ES2370794B1 - Biomarcador de células cartilaginosas humanas. - Google Patents
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Abstract
Biomarcador de células cartilaginosas humanas.#La presente invención se refiere al uso de un biomarcador en la selección de células destinadas al trasplante, en concreto, un biomarcador de células precursoras del cartílago que comprende al menos un producto de expresión del gen susd-2 y sus derivados.
Description
Biomarcador de células cartilaginosas humanas.
Campo de la técnica
La presente invención se encuadra en el campo de la biomedicina y, más específicamente, de la ingeniería tisular y medicina regenerativa. En concreto, la presente invención se refiere al uso de un biomarcador en la selección de células destinadas al trasplante.
Estado de la técnica anterior
El cartílago es un tejido conectivo especializado, el cual posee una matriz flexible firme que resiste a las tensiones mecánicas. Participa en el sostén del cuerpo, por estar íntimamente asociado al sistema esquelético. El cartílago posee células llamadas condrocitos, que ocupan cavidades pequeñas llamadas lagunas dentro de la matriz extracelular que secretan. La matriz extracelular del cartílago no está vascularizada ni inervada, y no posee vasos linfáticos; sin embargo, las células reciben su nutrición a partir de los vasos sanguíneos de los tejidos conectivos circundantes y del líquido sinovial por difusión a través de la matriz. La matriz extracelular está compuesta por glucosaminoglucanos y proteoglucanos, íntimamente asociados con fibras de colágeno y elásticas embebidas en la matriz (Deiters y Prehm, Arthritis Res Ther. 2008; 10(1):R8).
Según las fibras que se encuentren en la matriz extracelular, existen tres tipos de cartílago (Finn y Geneser, 3ª ed., 2000):
- •
- Cartílago Hialino: La matriz extracelular es flexible y semitranslúcida, de color gris azuloso, rica en colágeno tipo II. Es el más frecuente del cuerpo. Se encuentra en nariz, laringe, extremos ventrales de las costillas (en los sitios en los que éstas conectan con el esternón), y en los anillos traqueales y bronquiales. Este cartílago forma el modelo cartilaginoso de muchos de los huesos durante el desarrollo embrionario, y constituye las placas epifisiarias de los huesos en crecimiento.
- •
- Cartílago Elástico: El cartílago elástico se encuentra en orejas, conductos auditivos externo e interno, epiglotis y laringe (cartílago cuneiforme). En casi todos los aspectos, el cartílago elástico es idéntico al cartílago hialino, y frecuentemente se relaciona con él. La capa fibrosa externa de pericondrio (tejido conectivo denso irregular, encargado del crecimiento y la regeneración del cartílago) es rica en fibras elásticas. La matriz del cartílago elástico posee abundantes fibras elásticas ramificadas que varían entre finas y gruesas, interpuestas con haces de fibras colágenos de tipo II, aportando mayor flexibilidad que la matriz del cartílago hialino. Los condrocitos del cartílago elástico son más abundantes y de mayor tamaño que los del cartílago hialino.
- •
- Fibrocartílago: Se encuentra en discos intervertebrales, sínfisis del pubis y discos articulares, e insertado en el hueso. Se encuentra asociado con cartílago hialino y con tejido conectivo denso. A diferencia de los otros dos tipos de cartílago, el fibrocartílago no posee pericondrio, tiene una cantidad escasa de matriz extracelular rica en condroitín sulfato y dermatán sulfato y presenta haces de colágeno tipo II. Los condrocitos suelen encontrase alineados en filas paralelas alternativas con los haces gruesos de colágeno.
Numerosas patologías pueden afectar al cartílago humano, siendo muy frecuentes las enfermedades de origen autoinmune, infeccioso, traumático o degenerativo, destacando por su elevada frecuencia la artrosis, la artritis y las úlceras de la superficie articular. Todas estas enfermedades presentan una altísima incidencia y suponen un gran gasto sanitario en nuestro medio.
Los tratamientos convencionales para la reparación del cartílago articular incluyen microfracturas, mosaicoplastias, y el uso de autoinjertos y trasplantes heterólogos. El trasplante autólogo de condrocitos ha surgido como una alternativa al tratamiento clínico convencional de los defectos cartilaginosos, siendo posible en muchos casos reducir el dolor y mejorar la función articular del paciente mediante el implante autólogo de condrocitos. Hasta el momento, la investigación en este campo se basa en el cultivo de condrocitos para su aplicación clínica como células en suspensión (ACI, autologous chondrocyte implant) o, más recientemente, para su cultivo sobre membranas biocompatibles, aplicándose al paciente como una membrana sobre la cual se cultiva una monocapa de células cartilaginosas (MACI, membrane autologous chondrocyte implant). Sin embargo no existe un tejido artificial óptimo para el crecimiento de dichos condrocitos.
Desde 1987, múltiples investigadores han desarrollado protocolos de cultivo e implante clínico de condrocitos cultivados en laboratorio en más de 12.000 pacientes (Marlovits et al., Eur J Radiol. 2006, 57(1):24-31), siendo los resultados muy variables de un estudio a otro. Mientras algunos ensayos sugieren que el uso de estas técnicas puede resolver los problemas articulares de forma muy efectiva, la mayoría de los estudios, incluyendo metaanálisis y trabajos de revisión, demuestran que la utilidad del implante autólogo de condrocitos es muy limitada. Probablemente, esto se deba a la baja densidad del tejido cartilaginoso formado o la insuficiente cantidad y calidad de las células implantadas en el paciente. En general, el cartílago generado tras el implante autólogo de condrocitos es rico en colágeno tipo I, con características bioquímicas y biomecánicas deficientes y muy distintas de las existentes en el cartílago nativo, rico en colágeno tipo II (Tuli et al., Arthritis Res Ther. 2003, 5(5):235-238). Este hecho podría deberse, con elevada probabilidad, a que las células utilizadas para la terapia celular del cartílago podrían presentar bajos índices de viabilidad celular o bien por el uso de células diferentes a condrocitos bien diferenciados y funcionales.
Numerosos investigadores han demostrado que las células adultas humanas tienden a desdiferenciarse y a perder funcionalidad cuando se mantienen en cultivo durante tiempos prolongados (Rodríguez-Morata et al., Ann Vasc Surg. 2008, 22(3):440-448; Alaminos et al., J Cell Physiol. 2007, 211(3):692-698). Del mismo modo, es muy frecuente encontrar células mesenquimales o conectivas contaminantes de los cultivos de condrocitos, especialmente los fibroblastos procedentes del pericondrio. Por ese motivo, es importante desarrollar métodos que permitan controlar los niveles de diferenciación de las células cultivadas para asegurar el uso de células bien diferenciadas en la terapia celular del cartílago y evitar el uso de células contaminantes. A pesar de ello, hasta la fecha no se han descrito marcadores suficientemente específicos de los condrocitos humanos, utilizándose hasta el momento criterios puramente morfológicos junto con la expresión de colágeno II o agrecán, compuestos existentes en la matriz extracelular del cartílago hialino maduro.
El gen sushi domain containing protein-2 (susd-2; número de acceso genbank AK026431), está conservado en mamíferos (chimpancé, perro, vaca, ratón, rata) aves (pollo) peces (pez cebra) e invertebrados (mosca de la fruta, mosquito y C. elegans). En humanos, el gen susd-2 está localizado en el cromosoma 22q11-q12. La expresión de SUSD2 no ha sido determinada hasta la fecha en células del cartílago humano o animal. La predicción de los niveles de expresión se puede llevar a cabo utilizando programas informáticos como e-Northern (Northern-Blot virtual), el cual indica que los niveles de ARNm podrían ser elevados en riñón y pulmón, pero no en cartílago (Gene-Cards, http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=SUSD2&search=SUSD2).
Para asegurar el éxito de la terapia celular con condrocitos autólogos, sería necesario contar con un marcador específico del condrocito humano que se exprese en la superficie o en el citoplasma de las células mantenidas en cultivo. Además, el campo de la técnica carece de una plataforma biocompatible que provea las condiciones óptimas para la regeneración del tejido cartilaginoso.
Explicación de la invención
La presente invención provee un nuevo biomarcador de condrocitos en cultivo que permite la identificación específica de las células de linaje cartilaginoso frente a otras células de estirpe mesenquimal o conectiva presentes en el cultivo. El uso del biomarcador de la presente invención junto con una plataforma de crecimiento específica para condrocitos optimiza la regeneración del tejido cartilaginoso.
Los inventores de la presente solicitud han descubierto que, sorprendentemente, el gen susd-2 se expresa en condrocitos humanos mantenidos en cultivo y por lo tanto se puede utilizar para diferenciar éstos de otros tipos de células mesenquimales y conectivas también presentes.
Así, un primer objeto de la presente invención es un biomarcador de células precursoras del cartílago caracterizado porque comprende al menos un producto de expresión del gen susd-2 o algún fragmento de al menos uno de ellos.
La presente invención facilita la selección de los condrocitos en cultivo mediante el análisis de los niveles de expresión del gen susd-2. Los productos de expresión de dicho gen pueden ser su ARN mensajero (ARNm; de ahora en adelante también SEQ ID No 1) o la proteína que codifica, denominada sushi domain containing 2 (SUSD2; de ahora en adelante también SEQ ID No 2). Según esto, en una realización preferida, el biomarcador de la presente invención comprende la SEQ ID No 1 o algún fragmento de esta. Así mismo, en otra realización preferida, el biomarcador de la presente invención comprende la SEQ ID No 2 o algún fragmento de esta.
Para determinar la expresión del biomarcador de la presente invención, se utilizan técnicas ampliamente conocidas en el campo de la técnica. Por ejemplo, la expresión del gen susd-2 en su forma de SEQ ID No1 se puede analizar mediante RT-PCR cuantitativa o microarrays de ARN. Mientras que para analizar la expresión en su forma de SEQ ID No 2 se utilizan técnicas de inmunohistoquímica, western-blot o microarrays de proteínas.
Tal como se ha mencionado anteriormente, la utilidad del biomarcador de la presente invención viene definida por proveer capacidad discriminatoria a la hora de seleccionar las células de un cultivo que realmente van a dar lugar a condrocitos maduros y funcionales una vez transplantados. Por esto, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del biomarcador de la presente invención en la selección de células in vitro destinadas al trasplante. En una realización preferida, el biomarcador de la presente invención se utiliza en la selección de células in vitro para la preparación de un implante celular. En otra realización preferida, el biomarcador de la presente invención se utiliza en la selección de células in vitro para la preparación de un tejido artificial.
Más preferentemente, el biomarcador de la presente invención se utiliza en un método de preparación in vitro de un tejido artificial que comprende un paso de selección in vitro de células en cultivo que expresan el gen susd-2.
Descripción de las figuras
Figura 1. Cuantificación del ARNm del gen susd-2 en diferentes tipos de cartílago así como en distintos tipos celulares. Los valores obtenidos se expresan en unidades de fluorescencia. Estos datos demuestran que la expresión del gen susd-2 es significativamente mayor en todos los tipos de cartílago en comparación con células procedentes de tejido epitelial y células mesenquimales.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.
Ejemplo 1
Cuantificación de los niveles de expresión del gen susd-2 en condrocitos en cultivo
El análisis se ha realizado cuantificando la expresión de susd-2 a nivel de ARNm utilizando microarrays comerciales de ARN de la casa comercial Affymetrix® (sistema Human-Genome U133 plus 2.0). Los resultados muestran que la expresión media de este gen en el cartílago humano es de 957,9 U.F. (unidades fluorescentes de la casa comercial Affymetrix®), siendo 1612,7 U.F. en el cartílago hialino humano y 303,1 U.F. en el cartílago fibroso (fibrocartílago). Estos valores son significativamente superiores (p<0.001) a los encontrados en otros tipos de células mesenquimales, incluyendo los fibroblastos de la mucosa oral y de la piel y las células madre mesenquimales de la gelatina de Wharton del cordón umbilical (media 85,6 U.F.) y en células epiteliales de la córnea y de la mucosa oral (media 29,6 U.F.) (Figura1yTabla 1).
Estos resultados demuestran que los condrocitos mantenidos en cultivo expresan cantidades significativamente superiores de ARNm del gen susd-2 a que otros tipos celulares tanto de tipo mesenquimal como de tipo epitelial, por lo que su cuantificación podría ser un útil biomarcador específico de condrocitos humanos para uso clínico.
Claims (7)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Biomarcador de células precursoras del cartílago caracterizado porque comprende al menos un producto de expresión del gen susd-2.
-
- 2.
- Biomarcador según la reivindicación 1 caracterizado porque comprende la SEQ ID No 1.
-
- 3.
- Biomarcador según la reivindicación 1 caracterizado porque comprende la SEQ ID No 2.
-
- 4.
- Uso de un biomarcador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la selección de células in vitro destinadas al transplante.
-
- 5.
- Uso según la reivindicación 4 en la selección de células in vitro para la preparación de un implante celular.
-
- 6.
- Uso según la reivindicación 4 en la selección de células in vitro para la preparación de un tejido artificial.
LISTA DE SECUENCIAS<110> Servicio Andaluz de salud<120> Biomarcador de células cartilaginosas humanas<130> FIBAO-69<160> 2<170> PatentIn version 3.5<210> 1<211> 3201<212> DNA complementario a ARN mensajero<213> Homo sapiens<400> 1ES 2 370 794 A1<210> 2<211> 822<212> PRT<213> Homo sapiensES 2 370 794 A1<400> 2ES 2 370 794 A1ES 2 370 794 A1OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCASN.º solicitud: 201030791ESPAÑAFecha de presentación de la solicitud: 25.05.2010Fecha de prioridad:INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA51 Int. Cl. : C12N5/077 (2010.01) A61K35/32 (2006.01)DOCUMENTOS RELEVANTES- Categoría
- Documentos citados Reivindicaciones afectadas
- A
- US 20030109038 A1 (R. SCOTT THIES) 12.06.2003, todo el documento. 1-6
- A
- US 20030235813 A1 (FRANK LUYTEN; COSIMO DE BARI; FRANCESCO DELL'ACCIO) 25.12.2003, todo el documento. 1-6
- A
- WO 0125402 A1 (TIGENIX N.V.) 12.04.2001, todo el documento. 1-6
- Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud
- El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº:
- Fecha de realización del informe 07.11.2011
- Examinador M. M. García Coca Página 1/4
INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICANº de solicitud: 201030791Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) C12N, A61K Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos debúsqueda utilizados) INVENES, EPODOCInforme del Estado de la Técnica Página 2/4OPINIÓN ESCRITANº de solicitud: 201030791Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 07.11.2011Declaración- Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)
- Reivindicaciones Reivindicaciones 1-6 SI NO
- Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)
- Reivindicaciones Reivindicaciones 1-6 SI NO
Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).Base de la Opinión.-La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.Informe del Estado de la Técnica Página 3/4OPINIÓN ESCRITANº de solicitud: 2010307911. Documentos considerados.-A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.- Documento
- Número Publicación o Identificación Fecha Publicación
- D01
- US 20030109038 A1 (R. SCOTT THIES) 12.06.2003
- D02
- US 20030235813 A1 (FRANK LUYTEN; COSIMO DE BARI; FRANCESCO DELL'ACCIO) 25.12.2003
- D03
- WO 0125402 A1 (TIGENIX N.V.) 12.04.2001
- 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaraciónEl objeto de la invención, tal y como se recoge en las reivindicaciones 1-6 es un biomarcador de células precursoras del cartílago que comprende al menos un producto del gen susd2 (reiv. 1-3). Es también objeto de la invención el uso de dicho biomarcador para la selección de células destinadas al trasplante, para la preparación de un implante celular y para la preparación de un tejido artificial (reiv. 4-6).Novedad y Actividad Inventiva (art. 6.1 y 8.1 Ley 11/1986 de Patentes).El documento D01 divulga un sistema para la obtención de células de primate que se han diferenciado de células pluripotentes a células precursoras de condrocitos. Estas últimas son identificadas por su habilidad de sintetizar colágeno tipo II y agrecán de forma endógena. Este documento también divulga un método para la obtención de estas células mediante un cultivo con factores que promueven la diferenciación a condrocitos de las células pluripotentes. En este documento también se describe un método para la producción de cartílago a partir de dichas células precursoras y una composición farmacéutica, que contiene dichas células, para la producción, la reparación, reconstrucción, o el mantenimiento del cartílago in vivo.El documento D02 divulga marcadores de células con fenotipo estable de condrocitos, que son utilizados para seleccionar y aislar dichas poblaciones celulares para la elaboración de composiciones terapéuticas útiles para la reparación de tejidos.El documento D03 divulga un método para aislar células precursoras y su uso para la reparación de tejidos. En este documento las células que son aisladas e identificadas son células precursoras de esqueleto, para lo que se usan distintos marcadores moleculares, como el CDMP-1. Las células que expresan dicho marcador pueden ser diferenciadas para dar lugar a cualquier tipo de tejido conectivo, incluido el cartílago (ver página 21 línea 4-página 22 línea 5). En este documento también se divulga el uso de estas células como implantes celulares para la reparación de cartílago (ver página 22 línea 6página 23 línea 1).En ninguno de los documentos mencionados del estado de la técnica, se relaciona el gen susd-2 con las células precursoras del cartílago. En dichos documentos se utilizan células pluripotentes o distintos tipos de células precursoras (no únicamente células precursoras de cartílago) que son cultivadas en medios que favorecen la diferenciación hacia condrocitos, para posteriormente utilizar dichas células para la regeneración de tejidos, o para implantes celulares en reparación de cartílago.Por lo tanto, ninguno de los documentos citados (D01-D03), tomados solos o en combinación, revelan la invención definida en las reivindicaciones 1-6. Además, en los documentos citados no hay sugerencias que dirijan al experto en la materia hacia la invención definida por dichas reivindicaciones. Así, la invención contenida en las reivindicaciones 1-19 es con referencia a los documentos D01-D03 nueva y se considera que implica actividad inventiva (art. 6.1 y 8.1 Ley 11/1986 de Patentes).Informe del Estado de la Técnica Página 4/4
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