JP2016535999A - 形質導入バッファー - Google Patents
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Abstract
Description
形質導入とは、外部環境から細胞内への分子の内在化である。少数のタンパク質およびペプチドは、細胞膜を透過し得る固有の特性を有する。他のタンパク質は、細胞の環境条件を変更することによって、または形質導入のために関心対象のタンパク質を改変することによって、それらにこの形質導入特性を付与させ得る。
本発明は、細胞に関心対象の分子を形質導入するための方法を提供し、該方法は、該細胞と関心対象の分子とを接触させる工程、ならびに該細胞と、塩および形質導入化合物を含む形質導入バッファーとを接触させる工程を含む。
効率的な形質導入には、形質導入バッファーにおける形質導入化合物の包含が必要とされる。ゆえに、本発明は、本明細書において記載される少なくとも1種の形質導入化合物を含むバッファーを提供する。
本明細書において記載される形質導入バッファーまたはプロトコール(例えば、上記で記載される第1のプロトコール、第2のプロトコール、第3のプロトコール、または第4のプロトコール)を用いて、ガレクチン-3-GFP(GAL3-GFP)融合タンパク質を発現するように改変されている細胞と、形質導入化合物候補とを接触させる工程;および
緑色蛍光発光によってGAL3-GFPの局在を観察する工程
を含み、
細胞内小胞へのGAL3-GFPの局在は有効な形質導入化合物の指標である。
式中、
Xは、NR1R2、NR1R2R3+、OH、およびCOOR4より選択され;
Yは、SO3H、SO3 -、COO-、CONH2、COOR12、CONR5R6、テトラゾール、OH、NR10R11、およびHより選択され;
nは、1、2、3、4、5、もしくは6であり;
R1、R2、およびR3はそれぞれ独立して、H、C1〜6アルキル、C5〜10アリール、C6〜15アラルキル、COR9より選択され、C1〜6アルキル、C5〜10アリール、およびC6〜15アラルキルは、RY、OH、もしくはCOOHで置換されていてもよいか、または
R1およびR2は、それらが結合している窒素と一諸になってヘテロシクリルを形成してよいか、または
XがNR1R2R3+である場合、R3は存在しなくてもよく、かつR1およびR2は、それらが結合している窒素と一諸になってヘテロアリールを形成してもよく;
R4、R5、R6、R9、R10、R11、R12は独立してHおよびC1〜6アルキルより選択され;
R7およびR8は独立してH、C1〜6アルキル、およびOHより選択されるか、もしくはR7は、R1と一諸になってヘテロシクリルを形成してもよく;
ヘテロシクリルは、可能な場合には、独立してN、NR13、NR13R14+、およびOより選択される1つもしくは2つの環員と、2〜5個の炭素原子とを含有する、飽和しているかもしくは部分的に不飽和である単環式環であり、ヘテロシクリルは、C1〜C6アルキル、C1〜C6カルボン酸、もしくは、RYで置換されたC1〜C6アルキルで置換されていてもよく;
ヘテロアリールは、可能な場合には、独立してN、NR13、NR13R14+、およびOより選択される1、2、もしくは3つの環員を含有する、5員もしくは6員の芳香環であり、ヘテロアリールは、C1〜C6アルキル、C1〜C6カルボン酸、もしくは、RYで置換されたC1〜C6アルキルで置換されていてもよく;
R13およびR14は独立して、H、C1〜6アルキル、C1〜C6カルボン酸、および、RYで置換されたC1〜C6アルキルより選択され;
アルキルは、直鎖のもしくは分岐した飽和炭化水素であり;
RYは、SO3H、SO3 -、COO-、CONH2、COOR12、CONR5R6、テトラゾール、OH、およびNR10R11より選択され;
C1〜6カルボン酸は、-COOH、もしくは、COOHで置換されたC1〜5アルキル鎖、ならびにそれらの互変異性体、溶媒和物、双性イオン、および塩を意味する。
式中、
Xは、NR1R2およびNR1R2R3+より選択され;
Yは、SO3H、SO3 -、COO-、CONH2、COOR12、およびCONR5R6より選択され;
R1、R2、およびR3はそれぞれ独立してH、および、OHもしくはCOOHで置換されていてもよいC1〜6アルキルより選択されるか、またはR1およびR2は、それらが結合している窒素と一緒になって、置換されていてもよいヘテロシクリル、好ましくはピペリジン、ピペラジン、もしくはモルホリンを形成してよいか、またはXがNR1R2R3+である場合、R3は存在しなくてもよく、かつR1およびR2は、それらが結合している窒素と一緒になって、置換されていてもよいヘテロアリール、好ましくはピリジルを形成してもよく;かつ
他のすべての基は、上記の式Iにおいて定義されるとおりである。
Xは、
であり;
Zは、C(R15)2、NR13、NR13R14+、およびOより選択され;
各R15は独立して、H、C1〜6アルキル、C1〜C6カルボン酸、および、RYで置換されたC1〜C6アルキルより選択され;
R3は、H、C1〜6アルキル、C5〜10アリール、C6〜15アラルキル、COR9より選択され、C1〜6アルキル、C5〜10アリール、およびC6〜15アラルキルは、RY、OH、またはCOOHで置換されていてもよく、好ましくはR3は-CH3であり;
R13およびR14は独立して、H、C1〜6アルキル、C1〜C6カルボン酸、および、RYで置換されたC1〜C6アルキルより選択される。
Xは、
であり;
Zは、CR15およびNR13+より選択され;
R15は、H、C1〜6アルキル、およびC1〜C6カルボン酸、および、RYで置換されたC1〜C6アルキルより選択され;
R13は、H、C1〜6アルキル、C1〜C6カルボン酸、および、RYで置換されたC1〜C6アルキルより選択される。
上述のように、形質導入化合物であることが見出された化合物の1つは、脳における重要な神経伝達物質であるγ-アミノ酪酸(GABA、化合物#20)であった。GABAは、GABA受容体、そのうち3つのクラスが同定されている:GABA-A、GABA-B、およびGABA-Cの活性化を刺激することによって作用する。GABA受容体は、エタノールおよびGABAそれ自身のような単純な構造から、一見無関係なベンゾジアゼピン、ムシモール、バクロフェンに及ぶ、極めて広範な化学構造によって刺激される。有効なタンパク質形質導入化合物の化学構造はある程度の自由も呈するため、本発明者らは、GABAシグナル伝達は、形質導入効果において積極的な役割を果たし得ると仮定している。実際、本発明者らは、塩および形質導入化合物(NDSB-201など)を含む形質導入バッファーへのGABAアゴニストの添加が、マウス胎仔線維芽細胞(MEF)へのβ-ラクタマーゼの形質導入の増加をもたらすことを見出した。ゆえに、GABAアゴニストを形質導入バッファー中に含めて、形質導入効率をさらに増強することができる。
本発明の形質導入バッファー中で使用するための塩は、本発明の状況で働く任意の塩、すなわち、形質導入化合物と組みわせた場合に、細胞への分子の形質導入を可能にする任意の塩である。
本発明者らは、本明細書において記載される方法による形質導入が、マクロピノサイトーシスを介して生じかつアクチン再構成を必要とすることを示した。ゆえに、これらのプロセスの特異的阻害物質は、形質導入を阻止し得る。
上記で定義される塩を適切な分量で形質導入バッファーに添加して、所望の重量オスモル濃度を達成する。形質導入バッファーの重量オスモル濃度は、浸透圧計を用いた当技術分野において公知の方法によって決定され得るか、または例えばバッファーの残りの容積を補充する培地の浸透圧が分かっている場合には算出され得る。ゆえに、塩を添加して、バッファーの重量オスモル濃度を所望のレベルに調整することができる(例えば、実施例6を参照されたい)。
形質導入バッファー中の塩は、形質導入法の間、形質導入バッファーが細胞に対して高張であるように、形質導入バッファーの重量オスモル濃度を増加させる。これは細胞への浸透圧ストレスを引き起こし得、かつある特定の状況において、これは細胞の増殖または生存率を低下させ得る(例えば、BrdU組み入れによって測定される。実施例の節を参照されたい)。本発明者らは、浸透圧保護剤の添加がこれらの影響を保護し得ることを見出した。
本明細書において記載される形質導入バッファーの追加成分のいずれかは、形質導入バッファーの一部であり得ると理解されるべきである。代替的に、それらは、形質導入の方法における工程として、任意の組み合わせで同時にまたは逐次的に細胞に添加され得る。
好ましい態様において、2個以上の関心対象の分子(すなわち、多コピーの関心対象の分子)を細胞に形質導入する。例えば、少なくとも2個、少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも50個、少なくとも100個、少なくとも500個、少なくとも1000個、少なくとも2000個、少なくとも5000個、少なくとも10,000個の関心対象の分子、少なくとも104個、少なくとも105個、少なくとも106個、少なくとも107個、または107個超の関心対象の分子を細胞に形質導入する。
形質導入法を用いて、初代細胞もしくは幹細胞(前駆細胞など、それらの誘導体を含めた)、通常の健常細胞、または罹患細胞を含めた任意の細胞に関心対象の分子を形質導入することができる。
好ましい態様において、本発明の形質導入バッファーおよび方法は、細胞の生存率に対して最小限の影響力を有する。細胞生存率は、形質導入された細胞の移植;研究モデルのための、遺伝子改変された胚を作製するための形質導入された細胞の使用;および研究などにおける形質導入された細胞の使用を含むがそれらに限定されない、形質導入された細胞の多くの適用にとって重要である(「本発明の使用」に関する節を参照されたい)。細胞生存率の1つの尺度は、細胞増殖である(例えば、実施例5で記載される、BrdU組み入れアッセイ法)。継続中の細胞増殖は、正常な細胞周期がなおも機能していることを実証している。
細胞に関心対象の分子を形質導入するために、関心対象の分子および細胞を、該分子が該細胞に形質導入するのに十分な長さの時間接触させる。
形質導入バッファーおよび方法の非限定的な例は、下記で提供されている。本明細書において記載される適合する態様の任意の組み合わせを、形質導入バッファー、または形質導入バッファーを含む形質導入のための方法に用いることができると理解されるべきである。組み合わせ可能な態様のいくつかの例は、下記で提供されている。
いくつかの態様において、本発明は、本発明の形質導入バッファー、および形質導入のための関心対象の分子を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、本発明は、形質導入バッファーを含む薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、関心対象の分子および形質導入バッファー成分は、同時にまたは逐次的に投与される。
本発明は、細胞に関心対象の分子を形質導入するための、形質導入バッファーの使用を提供する。
「含む(comprising)」という用語は、「含む(including)」ならびに「からなる(consisting)」を包含し、例えばXを「含む(comprising)」組成物は、もっぱらXからなり得るか、またはX+Yなどの追加の何かを含み得る。
細胞に小分子または高分子を導入し得る能力は、研究および医学において重要な適用を見出している。残念なことに、多くの生物学的活性分子の導入に対して、細胞膜が主な障害を提示している。細胞へのヌクレオチド(DNA、RNA、siRNA)および/または治療用分子の導入に対しては相当な努力が投入されており、かつ初代細胞はなおも課題を提起しているものの、膜貫通担体としてカチオン性脂質、ナノ粒子、またはウイルスベクターを用いることにより、進歩がなされている。比較すると、タンパク質の細胞内送達のための新規技術の開発は、事実上休止状態にある。それにもかかわらず、細胞にタンパク質を導入し得る能力は、ワクチン開発、ゲノム編集、エピジェネティックリプログラミング、(幹)細胞分化、および細胞内過程の操縦において多くの適用を有すると考えられる。したがって、とくに初代細胞における、タンパク質および他の高分子の効率的な細胞内送達のためのより良い技術の開発が非常に必要とされている。本明細書では、本発明者らは、塩により誘導される高張性、小分子化合物、および浸透圧保護剤の組み合わせが、細胞生存率に影響を及ぼすことなく、初代細胞への小分子および高分子の堅牢かつ効率的な導入を駆動することを記載する。本発明者らは、タンパク質、ヌクレオチド、ナノスフェア、および高分子が、多種多様な初代細胞、幹細胞株、およびそれらの誘導体においてどのように導入され得るかの例を提供する。
本発明者らは、タンパク質形質導入のためのより信頼できかつ効率的な方法を開発することを追求した。細菌毒素は、非常に高い効率で形質導入されるタンパク質であることが多いため、本発明者らは、そのような毒素システム(の一部)は、組換えタンパク質の送達のための輸送システムとして作用し得ると仮定した。この考えを試験するために、本発明者らは、転写調節因子OCT4(POU5F1)が、炭疽菌致死因子のN末ドメイン(LFn)に融合された場合に、細胞に形質導入され得るかどうかを解析した。この目的のために、本発明者らは、His精製タグ、LFn形質導入ドメイン、SUMO切断部位、ヒトOCT4、およびVP16トランス活性化ドメインからなる組換え融合タンパク質を作製した(図2A)。後者は、組換え因子の転写活性をさらに強化するために付加された。加えて、本発明者らは、LFn形質導入ドメインを欠く、またはLFn形質導入ドメインおよびSUMO切断ドメインを欠く対照構築物を作製した(図2A)。6リピートのoct4標的配列、それに続く最小限のTKプロモーターおよびホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するレポーター構築物をCOS7細胞にトランスフェクトすることによって、COS7レポーター細胞を作製した(図2B)。対照として、本発明者らは、Oct4結合部位を有しないルシフェラーゼレポーターベクターをCOS7に形質導入した(図2B)。トランスフェクション効率の変動を制御するために、本発明者らは、普遍的に発現するウミシイタケルシフェラーゼベクターをCOS7細胞に共トランスフェクトした(図2B)。形質導入のスケジュールを図2Cに示す。組換えLFn-OCT4-SUMO1-VP16タンパク質によるCOS7細胞の形質導入は、ルシフェラーゼレポーター活性の活性化をもたらした(図2D)。しかしながら予想外にも、LFn形質導入ドメインを欠く対照タンパク質の対照形質導入は、わずかにより良好な形質導入効率とまではいかないにしても、同程度であることを実証した(図2D)。加えて、LFn形質導入ドメインおよびSUMO切断ドメインを欠く対照タンパク質は、Oct4を発現するレンチウイルスベクターによる細胞の対照感染に匹敵する、COS7細胞への効率的な形質導入を実証した(図2D)。
タンパク質形質導入プロセスをさらに特徴決定するために、本発明者らは、形質導入プロセスに対する時間、重量オスモル濃度、形質導入化合物濃度、タンパク質濃度の影響を解析した。この目的のために、本発明者らは、β-ラクタマーゼタンパク質形質導入アッセイ法を準備し、かつ酵素によって切断された場合に発光波長を変化させる細胞内蛍光性β-ラクタマーゼ基質CCF2-AMを用いて、細胞内β-ラクタマーゼ活性を測定した(図3A)。それゆえ、発光蛍光の変化は、細胞内β-ラクタマーゼ活性の定量的尺度である。本発明者らは、本発明者らの初期調査において不死化COS7細胞株を用いたが、本発明者らは、化合物仲介によるタンパク質形質導入が、初代細胞へのタンパク質の形質導入も可能にするかどうかを知りたかった。そのため、本発明者らは、NaClにより調整された高張培地(700mOsm/Kg)および25mM NDSB201を用いて、マウス胎仔線維芽細胞(MEF)にβ-ラクタマーゼ(1μM最終濃度)を形質導入した。実験の開始時に、β-ラクタマーゼ活性を1に設定し、かつ相対的な細胞内β-ラクタマーゼ活性を時間の関数として測定した(図3B、バー)。対照として、β-ラクタマーゼ形質導入を、25mM NSDB201の存在下で等張培地中にて測定した(図3B、白丸)。図3Bに示されるように、これらの条件下において、タンパク質形質導入の開始の2.5時間後に、細胞内β-ラクタマーゼ活性を観察することができた。より長い形質導入時間は、細胞内β-ラクタマーゼ活性の増加をもたらした(図3B)。
本発明者らは、NaClにより誘導される高浸透圧およびNDSB201の組み合わせが、タンパク質の効率的な形質導入を可能にするが、それが細胞増殖および細胞生存に影響を及ぼすとも考えられ、かつ高い培地張度および/または高いNSDB201濃度が、細胞に対する有害な影響を有すると考えられることに気付いた。哺乳類細胞において、高浸透圧ストレスは、細胞周期停止およびアポトーシスを誘導することが示されている10〜13。形質導入の間の高浸透圧条件が細胞増殖に影響を及ぼすかどうかを調べるために、本発明者らは、700mOsm/Kgで3時間または500mOsm/Kgで12時間のいずれかでのタンパク質形質導入時の、MEFにおけるBrdU組み入れを測定した(図4A)。BrdU組み入れは、タンパク質形質導入の開始の24時間後に測定された。等張条件で維持されたMEFのBrdU組み入れは、100%に設定され、かつ、タンパク質形質導入バッファー単独、またはタンパク質形質導入バッファー+β-ラクタマーゼが添加されると40%未満に低下した(図4A)。
培地高張性がタンパク質形質導入を誘導するメカニズムをさらに分析するために、本発明者らは、影響が、培地容量オスモル濃度を増加させるために用いられたNaClに特異的であるかどうかを調べた。NDSB201(25mM)および浸透圧保護剤の存在下で、MEFにβ-ラクタマーゼを3時間形質導入し、かつNaCl、またはLiCl、KCl、CsCl、およびRbClを含めた、元素の周期表に従った関連塩を用いて、培地張度を700mOsm/Kgに調整した。図5Aに示されるように、すべてのNa関連塩は形質導入活性を有し、NaおよびRbは最も高い活性を実証した。加えて、本発明者らは、他のNa塩が、タンパク質取り込みを誘導し得るかどうかを試験した。図5Aに示されるように、グルコン酸ナトリウムは、NaClおよびRbClと同程度の効率でβ-ラクタマーゼ形質導入を有効に仲介した。最後に、本発明者らは、非関連化合物を用いて培地張度を増加させることも、タンパク質形質導入を誘発するかどうかを試験した。図5Aに示されるように、スクロース、ラクツロース、ソルビトール、およびマンニトールはすべて、700mOsm/Kgにおいてタンパク質形質導入を誘導し得ず、タンパク質形質導入が、ナトリウムまたはナトリウム関連塩によって誘導される高張性に特異的に依存していることを示唆した。タンパク質形質導入を誘発する条件は、高張性がNa+および関連イオンによって特異的に誘導されることを必要とするため、単なる原形質膜の透過性の増強を通じて形質導入が生じることは起こりそうにないと考えられた。本発明者らは、タンパク質形質導入は活発な様式のエンドサイトーシス輸送を伴うと仮定し、かつ種々のタイプのエンドサイトーシスの特異的阻害物質を用いて、本発明者らのタンパク質形質導入バッファーによって利用される侵入のメカニズムを調べた。予測されるとおり、アクチン重合および小胞輸送の特異的阻害物質であるサイトカラシンDもしくはラトランクリンAによる細胞の処理は、タンパク質形質導入を完全に遮断し(図5B)、タンパク質形質導入がアクチン再構成を必要とすることを裏付けした。しかしながら、Pitstop2およびクロルプロマジン(クラスリン仲介によるエンドサイトーシスの阻害物質)、ならびにDynasoreおよびナイスタチン(カベオリン仲介によるエンドサイトーシスの阻害物質)を含めた、エンドサイトーシスの特異的阻害物質はすべて、タンパク質形質導入を阻害することにおいて効果がなかった(図5B)。これらのデータは、タンパク質形質導入が、古典的なクラスリン仲介またはカベオリン仲介によるエンドサイトーシス経路を通じては生じないことを示唆している。他のタイプのエンドサイトーシスとは対照的に、マクロピノサイトーシスは、Na+/H+交換の阻害物質の影響を独自に受けやすい。興味深いことに、タンパク質形質導入は、ナトリウム-水素交換輸送体(Nhe)タンパク質のファミリーの特異的阻害物質であるEIPAまたはDMAなど、Na+/H+交換の特異的阻害物質によって強力に阻害された(図5B)。これらのデータは、タンパク質形質導入プロセスが、マクロピノサイトーシスを介して外因的に適用されたものの活発な細胞内取り込みを伴うことを示唆している。
Nhe1がタンパク質形質導入の重要な仲介因子であるという本発明者らの知見は、本発明者らを、Nhe1の活性化因子がタンパク質形質導入プロセスを増強し得るかどうかを調べるように促した。いくつかの成長因子は、Nhe1を活性化することによってマクロピノサイトーシスを誘導し、かつNa+/H+交換を増強することが示されている15〜19。本発明者らは、タンパク質形質導入に対する、上皮成長因子(EGF)、線維芽細胞成長因子(FGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、インスリン、インスリン様成長因子(IGF)、およびこれらの因子の組み合わせの影響を調べた。図5Dに示されるように、インスリンおよびIGFは、MEFのタンパク質形質導入に対して、小さいが重大な刺激効果を有した。加えて、EGF、FGF、およびPDGFは、β-ラクタマーゼ取り込みの倍増をもたらした。最後に、これらの因子の組み合わせは、β-ラクタマーゼ形質導入に対する相加効果を実証した(図5D)。EIPAによるNhe活性の阻害は、FGFおよびPDGFの存在下でさえタンパク質形質導入を完全に遮断し、これらの成長因子によって誘導されるタンパク質形質導入の増強が、代替的エンドサイトーシスメカニズムによっては仲介されないことを実証した。短いdTAT-HA2ペプチドは、タンパク質のマクロピノソーム脱出を増強することが示されている20。本発明者らは、dTAT-HA2ペプチドの添加が、MEFへのβ-ラクタマーゼタンパク質のタンパク質形質導入をさらに増強し得るかどうかを試験した。この目的のために、本発明者らは、形質導入バッファー中への種々の濃度のdTAT-HA2ペプチドを滴定した。図5Dに示されるように、dTAT-HA2ペプチドの添加は、タンパク質形質導入に対して小さな増強効果を有した。最後に、本発明者らは、成長因子刺激またはdTAT-HA2ペプチドの添加が、他の細胞のタンパク質形質導入を同様に増強し得るかどうかを試験した。本発明者らは、表示される成長因子またはdTAT-HA2融合ペプチドの存在下において、500mOsm/Kgで12時間、マウスESCに1μM β-ラクタマーゼタンパク質を形質導入した。図5Eに示されるように、成長因子の添加は、mESCタンパク質形質導入に対してわずかな効果を有したが、dTAT-HA2融合ペプチドの添加は、mESC内へのβ-ラクタマーゼ組み入れの著しい増加をもたらした。
NDSB201と組み合わせた、塩により誘導される高張性が、効率的なタンパク質形質導入を誘発するという本発明者らの知見は、本発明者らを、他の非界面活性剤スルホベタインがタンパク質形質導入を同様に誘発し得るかどうかを調べるように促した。本発明者らは、6種の市販のNDSB(図6Aに表示される化学構造)のタンパク質形質導入活性を試験した。図6Aは、すべて25mM最終濃度におけるNDSB201(#01)ならびに5種の追加のNDSB化合物(#02〜06)による、MEFへのβ-ラクタマーゼの形質導入を示している(700mOSm/Kgで3時間)。白丸は、タンパク質形質の開始の24時間後に測定されたBrdU組み入れを表す。これらの結果は、すべてのNDSB化合物はタンパク質形質導入を助長するものの、それらは、それらの形質導入効率および細胞増殖への影響の点で変動することを実証した。NDSB201(#01)およびNDSB221(#03)は、β-ラクタマーゼ形質導入において最も効率的であると考えられ、それゆえ本発明者らは、これら2種の化合物に対するさらなるバリエーションを調べた。
マウス胚性幹細胞のタンパク質形質導入をより詳細に調べるために、本発明者らは、CREリコンビナーゼ誘導性レポーターがColA1遺伝子座に安定して組み込まれたトランスジェニックmESC株を用いた2。このレポーターは、CMVプロモーター、それに続くLoxP隣接型終止カセット、およびeGFPレポーター遺伝子を包含する(図7A)。eGFP発現は、終止カセットのCREリコンビナーゼ仲介による切除が成功すると誘導される。実際、マウスESCへの増加する濃度の組換えCREタンパク質の形質導入は、GFP+ ESCの用量依存的増加をもたらす(図7B、上のパネル、グリセロールおよびグリシンとともに、500mOsm/Kgで12時間の形質導入)。5μM CREによる2回の逐次的な形質導入(上記のようにそれぞれ12時間、その間に12時間の回復期間を有する)は、79%のGFP+ ESCをもたらした(図7B、上のパネル)。さらに、マクロピノサイトーシス小胞のエンドソーム溶解を増強することが知られる20、5μM Tat-HA2融合ペプチドの添加は、GFP+細胞のパーセンテージを、単回形質導入後に81%まで、かつ2回のタンパク質形質導入後に97%の形質導入された細胞までさらに増加させた(図7B、下のパネル)。Bにおける細胞の蛍光顕微鏡画像を図7Cに示す。次に、本発明者らは、タンパク質形質導入がESC増殖に影響を及ぼすかどうかを試験した。2回のCREタンパク質形質導入の後、7Bにおける二重に形質導入された細胞をトリプシン処理し、MEFフィーダー上に播種し、かつ細胞増殖を細胞計数によってモニターした。非形質導入細胞を対照として用いた。図7Dに示されるように、2回のCREタンパク質形質導入は、Tat-HA2融合ペプチドの非存在下(図7D、上段のパネル)または存在下(図7D、下段のパネル)のいずれにおいても、ESC増殖に影響を及ぼさなかった。次に、本発明者らは、二重形質導入されたmESCにおける主要な多能性因子の発現をqRTPCRによって調べた。図7Eは、Tat-HA2融合ペプチドの非存在下(図7E、上段のパネル)または存在下(図7E、下段のパネル)のいずれにおいても、Oct4、Nanog、Sox2、Rex1、およびFBox15の発現は、非形質導入の対照ESCと比較して、二重形質導入されたmESCにおいて変化しなかったことを実証した。マウスESCは、それらが三胚葉の誘導体に分化する能力を有することを意味する、多能性である。mESC多能性についてのストリンジェントな試験は、それらがキメラを形成し得る能力である。形質導入されたmESCの多能性を試験するために、7Bにおける実験からの二重形質導入されたGFP+ ESCを宿主胚盤胞胚内に注入し、かつ偽妊娠した育てのマウスに移植した。図7Fに示されるように、二重形質導入されたmESCは、Tat-HA2融合ペプチドを含まない(7F、上のパネル)およびそれを含む(図7F、下のパネル)形質導入の両方において、キメラ形成に効率的に寄与した。
本発明者らの形質導入バッファーが、ヒト誘導多能性幹細胞(iPSC)の形質導入を同様に可能にするかどうかを調べるために、本発明者らは、マウスESCに対して用いられた同様のストラテジー(図7)を、わずかな適応を有して採用した。本発明者らは、CREリコンビナーゼのタンパク質形質導入があると、発現するdsRed蛍光レポーター遺伝子の除去および後続のeGFPレポーター遺伝子の活性化をもたらす、レンチウイルスレポーターをヒトiPSCに形質導入した(図8A)。それゆえ、形質導入に成功したhiPSCの蛍光シグナルは、赤色から緑色に移行する。マウスESCと同様に、5μM CREタンパク質によるヒトiPSCの形質導入は、フローサイトメトリーによって解析されるように、dsRedレポーターの効率的な除去、および細胞の64%におけるeGFP発現への移行をもたらした(図8B、左の2つのパネル、500mOsm/Kgで12時間の形質導入)。一部の細胞は、GFPおよびdsRedに対して依然として二重陽性であることに留意されたい。これは、多コピーのレンチウイルスレポーター構築物がiPSC内に存在しており、かつすべてのコピーがloxにより外される(loxed-out)わけではないという事実によるためである。Tat-HA2融合ペプチドの添加は、形質導入効率を77%までさらに増加させた(図8B、中央のパネル)。二重のCREタンパク質形質導入は、tat-HA2融合ペプチドの添加なしで78%のeGFP細胞を産出し、かつ5μM Tat-HA2融合ペプチドが添加された場合には84%のGFP+ hiPSCを産出した。図8Cは、(8B)における細胞の蛍光顕微鏡画像を示している。
上記で記載されるCREリコンビナーゼ仲介による赤色から緑色へのレポーター移行の同様のストラテジーを利用して、マウスおよびヒトのニューロン、グリア、および神経幹細胞の形質導入を査定した。図9Aは、アッセイ法の模式図を描写している。マウスニューロスフェアのCREタンパク質形質導入は、eGFPレポーターの効率的な活性化をもたらした(図9B、左のパネル)。同様に、ヒトiPSC由来のグリア細胞およびニューロンに5μM CREを形質導入し、eGFPレポーターの効率的な活性化がもたらされた。蛍光レポーター構築物は、レンチウイルス感染を用いてiPSC由来のグリア細胞およびニューロン内に導入されたため、細胞は、多コピーのこのレポーターを組み入れた可能性が高い。ゆえに、CREタンパク質形質導入は、eGFPレポーターの効率的な活性化をもたらしたと同時に、細胞は、該レポーターの追加コピー由来のdsRedを発現し続けた。
4.5g/lグルコースを含有するDMEM(Life technologies、カタログ番号31966-021)
4.5g/lグルコースを含有するDMEMフェノールレッド不含(Life technologies、カタログ番号21063-029)
カルシウムおよびマグネシウムを含まないDPBS(Life technologies、カタログ番号14190-094)
L-グルタミン、100×(Life technologies、カタログ番号25030-123)
NEAA;非必須アミノ酸溶液、100×(NEAA;Life technologies、カタログ番号11140-035)
2-メルカプトエタノール溶液、14.3M(Sigma、カタログ番号M3148-25ml)
ペニシリン/ストレプトマイシン溶液、100×(Life technologies、カタログ番号15140-130)
0.05% トリプシン-EDTA(Life technologies、カタログ番号25300-054)
ゼラチン(Sigma、カタログ番号G1890)(試薬の準備を参照されたい)
ピューロマイシン(Life technologies、カタログ番号A11138-03)
mTeSR1(商標)(StemCell technologies、カタログ番号5850)
TeSR(商標)-E8(商標)(StemCell technologies、カタログ番号05840)
マトリゲル-低下型成長因子(BD、カタログ番号354230)
ディスパーゼ(StemCell technologies、カタログ番号7923)
マウス胎仔線維芽細胞(MEF)血清(Sigma、カタログ番号F7524)
マウス胚性幹細胞(mES)血清(Greiner Bio-One、カタログ番号758073)
5×形質導入バッファー(試薬の準備を参照されたい)
MEF培地(試薬の準備を参照されたい)
mES培地(試薬の準備を参照されたい)
mES形質導入培地(試薬の準備を参照されたい)
神経幹細胞培地(試薬の準備を参照されたい)
N2サプリメント、100×(Life technologies、カタログ番号17502-048)
B27サプリメント、50×(Life technologies、カタログ番号12587-010)
リゾチーム(Sigma、カタログ番号L6876-1G)
ベンゾナーゼ エンドヌクレアーゼ(Sigma、カタログ番号E1014-25KU)
イミダゾール(Sigma、カタログ番号I5513-5G)
NDSB-201(Sigma、カタログ番号82804-50G)
NDCB-165(SYNCOM B.V., The Netherlands)
グリセロール(Sigma、カタログ番号G2025)
グリシン(Sigma、カタログ番号50046)
NaCl−塩化ナトリウム(Sigma、カタログ番号S5886)
NaH2P04−リン酸一ナトリウム(Sigma、カタログ番号S5011)
MgCl2−塩化マグネシウム(Sigma、カタログ番号M4880)
細胞増殖ELISA、BrdU(Roche、カタログ番号11669915001)
Caspase-Glo 3/7アッセイ法(Promega、カタログ番号G8090)
EGF(Life Technologies、カタログ番号PHG0311)
FGF2(Life Technologies、カタログ番号13256-029)
PDGF(Life Technologies、カタログ番号PMG0044)
インスリン(Sigma、カタログ番号I9278-5ML)
IGF(R&D Systems、カタログ番号791-MG-050)
TAT-HA2融合ペプチド(Eurogentec Nederland b.v.、カタログ番号AS-64876)
INF7-TAT融合ペプチド(Eurogentec Nederland b.v.、カタログ番号AS-64908)
シャペロンプラスミドセット(TAKARA、カタログ番号3340)
アンピシリン(Sigma、カタログ番号A9518)
クロラムフェニコール(Chloranphenicol)(Sigma、カタログ番号C0378)
hLIF(ヒト白血病阻害因子、ストック1000×;R&D systems、カタログ番号7734-LF-025)
クマシー染色(Biorad、カタログ番号161-0786)
CCF2-AMローディングキット(Life Technologies、カタログ番号K1032)
ポリ-D-リシン臭化水素酸塩(Sigma、カタログ番号P6407)
Ni-NTA Superflowカラム(Qiagen、カタログ番号30622)
Amiconウルトラ-15遠心式フィルターユニット(Millipore、カタログ番号UFC903008)
Zebaスピン脱塩カラム(Thermo Scientific、カタログ番号87772)
96ウェル平面クリア底面黒色ポリスチレンTC(Corning、カタログ番号3603)
100mm組織培養ディッシュ(Greiner Bio-one、カタログ番号664160)
6ウェル組織培養プレート(Greiner Bio-one、カタログ番号657160)
24ウェル組織培養プレート(Greiner Bio-one、カタログ番号662160)
96ウェル組織培養プレート(Greiner Bio-one、カタログ番号655180)
2mlプラスチック製使い捨てピペット(Greiner Bio-one、カタログ番号710180)
5mlプラスチック製使い捨てピペット(Greiner Bio-one、カタログ番号606188)
10mlプラスチック製使い捨てピペット(Greiner Bio-one、カタログ番号607188)
50mlプラスチック製使い捨てピペット(Greiner Bio-one、カタログ番号768180)
0.22mm孔径フィルター(Millex GP;Millipore、カタログ番号SLGP033RS)
0.45mm孔径酢酸セルロースフィルター(FP30/0.45 CA-S、Schleicher & Schuell)
10ml使い捨て注射器(Terumo、カタログ番号SS-10ESZ)
解剖用鉗子!警告、オートクレーブによる滅菌
解剖用ハサミ!警告、オートクレーブによる滅菌
ルミノメーター(Berthold Technologies、Centro XS3 LB 960)
蛍光光度計(Molecular Devices、SpectraMax M5e)
蛍光顕微鏡(Nikon、Eclipse TS100)
フローサイトメーター(BD Biosciences、FACS-ARIAII)
形質導入:標的分子(小分子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、RNA、DNA、siRNA、またはナノ構造物)の細胞内送達
形質導入標的:形質導入によって導入される分子(小分子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、RNA、DNA、siRNA、またはナノ構造物)
形質導入高張性:形質導入を誘導する培地高張性
5×形質導入バッファー
25mM NaH2P04、500mM NaCl、75mMグリシン、150mMグリセロール、250mM NDB、1.25mM MgCL2、1mM 2-メルカプトエタノール。500mlの5×形質導入バッファーを調製するために、1.5gのNaH2PO4および14.6gのNACLを混合し、次いで400mlまでmiliQ H2Oを添加し、10M NaOHを用いて、8.0の最終pHに達するようにpHを調整する。次いで、2.8gのグリシン、25gのNDSB-201、60mgのMgCl2、5.5mlのグリセロール、7μlの2-メルカプトエタノールを混合しながら添加する。最後に、miliQ H2Oで500mlまで満たす。0.22umフィルターを用いてフィルター滅菌する。室温で保存する。
1×形質導入バッファー500を作製するために、関心対象のタンパク質を有する1容量の5×形質導入バッファーと、4容量の等張細胞培養用培地とを、500mOsm/Kgの最終張度に達するように混合する。
1×形質導入バッファー700を作製するために、関心対象のタンパク質を有する1容量の5×形質導入バッファーと、4容量の等張細胞培養用培地とを混合する。最後に、700mOsm/Kgの最終張度に達するように、適切量のNaClまたはRbCl塩を添加する。
50U/mlペニシリンおよび50mg/mlストレプトマイシンとともに10% FBSを含有するDMEM。500mlのMEF培地を調製するために、50mlのMEF血清および2,5mlのペニシリン/ストレプトマイシンを混合し、次いでDMEMで500mlまで満たす。4℃で保存する。
50Uペニシリンおよび50mg/mlストレプトマイシンとともに1×B27および10ng/mlのEGFを含有するDMEM/F12。500mlの神経幹細胞培地を調製するために、10mlのB27および2.5mlのペニシリン・ストレプトマイシン、次いでDMEM/F12で500mlまで満たす。4℃で保存する。
15% FBS(容積/容積)、2mM L-グルタミン、10mM NEAA、1×10-4M 2-メルカプトエタノール、20ng/ml hLIF、50Uペニシリン、および50mg/mlストレプトマイシンを含有するDMEM。500mlの培地を調製するために、75mlのmES培地、5mlのL-グルタミン、5mlの非必須アミノ酸、3,5μlの2-メルカプトエタノール、2.5mlのペニシリン/ストレプトマイシン、および500μlのhLIFを混合し、次いでDMEMで500mlまで満たす。4℃で保存する。
1×N2および1×B27(容積/容積)、2mM L-グルタミン、10mM NEAA、1×10-4M 2-メルカプトエタノール、ならびに20ng/mlのhLIFを含有するDMEMフェノールレッド不含。500mlの培地を調製するために、5mlのN2、10mlのB27、5mlのL-グルタミン、5ml NEAA、500ulのhLIF、および3.5μlの2-メルカプトエタノールを混合し、次いでDMEMフェノールレッド不含で500mlまで満たす。4℃で保存する。
100mlの蒸留水中に1gのゼラチン粉末を溶解し、オートクレーブし、かつ10×ゼラチンストック溶液として4℃で保存する。0.1%(1×)ゼラチン溶液を調製するために、10×ゼラチンストックを電子レンジおよび/またはオートクレーブ内で融解し、次いで50mlの10×溶液を450mlの蒸留水に添加する。溶液を0.22μmフィルターユニットで濾過し、かつ4℃で保存する。培養ディッシュをコートするために、ディッシュ底面の全域を覆うように適切な容量の0.1%(1×)ゼラチン溶液を添加する。例えば、35、60、または100mmディッシュには、それぞれ1、3、または5mlのゼラチン溶液が用いられる。滅菌環境において、ディッシュを37℃で少なくとも30分間インキュベートする。使用前に、過剰のゼラチン溶液を吸引除去する。
細胞培養
13.5日目の妊娠マウスの胎仔の単離によって、マウス胎仔線維芽細胞(MEF)を得た。まず、胎仔をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、かつ頭部および内臓組織を除去した。残存組織を冷却PBSで洗浄し、ハサミ1丁を用いて細かく刻み、かつ0.1mMトリプシン/1mM EDTA溶液中(1匹の胎仔あたり3ml)で37℃にて20分間インキュベートした。このインキュベーションの後、1匹の胎仔あたり追加の3mlの0.1mMトリプシン/1mM EDTA溶液を添加し、かつ混合物を37℃で20分間再度インキュベートした。トリプシン処理の後、1匹の胎仔あたり6mlのMEF培地を添加し、かつ数回上下にピペッティングして、組織解離を助けた。室温で5分間の組織/培地混合物のインキュベーションの後、上清を新たなチューブに移した。細胞を遠心分離(4℃で5分間の200×g)によって回収し、かつMEF培地中で再懸濁した。1×106個の細胞(継代番号1)を、100mmディッシュ上で、MEF培地中5% CO2にて37℃で培養した。
関心対象の遺伝子を有する発現プラスミドpET15とともにシャペロンを有する大腸菌系統BL21(DE3)から、タンパク質を過剰発現させかつ精製した。いくつかのセットのシャペロンがTakaraから入手可能であり、かつシャペロンプラスミドセットとともに提供されるメーカーのプロトコールに従って、各タンパク質に対して、最適なシャペロンセットを決定することができる。一晩の培養物を、50ug/mLアンピシリンおよび20ug/mlクロラムフェニコールを含有するx mLのLB培地に1:100で添加し、かつ37℃の振とうインキュベーター内に置いた。OD600 0.75に達するまで培養物を増大させ、その時点で培養物を16℃で振とうしながらインキュベートした。1時間後、IPTGを1mMで添加し、かつ培養物を、16℃で振とうしながら16時間の間インキュベートした。細胞を遠心分離によって収集し、かつリゾチーム(1mg/mL)およびベンゾナーゼ(1U/ml)による4℃で1時間の処理によって溶解した。溶解物を遠心分離によって浄化し、かつ上清をNi-NTAカラムにロードした。5×形質導入バッファー中のイミダゾール勾配によって、タンパク質を溶出した。各溶出画分のSDSゲル電気泳動およびクマシー染色の後、高純度のタンパク質画分をプールし、かつamiconフィルターを用いて濃縮した。イミダゾールを除去するために、Zebaスピン脱塩カラムをメーカーの指示書に従って用い、かつタンパク質を5×形質導入バッファー中に溶出した。この時点で、タンパク質をさらに精製することができ、または等分しかつ液体窒素中で即時凍結することができる。小画分のタンパク質溶液を用いて、Bradfordアッセイ法による、およびクマシー染色と連動したSDSゲル電気泳動によるタンパク質定量を実施して、それぞれタンパク質の濃度および純度を判定した。本発明者らの技能では、5×形質導入バッファー中のいくつかのタンパク質を、活性の最小限の喪失で、複数回凍結しかつ融解することが可能であった。
最適な形質導入条件を確立するために、いくつかのパラメーターをそれぞれの特異的細胞タイプに対して最適化する必要がある。具体的には、これらは、張度および張度誘導塩のタイプ、形質導入時間、浸透圧保護剤のタイプおよび濃度、形質導入化合物のタイプおよび濃度である。これらのパラメーターのそれぞれについての最適化のための具体的手法を下記で列挙する。本発明者らは、これまでに試験したすべての初代細胞および細胞株に対して、主に2つの異なる形質導入プロトコールを用いる。本発明者らは、形質導入に抗生物質を含まない培養用培地を用いる。形質導入は血清の存在下で働くものの、本発明者らは、それが血清不含条件下で最も効率的であることを見出した。
上記の3/700プロトコールを用いて、マウス胎仔線維芽細胞(MEF)においてβ-ラクタマーゼ形質導入を実施した。黒色のクリア底面96ウェルプレートに、0.15mg/mlのポリ-D-リシンを室温で1時間コートした。抗生物質を含まないMEF培地中に、1ウェルあたり12,000個のMEF細胞を播種した。翌日、上記で記載される形質導入プロトコール3/700を用いて、細胞に形質導入した。5×形質導入バッファー中のβ-ラクタマーゼタンパク質を、抗生物質を含まないDMEMフェノールレッド不含培地で1/5に希釈した。Na塩またはRb塩を添加して、最終張度を700mOsm/Kgに調整した。次いで、完全混合物を細胞に添加した。3時間後、形質導入培地を新鮮なMEF培地に30分間置き換えた。その後、細胞をフェノールレッド不含DMEMで1回洗浄した。β-ラクタマーゼ活性を、メーカーの指示書に従いCCF2-AMキットを用いて測定した。簡潔には、1ウェルあたり120μlのCCF2-AMローディング培地を添加し、かつ細胞を室温で1時間インキュベートした。細胞をDMEMフェノールレッド不含で2回洗浄し、かつ追加の30〜60分間インキュベートした。メーカーの指示書に従って、蛍光発光を409nmおよび510nmで測定した。すべての試験を三つ組で行った。
プロトコール3/700に従って、96ウェル形式でMEFにCREを形質導入した。簡潔には、MEF培地を用いて、ゼラチンコートされたプレートに1ウェルあたり12,000個のLox-RFP/終止-Lox-eGFP MEF細胞を播種した。翌日、5×形質導入バッファー中のCREタンパク質を、抗生物質を含まないDMEMフェノールレッド不含で1/5に希釈した。次いで、完全混合物を細胞に添加した。形質導入の3時間後、培地を新鮮なmES培地によって置き換え、かつ24〜48時間インキュベートした。次いで、蛍光顕微鏡におけるまたはフローサイトメーターにおける緑色および赤色シグナルの測定によって、細胞を解析した。
上記で記載されるように、TALENタンパク質を発現させ、かつ天然の条件下で精製した。組換えTALENタンパク質を5×形質導入バッファー中で精製した。形質導入プロトコール12/500を用いて、ヒトES細胞にTALENタンパク質を形質導入した。HPRT遺伝子分断のために、HPRT遺伝子を標的とするTALENタンパク質のペアを用いた。形質導入の4日後、2,5μM 6-TGを添加して、HPRTノックアウト細胞を選択した。2週間後、ゲノムDNA精製およびHPRT遺伝子シーケンシングのために、生存クローンを選出しかつ拡張した。
タンパク質形質導入増強因子として、EGF、FGF、およびPDGFを用いた。形質導入バッファー中に、成長因子をそれらの活性最終濃度で添加した(列挙された成長因子の場合、それぞれ約10ng/ml)。形質導入バッファー中で、1〜10uMに及ぶ濃度で融合ペプチドを用いた。
メーカーの指示書(Roche)に従い、細胞増殖Elisaキット、Brdu(Roche)を用いて、細胞増殖を判定した。メーカーのプロトコール(Promega)に従い、Caspase-Glo 3/7アッセイキット(Promega)を用いて、カスパーゼ-3およびカスパーゼ-7活性の定量を測定した。
張度は、細胞膜を横断しない全溶質の濃度によって規定されることに留意することが重要である。本発明者らの実施例において、本発明者らは、NaClまたはRbClを典型的に500〜700mOsm/KGで用いるが、下記(I)で概説されるように、バッファー張度ならびに形質導入時間を、特異的適用(形質導入標的および標的細胞タイプ)に対して最適化すべきである。また、本発明者らの実施例において、本発明者らは、形質導入化合物としてNDSB201を用いるが、形質導入を誘導または助長することにおける他の化合物の能力および効率を、下記で概説されるように判定することができ、かつ下記(II)で概説されるように、特異的適用(形質導入標的および標的細胞タイプ)に対して最適化すべきである。上記で記述されるように、本発明者らの実施例において、本発明者らは、NaClまたはRbClを用いて形質導入高張性を誘導するが、他の塩または化合物を用いることができる。本発明者らは、分子または化合物が形質導入高張性を有効に誘導し得るかどうかを試験するアッセイ法を下記(III)で概説している。形質導入を誘導することが見出されている塩、分子、または化合物を、(I)に概説されるように、時間およびバッファー張度に対してさらに最適化すべきである。本発明者らの実施例において、本発明者らの形質導入バッファー中で用いられた浸透圧保護剤はグリシンおよびグリセロールであるが、浸透圧保護剤としての他の化合物の有効度を、下記で概説されるように判定することができ、かつ下記(IV)で概説されるように、特異的適用および細胞タイプに対して最適化すべきである。上記のパラメーターの最適化は、他の成分の繰り返し調整を必要とすると考えられる。例えば、新規な形質導入化合物の判定および最適化の後、形質導入高張性および時間は再調整を必要とし得る。
形質導入手法を特異的適用(形質導入標的および標的細胞タイプ)に対して最適化するために、前で記載されるプロトコール12/500および3/700を開始点と見なす。ここで、本発明者らは、細胞内取り込み、細胞生存、および該当する場合には細胞増殖に対して形質導入プロトコールを最適化する方法を記載する。本発明者らの実施例において、本発明者らは、β-ラクタマーゼタンパク質を用いて形質導入を最適化するが、形質導入標的の細胞内送達を判定するのに利用可能なアッセイ法がありさえすれば、他のタンパク質、DNA、RNA、siRNA、(小)分子、またはナノ構造を用いることができる。
本発明者らの実施例において、本発明者らは、形質導入化合物NDSB201を用いたが、適用および形質導入標的に応じて、種々の形質導入化合物を用いることができる。ここで、本発明者らは、潜在的形質導入化合物の性能を試験し、かつ形質導入化合物の最終濃度を最適化する方法を記載する。本実施例において、本発明者らは、形質導入プロトコール3/700を用いて、β-ラクタマーゼタンパク質をマウス胎仔線維芽細胞(MEF)内に移動させるが、(I)で記載されるように、標的細胞タイプに応じて、形質導入プロトコールを調整すべきである。(I)で記載されるように、100×β-ラクタマーゼストックを調製する。形質導入化合物を最適化するために、このβ-ラクタマーゼストック溶液は、試験される対象となる関心対象の形質導入化合物において調製される必要があるか、または250mMの関心対象の形質導入化合物を有する5×形質導入バッファーに対して透析される必要がある。
いくつかの塩は形質導入高張性を誘導し得るが、本発明者らの実施例において実証されるように、すべての高張性誘導塩が形質導入を誘導するわけではない。ここで、本発明者らは、特異的塩が形質導入を誘導し得るかどうかを判定する方法、および形質導入塩のタイプを特異的適用に対して最適化する方法を記載する。
本発明者らの実施例において、本発明者らは、グリセロールおよびグリシンの組み合わせを浸透圧保護剤として用いるが、適用および形質導入標的に応じて、種々の浸透圧保護剤を用いることができる。ここで、本発明者らは、潜在的浸透圧保護剤の性能を試験し、かつ浸透圧保護剤の最終濃度を最適化する方法を記載する。
形質導入の1日前に、96ウェルプレートに1ウェルあたり75,000個のマウスES細胞を播いた。翌日、細胞に100μlのトランスフェクション培地をトランスフェクトした。簡潔には、トランスフェクション培地は、100ngプラスミドDNA、0,8μl LTX脂質、0,1μl plus試薬(LifeTechnologies)、および20μlの5×形質導入バッファーを含有する。総容量は、100μlのmESC培地+LIFを含んだ。対照細胞に同様にトランスフェクトし;形質導入バッファーをmESC培地+LIFで置き換えた。
形質導入の1日前に、96ウェルプレートの1ウェルあたり75,000個のマウスES細胞を播いた。翌日、細胞を100μlのトランスフェクション培地とともにインキュベートした。20μlの5×形質導入バッファー中CREタンパク質、それに加えて追加の80μlのmESC培地+LIFを組み合わせることによって、Cre形質導入培地を調製した。RFP/DNA-脂質トランスフェクション培地は、100ngプラスミドDNA、0.8μl LTX脂質、0.1μl plus試薬(LifeTechnologies)、および20μlの5×形質導入バッファーを含有した。総容量は、100μlのmESC培地+LIFを含んだ。CREおよびDNA/脂質形質導入培地は、100ngプラスミドDNA、0,8μl LTX脂質、0,1μl plus試薬(LifeTechnologies)、および20μlの5×形質導入バッファー中CREタンパク質を含有する。総容量は、100μlのmESC培地+LIFを含んだ。細胞を12時間インキュベートし、かつ培地をmESC培地で置き換えた。形質導入の32時間後に、細胞をFACS解析によって解析した。
96ウェル形式で75%集密度の細胞密度を有するヒトiPS細胞へのレンチウイルス形質導入。ウイルス形質導入は、1μlの濃縮されたウイルスストック、4μg/mlポリブレン、それに加えて100ulの最終容量のためのヒトiPSC培養用培地からなった。
2/1000形質導入バッファー−最終組成
D-MEM N2/B27+LIF中、500mM NaCl、250mM NDSB-201、300mMグリシン、150mMグリセロール。
簡潔には、80μlの2/1000形質導入バッファー+20μlの5×形質導入バッファー500/12中CREタンパク質を添加することによって、mES細胞に形質導入した。細胞を2時間インキュベートした。インキュベーションの後、培地をmESC培地で置き換えた。形質導入の36時間後に、細胞をFACSによって解析した。
雄性ヒトiPS細胞に2μM TALENタンパク質を12時間形質導入した。簡潔には、20μlの5×形質導入バッファー中HPRT TALENタンパク質と、80μlのヒトiPS細胞培地とを混合した。最終混合物を細胞に12時間添加した。その後、培地を150μlのヒトiPS細胞培養用培地によって置き換えた。5日後、3μM 6-TGを培養用培地中に添加して、HPRT欠損細胞を選択した。10日後、個々のクローンを選出し、かつそれらを別個に培養した。各クローンのゲノムDNAを精製し、かつHPRT遺伝子シーケンシングを実施した。Blastアラインメントを実行して、TALENタンパク質によって引き起こされる、HPRT遺伝子における挿入および欠失の割合を判定した。
形質導入バッファーが、タンパク質および巨大分子の同時形質導入を可能にするかどうかを査定するために、本発明者らは、GFP発現マウス胎仔線維芽細胞(MEF)による、TMR-デキストラン(赤色)および蛍光標識BSAタンパク質(シアン色)のマクロピノサイトーシス仲介による取り込みを解析した。簡潔には、eGFPタンパク質(緑色)を発現するMEFを、1×形質導入培地中で、5μg/mlの高分子量TMR-デキストラン(赤色)および1μgのBSA-Alexa-647(遠赤色)とともに(プロトコール700/3)、30分間インキュベートした。その後、細胞を1×形質導入バッファーで2回洗浄した。最後に、細胞を1×形質導入バッファー中で維持し、かつ共焦点顕微鏡法によって直ちに解析した。デキストランおよびBSAの取り込みは、形質導入手法の前および間に、細胞を100μMエチルイソプロピルアミロライド(EIPA)とともに30分インキュベートすることによって阻害された。
高効率のタンパク質オスモサイトーシスは、遺伝子編集における魅力的な適用を有する。上記で記載されるTALEN遺伝子編集システムに加えて、近年発見されたCRISPR-Cas9システムは、追加の遺伝子編集システムを提供する。CAS/CRISPRは、小さなガイドRNA(sgRNA)によって特異的ゲノム遺伝子座にガイドされるストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyrogenes)Cas9ヌクレアーゼタンパク質からなる[1,2]。CAS/CRISPRシステムの魅力は、その設計の簡易さである。ヌクレアーゼタンパク質それ自身を設計しかつ各特異的標的部位に対して改変する必要があるTALENおよびジンクフィンガーシステムとは対照的に、CAS/CRISPRシステムは、単一のヌクレアーゼタンパク質(Cas9)を必要とし、かつ標的選択のために、結合した短いガイドRNAを変動させる。標的結合があると、Cas9ヌクレアーゼは、標的遺伝子座における二本鎖断裂(DSB)を産生し、それは、細胞内DSB修復システムによって修復された場合に遺伝子分断をもたらすフレームシフト欠失を高頻度に産生する。Cas/CRISPRシステムは、典型的に、臨床応用を妨げるウイルスベクターを用いて標的細胞に導入され、かつ感染細胞のさらなる薬物選択なしでは、一部の標的細胞タイプにおいて非効率的である。ヒト幹細胞を含めたいくつかの感染させにくい細胞株における、本発明者らのオスモサイトーシスシステムの効率を考慮して、本発明者らは、このシステムが、タンパク質仲介による遺伝子編集を同様に可能にするかどうかを調べた。
形質導入が生じるためには、マクロピノサイトーシスによって取り入れられたタンパク質がサイトゾル内に放出される必要がある。本発明者らは、これは、マクロピノサイトーシス小胞の透過によって起こると仮定した。潜在的形質導入化合物候補の有効性を試験するために、本発明者らは、マクロピノソーム小胞透過をモニターするアッセイ法を準備した。本発明者らは、薬物または病原体によって誘導される小胞漏出をモニターする、以前に記載されているガレクチン3-GFPレポーターシステム[8,9]を用いた。ガレクチン-3は、炭水化物を含有するβ-ガラクトシド糖類に結合し得る小さな可溶性サイトゾルタンパク質である。これらは、通常、原形質膜の外部および細胞内エンドサイトーシス小胞の内部にのみ存在している。マクロピノサイトーシス小胞の膜の細胞内透過があると、細胞質ガレクチン-3は、該小胞に透過して小胞内炭水化物に結合し得る。したがって、ガレクチン-3の再局在化は、感染中に細胞質に入るために小胞破裂に頼る細菌およびウイルスの研究において、小胞の破裂を同定するためのツールとして利用されている[8,9]。本発明者らは、ガレクチン-3タンパク質をGFPに融合させた(GAL3-GFP)レポーターシステムを準備した。細胞質GAL3-GFPタンパク質は、透過化されたマクロピノソームの内部に再局在し、それによって強い緑色蛍光発光を有する多量体複合体が形成される。GAL3-GFPタンパク質を発現するMEF細胞に、700/3条件を用いて形質導入した。予想どおり、本発明者らは、形質導入培地の下で細胞内に明るい小胞形成を観察し、タンパク質形質導入条件下でのマクロピノソーム漏出が実証された(図16)。細胞がマクロピノサイトーシス阻害物質EIPA(タンパク質形質導入を強力に阻害する)とともにインキュベートされた場合、または細胞が未処理のままであった場合、Gal3-GFPは小胞に再局在しなかった(図16)。さらに、形質導入化合物(NDSB-201)を、形質導入活性をほとんどまたは全く有しない化合物(化合物09および18)によって置き換えた場合、Gal3-GFPはマクロピノサイトーシス小胞内に局在しなかった(図16)。これらの結果は、形質導入培地が、マクロピノサイトーシスを介して細胞外空間からのタンパク質取り込みを促進しており、かつマクロピノソーム小胞漏出を誘導して、タンパク質をサイトゾルに放出していることを示す。Gal3-GFPアッセイ法は、タンパク質形質導入の有効性に関して形質導入化合物候補を試験するための簡易でかつ有効な手段である。
[本発明1001]
細胞と、関心対象の分子、および形質導入バッファーとを接触させる工程を含む、該細胞に該関心対象の分子を形質導入するための方法であって、該形質導入バッファーが、(i)形質導入化合物、(ii)塩、またはナトリウム-水素輸送体の活性化因子/増強因子、および好ましくは(iii)浸透圧保護剤を含む、方法。
[本発明1002]
前記形質導入バッファーが、(i)形質導入化合物、(ii)塩、および好ましくは(iii)浸透圧保護剤を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記形質導入バッファーが、(i)形質導入化合物、(ii)塩、および(iii)浸透圧保護剤を含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記塩が、ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩、セシウム塩、またはルビジウム塩である、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記塩が塩化ナトリウムである、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記形質導入化合物が、
a.一般式:
を有し、
式中、
R 1 は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、もしくはそれらの誘導体であり、
R 2 は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、もしくはそれらの誘導体であり、
R 3 は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、もしくはそれらの誘導体であり、
R - は、SO 3 - もしくはCOO - もしくはPOO - であり、かつ/または
nは1〜6、すなわち1、2、3、4、5、もしくは6であるか;あるいは
該形質導入化合物が、
b.一般式:
を有し、
式中、
Xは、NR 1 R 2 、NR 1 R 2 R 3 +、OH、およびCOOR 4 より選択され、
Yは、SO 3 H、SO 3 - 、COO - 、CONH 2 、COOR 12 、CONR 5 R 6 、テトラゾール、OH、NR 10 R 11 、およびHより選択され、
nは、1、2、3、4、5、もしくは6であり、
R 1 、R 2 、およびR 3 はそれぞれ独立して、H、C1〜6アルキル、C5〜10アリール、C6〜15アラルキル、COR 9 より選択され、C1〜6アルキル、C5〜10アリール、およびC6〜15アラルキルは、R Y 、OH、もしくはCOOHで置換されていてもよいか、または
R 1 およびR 2 は、それらが結合している窒素と一緒になってヘテロシクリルを形成してもよいか、または
XがNR 1 R 2 R 3 +である場合、R 3 は存在しなくてもよく、かつR 1 およびR 2 は、それらが結合している窒素と一緒になってヘテロアリールを形成してもよく、
R 4 、R 5 、R 6 、R 9 、R 10 、R 11 、R 12 は独立してHおよびC1〜6アルキルより選択され、
R 7 およびR 8 は独立してH、C1〜6アルキル、およびOHより選択されるか、もしくはR 7 は、R 1 と一緒になってヘテロシクリルを形成してもよく、
ヘテロシクリルは、可能な場合には、独立してN、NR 13 、NR 13 R 14 +、およびOより選択される1つもしくは2つの環員と、2〜5個の炭素原子とを含有する、飽和しているかもしくは部分的に不飽和である単環式環であり、ヘテロシクリルは、C1〜C6アルキル、C1〜C6カルボン酸、もしくは、R Y で置換されたC1〜C6アルキルで置換されていてもよく、
ヘテロアリールは、可能な場合には、独立してN、NR 13 、NR 13 R 14 +、およびOより選択される1、2、もしくは3つの環員を含有する、5員もしくは6員の芳香環であり、ヘテロアリールは、C1〜C6アルキル、C1〜C6カルボン酸、もしくは、R Y で置換されたC1〜C6アルキルで置換されていてもよく、
R 13 およびR 14 は独立して、H、C1〜6アルキル、C1〜C6カルボン酸、および、R Y で置換されたC1〜C6アルキルより選択され、
アルキルは、直鎖のもしくは分岐した飽和炭化水素であり、
R Y は、SO 3 H、SO 3 - 、COO - 、CONH 2 、COOR 12 、CONR 5 R 6 、テトラゾール、OH、およびNR 10 R 11 より選択され、
C1〜6カルボン酸は、-COOH、もしくは、COOHで置換されたC1〜5アルキル鎖、ならびにそれらの互変異性体、溶媒和物、双性イオン、および塩を意味する、
本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記形質導入化合物が非界面活性剤ベタイン(NDB)またはその誘導体である、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記形質導入化合物が、一般式:
を有し、
式中、
Xは、NR 1 R 2 およびNR 1 R 2 R 3 +より選択され;
Yは、SO 3 H、SO 3 - 、COO - 、CONH 2 、COOR 12 、およびCONR 5 R 6 より選択され;
R 1 、R 2 、およびR 3 はそれぞれ独立して、H、および、OHもしくはCOOHで置換されていてもよいC1〜6アルキルより選択されるか、またはR 1 およびR 2 は、それらが結合している窒素と一緒になって、置換されていてもよいヘテロシクリル、好ましくはピペリジン、ピペラジン、もしくはモルホリンを形成してよいか、またはXがNR 1 R 2 R 3 +である場合、R 3 は存在しなくてもよく、かつR 1 およびR 2 は、それらが結合している窒素と一緒になって、置換されていてもよいヘテロアリール、好ましくはピリジルを形成してもよく;かつ
他のすべての基は、上記の式Iにおいて定義されるとおりである、
本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記形質導入化合物が四級窒素基を含有し、かつ該四級窒素が、脂肪族環構造または芳香族環構造の一部である、本発明1006〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記形質導入化合物が、式IまたはIIの化合物であり、
Xが、
であり;
Zが、C(R 15 ) 2 、NR 13 、NR 13 R 14 +、およびOより選択され;
各R 15 が独立して、H、C1〜6アルキル、C1〜C6カルボン酸、および、R Y で置換されたC1〜C6アルキルより選択され;
R 3 が、H、C1〜6アルキル、C5〜10アリール、C6〜15アラルキル、COR 9 より選択され、C1〜6アルキル、C5〜10アリール、およびC6〜15アラルキルは、R Y 、OH、またはCOOHで置換されていてもよく、好ましくはR 3 は-CH 3 であり;
R 13 およびR 14 が独立して、H、C1〜6アルキル、C1〜C6カルボン酸、および、R Y で置換されたC1〜C6アルキルより選択される、
本発明1006〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記形質導入化合物が表1における化合物より選択される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記形質導入化合物が、表1における参照化合物#1と比較して30%またはそれ以上の形質導入効率を有する任意の化合物である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記浸透圧保護剤がグリシンおよび/またはグリセロールである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記形質導入バッファーが、生物学的pHバッファー、粘性増強因子、および/または成長因子をさらに含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記生物学的pHバッファーがPBS、TES、またはHEPESである、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記粘性増強因子がポリビニルピロリドン(PVP)である、本発明1014または本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記成長因子が、EGF、FGF、HGF、BDNF、PDGF、VEGF、もしくはIGFより選択されるか、またはそれらの任意の組み合わせである、本発明1014〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記形質導入バッファーの重量オスモル濃度が、約300mOsm/kg〜約1000mOsm/kg、または約300mOsm/kg〜約2000mOsm/kg、または約300mOsm/kg〜約3000mOsm/kgの範囲内である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記形質導入化合物が、約0.1mM〜約500mMの濃度である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1020]
前記浸透圧保護剤が、約5〜約500mMの濃度である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記関心対象の分子が、ペプチド、タンパク質、核酸、多糖類、小分子、小胞、ナノ粒子、ウイルス、または単細胞生物である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記関心対象の分子が約30〜約200kDaまたは約1〜約400kDaである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記関心対象の分子が、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALENS、Cas9、Cas9類似体、DNA標的化FokIヌクレアーゼ関連タンパク質、カスケード、TtAgo、もしくはアルゴノートタンパク質またはそれらの誘導体より選択されるエンドヌクレアーゼまたはヌクレアーゼなどの核酸を改変するための酵素である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記細胞が、ヒト細胞などの哺乳類細胞である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記細胞が、胚性幹細胞もしくは神経幹細胞などの幹細胞、またはニューロンもしくは樹状細胞などの分化した細胞である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記細胞が初代細胞である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1027]
前記細胞と、2、3、4種、またはそれ以上の関心対象の分子とを接触させる、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1028]
インビトロで実施される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1029]
インビボで実施される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1030]
前記形質導入がマクロピノサイトーシスによる、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1031]
本発明1001〜1030のいずれかの方法によって形質導入された細胞または細胞の集団。
[本発明1032]
本発明1001〜1030のいずれかの方法における使用のための、本発明1001〜1030のいずれかの形質導入バッファー。
[本発明1033]
形質導入のための関心対象の分子をさらに含む、本発明1032の形質導入バッファー。
[本発明1034]
細胞に関心対象の分子を形質導入するための本発明1001〜1030のいずれかの方法における、本発明1032または本発明1033の形質導入バッファーの使用。
[本発明1035]
本発明1032または本発明1033の形質導入バッファーを含む薬学的組成物。
[本発明1036]
療法または診断における使用のための、本発明1032もしくは本発明1033の形質導入バッファーまたは本発明1035の薬学的組成物。
[本発明1037]
例えば、細胞に関心対象の分子を形質導入するための本発明1001〜1030のいずれかの方法における、浸透圧保護剤、任意でグリシンおよび/またはグリセロールの使用。
[本発明1038]
例えば、細胞に関心対象の分子を形質導入するための、表1より選択される形質導入化合物の使用であって、前記方法が本発明1001〜1030のいずれかの、使用。
[本発明1039]
表1における化合物#10、#11、#16、#42、#34、#41、#40、#39、#33、#15、#11、#29、#36、および#46より選択される化合物。
[本発明1040]
細胞と、核酸を改変できるタンパク質、および形質導入バッファーとを接触させる工程を含む、該細胞において遺伝子配列などの核酸を改変するための方法であって、該形質導入バッファーが、(i)形質導入化合物、(ii)塩、またはナトリウム-水素輸送体の活性化因子/増強因子、および好ましくは(iii)浸透圧保護剤を含む、方法。
[本発明1041]
前記核酸を改変できるタンパク質が、特異的標的配列を本質的に標的とし、例えば該タンパク質が、ジンクフィンガーヌクレアーゼもしくはTALEN、Cas9、Cas9類似体、DNA標的化FokIヌクレアーゼ関連タンパク質、カスケード複合体、TtAgoタンパク質もしくは他のアルゴノートタンパク質、またはそれらの誘導体である、本発明1040の方法。
[本発明1042]
前記細胞と、前記タンパク質を標的遺伝子配列に導くガイド分子とをさらに接触させる、本発明1040の方法。
[本発明1043]
重量オスモル濃度が、約1000mOsm/kg〜約1500mOsm/kg、好ましくは約1250mOsm/kgに調整される、本発明1040〜1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
前記形質導入化合物が、約200nM〜約400nM、好ましくは約250mMの濃度で用いられる、本発明1040〜1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
前記形質導入バッファーが、インターフェロン応答経路の阻害物質、例えばB18Rをさらに含む、本発明1040〜1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
改変された前記細胞を単離または使用する工程をさらに含む、本発明1040〜1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
本発明1040〜1046のいずれかの方法によって得ることができる、改変された細胞。
Claims (47)
- 細胞と、関心対象の分子、および形質導入バッファーとを接触させる工程を含む、該細胞に該関心対象の分子を形質導入するための方法であって、該形質導入バッファーが、(i)形質導入化合物、(ii)塩、またはナトリウム-水素輸送体の活性化因子/増強因子、および好ましくは(iii)浸透圧保護剤を含む、方法。
- 前記形質導入バッファーが、(i)形質導入化合物、(ii)塩、および好ましくは(iii)浸透圧保護剤を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記形質導入バッファーが、(i)形質導入化合物、(ii)塩、および(iii)浸透圧保護剤を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記塩が、ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩、セシウム塩、またはルビジウム塩である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記塩が塩化ナトリウムである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記形質導入化合物が、
a.一般式:
を有し、
式中、
R1は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、もしくはそれらの誘導体であり、
R2は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、もしくはそれらの誘導体であり、
R3は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、もしくはそれらの誘導体であり、
R-は、SO3 -もしくはCOO-もしくはPOO-であり、かつ/または
nは1〜6、すなわち1、2、3、4、5、もしくは6であるか;あるいは
該形質導入化合物が、
b.一般式:
を有し、
式中、
Xは、NR1R2、NR1R2R3+、OH、およびCOOR4より選択され、
Yは、SO3H、SO3 -、COO-、CONH2、COOR12、CONR5R6、テトラゾール、OH、NR10R11、およびHより選択され、
nは、1、2、3、4、5、もしくは6であり、
R1、R2、およびR3はそれぞれ独立して、H、C1〜6アルキル、C5〜10アリール、C6〜15アラルキル、COR9より選択され、C1〜6アルキル、C5〜10アリール、およびC6〜15アラルキルは、RY、OH、もしくはCOOHで置換されていてもよいか、または
R1およびR2は、それらが結合している窒素と一緒になってヘテロシクリルを形成してもよいか、または
XがNR1R2R3+である場合、R3は存在しなくてもよく、かつR1およびR2は、それらが結合している窒素と一緒になってヘテロアリールを形成してもよく、
R4、R5、R6、R9、R10、R11、R12は独立してHおよびC1〜6アルキルより選択され、
R7およびR8は独立してH、C1〜6アルキル、およびOHより選択されるか、もしくはR7は、R1と一緒になってヘテロシクリルを形成してもよく、
ヘテロシクリルは、可能な場合には、独立してN、NR13、NR13R14+、およびOより選択される1つもしくは2つの環員と、2〜5個の炭素原子とを含有する、飽和しているかもしくは部分的に不飽和である単環式環であり、ヘテロシクリルは、C1〜C6アルキル、C1〜C6カルボン酸、もしくは、RYで置換されたC1〜C6アルキルで置換されていてもよく、
ヘテロアリールは、可能な場合には、独立してN、NR13、NR13R14+、およびOより選択される1、2、もしくは3つの環員を含有する、5員もしくは6員の芳香環であり、ヘテロアリールは、C1〜C6アルキル、C1〜C6カルボン酸、もしくは、RYで置換されたC1〜C6アルキルで置換されていてもよく、
R13およびR14は独立して、H、C1〜6アルキル、C1〜C6カルボン酸、および、RYで置換されたC1〜C6アルキルより選択され、
アルキルは、直鎖のもしくは分岐した飽和炭化水素であり、
RYは、SO3H、SO3 -、COO-、CONH2、COOR12、CONR5R6、テトラゾール、OH、およびNR10R11より選択され、
C1〜6カルボン酸は、-COOH、もしくは、COOHで置換されたC1〜5アルキル鎖、ならびにそれらの互変異性体、溶媒和物、双性イオン、および塩を意味する、
請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。 - 前記形質導入化合物が非界面活性剤ベタイン(NDB)またはその誘導体である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記形質導入化合物が、一般式:
を有し、
式中、
Xは、NR1R2およびNR1R2R3+より選択され;
Yは、SO3H、SO3 -、COO-、CONH2、COOR12、およびCONR5R6より選択され;
R1、R2、およびR3はそれぞれ独立して、H、および、OHもしくはCOOHで置換されていてもよいC1〜6アルキルより選択されるか、またはR1およびR2は、それらが結合している窒素と一緒になって、置換されていてもよいヘテロシクリル、好ましくはピペリジン、ピペラジン、もしくはモルホリンを形成してよいか、またはXがNR1R2R3+である場合、R3は存在しなくてもよく、かつR1およびR2は、それらが結合している窒素と一緒になって、置換されていてもよいヘテロアリール、好ましくはピリジルを形成してもよく;かつ
他のすべての基は、上記の式Iにおいて定義されるとおりである、
請求項7に記載の方法。 - 前記形質導入化合物が四級窒素基を含有し、かつ該四級窒素が、脂肪族環構造または芳香族環構造の一部である、請求項6〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記形質導入化合物が、式IまたはIIの化合物であり、
Xが、
であり;
Zが、C(R15)2、NR13、NR13R14+、およびOより選択され;
各R15が独立して、H、C1〜6アルキル、C1〜C6カルボン酸、および、RYで置換されたC1〜C6アルキルより選択され;
R3が、H、C1〜6アルキル、C5〜10アリール、C6〜15アラルキル、COR9より選択され、C1〜6アルキル、C5〜10アリール、およびC6〜15アラルキルは、RY、OH、またはCOOHで置換されていてもよく、好ましくはR3は-CH3であり;
R13およびR14が独立して、H、C1〜6アルキル、C1〜C6カルボン酸、および、RYで置換されたC1〜C6アルキルより選択される、
請求項6〜9のいずれか一項に記載の方法。 - 前記形質導入化合物が表1における化合物より選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記形質導入化合物が、表1における参照化合物#1と比較して30%またはそれ以上の形質導入効率を有する任意の化合物である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記浸透圧保護剤がグリシンおよび/またはグリセロールである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記形質導入バッファーが、生物学的pHバッファー、粘性増強因子、および/または成長因子をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物学的pHバッファーがPBS、TES、またはHEPESである、請求項14に記載の方法。
- 前記粘性増強因子がポリビニルピロリドン(PVP)である、請求項14または請求項15に記載の方法。
- 前記成長因子が、EGF、FGF、HGF、BDNF、PDGF、VEGF、もしくはIGFより選択されるか、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項14〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記形質導入バッファーの重量オスモル濃度が、約300mOsm/kg〜約1000mOsm/kg、または約300mOsm/kg〜約2000mOsm/kg、または約300mOsm/kg〜約3000mOsm/kgの範囲内である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記形質導入化合物が、約0.1mM〜約500mMの濃度である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記浸透圧保護剤が、約5〜約500mMの濃度である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記関心対象の分子が、ペプチド、タンパク質、核酸、多糖類、小分子、小胞、ナノ粒子、ウイルス、または単細胞生物である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記関心対象の分子が約30〜約200kDaまたは約1〜約400kDaである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記関心対象の分子が、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALENS、Cas9、Cas9類似体、DNA標的化FokIヌクレアーゼ関連タンパク質、カスケード、TtAgo、もしくはアルゴノートタンパク質またはそれらの誘導体より選択されるエンドヌクレアーゼまたはヌクレアーゼなどの核酸を改変するための酵素である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、ヒト細胞などの哺乳類細胞である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、胚性幹細胞もしくは神経幹細胞などの幹細胞、またはニューロンもしくは樹状細胞などの分化した細胞である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が初代細胞である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞と、2、3、4種、またはそれ以上の関心対象の分子とを接触させる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- インビトロで実施される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- インビボで実施される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記形質導入がマクロピノサイトーシスによる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法によって形質導入された細胞または細胞の集団。
- 請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法における使用のための、請求項1〜30のいずれか一項に記載の形質導入バッファー。
- 形質導入のための関心対象の分子をさらに含む、請求項32に記載の形質導入バッファー。
- 細胞に関心対象の分子を形質導入するための請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法における、請求項32または請求項33に記載の形質導入バッファーの使用。
- 請求項32または請求項33に記載の形質導入バッファーを含む薬学的組成物。
- 療法または診断における使用のための、請求項32もしくは請求項33に記載の形質導入バッファーまたは請求項35に記載の薬学的組成物。
- 例えば、細胞に関心対象の分子を形質導入するための請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法における、浸透圧保護剤、任意でグリシンおよび/またはグリセロールの使用。
- 例えば、細胞に関心対象の分子を形質導入するための、表1より選択される形質導入化合物の使用であって、前記方法が請求項1〜30のいずれか一項に記載されている、使用。
- 表1における化合物#10、#11、#16、#42、#34、#41、#40、#39、#33、#15、#11、#29、#36、および#46より選択される化合物。
- 細胞と、核酸を改変できるタンパク質、および形質導入バッファーとを接触させる工程を含む、該細胞において遺伝子配列などの核酸を改変するための方法であって、該形質導入バッファーが、(i)形質導入化合物、(ii)塩、またはナトリウム-水素輸送体の活性化因子/増強因子、および好ましくは(iii)浸透圧保護剤を含む、方法。
- 前記核酸を改変できるタンパク質が、特異的標的配列を本質的に標的とし、例えば該タンパク質が、ジンクフィンガーヌクレアーゼもしくはTALEN、Cas9、Cas9類似体、DNA標的化FokIヌクレアーゼ関連タンパク質、カスケード複合体、TtAgoタンパク質もしくは他のアルゴノートタンパク質、またはそれらの誘導体である、請求項40に記載の方法。
- 前記細胞と、前記タンパク質を標的遺伝子配列に導くガイド分子とをさらに接触させる、請求項40に記載の方法。
- 重量オスモル濃度が、約1000mOsm/kg〜約1500mOsm/kg、好ましくは約1250mOsm/kgに調整される、請求項40〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記形質導入化合物が、約200nM〜約400nM、好ましくは約250mMの濃度で用いられる、請求項40〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記形質導入バッファーが、インターフェロン応答経路の阻害物質、例えばB18Rをさらに含む、請求項40〜44のいずれか一項に記載の方法。
- 改変された前記細胞を単離または使用する工程をさらに含む、請求項40〜45のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項40〜46のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、改変された細胞。
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