CN101903515B - 包含人血清的无饲养物多能干细胞培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了培养和维持多能干细胞的组合物和方法。更特别地，本发明提供了在还含有促进细胞粘附的人血清或人血清的可溶性粘附组分的无饲养物(feeder)确定培养基中培养、维持、生长和稳定灵长类多能干细胞的组合物和方法。
Description
联邦研究资助的致谢
本发明至少部分受到NCRR(5R24RR021313-05)资助。因此，美国政府对本发明具有一定权利。
发明背景
发明领域
本发明通常涉及用于培养多能干细胞和／或癌干细胞的组合物和方法，其包括含有人血清的确定培养基。
发明背景
胚胎干(ES)细胞是一种强大的模式系统，可用于多能细胞生物学和早期胚胎内分化潜在机制的研究，以及提供哺乳动物遗传操作的机会和所得的商业化、医药和农业应用。而且，ES细胞的适宜增殖和分化可以潜在地用于生成适宜于移植以治疗由细胞损伤或功能障碍引起的疾病的无限源细胞。其它多能细胞和细胞系包括如国际专利申请WO99／53021所述的早期原始外胚层样(EPL)细胞，体内或体外衍生的ICM／上胚层，体内或体外衍生的原始外胚层，原生殖细胞(EG细胞)，畸胎癌细胞(EC细胞)，和由去分化或核移植衍生的多能细胞，将共享某些或所有这些特性和应用。国际专利申请WO97／32033和美国专利第5,453,357号描述了包括来自非啮齿类物种的细胞的多能细胞。在国际专利申请WO00／27995和美国专利第6,200,806号描述了人ES细胞，而在国际专利申请WO98／43679描述了人EG细胞。
迄今为止，仅报导了几种分离和生长灵长类干细胞的次优方法。例如，使用添加了白血病抑制因子(LIF)的无饲养物(feeder)培养，将鼠科胚胎干细胞维持在未分化状态。另一方面，当细胞在无饲养物细胞层或来自适宜饲养物细胞系的条件培养基下培养时，即使存在LIF，人胚胎干细胞也会分化。采用饲养物细胞(或来自饲养物细胞培养物的条件培养基)的系统通常使用来自不同物种的细胞而不是正培养的干细胞，例如在大部分报道的人胚胎干细胞未分化生长中，小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)会形成饲养层(feeder layer)。而且，无饲养物系统的报道通常需要使用来自MEF培养物的条件培养基，其不能满足非异种产物/试剂的需要。甚至采用人饲养物细胞的系统具有将未分化细胞暴露于不确定培养条件下的缺陷，因此许多干细胞培养条件通常是不可再现的。
此外，对于大多数细胞疗法，治疗需要极大量的多能干细胞。根据使用埃德蒙顿方案的胰岛移植所需的细胞数量，所需的分化细胞估计量在109-1010细胞/患者的数量级。而且，取决于hES衍生分化靶细胞，未分化hESCs的数量可能在更高数量级。
因此需要鉴定培养、稳定和大规模生产治疗目的的均一种群的灵长类多能干细胞的方法和组合物，其中培养组合物是确定的和/或按GMP标准生产的。
在下文具体描述的本发明提供了使用未暴露或源于非人类的试剂，培养未分化hESCs的方法和组合物，从而提供更安全的培养基。
发明概述
本发明提供了用于支持未分化干细胞长期培养的确定培养基的组合物和方法。该培养基基本上是无饲养物的(即不需要饲养物细胞或饲养物细胞条件培养基)，且基本上不含任何基质涂层(matrix coating)。
因而，一方面，本发明涉及用于培养干细胞包括未分化多能干细胞的确定培养基。在溶液中，相对于正培养的干细胞，该培养基基本上是等渗的。在给定的培养中，特定培养基含有基础培养基和一定量的多种基本上支持胚胎干细胞未分化生长的因子。在优选实施方式中，基础培养基含有盐，必需氨基酸，可被灵长类干细胞代谢的碳源，和人血清。所有这些成分都按基本上支持灵长类干细胞未分化生长的量来提供。
在一实施方式中，本发明提供了无饲养物灵长类多能干细胞组织培养组合物，其包含未分化的人胚胎干细胞(hESC)，含有人血清(hS)的确定培养基，其中人血清还含有至少一种具有至少100kDa分子量的可溶性粘 附组分，其中该组合物本质上无饲养物细胞。
在另一实施方式中，本发明提供了无饲养物灵长类多能干细胞组织培养组合物，其包含未分化的人胚胎干细胞(hESC)，含有人血清(hS)或其可溶性粘附组分的确定培养基，其中人血清还含有至少一种具有至少100kDa分子量的可溶性粘附组分，其中该组合物本质上无饲养物细胞。
在又一实施方式中，本发明提供了在无饲养物确定培养基中培养灵长类胚胎干细胞的方法，其是通过在可支持干细胞的培养基中培养灵长类胚胎干细胞，该培养基基本上无饲养物细胞并还包含约0.5％-约2％的人血清，培养步骤进行超过一个月，在培养中胚胎干细胞增殖而维持干细胞分化成内胚层、中胚层和外胚层组织的衍生物的潜能，并维持胚胎干细胞的核型。
本文将更具体地描述本发明的这些和其它实施方式。
本发明的每个限制可包括本发明的多种实施方式。因此预期涉及任一元素或元素组合的本发明的每个限制可包括在本发明的每个方面。本发明的应用不限于以下说明书所列出的或附图所解释的具体构建和组分排布。本发明可以有其它实施方式和以多种方式实践或执行。
本文所用的措辞和术语是为描述的目的而不应认为是限制。本文所用的“包括”，“含有”，或“具有”，“包含”，“涉及”，和其变体，表示包括其后所列的项目和其等效物以及其它项目。
附图简要说明
图1A-图1E显示了在0-3代(p0-p3)和第1-4天(d1-d4)，在包含多种浓度人血清的确定培养基中多能干细胞培养物的显微图象。
图2是包含RT-PCR结果的琼脂糖凝胶显微图象，其使用了多能hESCs的OCT4,NANOG,REX1,SOX2,UTF1,CRIPTO,FOXD3,TERT,DPPA5AFP,MSX1和HAND1细胞标志物(2-11道，从左到右)和分化的hES-衍生细胞(12-14道)。
图3描述了在多能hESCs(67代；1道，左)、d3定形内胚层培养物(2,4和5道)和d5前肠内胚层培养物(3和6道)中SOX17、HNF1B和HNF4A的标准化、相对表达。
发明详述
Stojkovic et al.(Stem Cells Express(干细胞表达)(2005)Stem Cells23：895-902，2005年5月11日在线原始出版)描述了人血清用作无饲养物条件下人胚胎干细胞(hESCs)生长的基质。该方法涉及室温下以人血清(hs)涂布平板1小时，之后去除过量的血清并将平板在室温下干燥1小时。人血清是源于男性凝固血，通过FDA批准的检验，检验发现对乙型肝炎表面抗原成阴性，抗丙型肝炎病毒，和抗HIV／HIV-2。hESC的再接种也应该使用血清预涂平板。在一些实施方式中，人血清与hESC-dF-条件培养基一起使用。条件培养基源于成纤维细胞样细胞培养物，其来源于自发分化的hESCs，如Stojkovic et al所述的。
如以下更具体描述，本发明提供了用于在确定培养基中且缺乏基质、饲养层或平板涂层下培养、维持和生长均一和未分化灵长类多能干细胞的组合物和方法。
定义
除非另外指出，本文所用术语应按照相关领域普通技术人员的常规用法来理解。除了以下提供的术语定义之外，分子生物学中常用术语的定义也可查询Rieger et al.，1991 Glossary of genetics：classical and molecular,5th Ed.(经典和分子遗传学词汇，第5版)，Berlin：Springer-Verlag；and in Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验方案)，F.M.Ausubel et al.，Eds.，Current Protocols(现代实验方案)，Greene Publishing Associates，Inc.和John Wiley & Sons，Inc.的合资企业(1998增补)，或任何基于网络的词典。应该理解的是，如说明书和权利要求书中所用的，“一个／种”可表示一个／种或多个／种，这取决于其所在的上下文。因而，例如涉及“一个／种细胞”可表示可利用至少一个／种细胞。
如本文所用的，术语“接触”(即将细胞例如可分化细胞与化合物接触)意在包括在体外一起孵育化合物和细胞(例如，添加化合物至培养细胞中)。应理解与确定培养基接触的细胞可以以细胞分化环境进一步处理，以稳定细胞，或分化细胞。
如本文所用的，术语“稳定”，当用于涉及细胞或细胞培养物的分化状态时，表示该细胞将继续增殖多代，这发生在培养中，并优选不确定地培养中，其中，培养物中的大部分(如果不是所有)细胞处于相同的分化状态。此外，当稳定细胞分裂时，分裂通常产生相同细胞类型的细胞或产生相同分化状态的细胞。稳定细胞或细胞种群通常不会进一步分化或去分化，如果细胞培养条件不改变且细胞继续传代并不过度生长。在一实施方式中，被稳定的细胞可以在稳定状态下不确定地增殖，或至少大于2代。在一更具体实施方式中，细胞稳定大于3代，4代，5代，6代，7代，8代，9代，大于10代，大于15代，大于20代，大于25代，或大于30代。在一实施方式中，细胞稳定继续传代大于大约1个月，2个月，3个月，4个月，5个月，6个月，7个月，8个月，9个月，10个月，或11个月。在另一实施方式中，细胞稳定继续传代大于大约1年。在一实施方式中，通过在确定培养基中常规传代使干细胞在多能状态下维持培养，直至希望它们分化。如本文所用的，术语“增殖”是指细胞培养中细胞数量的增加。
因此，如本文所用的，术语“生长环境”是干细胞(例如灵长类胚胎干细胞)在体外增殖的环境。环境的特征包括培养细胞的培养基，和(如果存在)支持结构(例如在固定表面上的基底)。
“确定”培养基是指仅含有生物化学确定组成物的生物化学上确定的配方。确定培养基可仅包括具有已知化学组成的组成物。确定培养基还可包括衍生自已知来源的组成物。例如，确定培养基还可包括由已知组织或细胞分泌的因子和其它组合物；然而，确定培养基不包括来自这些细胞培养物的条件培养基。因而，如果标明，“确定培养基”可包括添加以形成培养基的特定化合物。
如本文所用的，术语“基础培养基”是指可有效支持培养细胞生长的氨基酸、维生素、盐和营养素的溶液，尽管通常地，这些化合物并不支持细胞生长除非添加了其它化合物。营养素包括可被细胞代谢的碳源(例如糖如葡萄糖)，以及细胞存活必需的其它化合物。存在细胞自身不能合成的化合物，这是由于缺乏编码合成该化合物(例如必需氨基酸)所必需蛋白的一个或多个基因，或与细胞可以合成的化合物相关，因为它们的 特定的发育状态，编码必需生物合成蛋白的基因不按足够水平表达。许多基础培养基是哺乳动物细胞培养领域所已知的，例如达尔贝科改良依格培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)(DMEM)，敲除-DMEM(KO-DMEM)，和DMEM／F12，尽管可采用在基本上不分化状态下支持灵长类胚胎干细胞生长的任何基础培养基。本文所述的“基础培养基”也是指2007年6月13日提交的PCT／US2007／062755所述的基础培养基，将其全文并入本文。
基础培养基可包含或不包含“外源胰岛素或胰岛素替代物”，其是指并非有意加入本发明的组合物或方法中的胰岛素或胰岛素替代物。因而，在本发明的特定实施方式中，方法和组合物不含有意提供的胰岛素或胰岛素替代物。然而，组合物或方法可以不必不含内源胰岛素。如本文所用的，“内源胰岛素”表示根据本发明方法培养时，培养细胞自身可产生胰岛素。内源胰岛素也可用于表示来自原代细胞培养物的残留杂质或来自起始材料的杂质。在特定实施例中，本发明的组合物和方法包含小于50，45，40，35，30，25，20，15，10，9，8，7，6，5，4，3，2，1，0.5，0.25，0.1μg／ml的胰岛素，或基本上不包含胰岛素。
需明确的是，术语“胰岛素”是指在正常生理浓度下与胰岛素受体结合和可通过胰岛素受体诱导信号转导的蛋白，或变体或其片段。术语“胰岛素”包括具有天然人胰岛素或其它哺乳动物胰岛素的多肽序列、或这些序列的任意同源物或变体的多肽序列的蛋白。此外，术语胰岛素包括能够结合胰岛素受体以通过胰岛素受体诱导信号转导的多肽片段。术语“胰岛素替代物”是指可用于替代胰岛素以提供基本上与胰岛素类似结果的任何含锌化合物。胰岛素替代物的实例包括但不限于氯化锌，硝酸锌，溴化锌和硫酸锌。
还需明确的是，胰岛素样生长因子不是胰岛素替代物或胰岛素同源物，如本发明所涉及的。因此，在另一具体实施方式中，本发明的组合物和方法包括使用至少一种胰岛素样生长因子(IGF)或其变体或功能片段。在另一实施方式中，本发明的组合物和方法不含任何外源胰岛素样生长因子(IGFs)。在具体实施方式中，本发明的组合物和方法包含小于200，150，100，75，50，25，20，15，10，9，8，7，6，5，4，3，2或 1ng／ml的IGF-1。
确定培养基和／或基础培养基可包括“非必需氨基酸”，其是指对于给定细胞类型而言不需要加入培养基的氨基酸物质，因为通常细胞会合成，或能够合成特定氨基酸物质。虽然物质之间不同，但是非必需氨基酸已知包括L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸和L-丝氨酸。
确定培养基和／或基础培养基也可包括多种生长因子，因此本文所述确定培养基中可包括或不包括的术语“生长因子”是指有效促进干细胞生长的物质，并且除非作为补充剂加入培养基中，否则其不是基础培养基的组分。换言之，生长因子是正培养细胞(包括任何饲养物细胞，如果存在)不分泌的分子，或如果是由培养基中细胞分泌的，其分泌量不足以实现外源加入生长因子所获得的结果。生长因子包括但不限于碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、胰岛素样生长因子-II(IGF-II)、血小板衍生生长因子-AB(PDGF)、和血管内皮细胞生长因子(VEGF)、激活素-A、和骨形态发生蛋白(BMPs)、细胞因子、炎症趋化因子、形态发生素、中和抗体、其它蛋白和其它分子，包括但不限于PCT／US07／062755所述的神经生长因子，通过参考将其全文并入本文。本文所述的确定培养基基本上也不包含胰岛素或缺乏实质量的胰岛素。
本文所述的培养条件是“等渗”，该术语是指与相比较的另一溶液具有本质上相同张性(即有效渗透压当量)的溶液。在细胞培养中，“等渗”培养基是可以在无可见净水流通过细胞膜下培养细胞的培养基。
此外，本文所述的培养条件是具有“低渗透压”的溶液，其是指具有小于约300毫渗摩尔每千克(“mOsm／kg”)的渗透压的溶液。
尽管本发明不采用条件培养基，但如本文所述的短语“条件培养基”是指还添加了来源于培养基中所培养细胞的可溶性因子的生长培养基。从细胞培养物中分离条件培养基的技术是本领域公知的。应该理解的是，条件培养基优选本质上不含细胞。在该语境中，“本质上不含细胞”是指与其所分离自的培养物相比，包含比每单位体积细胞数量小约10％，优选小约5％、1％、0.1％、0.01％、0.001％和0.0001％的条件培养基。但是， 应考虑到技术人员可“基本上去除”一种或多种可检测的条件培养基组分。例如，技术人员可从条件培养基中去除一定量的可检测已知组分，这与未分级的条件培养基相比，形成分级的条件培养基。可通过适宜去除可检测组分的任何方法(或方法的组合)实施条件培养基的分级，所述方法例如凝胶过滤层析、亲和层析、免疫沉淀、大小排阻装置等。
“可分化细胞”用于描述这样的细胞或细胞群，其可分化成至少部分成熟细胞，或可参与可分化成至少部分成熟细胞的细胞的分化、例如与其它细胞融合。如本文所用的，“部分成熟细胞”是表现出来自相同器官或组织的成熟细胞的至少一种表型、例如形态或蛋白表达的特征的细胞。
如本文所用的可分化细胞可以是多能、多向(multipotent)、寡能或甚至单能的，如下文具体定义。在本发明的特定实施方式中，可分化细胞是多能可分化细胞。在更具体实施方式中，多能可分化细胞选自ICM／上胚层细胞、原始外胚层细胞、原生殖细胞和畸胎癌细胞。
本发明也考虑了来自动物体内任何来源的可分化细胞，只要该细胞如本文所定义是可分化的。例如，可从胚胎，或其中的任何原生胚层，从胎盘或绒毛膜组织，或从更多成熟组织例如成人干细胞包括但不限于脂肪、骨髓、神经组织、乳房组织、肝组织、胰腺、上皮、呼吸、性腺和肌肉组织收获可分化细胞。在具体实施方式中，可分化细胞是胚胎干细胞。在另一具体实施方式中，可分化细胞是成人干细胞。在又一具体实施方式中，干细胞是胎盘或绒毛膜源的干细胞。
当然，本发明考虑使用来自于能够生成可分化细胞的任何动物的可分化细胞，例如胰腺型细胞如β细胞。从其收获可分化细胞的动物可以是脊椎动物或无脊柱动物、哺乳动物或非哺乳动物、人或非人。动物来源的实例包括但不限于灵长类、啮齿类、尖牙类、猫科动物、马类、牛类和猪类。
可使用本领域技术人员已知的任何方法衍生本发明的可分化细胞。例如，可使用去分化和核移植方法产生人多能细胞。此外，可在体内或体外衍生本发明所用的人ICM／上胚层细胞或原始外胚层细胞。如WO99／53021所述，可在贴壁培养中或以悬浮培养中的细胞团块生成原始外 胚层细胞。而且，可使用本领域技术人员已知的任何方法使人多能细胞传代，包括人工传代法，和容积传代法例如酶或非酶传代。
如本文所用的，术语“分化”是指产生比其所源自的细胞类型更分化的细胞类型。因此该术语包括部分和终末分化的细胞类型。
在本发明的某些实施方式中，术语“富含”是指包含至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％所需细胞谱系的细胞培养物。
如本文所用的，术语“基本上未分化”的细胞培养物是指包含至少约50％、优选至少约60％、70％或80％、甚至更优选至少约90％未分化干细胞的干细胞群。荧光活化细胞分选法可用于测定给定干细胞群中有多少细胞是未分化的，所述分选法使用一个或多个指示所需未分化状态的标志物的标记抗体或报告基因/蛋白(例如，增强绿色荧光蛋白[EGFP])。为进行这种评估，可检测与未分化状态相关的一个或多个细胞表面标志物(例如SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81)，以及典型的多能干细胞转录因子标志物，Oct-4。也可检测端粒酶逆转录酶(TERT)活性和碱性磷酸酶。对于灵长类干细胞，阳性和／或阴性选择可用于例如通过免疫染色或采用报告基因(例如EGFP)，检测某些标志物(例如Oct-4、SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81、SSEA-1、SSEA-3、巢蛋白、端粒酶、Myc、p300和Tip60组蛋白乙酰转移酶和碱性磷酸酶活性)的表达(或其缺乏)或某些翻译后修饰(例如乙酰化组蛋白)的存在，由此促进细胞自我更新或分化状态的评估。此外，本文所述的未分化细胞通常具有本领域熟知的干细胞形态。
“多能”是指能够分化成多种不同细胞类型(尽管不一定是所有细胞类型)之一的细胞。因而，会认识到，当多能细胞可分化成多向细胞和其它更分化细胞类型时，逆分化的过程(即去分化)可能更复杂并需要“再编程”细胞变得更原始，这表示再编程之后，它具有分化成与再编程之前所可能的相比更多种的或不同的细胞类型的能力。
“全能”是指这样的细胞，其能够分化成任何细胞类型包括多能、多向和完全分化细胞(即细胞不能再分化成多种细胞类型)，非限制性地例如，胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓干细胞、造血干细胞、心肌细胞、神经元、星形细胞、肌细胞和结缔组织细胞。
如本文所用的，“多向细胞”包括细胞和它们的后代，其可能能够分化成或产生多向、寡能和单能祖细胞，和／或一种或多种成熟或部分成熟细胞类型，除了源自多向细胞的成熟或部分成熟细胞类型限定于特定组织、器官或器官系统的细胞。例如，多向造血祖细胞和／或其后代拥有分化成或产生一种或多种寡能细胞类型，例如骨髓祖细胞和淋巴祖细胞，以及产生血液中通常存在的其它成熟细胞组分的能力。“寡能细胞”包括能够分化成成熟或部分成熟细胞的细胞和它们的后代，所述分化能力比多向细胞更受限。然而，寡能细胞仍可拥有分化成寡能和单能细胞，和／或给定组织、器官或器官系统的一种或多种成熟或部分成熟细胞类型的能力。寡能细胞的一个实例是骨髓祖细胞，其最终可产生成熟或部分成熟红细胞、血小板、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和单核细胞。“单能细胞”包括拥有分化成或产生其它单能细胞和／或一种类型的成熟或部分成熟细胞类型的能力的细胞和它们的后代。
此外，“正常”干细胞是指不表现出异常表型或具有异常基因型，从而可以产生可由这种干细胞衍生的全范围细胞的干细胞(或其后代)。对于全能干细胞，例如该细胞可产生例如健康的完整、正常的动物。相反的，“异常”干细胞是指由于例如一个或多个突变或基因修饰或病原体而不正常的干细胞。因此，异常干细胞不同于正常干细胞。
另外，尽管本发明不采用组织培养容器涂层或基质，例如“细胞外基质”，如本文所用的“细胞外基质”或“基质”是指为支持细胞生长提供基本相同条件的一种或多种物质，其如由饲养物细胞合成的细胞外基质所提供。基质可在基底上(例如纤维连接蛋白、胶原、MATRIGELTM等)提供。
如本文所用的，术语“饲养物细胞”或“饲养物细胞层”是体外生长并与靶细胞共培养的、例如与干细胞共培养的细胞。如本文所用的，术语“本质上无饲养物细胞”或“无饲养物”和其等同物是指不包含有意加入的饲养物细胞的组织培养条件。此外，当在培养物中不包含外源加入的取自饲养物细胞培养物的条件培养基，也无外源加入的饲养物细胞时，细胞培养物是“本质上无饲养物”，其中“无外源加入的饲养物细胞”表示待发育成饲养物细胞层的细胞尚未为此原因而有意导入。当然， 如果待培养的细胞来源于包含饲养物细胞的种子培养物，小部分这些饲养物细胞连同所需细胞(例如未分化灵长类干细胞)的偶然的共分离及之后被导入另一培养中不应视为有意导入饲养物细胞。在这种情况中，培养物包含最少量的饲养物细胞。通过“最少量”，表示从之前培养条件转移至目前培养条件的饲养物细胞数量，其中可分化细胞可已在饲养物细胞上培养。相似地，由播入培养物中的干细胞发育的饲养物细胞或饲养物样细胞不应视为有意导入培养物中的。
本发明包含还含有多种量的人血清的确定培养基，所述量例如约0.5％-约40％、约0.5％-约30％、约0.5％-约20％、约0.5％-约10％、约0.5％-约5％、约0.5％-约3％、约0.5％-约2％、约0.5％-约1％。但是，典型的确定培养基干细胞培养使用术语“本质上不含血清”，其指外源加入的血清。加入这种培养基的血清通常比本文所述的量更大。当然，如果正培养的细胞产生一些或所有血清组分，或如果待培养的细胞来源于在包含血清的培养基中生长的种子培养物，则少量血清(例如小于约1％)的偶然共分离和随后的导入另一培养中不应视为有意导入血清。
如本文所用的，术语“大小排阻装置”是指能够基于材料大小分离材料的过滤装置。这种装置的一个非限制性、示例性种类是过滤型类，其中通过允许小分子比较大分子更快通过的基质，基于分子量分离样品组分。通常地，过滤型装置特征在于表示能够通过基质的分子的分子量上限的截留分子量。通常，通过应用离心力(通过离心)或正压(例如在溶液或反应混合物上方应用气压或应用活塞)促使样品溶液或反应混合物通过分子量分离基质。在一些实施方式中，所提供的基质是膜。这类装置通常在上下室之间具有完整过滤材料。这类大小排阻装置的实例是商业可供的Microcon300、100、50、30、3和Centricon3K、30K、50K、100K、和300K(均来自Millipore)，和可供的10K、30K、100K和300k截留的Nanosep(均来自Pall Corp.)。Microcon和Centricon单元是相同装置，但可用的溶液体积是不同的。另外还可供用于同时处理许多样品的96孔板。使用这种多样品孔板使纯化过程更简单。因而，在一些实施方式中，“大小排阻装置”含有多孔、大小辨别屏障，其允许更小的分子(例如小于预定的截留分子量，如以上示例的)通过而同时阻滞更大分子(其具有大于截 留的分子量)。例如，这种装置可以是超滤装置，其含有多孔膜，例如所述类型的Microcon或Centricon过滤装置类型。可选择大小排阻装置的截留分子量以阻滞所需组分，并允许非所需物种通过。因而，这种实施方式是通过阻滞可以瞬时陷于颗粒孔的较大分子而较小分子随大量洗脱液通过以致较小分子先洗脱而起作用的。在一些实施方式中，大小排阻装置具有300K的截留、或100K的截留、或30K的截留。然而应认识的是，本方法中可采用具有任何适宜截留的大小排阻装置。
本文所述方法包括将细胞平板接种在贴壁培养中。如本文所用，术语“平板接种的”和“平板接种”是指允许细胞在贴壁培养中生长的任何过程。如本文所用的，术语“贴壁培养”是指一种细胞培养系统，借此细胞培养在固体表面上，可以依次对其涂布不溶性基底，对于该基底可以依次涂布基底的另一表面涂层(如以下所列的那样)，或允许培养的细胞增殖或稳定的任何其它化学或生物材料。细胞可以或可以不紧密粘附在固体表面或基底上。贴壁培养的基底可包括MATRIGELTM聚鸟氨酸、层粘连蛋白、聚赖氨酸、纯化胶原、凝胶、纤连蛋白、肌腱蛋白、玻连蛋白、巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、聚乙醇酸(poly glycolytic acid)(PGA)、聚乳酸(PLA)、以及聚乳-乙醇酸(PLGA)中的任一种或组合。而且，贴壁培养的基底可包括由饲养层铺设的、或由多能人细胞或细胞培养物铺设的基质。
如本文所用的，短语“可溶性粘附组分”或“可溶性粘附剂”或其等同物是指人血清包含的可溶性组分，例如多肽，其功能是促进多能干细胞粘附在基底上，例如促进多能干细胞粘附在塑性组织培养容器上。可溶性粘附组分是至少100kDa、至少150kDa、至少200kDa、至少250kDa、或至少300kDa或更大，并保持悬浮或溶解在溶液中。即，这种可溶性粘附组分不是用来涂布组织培养容器的，因此不会形成通常所理解的在灵长类干细胞培养中的基质涂层的基础。
如本文所用的，术语“组织培养容器”或“组织培养塑体(plastic)”或其等同物是指目前已知的或之后发现的，常用于培养和生长干细胞的任何和所有容器。例如，一些组织培养容器具有带底壁的基和由所述底壁向上延伸成的多个侧壁，跨所述侧壁延伸并与底壁相对的盖。可选地， 所述盖可形成为具有至少一个开口和跨所述开口延伸而允许通过另一装置进入所述容器内部的隔膜。而且，许多组织培养容器通常是具有多个在相对的顶部和底壁之间延伸的直立侧壁的棱形(例如生物反应器)。通常构建侧壁以致容器的长度和宽度超过高度。因此，容器的底壁确定了相对于容器体积的相对大的表面积。通常在容器的一个侧壁形成管形颈以提供进入内部的入口。颈的外表面可形成具有多列螺纹用于接受螺帽。因而，本领域技术人员应认识到本发明和使用包含hS的培养基以促进细胞粘附在组织培养或组织培养样容器的基、底或侧壁上，包括许多和潜在的所有组织培养容器，不依赖形状，大小和体积。
还可参照以下具体描述的本发明优选实施方式和本文所包括的实施例以便更容易地理解本发明。但是，公开并描述本发明组合物和方法之前，需理解本发明并不限于具体核酸、具体多肽、具体细胞类型、具体宿主细胞、具体条件、或具体方法等，当然这些是可以变化的，并且对于本领域技术人员而言，其众多修改和改变都是显而易见的。
生长、增殖和维持多能干细胞的确定培养
本发明描述了使用确定培养基的方法和确定培养基组合物，这在2007年6月13日提交的PCT／US2007／062755中首先描述过，将该申请全文并入本文。
在将hESC技术引导至临床中，一个待处理的关键问题是在hESCs的培养和维持中缺乏标准化。在缺乏小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层时，许多研究者依赖“条件化(conditioning)”，其中首先将培养基暴露于MEFs以获得支持培养的未分化hESCs繁殖的可溶性因子。难以辨别MEF条件化如何使得hESCs维持在未分化状态下。最近发展的hESC培养条件的其它常见特征包括存在FGF2，缺乏血清，和存在血清替代物例如敲除血清替代剂(KSR-Invitrogen,专有配方)或无异种成分(Xeno-free)的敲除血清替代剂(XFKSR-Invitrogen,专有配方)。表明具有支持hESCs维持作用的其它因子包括TGFβ1、激活素A(ActA)、PDGF和鞘氨醇-1-磷酸盐、BIO、GSK3β的小分子抑制剂和神经营养因子。已经描述了几种用于hESCs的确定培养基系统，它们是基于FGF2与节点、TGFβ1、GABA、 哌可酸、外加氯化锂、Wnt3a加April／BAFF、或N2／B27补充剂的组合。当这些研究关注于鉴定支持未分化hESCs增殖的生长因子和条件时，对于在hESCs暴露于自我更新所偏爱的条件下时被激活的细胞表面受体知之甚少，
在PCT／US2007／062755中描述了支持hESC自我更新的确定培养基的方法和组合物，并将其全文通过引用并入本文。使用确定培养基的益处在于，培养基所含成分都是已知的并具有已知量。相反的，非确定培养基具有某些复合成分，其是由未知比例的许多许多化学物质的混合物的组成。采用化学上确定培养基的原因也是实际的，因为这种培养基可在不同时间在不同实验室再现。确定培养基可用可控方式改变，并且不含可能影响所研究反应的未知生物活性，例如酶和可选地生长因子。
本发明的组合物和方法可用于培养细胞、特别地可分化细胞。应理解的是，在培养可分化细胞期间的不同点，可在细胞培养中加入多种成分以便培养基可包含除本文所述那些之外的组分。
组合物和方法含有基础盐营养溶液。如本文所用的，并如全文并入本文的PCT／US2007／062755所描述的，基础盐营养溶液是指盐混合物，其可向细胞提供正常细胞代谢必需的水和某些大无机离子，维持细胞内外的渗透压平衡，提供碳水化合物作为能量源，并提供缓冲体系以维持培养基在生理pH范围内。基础盐营养溶液的实例包括但不限于达尔贝科改良依格培养基(DMEM)、最小必需培养基(MEM)、基础依格培养基(Basal Medium Eagle)(BME)、RPM1 1640、Hams F-10、Ham’s F-12、β-最小必需培养基(βMEM)、格拉斯格最小必需培养基(G-MEM)和伊斯科夫改良达尔贝科培养基(Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium)、和其混合物。在一特定实施方式中，基础盐营养溶液是大约50：50的DMEM和Ham′s F12的混合物。
在一实施方式中，本发明的组合物和方法提供了可溶性粘附因子或试剂。这种细胞粘附允许细胞粘附并形成单层，但是在缺乏饲养层或基底涂层例如基质涂层，MATRIGELTM等下。优选地，采用人血清以提供无动物环境。人血清可从任何商业供应者的组织培养产品中获得，实例包括Gibco-Invitrogen Corporation(Grand Island，N.Y.USA)，Sigma(St. Louis Mo.，USA)和ATCC(Manassas，Va.USA)。本发明所用的血清浓度范围是大约0.1％-约20％、更优选大约0.1-约3％、更优选大约0.5-约2％、更优选大约0.5-约1.5％、且更优选大约0.5-大约1％。
在本发明的另一方面，人血清是使用微流体大小排阻装置分级的。多种过滤用的微流体装置都是商业可供的。装置可用于例如凝胶过滤，大小排除过滤，离子交换过滤，或这些过滤技术的组合。例如过滤材料可装载在和／或包含在装置中，并可包含过滤材料的微球。可以使用可阻滞水性样品的更小分子同时允许样品的更大分子通过或绕过的大小排除材料。例如，可使用Bio-Rad的P-10BIO-GEL材料，其是由平均颗粒大小直径为45-100μm的丙烯酰胺颗粒组成的。可通过微流体装置经重力压力差异、或例如向心力处理样品。然后可分析、使用从装置中洗脱的所得滤过物，或之后将其通过装置进行后续处理阶段。在本发明的一方面，大小排阻装置具有300KDa截留、或100KDa截留、或30KDa截留的离心分离柱(spin-offcolumn)、例如Microcon离心分离柱。
根据本发明的其它方面，过滤器适应材料可被“压入适应”至相关室中，置于相关室中，或定位于相关室中。
在本发明的另一方面，凝胶过滤材料可布置在微流体装置通道中。可通过移液至装置输入开口和／或通过使用例如应用在装置的输入开口的真空力将材料吸入装置中，来将凝胶过滤材料装载到装置中。可以通过经装置的输入开口加压装载凝胶过滤材料使凝胶过滤材料分散在装置的通道或室中，来以凝胶过滤材料填充装置的通道。一旦通道填充了水合凝胶过滤材料，可离心装置以使凝胶过滤材料脱水并“装紧”凝胶过滤材料，形成纯化柱。这个过程可用于制备样品过滤装置并用于从凝胶过滤材料中去除非必需或过量的水或缓冲液。
因而，需认识到通常具有任何适宜过滤材料和／或试剂并具有任何适宜截留分子量的微流体大小排阻装置可用于本发明中；本文所述的组合物和方法并不限于所述装置。
本发明的组合物和方法也可包括至少一种FGF受体激活剂，包括任何FGF多肽，其功能性片段或其变体。本发明的组合物和方法可包括血清白蛋白(SA)，例如牛SA(BSA)或人SA(HSA)，至少一种不溶性基底。 例如，可分化细胞可置于含有但不限于聚苯乙烯和聚丙烯的这类化合物的细胞培养物表面上。
本发明不同于其它确定培养条件，其中组合物和方法包括增殖多能干细胞，其基本上无饲养物细胞或层，或“无饲养物”，或通过从饲养物细胞培养物中收集培养基产生的条件培养基。此外，本发明的组合物和方法不要求多能干细胞在任何基底上增殖和生长，所述基底包括涂布了细胞外基质组分(即单独或不同组合的胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸类肝素等)，或MATRIGELTM的任何基底。本文所提供的人血清浓度足以促进细胞粘附并促进未分化多能干细胞生长和增殖。
在一实施方式中，将可分化细胞与至少一种缺乏饲养物细胞层的本发明组合物接触，以便细胞维持在未分化状态至少一(1)至十二(12)个月或更久。通过与表面标志物、转录标志物、核型和分化成三胚层细胞的能力相关的细胞表征，可测定多能性。这些特征是本领域技术人员公知的。
所涉及的是，可以在与本发明确定培养基接触之前和／或之后，使用酶、非酶、或人工解离方法使可分化细胞传代。酶解离方法的非限制性实例包括使用蛋白酶例如胰蛋白酶、胶原酶、中性蛋白酶和ACCUTASETM。在一实施方式中，将ACCUTASETM用于传代所接触细胞。当使用酶传代方法时，所得培养物可含有单细胞(singlets)、双细胞(doublets)、三细胞(triplets)和依赖所用的酶而大小变化的细胞团块的混合物。非酶解离方法的非限制性实例是细胞分散缓冲液。人工传代技术是本领域公知的，例如在Schulz et al.，2004Stem Cells，22(7)：1218-38中。传代方法的选择受其它培养条件的影响，包括但不限于饲养物和／或细胞外基质；尽管本发明不期望这两种。
本发明方法中所用的解聚溶液可以是任何解聚溶液，其能够使细胞分开或解聚成单个细胞，且不会对细胞造成大量毒性。解聚溶液的实例包括但不限于胰蛋白酶、ACCUTASETM、0.25％胰蛋白酶／EDTA、TrypLE、或VERSENETM(EDTA)和胰蛋白酶。本发明的方法不需要使汇合层的每个细胞解聚成单细胞，如果至少少数单细胞被解聚并能够再培养。
本发明的组合物和方法事实上可包含以上所列的或本文其它地方所 述的(例如PCT／US2007／062755)组分的任何组合。如本领域技术人员所认为的，本发明的组合物和方法的组分可根据方案设计而变化。因此，本发明的一实施方式涉及在96孔板和／或384孔板或在更大容器包括生物反应器、细胞工厂或其它可获得的或由本领域技术人员设计的自动化、符合GMP、专业化装置中培养可分化细胞。因而，本发明的方法不限于特定的培养箱尺寸。
本发明的培养方法包括在生长环境中培养干细胞例如灵长类胚胎干细胞，所述生长环境是本质上无饲养物的，并且包括本发明所述的确定的、等渗培养基且缺乏基质。这种确定的、等渗培养基包含将干细胞(例如多能干细胞)维持在基本上未分化状态(或它们的功能等同物)所要求的必需组分。可在这种环境下在任何适宜培养容器中，在允许维持未分化状态的条件下培养细胞。
使用这种方法，可从所得细胞培养物中分离干细胞群，包括基本上未分化的灵长类干细胞，由此表示本发明的另一方面。可通过任何适宜技术分离这些群。这种技术包括亲和层析、淘洗和荧光辅助细胞分选。这些技术每个采用一种或多种分离试剂(例如但不限于抗体和抗体片段，报告基因／蛋白等)，所述试剂对指示未分化状态的细胞基标志物是特异的。这种标志物包括但不限于例如转录因子Oct4，和细胞表面标志物SSEA-4，Tra-1-60和Tra-1-81。其它标志物包括端粒酶、Myc、p300、和Tip60组蛋白乙酰转移酶、乙酰化组蛋白和碱性磷酸酶和典型干细胞形态。
鉴定能够促进多能干细胞生长和／或分化的因子／试剂的方法
本发明的另一实施方式涉及使用干细胞以鉴定促进细胞分化、或可选地细胞持续维持和稳定在基本上未分化状态下的因子的方法。简而言之，对于分化或维持基本上未分化状态，这种方法包括例如将检验化合物暴露于在本发明确定的、等渗培养基中培养的基本上未分化的灵长类胚胎干细胞。暴露于检验化合物之后，评估细胞以测定它们是较好地维持在基本上未分化状态还是被诱导分化。如果细胞较好地维持在基本上未分化状态下，可以将检验化合物鉴定为促进灵长类多能干细胞的未分化状态或自我更新的化合物。如果细胞被诱导分化，可以将检验化合物 鉴定为促进基本上未分化灵长类多能干细胞的分化的化合物。分化细胞之后可以测定它们的发育命运，换而言之，测定它们因分化所变成的细胞谱系。对于去分化，将更分化状态的细胞暴露于一种或多种化合物，然后对其评估，以测定暴露是否获得比最初暴露于该检验化合物的那些具有更原始类型的细胞(例如多能干细胞)。如果是这样的话，产生该效果的化合物被鉴定为促进细胞的去分化、或再编程的化合物。优选地，以高通量的方式进行本发明所述的这些和其它筛选方法，以便可同时筛选众多化合物。
由可分化细胞分化的细胞类型在不同研究和发展领域具有多种用途，包括但不限于药物发现，药物开发和检验，毒理学，治疗目的的细胞生产以及基础科学研究。这些细胞类型表达了广泛研究领域感兴趣的分子。这些包括如标准参考文献所述的已知行使多种细胞类型的功能所需的分子。这些分子包括但不限于细胞因子、生长因子、细胞因子受体、细胞外基质、转录因子、分泌多肽和其它分子、和生长因子受体。
应该理解的是，通过本发明所述方法培养干细胞所提供的益处之一是减少和避免了对干细胞外源的病原体或抗原对干细胞的污染。当使用来自不同物种或来自相同物种的不同和非相关个体的饲养物细胞时，可发生这种类型的污染。本发明的方法意在尽可能避免进一步检验干细胞系(包括病原体含量的检验)。在一些实施方式中，预期人干细胞和／或它们的分化后代可被移植到遗传相关个体而无需提前检验一些或所有病原体含量。
适当地，在冻存之前或之后检验细胞系的基因型和组织相容性单元型。基因型检验是指在一个或多个分辨率水平下，测定干细胞系的基因型。不一定要在单个核苷酸分辨率下测得细胞系的基因型。相反，基因分型仅需在允许普通技术人员确定干细胞系与其任何预期受体之间的相似性的分辨率水平下进行。基因分型可按多种方式进行，包括但不限于限制性片段长度多态性(RFLP)、单核苷酸多态性(SNPs)等。
也可检验细胞系和／或它们后代的组织相容性单元型；或确定它们是“正常”还是“异常”干细胞。组织相容性单元型是在组织相容性基因位点(loci)上的一组等位基因，该位点是免疫系统用来辨别自我和非我(即 外源)组织和／或细胞。对于人，主要组织相容性(MHC)位点是由在6号染色体短臂上的四个位点所组成的。人也具有一组次要组织相容性位点。例如，对多种移植物例如造血细胞移植物常实施人白细胞抗原(HLA)分型。主要和次要组织相容性抗原存在于细胞表面并作为细胞或组织来源的指示物通过免疫系统被识别。通过宿主抗移植物免疫反应，被视为外源的细胞或组织通常被受体所排斥。但是，有时可以使用例如免疫抑制药物例如但不限于环孢菌素A、FK506、纳巴霉素、环磷酰胺(CY)、丙卡巴肼(PCB)和抗胸腺细胞球蛋白(ATG)，来克服组织相容性的某些差异，特别地次要组织相容性位点的差异。此外，某些组织对例如在人HLA位点上的差异是较不易感。这些组织包括但不限于肝、肾和中枢神经系统。最近报道了胚胎干细胞具有免疫赦免(immune privileged)特性(Li et al.Stem Cells 2004 33：448-456)。
试剂盒
本发明还涉及试剂盒，其中该试剂盒包含基础盐营养溶液和至少一种能够刺激ErbB2-定向的酪氨酸激酶活性的化合物。在一实施方式中，试剂盒包含至少一种ErbB3配体，其如本文所述。在另一实施方式中，试剂盒包含多于一种的ErbB3配体。在另一实施方式中，试剂盒包含如本文所述的TGF-β或TGF-β家族成员或其变体或功能性片段中的至少一种。在又一实施方式中，试剂盒包含TGF-β或TGF-β家族成员或其变体或功能性片段中的多于一种。在再一实施方式中，试剂盒包含至少一种的成纤维细胞生长因子或其变体或功能性片段。在另一实施方式中，试剂盒包含多于一种的成纤维细胞生长因子或其变体或功能性片段。在特定实施方式中，试剂盒包含FGF-7、FGF-10、FGF-22或其变体或功能性片段中的至少一种。在另一实施方式中，试剂盒包含血清白蛋白。在又一实施方式中，试剂盒包含血清和／或至少一种如本文所述的不溶性基底和／或至少一种解聚溶液。
本发明的试剂盒事实上可包含以上所列或本文其它地方所述的组分的任何组合，其包括但不限于所述的含有人血清或其高分子量部分的确定培养基。如本领域技术人员所认识的，本发明试剂盒提供的组分可根据试剂盒的预定用途而变化。因而，可将试剂盒设计成实施本申请所列的多种功能并且这类试剂盒的组分会相应变化。
在本申请中，引用了多篇出版物。所有这些出版物的公开内容和这些出版物内所全文引用的参考文献都通过引用其全文并入本申请，以便更充分地描述本发明所属领域的状态。
实施例
实施例1
未分化多能干细胞在含有少量人血清的无饲养物培养中的增殖
为阐明符合管理临床安全性和效应的预期调控规范的培养基和细胞培养条件，申请人提供了hESC扩大策略，其符合以下具体描述的要求。在无饲养物、不含条件培养基和不含基质的培养基中长期培养未分化hESCs对于为基于细胞的疗法提供无限细胞供应、以及指导hESCs的系谱特异性分化是至关重要的。
之前，确定了支持未分化hESCs长期生长所需要的最小必需条件。参见PCT/US2007/062755)。部分地基于形态学分析以及通过细胞表面标志物的表达和碱性磷酸酶分析评估了干细胞的发育阶段。
为建立无异种成分、无饲养物、不含条件培养基和不含基质的生长培养环境，使用了并入如本文和PCT/US2007/062755所述的确定培养基的培养系统。此外，为维持不含非人动物产物、但促进细胞结合或粘附或铺设在塑体上和生长的培养条件，使用人血清。将使用人饲养物细胞在GMP条件下分离的NIH-注册的BG01、BG02和BG03hESC系、以及CyT49、hESC系(Novocell,San Diego,CA)在包含约0.5-2％人血清(hS)的确定培养基中于37℃培养约12-24小时。可选地，在温室下，将hES细胞接种至不含血清的培养基的组织培养盘，然后加入hS至大约1-10％终浓度。大部分商业可供类型的人血清都是可以使用的，例如ALBUMARC人血清用于本文所述的某些hESC培养物。ALBUMARC是美国红十字血液服务中心(American Red Cross Blood Services)人血清的注册名。值得注意的是，未分化hESCs生长并维持在非被涂层的组织培养容器中。所用的hS量促进细胞粘附到组织培养塑体上，以致不需要用例如ECM、纤连蛋白、胶原和/或MATRIGELTM等来涂布组织培养容器。也可采用增加 浓度的hS，例如将高达20％的hS用于培养和维持hESC培养物。
去除基质要求提供了更有效的细胞培养和生长。常规以ACCUTASE传代细胞培养物。在组织培养平板上接种大约12-24小时之后，hESCs表现出形态正常。而且，使用标准G带显技术对hS和在确定培养基上生长的hESCs进行核型分析。
为确定hS是热敏感性还是热不稳定性，以及它是否影响hESC生长，首先将hS加热至大约50-60℃约20-60分钟，然后加入浓度大约0.5-2％的确定培养基。在该培养基中的hESCs增殖不明显，接种后大约1-3天之后大部分死亡。因而，hS的细胞粘附促进组分是热敏感性的，并且在大约50-60℃下活性会明显降低且hESCs不会存活。由于hS中的一种或多种可溶性粘附因子的热敏感性(其可变为热失活的)，hESCs很可能不会存活。这些可溶性粘附因子的热失活预防了多能干细胞粘附至塑体上，其粘附促进了hESCs的生长和维持。
为进一步确定这些可溶性粘附因子的大致大小，假设hS中的特定部分负责加强hESCs的生长和增殖。为确定是哪一部分，使用多种大小排阻装置，例如Microcon300K、100K和30K截留离心分离柱对hS分级。使用这些截留离心分离柱允许某些分子量蛋白通过并作为洗脱或阻滞部分被收集。然后在包含基本上如上所述的多种阻滞部分中的一种的确定培养基中培养hESCs。来自300K和100K截留离心分离柱的阻滞部分表现出包含特定可溶性粘附因子和/或试剂，其促进未分化hESC生长和增殖。未分化hESC生长和增殖与来自300K和100K截留离心分离柱的多种阻滞部分一致，这不依赖于(非热处理的)hS的商业源。因而，这些能够保留在300K至100K截留离心分离柱的阻滞部分中的可溶性粘附因子是很重要的并能够促进生长和增殖。
图1A-图1E是在具有不同量人血清的未涂层组织培养容器的确定培养基中生长的hESCs(BG02细胞)的图像。图1A是在未涂层组织培养容器中的包含1％全血清DC-HAIF中生长4天之后的hESCs图像。将细胞与加1％hS的DC-HAIF孵育大约24小时然后以DC-HAIF替换培养基。图1B是在包含1％hS的DC-HAIF中生长1天之后的hESC图像，hS是在300K截留离心分离柱中部分分级的(使用阻滞部分)。图1C是在包含 约0.7％hS的DC-HAIF中生长4天之后的hESC图像，hS是在100K截留离心分离柱中部分分级的(使用阻滞部分)。图1D是在包含约0.7％hS的DC-HAIF培养基中生长1代和3天之后的hESC图像，hS是在100K截留离心分离柱中部分分级的(使用阻滞部分)。图1E是在DC-HAIF和约1％hS中培养的连续传代(2代)群的hESC图像，hS是在100K截留离心分离柱中部分分级的(阻滞部分)。
此外，为确定在这些培养条件下的hESCs连续传代对干细胞形态是否有影响，将未分化hESCs连续传代大约2、3、4、5、6、7、8、9和10次等。分裂成单细胞的未分化hESCs还可以基本上如所述的生长和增殖。借助显微镜，所有培养物表现出正常形态。相反地，当使用全hS对未分化hESCs连续传代时，相对于使用如上所述阻滞部分传代的hESC，在hESC培养物的形态质量上有所劣变。然而，为恢复典型的hESC细胞形态，可使用100K截留离心分离柱通过过滤大约20％hS部分地纯化hS，然后将收集的洗脱/阻滞部分稀释回原始体积。因而，本文所述的hS的分级极大地避免了连续传代hESC形态质量的劣变。这在大约0.5-1.0％的hS浓度下也可观察到。
为证实在以上所述确定的不含生物制品培养条件下所维持的未分化hESCs的自我更新，对hESCs进行酶处理，并将其解离成单细胞悬浮液，然后在基本上如上所述的确定条件下进行培养。在体外大约4、5、6和7天之后，开始显现出未分化的成熟大小的单细胞衍生的hESC群落。
平板接种效率可与PCT/US2007/062755所述的在DC-HAIF中培养的或使用MATRIGELTM作为ECM在DC-HAIF培养基中培养的hESCs上所观察到的相较。使用MATRIGELTM的平板接种效率明显高于使用MEF-CM或饲养物的效率。一个解释是，与其它饲养物和/或饲养物和基质类型培养相比，解离的单细胞有效地接种于包含hS的DC-HAIF或确定hESC培养基。
本实施例鉴定了将灵长类胚胎干细胞、特别是hESCs维持在能够延续传代以及随后定向分化的健康、未分化状态所必需的最小必需组分。已经辨别这些分子要求，使得衍生条件变得可能，所述条件允许用完全确定组成替换未充分表征和未指明的生物添加剂和基底(包括衍生自动物 的那些)。这种确定培养系统具有允许酶介导解离之后有效且稳定扩增hESCs的优势。因此，该研究提供了可行方法，所述方法为基于细胞的疗法提供大量供应的良好表征的、临床可接受的健康细胞。此外，已经建立了hESCs的未分化生长所需的单个组分，现在有可能更准确地评估其它生长因子和化合物对hESCs发育命运的影响。如所理解的，确定培养基对于为治疗目的使必要数量的多能hESCs有效地、均一地、稳定地且可再现地定向于特定谱系是至关重要的。此外，在具有1％100K人血清部分的DC-HAIF中维持10代的BG02细胞的FISH分析物显示出在人12号染色体(hChr12；98％两个拷贝，n＝591)和hChr17(98％两个拷贝，n＝578)上的正常计数。因此，在包含小量百分比人血清的培养基中的多能hESCs的自我更新不选择在hESCs中通常观察到的非整倍体。
实施例2
使用100K人血清部分的HESCS的长期自我更新
为了可用，任何hESC培养基必须能够支持长期或延长的细胞自我更新，即持续数代。为证实本文所述的含hS DC-HAIF培养基可支持hESCs的长期或延长自我更新，将hESCs在具有约1％100k人血清阻滞部分的DC-HAIF中培养。为确保hESCs维持它们的多能性且不自发分化成不同细胞谱系，使用本领域公知的用于描述和鉴定多能干细胞和/或分化的干细胞衍生谱系的细胞标志物进行RT-PCR分析。对6代和10代之后的hESC培养物实施RT-PCR。对于对照培养物，仅在确定培养基中53代之后实施RT-PCR(图2)。图2显示来自第6(中间插图)、第10(底部插图)和第53(顶部插图)代的培养物中表达典型多能干细胞标志物，例如OCT4、NANOG、REX1、SOX2、UTF1、CRIPTO、FOXD3、TERT和DPPA5的表达。相反地，在这些培养物中未检测到分化的干细胞衍生系谱的典型标志物例如α-胎蛋白(AFP)、MSX1、HAND1。因而，这些数据表明了在具有人血清的DC-HAIF培养基中生长的hESCs促进了多能hESCs的长期或延长的自我更新且不促进向hES衍生的细胞系谱的自发分化。
实施例3
维持在包含100K人血清部分的确定培养基中的HESCS可分化成多种细胞谱系
为确定如本文所述培养的hESCs是否也可分化成多种hES衍生的细胞谱系，在体外将BG02细胞分化成hES衍生的细胞(图3)。首先将hESCs在使用100K截留离心分离柱分级的0.7％或1％hS中维持5-7天(3份)。然后分别在第5和第7天通过将培养物在包含2％的无脂肪酸BSA、25ng/ml Wnt3a、100ng/ml激活素A和8ng/ml FGF2的RPMI中暴露24小时，之后在包含2％BSA、100ng/ml激活素A和8ng/ml FGF2的RPMI中暴露另外两天(分化的第3天)，诱导hESCs分化成定形内胚层。通过将细胞在包含2％BSA、50ng/ml FGF7和0.25μM KAAD-环巴胺的RPMI中暴露另外约2-3天(分化的第6天)使定形内胚层细胞的进一步分化成前肠内胚层。通过如之前在D’Amour et al..2005,Nat.Biotechnol.23:1534-1541和D’Amour et al.,2006,Nat.Biotechnol.24:1392-1401所述的qPCR检测细胞培养物，并将该文献通过引用全文并入本文。
在分化的第三天检测hES衍生的细胞(定形内胚层)。图3显示了描述d3(定形内胚层，DE)和d5(前肠内胚层，FG)下多种细胞标志物的标准化表达水平的图。图3的顶部插图显示了在d3(定形内胚层)，SOX17表达明显增加；而在d5(前肠)样品中，HNF1B和HNF4A表达水平上调。在定形内胚层和前肠型hES衍生细胞中的SOX17、HNF1B和HNF4A表达水平与D'Amour et al.2005和2006(见上)描述的一致。
这些数据证实了所述的使用来自100K人血清部分的阻滞部分维持的无饲养物培养物可有效分化成多种hES衍生的细胞谱系，包括定形内胚层和前肠内胚层。
本说明书中所提到的所有专利和专利申请、出版物、科技文献和其它参考材料都指示本发明所属领域技术人员的技术水平，通过引用将每篇文献并入本文，如同单独地引用每篇参考文献全文而并入。
申请人保留在物理上将来自任意此类专利和专利申请、出版物、科技文章、电子可供的信息和其它参考材料或文件的任意和所有材料和信息并入本说明书的权利。
本文所述的方法、组合物和装置现代表优选实施方式并且是示例性 的，并非意在限制本发明的范围。在本发明的精神内所包括的并由公开内容的范围所确定的该处的变化和其它用途为本领域技术人员所理解。因此，对于本领域技术人员显而易见的是，可在不偏离本发明范围和精神下，对本文所公开的发明作出各不相同的替换和修改。
如以下权利要求书和全部本公开内容中所用，短语“本质上由……组成”表示包括短语之后所列的任何元素，还可包括不干扰或促成公开内容中所列元素指明的活性或作用的其它元素。因而，短语“本质上由……组成”表示所列元素是必需的或强制性的，但其它元素是任选的，并且依据它们是否影响所列元素的活性或作用而存在或不存在。
Claims (15)
1.无饲养物的灵长类多能干细胞组织培养组合物，其含有：
a)未分化的人胚胎干细胞，其中所述人胚胎干细胞是BG01、BG02或BG03细胞系；
b)支持其中所培养的人胚胎干细胞在未分化状态下增殖的确定培养基，其含有促进所述人胚胎干细胞粘附至基底的浓度为0.1％至20％的人血清或包含于所述人血清中的可溶性粘附组分，其中所述可溶性粘附组分通过分级富集并具有至少100kDa分子量，其中所述基底缺乏基质涂层或平板涂层。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述人血清处于所述培养基的0.5％－2％的浓度。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述可溶性粘附组分的大小选自至少100kDa、至少150kDa、至少200kDa、至少250kDa和至少300kDa。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述基底为组织培养容器。
5.在无饲养物培养基中培养灵长类胚胎干细胞的方法，其包括：
在可以支持其中所培养的人胚胎干细胞在未分化状态下增殖的培养基中培养所述灵长类胚胎干细胞，其中所述人胚胎干细胞是BG01、BG02或BG03细胞系，并且其中所述培养基含有促进灵长类胚胎干细胞粘附至基底的浓度为0.1％至20％的人血清或包含于人血清中的可溶性粘附组分，其中所述可溶性粘附组分通过分级富集且具有至少100kDa分子量，其中所述基底缺乏基质涂层或平板涂层，
由此促进未分化灵长类胚胎干细胞的增殖。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述培养基含有0.5％－2％的人血清或其可溶性粘附组分。
7.如权利要求6所述的方法，还包括富集至少一种胚胎干细胞可溶性粘附组分，所述可溶性粘附组分由通过分级富集的至少100kDa的组分组成。
8.如权利要求6所述的方法，还包括富集至少一种胚胎干细胞可溶性粘附组分，所述可溶性粘附组分由通过分级富集的至少150kDa的组分组成。
9.如权利要求6所述的方法，还包括富集至少一种胚胎干细胞可溶性粘附组分，所述可溶性粘附组分由通过分级富集的至少200kDa的组分组成。
10.如权利要求6所述的方法，还包括富集至少一种胚胎干细胞可溶性粘附组分，所述可溶性粘附组分由通过分级富集的至少250kDa的组分组成。
11.如权利要求6所述的方法，还包括富集至少一种胚胎干细胞可溶性粘附组分，所述可溶性粘附组分由通过分级富集的至少300kDa的组分组成。
12.如权利要求7-11任一项所述的方法，其中富集是通过使用大小排阻装置分级所述人血清。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述大小排阻装置具有300kDa的截留分子量。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述大小排阻装置具有100kDa的截留分子量。
15.在无饲养物的确定培养基中培养灵长类胚胎干细胞的方法，其包括：
在支持其中所培养的人胚胎干细胞在未分化状态下增殖的确定培养基中培养所述灵长类胚胎干细胞，其中所述人胚胎干细胞是BG01、BG02或BG03细胞系，所述培养基包含促进灵长类胚胎干细胞粘附至基底的0.5％－2％的人血清或包含于所述人血清中的可溶性粘附组分，其中所述可溶性粘附组分通过分级富集且具有至少100kDa分子量，以及其中所述基底缺乏基质涂层或平板涂层，进行培养步骤超过一个月，在培养中，所述灵长类胚胎干细胞增殖，而同时维持所述干细胞分化成内胚层、中胚层和外胚层组织衍生物的潜能，并同时维持所述干细胞的核型。
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