tiene un locus del gen HLA-A, un locus del gen HLA-B y un locus del gen HLA-DR, y un genotipo de cada locus es homocigoto.
2. El método según la reivindicación 1, en el que la desnaturalización de la retina o la enfermedad asociada con la desnaturalización de la retina es degeneración macular relacionada con la edad, retinitis pigmentosa, retinopatía diabética o desprendimiento de retina.
3. Una célula epitelial del pigmento de la retina para su uso en el tratamiento alogénico de la desnaturalización de la retina o una enfermedad asociada con la desnaturalización de la retina en un paciente con desnaturalización de la retina o una enfermedad asociada con la desnaturalización de la retina,
en el que la célula epitelial del pigmento de la retina tiene un locus del gen HLA-A, un locus del gen HLA-B y un locus del gen HLA-DR y cada locus tiene un genotipo homocigoto; y
el paciente tiene una combinación en la que al menos uno de los alelos en cada locus del gen correspondiente es el mismo que un alelo que es homocigoto en el locus del gen HLA-A, el locus del gen HLA-B y el locus del gen HLA-DR de la célula epitelial del pigmento retiniano.
4. La célula epitelial del pigmento retiniano para su uso según la reivindicación 3, en la que la célula epitelial del pigmento retiniano se deriva de una célula madre pluripotente.
5. La célula epitelial del pigmento de la retina para su uso según la reivindicación 4, en la que la célula madre pluripotente es una célula iPS.
6. La célula epitelial del pigmento retiniano para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en la que la desnaturalización de la retina o la enfermedad asociada con la desnaturalización de la retina es degeneración macular relacionada con la edad, retinitis pigmentosa, retinopatía diabética o desprendimiento de retina.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018112510A1 (en) * 2016-12-22 2018-06-28 Hydra Light International Ltd Metal-air fuel cell
CN117597433A (zh) 2021-04-30 2024-02-23 国立研究开发法人理化学研究所 视网膜色素上皮细胞的条状聚集体、用于制造其的装置和制造方法、以及含有该条状聚集体的治疗药物

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2322854A1 (en) * 1998-03-05 1999-09-10 Jun Inoue Pharmaceutical composition for prophylaxis and therapy of diseases associated with ocular fundus tissue cytopathy
US7794704B2 (en) 2004-01-23 2010-09-14 Advanced Cell Technology, Inc. Methods for producing enriched populations of human retinal pigment epithelium cells for treatment of retinal degeneration
CN101715485A (zh) 2007-04-06 2010-05-26 国际干细胞公司 源于人单性生殖胚泡的患者特异性干细胞系
BRPI0914422A2 (pt) 2008-06-25 2017-03-21 Inserm (Institut Nat De La Sante Et De La Rech Medicale) métodos para preparar substitutos de pele humana a partir de células tronco pluripotentes
IL301479A (en) 2009-11-17 2023-05-01 Astellas Inst For Regenerative Medicine Methods for preparing human RPE cells and pharmaceutical preparations of human RPE cells
CN107937341A (zh) 2011-02-25 2018-04-20 国立研究开发法人理化学研究所 视网膜色素上皮细胞片层的生产方法
KR102254082B1 (ko) 2012-08-24 2021-05-18 고쿠리쓰 겐큐 가이하쓰 호징 리가가쿠 겐큐소 망막 색소 상피 세포 시트의 제조 방법

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