ES2897625T3 - Tampón de transducción - Google Patents

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Niels Geijsen
Diego D'astolfo
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Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen
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Abstract

Un método in vitro para transducir una proteína, un ácido nucleico o una combinación de los mismos en una célula, en donde el método comprende poner en contacto dicha célula con la proteína, un ácido nucleico o una combinación de los mismos y un tampón de transducción, en donde el tampón de transducción comprende (i) un compuesto de transducción y (ii) una sal seleccionada entre una sal de sodio, litio, potasio, cesio o rubidio; en donde el compuesto de transducción a. tiene la fórmula general: **(Ver fórmula)** en donde: X se selecciona de NR1R2, NR1R2R3+, OH y COOR4; Y se selecciona de SO3H, SO3, COO-, CONH2, COOR12, CONR5R6, tetrazol, OH, NR10 R11 y H; n es 3, 4, 5 o 6; R1, R2 y R3, se seleccionan cada uno independientemente de H, C1-6 alquilo, C5-10 arilo, C6-15 aralquilo, COR9; C1-6 alquilo, C5-10 arilo y C6-15 aralquilo puede estar opcionalmente sustituido con RY, OH o COOH; o R1 y R2 pueden unirse con el nitrógeno al que están unidos para formar heterociclilo; o cuando X es NR1R2R3+, R3 puede estar ausente y R1 y R2 pueden unirse con el nitrógeno al que están unidos para formar heteroarilo; R4, R5, R6, R9, R10, R11, R12 se seleccionan independientemente entre H y C1-6 alquilo; R7 y R8 se seleccionan independientemente entre H, C1-6 alquilo y OH; heterociclilo es un anillo monocíclico que está saturado o parcialmente insaturado, que contiene cuando es posible 1 o 2 miembros del anillo seleccionados independientemente entre N, NR13, NR13R14+ y O, y 2 a 5 átomos de carbono; el heterociclilo puede estar opcionalmente sustituido con C1-C6 alquilo, ácido carboxílico C1-C6 o C1-C6 alquilo sustituido con RY; heteroarilo es un anillo aromático de 5 o 6 miembros que contiene, cuando sea posible, 1, 2 o 3 miembros del anillo seleccionados independientemente entre N, NR13, NR13R14+ y O; el heteroarilo puede estar opcionalmente sustituido con C1-C6 alquilo, ácido carboxílico C1-C6 o C1-C6 alquilo sustituido con RY; R13 y R14 se seleccionan independientemente de H, C1-6 alquilo, ácido carboxílico C1-C6 y C1-C6 alquilo sustituido con RY; alquilo es un hidrocarburo saturado lineal o ramificado; RY se selecciona de SO3H, SO3, COO, CONH2, COOR12, CONR5R6, tetrazol, OH y NR10 R11; Ácido carboxílico C1-6 significa -COOH o una cadena de C1-5 alquilo sustituida con COOH y tautómeros, solvatos, iones híbridos y sales de los mismos; o b. tiene la fórmula general: en donde R1 es metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo o hexilo; R2 es metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo o hexilo; R3 es metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo o hexilo; R- es SO3- o COO - o POO- y n es 3-6, es decir, 3, 4, 5 o 6.

Description

DESCRIPCIÓN
Tampón de transducción
CAMPO TÉCNICO
[0001] Esta invención se refiere a tampones de transducción y métodos para introducir moléculas en células.
TÉCNICA ANTERIOR
[0002] La capacidad de introducir pequeñas moléculas o macromoléculas en las células tiene aplicaciones importantes en la investigación y la medicina. Desafortunadamente, la membrana celular presenta un gran obstáculo para la introducción de muchas moléculas biológicamente activas.
[0003] Mientras que la capacidad de introducir las proteínas en las células tiene muchas aplicaciones en la investigación y la medicina, un método fiable, no tóxico y eficaz de hacerlo es todavía insuficiente.
[0004] Castellot JJ Jr et al, (Proc Natl Acad Sci EE. UU. A. 1978 enero; 75(1): 351-5) contempló un método para introducir moléculas pequeñas en las células utilizando un medio que contiene cloruro de sodio al 4,2% (p/v). Demostraron la captación de azul tripán por células BHK de hámster inmortalizadas tras el tratamiento hipertónico. Sin embargo, los autores no demostraron que el azul de tripán se liberara en el citoplasma u otros compartimentos celulares después de la absorción. Además, el azul de tripán es una molécula pequeña y no estaba claro si el procedimiento permitiría también la captación de macromoléculas. A partir de los datos presentados en esta solicitud, en particular las Figuras 2G y 3E, demostramos que aunque la hipertonicidad mediada por NaCl induce la captación de macromoléculas del espacio extracelular a través de macropinocitosis, la adición de compuestos de transducción como sulfobetaínas no detergentes u otros compuestos descritos en esta aplicación se requiere para la liberación de los macropinosomas en el lumen intracelular. Además, 4,2 gramos de cloruro de sodio por 100 ml de medio se traduce en una osmolalidad del medio de aproximadamente 1727 mOsm/kg, que normalmente no es tolerada por las células primarias. Como tal, el método descrito por Castellot y colegas no se puede aplicar para la transducción de macromoléculas en células primarias y/o líneas de células madre.
[0005] En 1982, Okada y Rechsteiner demostraron que el tratamiento hipertónico inducida por 0,5 M de sacarosa y 10% de PEG1000, seguido de un breve tratamiento hipotónico inducido por la absorción intracelular de macromoléculas y proteínas en líneas celulares inmortalizadas1. Desafortunadamente, esta técnica demostró estar limitada a las líneas celulares inmortalizadas y produce eficiencias de transducción de proteínas deficientes en las células primarias. Probamos la transducción de la proteína CRE recombinasa en células madre embrionarias murinas (mESC) utilizando el método Okada. Usamos una línea transgénica mESC en donde un indicador inducible por CRE-recombinasa se integró de manera estable en el locus 2 de ColA1. Este informador abarca un promotor de CMV seguido de una caja de parada con flancos LoxP y un gen informador de eGFP (Figura 1A). La expresión de eGFP se induce tras la escisión exitosa mediada por CRErecombinasa del casete de parada (Figura 1A). Como se muestra mediante citometría de flujo, la transducción de mESC con proteína CRE-recombinasa 5 pM produjo 6% de mESC positivas para GFP, lo que indica que el método combinado de transducción hipertónica/hipotónica descrito por Okada y sus colegas es ineficaz en la transducción de células primarias (madre) (Figura 1B).
[0006] Algunos años más tarde, los descubrimientos independientes de Green3 y Frankel4'5 por primera vez demostraron que la proteína TAT del VIH puede transducir sí mismo a través de la membrana celular. La secuencia de péptidos que media en esta auto-transducción se identificó posteriormente y se demostró que impulsa la transducción celular cuando se fusiona químicamente con proteínas heterólogas6. Finalmente, Nagahara y sus colegas demostraron que la transducción de proteínas mediada por péptidos TAT también funcionaba cuando el péptido TAT se clonaba como una fusión en marco de la proteína "carga" de interés7.
[0007] Una ventaja clara de transducción de proteínas mediada por péptido TAT es que el método parece funcionar con todos los tipos de células, incluidas células primarias, y es generalmente no tóxico. Sin embargo, la fuerte carga positiva del péptido TAT obstaculiza gravemente la producción de proteínas de fusión TAT recombinantes nativas en E. coli, y gran parte de la proteína recombinante termina en cuerpos de inclusión. Además, investigaciones posteriores demostraron que algunos informes anteriores sobre proteínas autotransductoras eran de hecho el resultado de un artefacto experimental introducido durante la fijación de las células8. Además, esta tecnología requiere que el péptido TAT se fusione con la proteína recombinante y, por lo tanto, limita el tipo y número de proteínas que se pueden transducir. El péptido TAT en sí mismo puede alterar la función o localización de la proteína recombinante dando lugar a resultados inesperados o no deseados. Finalmente, y quizás lo más importante, la eficiencia de transducción de las proteínas de fusión TAT es bastante variable y depende de la naturaleza y las propiedades físicas de la carga proteica.
[0008] Esfuerzo significativo ha capitalizado en la introducción de nucleótidos (ADN, ARN, ARNsi) y/o moléculas terapéuticas en las células, y mientras que las células primarias todavía plantean un reto, se han realizado progresos utilizando lípidos catiónicos, nanopartículas o vectores virales como portadores de transmembrana.
[0009] Por ejemplo, US 6,124,207 describe el uso de un agente de transfección anfipático catiónico con propiedades de fusión para crear liposomas (micelas de detergente). Estos liposomas se mezclan posteriormente con ADN para formar complejos de liposoma-ADN antes de la transfección en las células. Cuando se realiza in vivo, se añade a la formulación de transfección solución salina "fisiológica" (solución acuosa de NaCl a 9 g/l), también conocida como solución salina "normal" y una aproximación cercana a la osmolalidad del NaCl en sangre. Esta aplicación explica que la eficacia de la transfección de ADN "desnudo" es baja.
[0010] Dichos métodos "portadores" también se han utilizado para la modificación génica dirigida, en los que el ADN o ARNm que codifica las proteínas de modificación genética, por ejemplo, TALEN, CRISPR/CAS y otros sistemas de edición de genes, se transfecta en células. Normalmente, dicha modificación génica se realiza mediante transducción viral. Estos métodos dan como resultado un riesgo significativo de reacciones adversas, incluido el rechazo inmunitario agudo debido a la alta dosis de virus inyectado y la formación de tumores como resultado de los efectos de la posición de integración viral. Además, el ácido nucleico se expresa dentro de la célula durante varios días dando como resultado una alta expresión de enzimas y una mayor probabilidad de efectos fuera del objetivo, por ejemplo, modificación genética de secuencias no objetivo dentro de la célula. La transducción viral también sigue siendo ineficaz para ciertos tipos de células. Estas dificultades obstaculizan la aplicación clínica de los sistemas de edición de genes mencionados anteriormente.
[0011] El desarrollo de nuevas tecnologías para el suministro intracelular de proteínas, por el contrario, ha sido en un punto muerto virtual. No obstante, la capacidad de introducir proteínas en las células tendría muchas aplicaciones en el desarrollo de vacunas, la edición del genoma, la reprogramación epigenética, la diferenciación de células (madre) y la manipulación de procesos intracelulares. Por lo tanto, es muy necesario el desarrollo de mejores tecnologías para el suministro intracelular eficiente de proteínas y otras macromoléculas, particularmente en células primarias.
[0012] Por lo tanto hay una necesidad de métodos más eficientes para las proteínas de transducción, y otras moléculas en las células. La transducción de moléculas en células es deseable para varios propósitos terapéuticos y científicos, incluida la terapia génica.
[0013] Aquí se describe que una combinación de hipertonicidad inducida por sal, un compuesto de molécula pequeña y osmoprotectores promueve la introducción robusta y eficiente de pequeñas moléculas y macromoléculas en células primarias, sin afectar la viabilidad celular. Proporcionamos ejemplos de cómo se pueden introducir proteínas, nucleótidos, nanoesferas y macromoléculas en una amplia variedad de células primarias, líneas de células madre y sus derivados. Además, describimos la transducción simultánea de proteínas y nucleótidos en células.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0014] La invención proporciona un método in vitro para transducir una molécula de interés en una célula, en donde la molécula de interés es una proteína, un ácido nucleico o una combinación de los mismos, en donde el método comprende poner en contacto dicha célula con la molécula de interés y un tampón de transducción, en donde el tampón de transducción comprende una sal seleccionada de una sal de sodio, litio, potasio, cesio o rubidio, un compuesto de transducción como se define en la reivindicación 1. Preferiblemente, el tampón de transducción comprende un osmoprotector.
[0015] El "método para la transducción de una molécula de interés en una célula" también se denomina en el presente documento como el "método de la transducción" o "método para la transducción". Estos términos se utilizan indistintamente para referirse a los mismos métodos.
[0016] La invención también proporciona una transducción de tampón que comprende una sal y un compuesto de la transducción, en donde la osmolalidad del tampón de la transducción es de al menos 500 mOsm/kg. La invención también proporciona un tampón de transducción que comprende una sal, un compuesto de transducción y opcionalmente un osmoprotector y/o un medio de cultivo celular.
[0017] La invención también proporciona el uso del tampón de la transducción de la invención, para la transducción de una molécula de interés en una célula.
[0018] La invención también proporciona el uso de un tampón de transducción de la invención para la modificación genética, por ejemplo la modificación genética de secuencias diana específicas (también denominada en este documento "edición de gen"). Los ejemplos de sistemas de edición de genes que pueden introducirse en células usando compuestos de transducción, tampones y métodos de la invención generalmente implican una proteína con actividad nucleasa, por ejemplo, actividad endonucleasa o exonucleasa. La actividad nucleasa puede estar presente en la versión de tipo salvaje de la proteína o puede añadirse, por ejemplo, mediante métodos recombinantes, para generar una proteína de fusión. Los ejemplos de sistemas de edición de genes que se pueden introducir en las células utilizando compuestos de transducción, tampones y métodos de la invención incluyen proteínas que se dirigen "inherentemente" a una secuencia particular, como las nucleasas con dedos de zinc (ZFN) y TALENs , y también proteínas que son "guiadas" para apuntar a secuencias utilizando ácidos nucleicos (por ejemplo, pequeños ARN guía [ARNg] o ADN guía [ADNg]), por ejemplo, como parte del sistema CRISPR-Cas9, el sistema Cascade, TtAgo y otros sistemas Argonaute, y otras proteínas asociadas a nucleasa FOKI. Por "inherentemente" se entiende que la proteína no requiere una molécula guía adicional para alcanzar su secuencia diana.
[0019] La invención también proporciona una transducción de tampón de acuerdo con la invención, para uso en terapia.
[0020] La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el tampón de transducción de la invención.
[0021] La invención también proporciona el uso de glicina y/o glicerol como un agente osmoprotector para la transducción de una molécula de interés en una célula, en donde la molécula de interés es una proteína, un ácido nucleico o una combinación de los mismos.
[0022] La invención también proporciona el uso de un compuesto de transducción tal como se define en la reivindicación 1, para la transducción de una molécula de interés en una célula, en donde la molécula de interés es una proteína, un ácido nucleico o una combinación de los mismos.
[0023] La invención también proporciona el uso de un compuesto de transducción tal como se define en la reivindicación 1 que se selecciona de la Tabla 1, para la transducción de una molécula de interés en una célula, en donde la molécula de interés es una proteína, un ácido nucleico o una combinación de los mismos.
[0024] La descripción también proporciona los siguientes compuestos: N° 10, N° 11, N° 16, N° 42, N° 34, N° 41, N° 40, N° 39, N° 33, N° 15, N° 11, N° 29, N° 36 y N° 46 (numerado en la Tabla 1).
[0025] La invención también proporciona un tampón de transducción para uso en un método de tratamiento de una enfermedad genética, en donde dicho método comprende la modificación de un ácido nucleico, tal como una secuencia genética, en una célula, en donde el método comprende poner en contacto dicha célula con una proteína capaz de modificar un ácido nucleico y un tampón de transducción, en donde el tampón de transducción comprende (i) un compuesto de transducción como se define en la reivindicación 1, y (ii) una sal seleccionada entre una sal de sodio, litio, potasio, cesio o rubidio. Preferiblemente, el tampón comprende un osmoprotector.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0026] La transducción es la internalización de moléculas en una célula, desde el entorno externo. Un pequeño número de proteínas y péptidos tienen la propiedad inherente de poder penetrar la membrana celular. A otras proteínas se les puede conferir esta propiedad de transducción alterando las condiciones ambientales de la célula o modificando la proteína de interés para la transducción.
[0027] La invención proporciona métodos mejorados y tampones para la transducción de las moléculas en las células. En particular, la invención proporciona una nueva composición tampón que permite la transducción eficiente de moléculas en células, sin la necesidad de modificar la molécula y con una pérdida mínima de viabilidad celular.
[0028] En concreto, los inventores han encontrado que una transducción de tampón que comprende una sal, un compuesto de transducción y, preferiblemente, un agente osmoprotector, permite la absorción sorprendentemente eficaz de las proteínas, y otras moléculas, en las células. Los inventores intentaron mejorar la eficiencia del transporte de OCT4 marcado con un péptido penetrante celular (CPP) en células madre, con el objetivo de generar células iPS. Descubrieron inesperadamente que podían lograr una eficacia sorprendentemente buena con un tampón de transducción que contenía una sal en combinación con un estabilizador de proteínas, tanto que la etiqueta CPP podía eliminarse y todavía se producía una transducción eficaz. Los inventores han descubierto que el nivel de transducción también se puede mejorar mediante la adición de un osmoprotector, que aumenta la eficacia de la transducción y también aumenta la viabilidad y la proliferación continua de las células transducidas. Han demostrado que el método funciona para otras moléculas, como moléculas pequeñas, ácidos nucleicos y proteínas con una variedad de tamaños, cargas y funciones. También han demostrado que el método funciona para la transducción en todos los tipos de células probados, incluida una variedad de células primarias, líneas de células madre y sus derivados. Además, contemplan que el tampón de transducción puede usarse in vivo, en particular cuando se añade un potenciador de la viscosidad al tampón de transducción. Por tanto, el tampón tiene muchos usos para transducir una variedad de moléculas en una variedad de células, tanto in vitro como in vivo.
[0029] Sin desear estar ligado por la teoría, los inventores contemplan que una transducción de tampón que comprende la combinación de una sal y un compuesto de transducción (como se define a continuación) activa la vía de macropinocitosis. Esta hipótesis está respaldada por una serie de experimentos de los inventores, que implican la inhibición de vías de transporte alternativas (véanse los Ejemplos). Por ejemplo, está respaldado por el Ejemplo 14, que describe el uso de un sistema indicador de Galectin3-GFP y demuestra la fuga de vesículas de macropinosomas durante la transducción de proteínas. Por tanto, el Ejemplo 14 indica que el tampón de transducción descrito en el presente documento promueve la captación de proteínas y otras moléculas mediante macropinocitosis e inducción de la fuga de vesículas de macropinosomas para liberar la molécula transducida de interés en el citosol. La macropinocitosis es un tipo de endocitosis en fase líquida que se caracteriza por su independencia de la clatrina y la formación de vesículas de tamaño relativamente grande, con diámetros que varían de 0,2 a 1 pM. A pesar de estar generalmente mal caracterizada con pocos marcadores específicos, se ha demostrado que la macropinocitosis es importante para la vigilancia inmunológica en células dendríticas. En otros tipos de células, la macropinocitosis se produce a una tasa espontánea baja, pero se induce rápidamente en respuesta a factores de crecimiento. La función de la macropinocitosis en las células fuera del sistema inmunológico sigue siendo difícil de alcanzar. Los inventores plantean la hipótesis de que su tampón de transducción activa la vía de macropinocitosis y mejora la captación de moléculas por esta vía en la célula. También mejora la liberación de moléculas de los endosomas al citosol celular. Se plantea la hipótesis de que la sal desempeña dos funciones: en primer lugar, genera hiperosmolalidad y, en segundo lugar, se une y activa proteínas de transporte de membrana clave involucradas en la macropinocitosis. Se cree que el compuesto de transducción mejora la captación de la proteína u otra molécula de interés en las vesículas. También se cree que mantiene la estructura nativa y la estabilidad de la molécula de interés y quizás ayuda en la liberación intracelular de las vesículas macropinocitóticas. La combinación de la sal con el compuesto de transducción parece ser importante para una transducción eficaz. Hasta donde sabemos, esta combinación no se ha utilizado anteriormente para estimular la transducción de proteínas u otras moléculas en las células.
Métodos de transducción
[0030] La invención proporciona un método in vitro para transducir una molécula de interés en una célula, en donde la molécula de interés es una proteína, un ácido nucleico o una combinación de los mismos, en donde el método comprende las etapas de poner en contacto dicha célula con la molécula de interés y poner en contacto dicha célula con una transducción de tampón que comprende una sal seleccionada a partir de un sodio, litio, potasio, cesio o rubidio sal y un compuesto de transducción tal como se define en la reivindicación 1.
[0031] La molécula de interés y el tampón de transducción se ponen en contacto con la célula en combinación, ya sea de forma simultánea, secuencial o por separado en cualquier orden. En una realización preferida, se administran simultáneamente (por ejemplo, desde un recipiente que contiene la combinación). Por tanto, en algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende la molécula de interés. En algunas formas de realización, el método implica la etapa de mezclar el tampón de transducción y la molécula de interés.
[0032] En algunas formas de realización, el método comprende la etapa de obtener y/o mantener las células en medio de cultivo antes de la transducción. En algunas formas de realización, la célula se siembra en un medio de cultivo, adecuado para la célula en particular, antes de la transducción. En algunas formas de realización, el método comprende además poner en contacto la célula con un medio de cultivo durante la transducción. En algunas formas de realización, el método incluye el paso de mezclar el tampón de transducción con un medio de cultivo.
[0033] En algunas formas de realización, el método comprende las etapas de obtención de las células y el mantenimiento de las células en medio de cultivo antes de la transducción y puesta en contacto de la célula con medio de cultivo durante la transducción. En algunas formas de realización, el método incluye el paso de mezclar el tampón de transducción con un medio de cultivo antes de poner en contacto la célula con el tampón de transducción. En algunas formas de realización, después de la transducción, se aspira el tampón de transducción y/o se lavan las células, por ejemplo, una o dos veces. Normalmente, en esta etapa, se agregará a las células un medio de cultivo regular, adecuado para el tipo de célula particular. En algunas formas de realización, el método comprende la etapa de obtener las células y/o mantener las células en el medio de cultivo después de la transducción.
[0034] En algunas formas de realización, la osmolalidad del tampón de transducción final se ajusta a la osmolalidad deseada mediante la adición de sal. En una realización preferida, el tampón de transducción final, que comprende la molécula de interés y/o el medio de cultivo, es hipertónico con respecto al citosol celular.
[0035] En algunas formas de realización, el método de la transducción no implica un portador transmembrana, por ejemplo seleccionado de un plásmido viral, una nanopartícula, un liposoma u otra vesícula lipídica (incluyendo micelas). En algunas formas de realización, el método de transducción no es viral, lo que significa que no se basa en un sistema de transfección viral y/o no implica un plásmido viral, por ejemplo, como portador transmembrana. En algunas formas de realización, el método de transducción no implica lípidos catiónicos, por ejemplo, como vehículos transmembrana. En algunas formas de realización, el método de transducción no implica liposomas, por ejemplo, como vehículos transmembrana. En algunas formas de realización, el método de transducción no implica nanopartículas, por ejemplo, como portadores transmembrana. En algunas formas de realización, el método de transducción no implica vesículas de membrana externa (OMV), por ejemplo, como portadores transmembrana. En algunas formas de realización, los métodos no implican péptidos que penetran en las células.
[0036] En algunas formas de realización, el método implica la activación o mejora de macropinocitosis y/o mejorar la lisis endosomal, mejorando así la absorción de las moléculas, en particular la molécula de interés, en la célula. En el contexto de esta solicitud, debe entenderse que los "endosomas", que son invaginaciones internas de la membrana celular implicadas en la macropinocitosis, y que comprenden una mezcla compleja de lípidos, se diferencian de los "liposomas" o "micelas", que son vesículas lipídicas sintéticas típicamente formadas a partir de un menor número de tipos de moléculas lipídicas y de "OMV", que son vesículas bacterianas que pueden modificarse para hacerlas adecuadas como vehículos transmembrana.
[0037] En una realización (el "primer protocolo" o "Protocolo 12/500), la transducción se lleva a cabo durante aproximadamente 12 horas a una osmolalidad de aproximadamente 500 mOsm/Kg. Por ejemplo, el día antes (aproximadamente 12 a 24 horas antes) de la transducción, las células se siembran en el medio de cultivo apropiado sin antibióticos. Al día siguiente (el día de la transducción), se prepara 1x "tampón de transducción 500" (tampón de transducción con una osmolalidad de 500 mOsm/kg) con la molécula de interés. El tampón de transducción 5x y la molécula de interés se mezclan con medio de cultivo celular para obtener tampón de transducción 1x a una osmolalidad de 500 mOsm/Kg. Esta mezcla de medio/tampón de transducción/molécula de interés se añade a la célula. La célula se incuba con la molécula de interés en la transducción de tampón durante aproximadamente 12 horas, después de lo cual, los medios de transducción se retiran y se intercambian por medios de cultivo regulares.
[0038] En otra forma de realización (el "segundo protocolo" o "Protocolo 3/700"), la transducción se realiza por un aproximadamente 3 horas a una osmolalidad de aproximadamente 700 mOsm/Kg. Por ejemplo, el día antes (aproximadamente de 12 a 24 horas antes) de la transducción, las células se siembran en el medio de cultivo apropiado sin antibióticos. Al día siguiente, se prepara 1x "tampón de transducción 500" con la molécula de interés. Se añade NaCl o RbCl u otra sal (ver más abajo) para ajustar la osmolalidad final a 700 mOsm/kg. Por ejemplo, se añaden 2 pl de NaCl 5 M a 98 pl de 1x "tampón de transducción 500" para obtener una osmolalidad final de 700 mOsm/kg. La célula se incuba con la molécula de interés en el tampón de transducción durante aproximadamente 3 horas, después de lo cual, el medio de transducción se retira y se cambia por medio de cultivo regular.
[0039] En otra forma de realización (el "tercer protocolo" o "Protocolo 2/1000), la transducción se lleva a cabo durante aproximadamente 2 horas a una osmolalidad de aproximadamente 1.000 mOsm/Kg. Por ejemplo, el día antes (aproximadamente 12 a 24 horas antes) transducción, las células se siembran en el medio de cultivo apropiado sin antibióticos. Al día siguiente, se mezclan 4 volúmenes de 1x "tampón de transducción 1000" con 1 volumen de 5x "tampón de transducción 500" que contiene la molécula de interés. La célula se incuba con el molécula de interés en el tampón de la transducción durante aproximadamente 2 horas, tiempo después del cual el medio de transducción se retira y se intercambian por medios de cultivo regulares.
[0040] En otra forma de realización (el "cuarto protocolo" o "protocolo de transducción adaptado a Cas9"), la transducción se realiza durante aproximadamente 60 a 90 minutos a una osmolalidad de aproximadamente 1250 mOsm/Kg. El compuesto de transducción se usa preferiblemente a una concentración de aproximadamente 250 mM. Este protocolo es particularmente útil para transducir moléculas con baja solubilidad, incluyendo, por ejemplo, la proteína nucleasa Cas9 que es parte del sistema de edición de genes CAS/CRISPR. Por ejemplo, el día antes (aproximadamente 12 a 24 horas antes) de la transducción, las células se siembran en el medio de cultivo apropiado, preferiblemente sin antibióticos. Al día siguiente, se agrega la molécula de interés al tampón de transducción. Las células se incuban con la molécula de interés en el tampón de transducción durante aproximadamente 60 a 90 minutos, después de lo cual se retira el medio de transducción y se cambia por medio de cultivo regular.
[0041] En otra realización, la transducción se realiza a osmolaridades combinadas. Por ejemplo, durante aproximadamente 2 horas a una osmolaridad de aproximadamente 1000 mOsm/kg seguido de aproximadamente 10 horas a una osmolaridad de aproximadamente 500 mOsm/kg. Por ejemplo, el día antes (aproximadamente de 12 a 24 horas antes) de la transducción, las células se cultivan en placas en el medio de cultivo apropiado sin antibióticos. Al día siguiente, se mezclan 4 volúmenes de 1x "tampón de transducción 1000" con 1 volumen de 5x "tampón de transducción 500" que contiene la molécula de interés. La célula se incuba con la molécula de interés en el tampón de transducción durante aproximadamente 2 horas, después de lo cual se retira el medio de transducción y se cambia por 1x "tampón de transducción 500" (tampón de transducción con una osmolalidad de 500 mOsm/kg), con o sin la molécula de interés. La célula se incuba con la molécula de interés en el "tampón de transducción 500" 1x durante aproximadamente 10-12 horas, después de lo cual, el medio de transducción se retira y se cambia por medio de cultivo regular.
[0042] Para evitar cualquier duda, se debe entender que estos métodos y protocolos son compatibles y combinables con los compuestos de transducción, sales, osmoprotectores, y otros componentes adicionales de la transducción de tampón descritos en detalle a continuación. Estos protocolos y métodos pueden usarse para transducir diversas moléculas de interés, incluidas combinaciones de moléculas de interés en células, como se describe en detalle a continuación.
Compuesto de transducción para transducción
[0043] Se requiere la inclusión de un compuesto de transducción en el tampón de transducción para una transducción eficiente. Por tanto, la invención proporciona tampones que comprenden al menos un compuesto de transducción como se describe en el presente documento.
[0044] Los inventores han encontrado que diversos compuestos, cuando se utilizan en el contexto del tampón de la transducción de la invención, permiten la transducción eficaz de una molécula de interés en una célula. Por tanto, un "compuesto de transducción" como se usa en este documento, se refiere a cualquier compuesto que potencia la transducción de una molécula de interés en una célula, cuando se usa en el contexto de un tampón de transducción de la invención. El ensayo de beta-lactamasa, como se describe en los ejemplos, puede usarse para determinar si un compuesto es o no un compuesto de transducción. Si se requiere un ensayo adicional para probar la eficacia de un compuesto de transducción, particularmente para demostrar la participación del mecanismo de macropinocitosis, se puede usar el ensayo Gal3-GFP descrito en el Ejemplo 14.
[0045] Se proporciona en consecuencia, en un aspecto, un método para identificar un compuesto de transducción, donde el método comprende
poner en contacto una célula que ha sido modificada para expresar una proteína de fusión de galectina-3-GFP (Gal3-GFP) con un compuesto de transducción candidato, usando un tampón de transducción o protocolo descrito en este documento (por ejemplo, el primer protocolo, segundo protocolo, tercer protocolo o cuarto protocolo descrito anteriormente); y
observar la localización de GAL3-GFP por emisión fluorescente verde;
en donde la localización de GAL3-GFP en vesículas intracelulares es indicativa de un compuesto de transducción eficaz.
[0046] En algunas formas de realización, el método para identificar un compuesto de transducción comprende además aislar el compuesto de transducción eficaz y, opcionalmente, la incorporación del compuesto de transducción en un tampón de transducción descrito en este documento o usando el compuesto de la transducción en un método de transducción descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, el compuesto de transducción candidato reemplaza al compuesto de transducción conocido en el tampón o protocolo de transducción descrito en el presente documento. En otras realizaciones, el compuesto de transducción candidato es adicional a un compuesto de transducción conocido en el tampón o protocolo de transducción descrito en el presente documento. En una realización preferida, la emisión fluorescente verde se compara con una célula de control que se ha tratado de la misma manera, excepto que no contiene el compuesto de transducción candidato. En algunas formas de realización, el compuesto de transducción es cualquier compuesto de transducción identificable por este método.
[0047] El primer compuesto de transducción que los inventores descubrieron fue una sulfobetaína no detergente (NDSB; por ejemplo NDSB-201). Los inventores probaron derivados de este compuesto (como las carbobetaínas no detergentes [NDCB]) y encontraron varios otros compuestos relacionados que también son compuestos de transducción. Aunque hay una variedad de estructuras de compuestos que funcionan, hay una serie de características comunes que pueden extraerse de los diversos compuestos diferentes, como se describe con más detalle a continuación.
[0048] Los inventores han encontrado que los compuestos de transducción comprenden generalmente al menos un grupo funcional hidrófilo. En algunas formas de realización, el compuesto de transducción tiene solo un grupo funcional hidrófilo; ejemplos de tales compuestos incluyen ácido pentanoico (ejemplo de compuesto n.° 23 en la Tabla 1) y n-butilamina (ejemplo de compuesto n° 24 en la Tabla 1). En algunas formas de realización, el compuesto de transducción tiene más de un grupo funcional hidrófilo, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o más.
[0049] Mientras que el compuesto de transducción permite la libertad sustancial en sus extremos, parece que un grupo hidrófilo se prefiere en cada extremo de la cadena de carbono. Por lo tanto, en realizaciones preferidas, el compuesto de transducción es un compuesto que tiene al menos dos grupos hidrófilos, cada uno separado por un grupo hidrófobo corto, como alquileno C1-5. Es probable que un alquileno con 6 o más carbonos en la cadena sea tóxico para las células. Los grupos hidrófilos pueden ser iguales o diferentes.
[0050] En algunas formas de realización, el compuesto de transducción es una betaína. Como se usa en este documento, el término "betaína" se refiere a cualquier compuesto químico neutro con un grupo funcional catiónico, que no lleva átomo de hidrógeno, y con un grupo funcional aniónico. Los ejemplos no limitantes de grupos funcionales catiónicos incluyen cationes de amonio cuaternario. Los ejemplos no limitantes de grupos funcionales aniónicos incluyen aniones carboxilato, sulfonato y fosfato.
[0051] En algunas formas de realización, el compuesto de transducción no es un detergente. En algunas formas de realización, el compuesto de transducción es una betaína no detergente. El término "betaína no detergente" (NDB) se refiere a una betaína que no forma micelas en solución. Por tanto, los compuestos de transducción que no son detergentes no forman liposomas ni micelas en solución.
[0052] Por ejemplo, en algunas formas de realización, el compuesto de transducción es una sulfobetaína no detergente (NDSB). Las n Ds B son betaínas que tienen un grupo sulfonato separado de un grupo de nitrógeno cuaternario, por un grupo hidrófobo corto, como C1-5 alquileno.
[0053] En algunas formas de realización, el compuesto es un compuesto de transducción de molécula pequeña. En algunas formas de realización, el compuesto de transducción tiene menos de 50 átomos de carbono, menos de 30 átomos de carbono, menos de 25 átomos de carbono o menos de 20 átomos de carbono. En algunas formas de realización, el compuesto de transducción tiene una masa de menos de 1000 g/mol, menos de 500 g/mol, menos de 400 g/mol, menos de 360 g/mol, menos de 300 g/mol, menos de 200 g/mol.
[0054] Sin desear estar ligado por la teoría, los inventores plantean la hipótesis de que estos compuestos se pueden plegar uno hacia el otro creando un hidrofóbico y un lado hidrofílico de la molécula dejando que el compuesto funcione particularmente bien como un compuesto de transducción, por ejemplo, como se muestra a continuación.
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[0055] En algunas formas de realización, el átomo de nitrógeno cuaternario es parte de una estructura de anillo alifático o aromático. En algunas formas de realización, el compuesto de transducción es un NDSB seleccionado de sal de dimetiletil-(3-sulfopropil)-amonio (NDSB-195, Vuillard et al (1994) FEBS Letters, 353, 294-296; Goldberg et al (1995/1996) Folding & Design, 1, 21-27), 3-(1-piridino)-1-propanosulfonato (NDSB-201), propanosulfonato de dimetilbencilamonio (NDSB-256), sal de dimetil-t-butil-(3-sulfopropil) amonio (NDSB-222t), 3-( 1 -metilpiperidina)-1-propanosulfonato (n Ds B221), sal de dimetil-(2-hidroxietil)-(sulfopropil)-amonio (NDSB-211; Vuillard et al (1995) Anal Biochem, 230, 290- 294). En una realización preferida, el compuesto de transducción es NDSB-201.
[0056] También se ha encontrado que carboxibetaínas no detergentes (NDCBs) funcionan como compuestos de transducción. Por tanto, en algunas formas de realización, el compuesto de transducción es un NDCB. Las NDCB son betaínas que tienen un grupo carboxilato separado de un grupo de nitrógeno cuaternario, por un grupo hidrófobo corto, tal como C1-5 alquileno. Los NDCB pueden plegarse en solución como se describió anteriormente para los NDSB, mejorando su capacidad de promoción de la transducción. Los inventores encontraron que la sustitución del grupo sulfonato de un NDSB por un grupo carboxilato para formar un NDCB no afecta negativamente a la eficacia de la transducción. Como se muestra en los ejemplos siguientes, muchos NDCB funcionan con una mayor eficiencia y con un impacto reducido sobre la viabilidad celular y/o la proliferación celular que los NDSB.
[0057] Los compuestos no de betaína que son de ion híbrido en solución en un amplio intervalo de pH también funcionan como compuestos de transducción. Por ejemplo, algunos aminoácidos, como el GABA (ácido gammaaminobutírico), que son zwiteriónicos en solución, también funcionan como compuestos de transducción. Los compuestos bipolares a menudo comprenden al menos un grupo funcional ácido y al menos un grupo funcional básico, que pueden ionizarse en solución. Los grupos ácidos incluyen grupos funcionales de ácido carboxílico, ácido sulfónico y ácido fosfónico. Los grupos básicos incluyen grupos amino. Por tanto, en algunas formas de realización, el compuesto de transducción es un ion híbrido, por ejemplo, un ion híbrido no detergente, que preferiblemente comprende al menos un grupo funcional ácido y al menos un grupo funcional básico. En ciertas realizaciones preferidas, el grupo funcional ácido está separado del al menos un grupo básico, por un grupo hidrófobo corto, tal como C1-5 alquileno.
[0058] También se ha encontrado sorprendentemente que compuestos no zwitteriónicos operan como compuestos de transducción. En lugar de tener un grupo funcional cargado negativamente (tal como carboxilato o sulfonato como se describió anteriormente), los compuestos que comprenden grupos bioisostéricos tales como una amida o tetrazol también funcionan como compuestos de transducción. Por tanto, en algunas formas de realización, el compuesto de transducción comprende un grupo funcional amida o tetrazol. En ciertas realizaciones preferidas, el agente promotor de la transducción (el compuesto de transducción) comprende un grupo de amida o tetrazol separado de otro grupo hidrófilo, preferiblemente amino o amonio, por un grupo hidrófobo corto, tal como C1-5 alquileno.
[0059] Así, en algunas formas de realización, el compuesto de transducción es un zwitterion o un compuesto no iónico dipolar con un grupo que es bioisostérico a un grupo funcional cargado negativamente. Se cree que debido al grupo bioisostérico, en combinación con un grupo funcional cargado positivamente, estos compuestos no iónicos híbridos tienen algunas "propiedades de iones híbridos", por ejemplo, para permitir el mecanismo de plegado descrito anteriormente. Los grupos que pueden ser bioisostéricos a un grupo funcional cargado negativamente incluyen, pero no se limitan a grupos funcionales amida y tetrazol (por ejemplo, vea los compuestos N° 43, N° 15, N° 29, N° 34, N° 30, N° 31 y N° 45). La Figura 6 muestra los resultados de los estudios que analizan las relaciones estructuralfuncionales de los compuestos de transducción.
[0060] De acuerdo con lo anterior, el compuesto de transducción puede ser un compuesto de fórmula I
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en donde
X se selecciona de NR1R2 , NR1R2R3+, OH y COOR4;
Y se selecciona de SO3H, SO3, COO-, CONH2, COOR12, CONR5R6 , tetrazol, OH, NR10R11 y H;
n es 3, 4, 5 o 6; R1, R2 y R3 cada uno, se seleccionan independientemente de H, C1-6 alquilo, C5-10 arilo, C6-15 aralquilo, COR9 ;
C1-6 alquilo, C5-10 arilo y C6-15 aralquilo pueden estar opcionalmente sustituidos con RY, OH o COOH; o R1 y R2 pueden unirse con el nitrógeno al que están unidos para formar heterociclilo;
o cuando X es NR1R2R3+, R3 puede estar ausente y R1 y R2 pueden unirse con el nitrógeno al que están unidos para formar heteroarilo;
R4 , R5, R6, R9 , R10, R11, R12 se seleccionan independientemente entre H y C1-6 alquilo;
R7 y R8 se seleccionan independientemente entre H, C1-6 alquilo y OH; heterociclilo es un anillo monocíclico que está saturado o parcialmente insaturado, que contiene cuando es posible 1 o 2 miembros del anillo seleccionados independientemente entre N, NR13, NR13R14+ y O, y 2 a 5 átomos de carbono;
el heterociclilo puede estar opcionalmente sustituido con C1-C6 alquilo, ácido carboxílico C1-C6 o C1-C6 alquilo sustituido con RY;
heteroarilo es un anillo aromático de 5 o 6 miembros que contiene, cuando sea posible, 1, 2 o 3 miembros del anillo seleccionados independientemente entre N, NR13, NR13R14+ y O; heteroarilo puede estar opcionalmente sustituido con C1-C6 alquilo, ácido carboxílico C1-C6 o C1-C6 alquilo sustituido con RY; R13 y R14 se seleccionan independientemente de H, C1-6 alquilo, ácido carboxílico C1-C6 y C1-C6 alquilo sustituido con RY;
alquilo es un hidrocarburo saturado lineal o ramificado;
RY se selecciona de SO3H, SO3, COO-, CONH2, COOR12, CONR5R6 , tetrazol, OH y NR10 R11;
Ácido carboxílico C1-6 significa -COOH o una cadena de C1-5 alquilo sustituida con COOH y tautómeros, solvatos, iones híbridos y sales de los mismos.
[0061] Los compuestos de transducción pueden en algunas formas de realización comprender un cuaternario o grupo de nitrógeno básico. Por tanto, en algunas formas de realización, el compuesto de transducción es un compuesto de fórmula I en donde X es NR1R2R3+ o NR1R2.
[0062] En algunas formas de realización R1, R2 y R3 , se seleccionan cada uno independientemente entre H y C1-6 alquilo que puede estar opcionalmente sustituido con RY, OH o COOH; o R1 y R2 pueden unirse con el nitrógeno al que están unidos para formar heterociclilo, preferiblemente piperidina, piperazina o morfolina, que pueden estar opcionalmente sustituidos; o R3 puede estar ausente y R1 y R2 pueden unirse con el nitrógeno al que están unidos para formar heteroarilo, preferiblemente piridilo, que puede estar opcionalmente sustituido.
[0063] En algunas formas de realización, el compuesto de la transducción es un compuesto de fórmula I en donde Y se selecciona de SO3H, SO3', COO', COOR12, Co NR5R6 y tetrazol, preferiblemente seleccionados del SO3H, SO3-, COO', COOR12 y CONR5R6 y más preferiblemente seleccionados entre COO-, COOH y CONR5R6
[0064] En algunas formas de realización RY se selecciona de SO3H, SO3-, COO-, COOR12, CONR5R6 y tetrazol, preferiblemente RY se selecciona de SO3H, SO3-, COO-, COOR12 y CONR5R6 , y más preferiblemente RY se selecciona de COO-, COOH y CONR5R6.
[0065] Se ha encontrado que cuando la cadena de carbono que separa X e Y es tres átomos de carbono de largo, la transducción se promueve de manera más eficiente. Por tanto, en algunas formas de realización, el compuesto de transducción es un compuesto de fórmula I en donde n es 3. En otras realizaciones, n es 3, 4 o 5. En algunas formas de realización preferidas, el compuesto de transducción es un compuesto que pertenece a un subconjunto de fórmula I, según la fórmula II
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en donde
X se selecciona entre NR1R2 y NR1R2R3+;
Y se selecciona de SO3H, SO3, COO-, CONH2, COOR12 y CONR5R6 ;
R1, R2 y R3 , se seleccionan cada uno independientemente de H y C1-6 alquilo que puede estar opcionalmente sustituido con OH o COOH; o R1 y R2 pueden unirse con el nitrógeno al que están unidos para formar heterociclilo, preferiblemente piperidina, piperazina o morfolina, que pueden estar opcionalmente sustituidos; o cuando X es NR1R2R3+, R3 puede estar ausente y R1 y R2 pueden unirse con el nitrógeno al que están unidos para formar heteroarilo, preferiblemente piridilo, que puede estar opcionalmente sustituido; y todos los demás grupos son como se definen en la fórmula I anterior.
[0066] En algunas formas de realización, el compuesto de transducción contiene un grupo de nitrógeno cuaternario. Por tanto, en algunas formas de realización, el compuesto de transducción es un compuesto de fórmula I o II en donde X es NR1R2R3+. En algunas formas de realización, el compuesto de transducción es un compuesto de fórmula I o II en donde X es NH3+.
[0067] En algunas formas de realización, el nitrógeno cuaternario puede ser parte de una estructura de anillo alifático 0 aromático. Por tanto, en algunas formas de realización, el compuesto de transducción es un compuesto de fórmula 1 o II en donde X es
Z se selecciona entre
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cada R15 se selecciona independientemente de H, C1-6 alquilo, ácido carboxílico C1-C6 y C1-C6 alquilo sustituido con RY;
R3 se selecciona de H, C1-6 alquilo, C5-10 arilo, C6-15 aralquilo, COR9 ; C1-6 alquilo, C5-10 arilo y C6-15 aralquilo pueden estar opcionalmente sustituidos con RY, OH o COOH. Preferiblemente R3 es -CH3;
R13 y R14 se seleccionan independientemente de H, C1-6 alquilo, ácido carboxílico C1-C6 y C1-C6 alquilo sustituido con RY
[0068] En algunas formas de realización, el compuesto de la transducción es un compuesto de fórmula I o II en donde X es (a), Z es NR13 o NR13R14+ y R13 es -CH2CH2CH2RY. Alternativamente, en otras realizaciones, el compuesto de transducción es un compuesto de fórmula I o II en donde X es (a), Z es CH2y R3 es -CH3.
[0069] En otras realizaciones, el compuesto de la transducción es un compuesto de fórmula I o II en donde X es
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Z se selecciona entre CR15 y NR13+;
R15 se selecciona de H, C1-6 alquilo y ácido carboxílico C1-C6 y C1-C6 alquilo sustituido con RY;
R13 se selecciona de H, C1-6 alquilo, ácido carboxílico C1-C6 y C1-C6 alquilo sustituido con RY
[0070] En algunas formas de realización, el compuesto de la transducción es un compuesto de fórmula I o II en donde X es (b), Z es NR13 y R13 es -CH2CH2CH2RY. Alternativamente, en otras realizaciones, el compuesto de transducción es un compuesto de fórmula I o II en donde X es (b) y Z es CH.
[0071] En algunas formas de realización, el compuesto de la transducción es un compuesto seleccionado de los compuestos en la Tabla 1. "Compuesto N°" como se usa aquí, se refiere a los compuestos en la Tabla 1 usando los números de los compuestos (N°) en la columna izquierda.
[0072] En algunas formas de realización, el compuesto de la transducción se selecciona a partir del compuesto N° 10, N° 11, N° 16, N° 42, N° 34, N°41, N° 40, N° 39, N° 33, N°15, N°11, N° 29, N° 46 y N° 36.
[0073] Donde afirmaciones se refieren a "los compuestos de la Tabla 1" se entiende que en algunas formas de realización, esto se refiere a todos los compuestos de la Tabla 1 excepto para el compuesto N° 32, o todos los compuestos de la Tabla, excepto para los compuestos N° 27, N° 07, N° 18, N° 09 y N° 32.
[0074] En algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende un compuesto de la transducción. En algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 o más) compuestos de transducción, por ejemplo, dos o más de los compuestos de transducción enumerados, en cualquier combinación posible. En la Figura 6F se proporcionan ejemplos de combinaciones de compuestos de transducción. En algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende el compuesto N° 1 y el compuesto N° 34. En algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende el compuesto N° 1 y el compuesto N° 20.
[0075] En algunas formas de realización, la concentración del compuesto de la transducción es de entre aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 500 mM, entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 400 mM, entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 300 mM, entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 200 mM, entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 100 mM, entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 200 mM, entre aproximadamente 2 mM y 100 mM, entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 80 mM, entre aproximadamente 3 mM y aproximadamente 75 mM, entre aproximadamente 4 mM y aproximadamente 70 mM, entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 60 mM, entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 50 mM, entre aproximadamente 25 mM y 40 mM, o aproximadamente 30 mM. En algunas formas de realización, la concentración del compuesto de transducción es aproximadamente 25 mM, por ejemplo, la concentración del compuesto de transducción es, en algunas formas de realización, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 25 mM, o aproximadamente 25 mM. En algunas formas de realización, la concentración del compuesto de transducción es al menos 1 mM, al menos 2 mM, al menos 3 mM, al menos 4 mM, al menos 5 mM, al menos 10 mM, al menos 20 mM, al menos 30 mM, al menos 40 mM, al menos 50 mM, al menos 60 mM, al menos 70 mM o al menos 80 mM, al menos 90 mM, al menos 100 mM, al menos 150 mM, al menos 200 mM, al menos 300 mM, al menos 400 mM o 500 mM.
[0076] En algunas formas de realización, la concentración del compuesto de la transducción es de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 500 mM, aproximadamente 200 mM a aproximadamente 400 mM, 200 mM a aproximadamente 300 mM, o aproximadamente 250 mM. Estos rangos de concentración más altos son particularmente útiles, por ejemplo, cuando se transducen proteínas de baja solubilidad, como Cas9. Debe entenderse que la concentración óptima de compuesto de transducción también dependerá del compuesto y su eficacia, pero el experto en la técnica puede determinarla fácilmente, por ejemplo, utilizando los experimentos y ensayos descritos en los ejemplos.
[0077] La descripción proporciona el compuesto N° 10. La divulgación también proporciona el compuesto N° 11. La divulgación también proporciona el compuesto N° 16. La divulgación también proporciona el compuesto N° 42. La divulgación también proporciona el compuesto N° 34. La divulgación también proporciona el compuesto N° 41. La divulgación también proporciona el compuesto N° 40.
[0078] La divulgación también proporciona el compuesto N° 39. La divulgación también proporciona el compuesto N° 33. La divulgación también proporciona el compuesto N° 15. La divulgación también proporciona el compuesto N° 11. La divulgación también proporciona el compuesto N° 29. La divulgación también proporciona el compuesto N° 36. La divulgación también proporciona el compuesto N° 46. Estos compuestos parecen ser nuevos. La divulgación también proporciona un compuesto de transducción, como se describe en cualquier lugar de la presente, para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia. En particular, se describe el compuesto N° 10, el compuesto N° 11 o el compuesto N° 16 para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
[0079] En algunas formas de realización, el compuesto de transducción es el compuesto N° 15 (BU-2026-05). Este compuesto es ventajoso porque da como resultado una alta eficiencia de transducción, mientras mantiene una buena viabilidad celular, incluso cuando se usa a altas concentraciones (ver Tabla 1).
[0080] En algunas formas de realización, el compuesto de transducción es el compuesto N° 10. En algunas formas de realización, el compuesto de transducción es el compuesto N° 11. En algunas formas de realización, el compuesto de transducción es el compuesto N° 16. En algunas formas de realización, el compuesto de transducción es el compuesto N° 42. En algunas formas de realización, el compuesto de transducción es el compuesto N° 34. En algunas formas de realización, el compuesto de transducción es el compuesto N° 41. En algunas formas de realización, el compuesto de transducción es el compuesto N° 11. En algunas formas de realización, el compuesto de transducción es el compuesto N° 40. En algunas formas de realización, el compuesto de transducción es el compuesto N° 39. En algunas formas de realización, el compuesto de transducción es el compuesto N° 29. En algunas formas de realización, el compuesto de transducción es el compuesto N° 15. En algunas formas de realización, el compuesto de transducción es el compuesto N° 36. En algunas formas de realización, el compuesto de transducción es el compuesto N° 46. En algunas formas de realización, el compuesto de transducción es el compuesto N° 20. Se ha demostrado que el compuesto N° 20 da como resultado tasas de supervivencia celular particularmente buenas en comparación con otros compuestos de transducción (por ejemplo, véase la Figura 18b ).
[0081] En algunas formas de realización, el compuesto de transducción es cualquier compuesto que tiene 20% o más, 30% o más, 40% o más, 50% o más, 60% o más, 70% o más, 80% o más, 90% o más, 100% o más, 110% o más, 120% o más, 150% o más, 200% o más, 300% o más, 400% o más, 500% o más, 600% o más, 700% o más, 800% o más, 1,000% o más eficacia de la transducción en comparación con el compuesto de referencia N° 1 en la Tabla 1 (NDSB-201), como se determina por los métodos descritos en el Ejemplo 1.
[0082] Del mismo modo, en algunas formas de realización, el método de transducción (en su conjunto) tiene 20% o más, 30% o más, 40% o más, 50% o más, 60% o más, 70% o más, 80% o más, 90% o más, 100 % o más, 110% o más, 120% o más, 150% o más, 200% o más, 300% o más, 400% o más, 500% o más, 600% o más, 700% o más, 800% o más, 1000% o más de eficiencia de transducción, usando el método que comprende el compuesto N° 1 como se muestra en la Tabla como control (es decir, como 100% de eficiencia de transducción).
[0083] Los ejemplos no limitantes de compuestos de la transducción con más de 100% de eficacia de transducción en comparación con el compuesto de referencia N° 1 en la Tabla 1 incluyen los compuestos de referencia N° 30, N° 17, N° 15, N° 38, N° 35, N° 11, N° 10, N° 28 y N° 37. Estos compuestos son compuestos de transducción particularmente eficaces. Por tanto, en algunas formas de realización, el compuesto de transducción se selecciona entre los compuestos N° 30, N° 17, N° 15, N° 38, N° 35, N° 11, N° 10, N° 28 y N° 37.
[0084] Otros compuestos de transducción preferidos incluyen N° 42, N° 1, N° 45, N° 43, N° 44, N° 15, N° 10, N° 11, N° 28, N° 37 y N° 46. Por tanto, en algunas formas de realización, el compuesto de transducción se selecciona de los compuestos N° 42, N° 1, N° 45, N° 43, N° 44, N° 15, N° 10, N° 11, N° 28, N° 37 y N° 46. Estos son compuestos que tienen o se espera que tengan eficacia de transducción de 50% o más con respecto al compuesto de control N° 1 y/o 75% o más viabilidad con respecto al compuesto de control N° 1.
[0085] En algunas situaciones puede ser ventajoso usar un compuesto de transducción en el tampón que provoca una reducción en la proliferación o viabilidad celular. Por ejemplo, en el caso del desarrollo de una vacuna, cierta toxicidad puede ser una ventaja. Los antígenos transducidos en células se muestran al sistema inmunológico. Si las células exhibidoras están enfermas o muriendo, la respuesta inmune se puede mejorar. Los compuestos de transducción adecuados para tales fines incluyen los compuestos N° 40, N° 41, N° 25, N° 35 y N° 38. Por tanto, en algunas formas de realización, el compuesto de transducción se selecciona de los compuestos N° 40, N° 41, N° 25, N° 35 y N° 38.
[0086] En otras formas de realización, el compuesto de transducción se selecciona de entre los compuestos N° 10, N° 11, N° 16, N° 42, N° 34, N° 41, N° 40, N° 39, N° 33, N° 15, N° 11, N° 29, N° 36 y N° 46. Estos son los compuestos de transducción que se cree que son compuestos nuevos.
[0087] Los compuestos de transducción descritos en este documento pueden existir como monómeros, dímeros o multímeros. Por ejemplo, el compuesto N° 42 es activo como dímero. Por tanto, en algunas formas de realización, el compuesto de transducción se usa en su forma monomérica, dimérica o multimérica. En algunas formas de realización, el compuesto de transducción es la forma dimérica del compuesto N° 42.
[0088] La invención también proporciona el uso de un compuesto de transducción como se describe anteriormente para la transducción de una o más moléculas en una célula.
Agonistas de GABA
[0089] Como se mencionó anteriormente, uno de los compuestos que se encontró que era un compuesto de transducción fue un ácido gamma-aminobutírico (GABA, compuesto N° 20) que es un importante neurotransmisor en el cerebro. GABA actúa estimulando la activación de los receptores GABA, de los cuales se han identificado tres clases: GABA-A, GABA-B y GABA-C. Los receptores GABA son estimulados por una gama notablemente amplia de estructuras químicas que van desde estructuras simples como el etanol y el propio GABA, hasta benzodiazepinas, muscimol y baclofeno aparentemente no relacionados. Dado que la estructura química de los compuestos de transducción de proteínas eficaces también muestra cierto grado de libertad, los inventores plantean la hipótesis de que la señalización de GABA podría desempeñar un papel activo en el efecto de transducción. De hecho, los inventores encontraron que la adición de agonistas de GABA al tampón de transducción que comprende una sal y un compuesto de transducción (tal como NDSB-201), dio como resultado una mayor transducción de p-lactamasa en fibroblasto embrionario de ratón (MEF). Por tanto, se pueden incluir agonistas de GABA en el tampón de transducción para mejorar aún más la eficacia de la transducción.
[0090] Los procedimientos para identificar agonistas de GABA son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los agonistas de GABA adecuados para su uso en el tampón de transducción pueden identificarse mediante un ensayo que mide la activación de los receptores de GABA por un compuesto dado midiendo los cambios en el potencial de membrana utilizando tecnología de pinzamiento de parche en cortes de cerebro (Técnicas de pinzamiento de parche, manuales de protocolos de Springer, 2012, págs,71-83). También hay ensayos comerciales disponibles para identificar agonistas de GABA-B (por ejemplo, "Listo para el ensayo" de Millipore). Los agonistas de GABa adecuados para su uso en los tampones de transducción descritos en este documento pueden identificarse usando tales ensayos.
[0091] Por lo tanto, en algunas formas de realización, la transducción de tampón comprende además un agonista de GABA. Un agonista de GABA incluye cualquier compuesto que active la vía de señalización de GABA, por ejemplo, cualquier compuesto que se una y/o active un receptor de GABA (por ejemplo, receptores de GABA-A, GABA-B y/o GABA-C), por ejemplo, según se identifique utilizando el ensayo de pinzamiento de parche o el ensayo de Millipore mencionado anteriormente. Los ejemplos de agonistas de GABA incluyen, entre otros, SKF-97541, acamprosato, barbitúricos, benzodiazepinas, etanol, metacualona, muscimol, no benzodiazepinas (zaleplon, zolpidem, zopiclona), picamilon, progabida, tiagaol, 1,4-butanodi, GBL (Y-butirolactona), GHB (ácido Y-hidroxibutírico), GHV (ácido yhidroxivalérico), GVL (y-valerolactona), lesogaberán, fenibut, ácido (Z)-4-amino-2-butenoico, (+) ácido cis-2-aminometilcidopropano carboxílico, arabinósido de N4-cloroacetilcitosina, GABOB (ácido Y-amino-betahidroxibutírico) y progabida.
[0092] En algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende una sal y un compuesto de la transducción y adicionalmente comprende muscimol y/o SKF-97541.
[0093] En algunas formas de realización, el agonista de GABA está incluido en el tampón de transducción a concentraciones en rangos micromolares o nanomolares. Por ejemplo, en algunas formas de realización, el agonista de GABA tiene una concentración de aproximadamente 0,1 pM y aproximadamente 100 pM, entre aproximadamente 1 pM y aproximadamente 90 pM, entre aproximadamente 2 pM y aproximadamente 80 pM, entre aproximadamente 3 pM y aproximadamente 75 pM, entre aproximadamente 4 pM y aproximadamente 70 pM, entre aproximadamente 5 pM y aproximadamente 60 pM, entre aproximadamente 10 pM y aproximadamente 50 pM, entre aproximadamente 25 pM y 40 pM, o aproximadamente 30 pM. En algunas formas de realización, el agonista de GABA tiene una concentración de aproximadamente 10 pM, de aproximadamente 25 pM o de aproximadamente 50 pM. En otras formas de realización, el agonista de GABA tiene una concentración de entre aproximadamente 0,1 nM y aproximadamente 100 nM, entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 90 nM, entre aproximadamente 2 nM y aproximadamente 80 nM, entre aproximadamente 3 nM y aproximadamente 75 nM, entre aproximadamente 4 nM y aproximadamente 70 nM, entre aproximadamente 5 nM y aproximadamente 60 nM, entre aproximadamente 10 nM y aproximadamente 50 nM, entre aproximadamente 25 nM y 40 nM, o aproximadamente 30 nM. En algunas formas de realización, el agonista de GABA tiene una concentración de aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 25 nM o de aproximadamente 50 nM.
[0094] Otros neurotransmisores pueden mejorar la transducción de manera similar. Por tanto, en algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende una sal, un compuesto de transducción y además comprende un neurotransmisor.
Sal para uso en el tampón de transducción
[0095] La sal para usar en el tampón de transducción de la invención se selecciona entre una sal de sodio, litio, potasio, cesio o rubidio.
Como se muestra en la Figura 5A, todas las sales relacionadas con Na probadas (de acuerdo con la tabla periódica) incluyendo LiCl, KCl, CsCl, RbCl tenían actividad transductora de proteínas, con Na y Rb demostrando la actividad más alta. Además, se probó si otras sales de sodio podrían inducir la absorción de proteínas. Como se muestra en la Figura 5A, el gluconato de sodio mediaba eficazmente la transducción de p-lactamasa con una eficiencia similar a la de NaCl y RbCl. Finalmente, se probó si el aumento de la tonicidad utilizando compuestos no relacionados también desencadenaría la transducción de proteínas. Como se muestra en la Figura 5A, la sacarosa, lactulosa, sorbitol y manitol no lograron inducir la transducción de proteínas a 700 mOsm/kg, lo que sugiere que la transducción de proteínas depende específicamente de la hipertonicidad inducida por sodio o sales relacionadas con el sodio. En los ejemplos se proporcionan ensayos para identificar sales inductoras de hipertonicidad adecuadas para su uso en el tampón de transducción de la invención (véase el Ejemplo 6). Por tanto, preferiblemente, la sal puede aumentar la tonicidad a través de la membrana celular, es decir, la sal es una sal "hipertónica". La tonicidad se explica con más detalle a continuación.
[0096] La sal es una sal de sodio, litio, potasio, cesio, o rubidio, preferiblemente una sal de sodio o de rubidio. En algunas formas de realización, la sal es un cloruro, gluconato, carbonato, sulfonato, sulfato, sulfuro, bromuro, yoduro o fluoruro, preferiblemente el cloruro o gluconato. Los ejemplos no limitantes incluyen cloruro de sodio, gluconato de sodio, cloruro de litio, gluconato de litio, cloruro de potasio, gluconato de potasio, cloruro de cesio, gluconato de cesio, cloruro de rubidio y gluconato de rubidio. En algunas formas de realización, se incluye una sal en el tampón de transducción. En algunas formas de realización, se incluye más de una sal en el tampón de transducción, por ejemplo, dos, tres, cuatro o cinco sales.
[0097] Curiosamente, la transducción de proteína fue fuertemente inhibida por inhibidores específicos de intercambio Na+/H+ tal como EIPA o DMA, inhibidores específicos de una familia de proteínas de antiportador de sodio-hidrógeno (Nhe) (Figura 5B). Estos datos sugieren que el proceso de transducción implica la captación celular activa de compuestos aplicados exógenamente a través de macropinocitosis. Esto se confirmó además comparando la transducción de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) de embriones knockout de Nhel con MEF heterocigotos y de tipo salvaje de Nhel. Como se muestra en la Figura 5C, la transducción de proteínas se derogó casi por completo en fibroblastos nulos de Nhel. Los fibroblastos de embriones heterocigotos Nhe1+/- mostraron una actividad de transducción de proteínas reducida en comparación con los compañeros de camada de tipo salvaje (Figura 5C). Estos resultados demuestran que Nhel es un mediador importante de la transducción de proteínas, pero permanece una actividad de transducción de proteínas residual en ausencia de expresión de Nhel. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, los inventores plantean la hipótesis de que la activación de tales transportadores Nhe conduce a la activación de la vía de macropinocitosis, que es el primer paso en el proceso de transducción.
[0098] Por lo tanto, en una realización preferida, la sal es cualquier sal capaz de unirse a y/o activar un transportador de sodio/hidrógeno (Na+/H+), tal como un transportador de Nhe, por ejemplo un transportador de NheI. Nhel es una enzima ubicua unida a la membrana que participa en la regulación del volumen y el pH de las células de vertebrados.
[0099] En algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende un activador y/o potenciador de un transportador de sodio/hidrógeno, tal como el transportador de NheI, además de la sal. Por ejemplo, se ha demostrado que varios factores de crecimiento inducen macropinocitosis activando Nhel y mejorando el intercambio Na+/H+. Por consiguiente, en algunas formas de realización, el activador o potenciador de un transportador de sodio/hidrógeno es una citoquina o factor de crecimiento. En algunas formas de realización, el activador o potenciador de un transportador de sodio/hidrógeno es factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), insulina, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF). Los agonistas de moléculas pequeñas de la señalización de citocinas o factores de crecimiento también pueden inducir la actividad de Nhel. Otros ejemplos de activadores de NHE1 incluyen, pero no se limitan a agonistas de moléculas pequeñas de señalización de citocinas o factores de crecimiento, angiotensina II, glucocorticoides y hormonas (Alexander RT, J Exp Biol 212, 1630-1637, 2009). En algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende más de un activador y/o potenciador de un transportador de sodio/hidrogeno, por ejemplo uno, dos, tres, cuatro o cinco. Se contempla cualquier combinación de los activadores y/o potenciadores anteriores, con o sin una sal, como se describe anteriormente.
[0100] En una realización, la invención proporciona una transducción de tampón que comprende un activador y/o potenciador de un transportador de sodio/hidrógeno, tal como un transportador de Nhe y un compuesto de la transducción.
[0101] Otros activadores y/o potenciadores de macropinocitosis o lisis endosomal también pueden ser útiles en el contexto de la invención. Por ejemplo, los presentes inventores demostraron que un péptido de fusión corto de dTAT-HA2, que se ha demostrado previamente que mejora el escape de proteínas de los macropinosomas, mejora la transducción de proteínas y es particularmente eficaz en células madre embrionarias de ratón (mESC). Por tanto, en algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende adicionalmente un activador y/o potenciador de macropinocitosis o un facilitador del escape macropinosomal. En algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende adicionalmente péptido de fusión dTAT-HA2. En algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende adicionalmente un péptido lisogénico. Por ejemplo, en algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende adicionalmente un activador y/o potenciador de la lisis endosomal.
[0102] También se proporciona el uso de un péptido lisogénico para mejorar la transducción de una molécula de interés en una célula, preferiblemente como parte de un tampón de transducción descrito en este documento.
Inhibición de la transducción
[0103] Los inventores han demostrado que la transducción mediante los métodos descritos en el presente documento se produce mediante macropinocitosis y requiere remodelación de actina. Por tanto, los inhibidores específicos de estos procesos pueden prevenir la transducción.
[0104] En algunas formas de realización, los métodos de transducción pueden ser inhibidos por la citocalasina D o latrunculina A, u otros inhibidores específicos de la actina de transporte de polimerización y de la vesícula. De manera similar, los métodos de transducción pueden ser inhibidos por inhibidores específicos del intercambio Na+/H+ por transportadores Nhe, tales como EIPA o DMA.
Intervalos de osmolalidad
[0105] La sal, como se definió anteriormente, se agrega al tampón de transducción en cantidades apropiadas para lograr la osmolalidad deseada. La osmolalidad del tampón de transducción se puede determinar mediante métodos conocidos en la técnica usando un osmómetro o se puede calcular, por ejemplo, si se conoce la presión osmolar del medio que constituye el volumen restante del tampón. Por lo tanto, la sal se puede agregar para ajustar la osmolalidad del tampón al nivel deseado (ver, por ejemplo, el Ejemplo 6).
[0106] La osmolalidad es la concentración de una solución en términos de osmoles de solutos por kilogramo de disolvente. Se diferencia de la osmolaridad, que es la concentración de osmoles de solutos por volumen de disolvente. La osmolaridad depende de la temperatura porque el agua cambia su volumen con la temperatura. Por tanto, la osmolalidad es la medida preferida porque no depende de la temperatura. Si la concentración de solutos es muy baja, la osmolaridad y la osmolalidad se consideran equivalentes.
[0107] La tonicidad, por el contrario, se define por la concentración de todos los solutos que no atraviesan una membrana celular, es decir, la concentración de solutos que dan como resultado una presión osmótica a través de la membrana celular. En el contexto del tampón de transducción, la hiperosmolalidad se logra usando sales hipertónicas, como las sales descritas anteriormente. Para que el método de transducción funcione, es importante que exista presión osmótica a través de la membrana celular. Por tanto, mientras que el tampón de transducción puede definirse por osmolalidad (en aislamiento de la célula), el método de transducción requiere que el tampón de transducción sea hipertónico con respecto al citosol celular. Una célula colocada en una solución hipertónica, tal como un tampón de transducción descrito en este documento, perderá agua por ósmosis. Esto hace que la célula se encoja y tiende a aumentar el espacio entre las células de una población. Para compensar la pérdida de volumen celular, las células activan la macropinocitosis, es decir, la entrada de macromoléculas del entorno extracelular. Debe entenderse que la osmolalidad óptima del tampón de transducción es específica del tipo de célula y se define, en parte, por la osmolalidad del medio de cultivo utilizado para mantener la célula antes de la transducción y/o la osmolalidad del citosol celular.
[0108] Así, en algunas formas de realización, el método para la transducción de una molécula de interés en una célula implica la etapa de aumentar la presión osmótica exterior de la célula. En algunas formas de realización, existe una presión osmótica a través de la membrana celular. En algunas formas de realización, el tampón de transducción es hipertónico con respecto al medio de cultivo en donde se mantuvo la célula antes de la transducción y/o con respecto al citosol celular. En otras palabras, en algunas formas de realización, la osmolalidad del tampón de transducción es mayor que la osmolalidad del medio de cultivo en donde se mantuvo la célula antes de la transducción y/o mayor que el citosol celular.
[0109] Osmolalidad normal del suero humano es de aproximadamente 275-295 mOsm/kg. Si bien se ha utilizado la elevación temporal de la osmolalidad sérica para reducir el edema cerebral en pacientes con accidente cerebrovascular, la osmolalidad global elevada prolongada en un ser humano puede provocar complicaciones y, en casos graves, puede ser fatal. Por esta razón, las composiciones farmacéuticas son típicamente isotónicas (tienen aproximadamente la misma osmolalidad que el suero). Sin embargo, las células individuales pueden sobrevivir a osmolalidades mucho más altas (por ejemplo, hasta aproximadamente 1000 mOsm/kg). Por lo tanto, los organismos vivos pueden tolerar una elevación moderada de la osmolalidad durante varios días y una osmolalidad alta temporal a nivel local.
[0110] La hiperosmolalidad se refiere a un aumento anormal de la osmolalidad de una solución, especialmente un fluido corporal o medio de cultivo. La osmolalidad a la que se mantienen las células humanas es típicamente de aproximadamente 275-295 mOsm/kg pero, por ejemplo, los embriones de preimplantación se cultivan a una osmolalidad de aproximadamente 250-260 mOsm/kg. Por tanto, en el contexto de una célula humana típica, la hiperosmolalidad se refiere a una osmolalidad de más de aproximadamente 250 mOsm/kg. Por lo tanto, es probable que un tampón de transducción con una osmolalidad de más de aproximadamente 295 mOsm/kg sea hipertónico con respecto a una célula humana típica, mientras que un tampón de transducción con una osmolalidad de más de aproximadamente 260 mOsm/kg sea hipertónico con respecto a a los embriones tempranos. La hipoosmolalidad se refiere a una disminución anormal de la osmolalidad de una solución, especialmente un fluido corporal. Por lo tanto, en el contexto de las células humanas típicas, la hipoosmolalidad se refiere a una osmolalidad de menos de aproximadamente 295 mOsm/kg. Por tanto, es probable que un tampón de transducción con una osmolalidad mediada por sales tónicas de menos de aproximadamente 295 mOsm/kg sea hipotónico con respecto a una célula humana típica. En el contexto de un embrión típico, hipoosmolalidad se refiere a una osmolalidad de menos de aproximadamente 260 mOsm/kg. Por tanto, es probable que un tampón de transducción con una osmolalidad mediada por sales tónicas de menos de aproximadamente 260 mOsm/kg sea hipotónico con respecto a un embrión temprano típico.
[0111] El choque osmótico es un cambio repentino en la concentración de soluto alrededor de una célula, que provoca un cambio rápido en el movimiento del agua a través de su membrana celular. En una realización preferida, el método de transducción no requiere ni implica un choque hipoosmótico de las células o un entorno hipoosmótico en ninguna etapa. En algunas formas de realización, el método para transducir una célula implica un choque hiperosmótico. Sin embargo, cualquier choque o estrés osmótico preferiblemente se mantiene al mínimo (ver la sección más adelante sobre osmoprotectores).
[0112] En algunas formas de realización, el tampón de la transducción no es isotónica y/o no iso-osmolar con respecto a los medios de cultivo en donde la célula se mantiene antes de la transducción y/o con respecto al citosol de la célula.
En algunas formas de realización, el tampón de transducción no es hipotónico con respecto al medio de cultivo en donde se mantuvo la célula antes de la transducción y/o con respecto al citosol celular. En una realización preferida, el tampón de transducción es hipertónico y/o hiperosmolar con respecto al medio de cultivo en donde se mantuvo la célula antes de la transducción y/o con respecto al citosol celular.
[0113] En algunas formas de realización, el tampón de transducción tiene una osmolalidad de más de 250 mOsm/kg, por ejemplo más de 300 mOsm/kg. Por ejemplo, el tampón de transducción puede tener una osmolalidad de más de 350 mOsm/kg, más de 400 mOsm/kg, más de 450 mOsm/kg, más de 500 mOsm/kg, más de 550 mOsm/kg, más de 600 mOsm/kg, más de 650 mOsm/kg, más de 700 mOsm/kg, más de 750 mOsm/kg, más de 800 mOsm/kg, más de 850 mOsm/kg, más de 900 mOsm/kg, más de 950 mOsm/kg, más de 1000 mOsm/kg, más de 1100 mOsm/kg, más de 1200 mOsm/kg, más de 1300 mOsm/kg, más de 1400 mOsm/kg o más de 1.500 mOsm/kg, más de 1600 mOsm/kg, más de 1700 mOsm/kg, más de 1800 mOsm/kg, o más de 1900 mOsm/kg, más de 2000 mOsm/kg, más de 2100 mOsm/kg, más de 2200 mOsm/kg, más de 2300 mOsm/kg, más de 2400 mOsm/kg, más de 2500 mOsm/kg, más de 2500 mOsm/kg, más de 2600 mOsm/kg, más de 2700 mOsm/kg, más de 2800 mOsm/kg, más de 2900 mOsm/kg, o aproximadamente 3000 mOsm/kg.
[0114] En algunas formas de realización, el tampón de transducción tiene una osmolalidad de menos de 3.000 mOsm/kg, por ejemplo de menos de 2,500 mOsm/kg. Por ejemplo, el tampón de transducción puede tener una osmolalidad de menos de 2000 mOsm/kg, menos de 1900 mOsm/kg, menos de 1800 mOsm/kg, menos de 1700 mOsm/kg, menos de 1600 mOsm/kg, menos de 1.500 mOsm/kg, menos de 1400 mOsm/kg, menos de 1300 mOsm/kg, menos de 1200 mOsm/kg, menos de 1000 mOsm/kg, menos de 900 mOsm/kg, menos de 800 mOsm/kg o menos de 700 mOsm/kg, menos de 600 mOsm/kg, menos de 500 mOsm/kg, menos de 400 mOsm/kg, o alrededor de 400 mOsm/kg.
[0115] En algunas formas de realización, el tampón de transducción tiene una osmolalidad de al menos 250 mOsm/kg, al menos 300 mOsm/kg. Por ejemplo, el tampón de transducción puede tener una osmolalidad de al menos 350 mOsm/kg, al menos 400 mOsm/kg, al menos 450 mOsm/kg, al menos 500 mOsm/kg, al menos 550 mOsm/kg, al menos 600 mOsm/kg, al menos 650 mOsm/kg, al menos 700 mOsm/kg, al menos 750 mOsm/kg, al menos 800 mOsm/kg, al menos 850 mOsm/kg, al menos 900 mOsm/kg, al menos 950 mOsm/kg, al menos 1000 mOsm/kg, al menos 1100 mOsm/kg, al menos 1200 mOsm/kg, al menos 1300 mOsm/kg, al menos 1400 mOsm/kg al menos 1.500 mOsm/kg, al menos 1600 mOsm/kg, al menos 1700 mOsm/kg, al menos 1800 mOsm/kg, al menos 1900 mOsm/kg, al menos 2000 mOsm/kg, al menos 2100 mOsm/kg, al menos 2200 mOsm/kg, al menos 2300 mOsm/kg, en al menos 2400 mOsm/kg, al menos 2500 mOsm/kg, al menos 2600 mOsm/kg, al menos 2700 mOsm/kg, al menos 2800 mOsm/kg, al menos 2900 mOsm/kg, al menos 3000 mOsm/kg, o aproximadamente 3000 mOsm/kg. En algunas formas de realización, el tampón de transducción tiene una osmolalidad de al menos 1250 mOsm/kg.
[0116] En algunas formas de realización, la osmolalidad se encuentra en el intervalo de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 1.500 mOsm/kg, aproximadamente 300 mOsm/kg a aproximadamente 1.500 mOsm/kg, aproximadamente 400 mOsm/kg a aproximadamente 1.500 mOsm/kg, aproximadamente 500 mOsm/kg a aproximadamente 1.500 mOsm/kg, aproximadamente 600 mOsm/kg a aproximadamente 1.500 mOsm/kg, aproximadamente 700 mOsm/kg a aproximadamente 1.500 mOsm/kg, aproximadamente 800 mOsm/kg a aproximadamente 1.500 mOsm/kg, aproximadamente 900 mOsm/kg a aproximadamente 1.500 mOsm/kg, aproximadamente 1000 mOsm/kg a aproximadamente 1.500 mOsm/kg, aproximadamente 1100 mOsm/kg a aproximadamente 1.500 mOsm/kg, aproximadamente 1200 mOsm/kg a aproximadamente 1.500 mOsm/kg, aproximadamente 1300 mOsm/kg a aproximadamente 1.500 mOsm/kg o aproximadamente 1400 mOsm/kg a aproximadamente 1.500 mOsm/kg, aproximadamente 300 mOsm/kg a aproximadamente 1000 mOsm/kg, aproximadamente 300 mOsm/kg a aproximadamente 800 mOsm/kg, aproximadamente 300 mOsm/kg a aproximadamente 600 mOsm/kg, aproximadamente 400 mOsm/kg a aproximadamente 600 mOsm/kg, aproximadamente 450 mOsm/kg a aproximadamente 550 mOsm/kg, aproximadamente 400 mOsm/kg a aproximadamente 800 mOsm/kg, aproximadamente 500 mOsm/kg a aproximadamente 800 mOsm/kg, aproximadamente 600 mOsm/kg a aproximadamente 800 mOsm/kg, o aproximadamente 700 mOsm/kg a aproximadamente 800 mOsm/kg, aproximadamente 750 mOsm/kg a aproximadamente 850 mOsm/kg. En algunas formas de realización, la osmolalidad está en el intervalo de aproximadamente 800 mOsm/kg a aproximadamente 900 mOsm/kg, aproximadamente 850 mOsm/kg a aproximadamente 950 mOsm/kg, aproximadamente 900 mOsm/kg a aproximadamente 1000 mOsm/kg, aproximadamente 950 mOsm/kg a aproximadamente 1050 mOsm/kg, aproximadamente 1000 mOsm/kg a aproximadamente 1100 mOsm/kg, aproximadamente 1050 mOsm/kg a aproximadamente 1150 mOsm/kg, aproximadamente 1100 mOsm/kg a aproximadamente 1200 mOsm/kg, aproximadamente 1150 mOsm/kg a aproximadamente 1250 mOsm/kg, aproximadamente 1200 mOsm/kg a aproximadamente 1300 mOsm/kg, aproximadamente 1250 mOsm/kg a aproximadamente 1350 mOsm/kg, aproximadamente 1300 mOsm/kg a aproximadamente 1400 mOsm/kg, aproximadamente 1350 mOsm/kg a aproximadamente 1450 mOsm/kg, aproximadamente 1400 mOsm/kg a aproximadamente 1.500 mOsm/kg, aproximadamente 1600 mOsm/kg a aproximadamente 1800 mOsm/kg, o aproximadamente 1700 mOsm/kg a aproximadamente 1800 mOsm/kg, aproximadamente 1750 mOsm/kg a aproximadamente 1850 mOsm/kg, aproximadamente 1800 mOsm/kg a aproximadamente 1900 mOsm/kg, aproximadamente 1850 mOsm/kg a aproximadamente 1950 mOsm/kg, aproximadamente 1900 mOsm/kg a aproximadamente 2000 mOsm/kg, aproximadamente 1950 mOsm/kg a aproximadamente 2050 mOsm/kg, aproximadamente 2000 mOsm/kg a aproximadamente 2100 mOsm/kg, aproximadamente 2050 mOsm/kg a aproximadamente 2150 mOsm/kg, aproximadamente 2100 mOsm/kg a aproximadamente 2200 mOsm/kg, aproximadamente 2150 mOsm/kg a aproximadamente 2250 mOsm/kg, aproximadamente 2200 mOsm/kg a aproximadamente 2300 mOsm/kg, aproximadamente 2250 mOsm/kg a aproximadamente 2350 mOsm/kg, aproximadamente 2300 mOsm/kg a aproximadamente 2400 mOsm/kg, aproximadamente 2350 mOsm/kg a aproximadamente 2450 mOsm/kg, aproximadamente 2400 mOsm/kg a aproximadamente 2500 mOsm/kg, aproximadamente 2600 mOsm/kg a aproximadamente 2800 mOsm/kg, o aproximadamente 2700 mOsm/kg a aproximadamente 2800 mOsm/kg, aproximadamente 2750 mOsm/kg a aproximadamente 2850 mOsm/kg, aproximadamente 2800 mOsm/kg a aproximadamente 2900 mOsm/kg, aproximadamente 2850 mOsm/kg a aproximadamente 2950 mOsm/kg, aproximadamente 2900 mOsm/kg a aproximadamente 3000 mOsm/kg.
[0117] En algunas formas de realización, la osmolalidad se encuentra en el intervalo de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 3.000 mOsm/kg, aproximadamente 300 mOsm/kg a aproximadamente 3.000 mOsm/kg, aproximadamente 350 mOsm/kg a aproximadamente 3.000 mOsm/kg, aproximadamente 400 mOsm/kg a aproximadamente 3000 mOsm/kg, aproximadamente 450 mOsm/kg a aproximadamente 3000 mOsm/kg, aproximadamente 500 mOsm/kg a aproximadamente 3000 mOsm/kg.
[0118] En una realización, la osmolalidad del tampón de la transducción es de aproximadamente 800 mOsm/kg. Se ha demostrado que esta osmolalidad es apropiada para fibroblastos embrionarios de ratón (MEF). En otra realización, la osmolalidad del tampón de transducción es de aproximadamente 500 mOsm/kg. Se ha demostrado que esta osmolalidad es apropiada para células madre embrionarias de ratón (mESC), células madre pluripotentes inducidas por humanos (hIPSC) y células madre neurales murinas y humanas. Sin embargo, como se explicó anteriormente, el experto en la materia apreciará que, dependiendo del tipo de célula diana, la naturaleza de la molécula transducida y la osmolalidad del entorno celular antes de la transducción, cambiará la osmolalidad preferida del tampón de transducción.
[0119] Osmolalidades más altas también pueden ser preferibles cuando la molécula de interés es una proteína mal soluble. Por ejemplo, se prefiere una osmolalidad de aproximadamente 1000 mOsm/kg para proteínas poco solubles. En algunas formas de realización, se prefiere una osmolalidad de aproximadamente 1250 mOsmol/kg, por ejemplo, para proteínas poco solubles, por ejemplo, para la transducción de la proteína nucleasa Cas9, por ejemplo, en el contexto de la edición del gen CRISPR-Cas9.
[0120] En general, cuanto mayor es la osmolaridad del tampón de transducción, más eficiente será el tampón, es decir, menor es el tiempo requerido para la transducción. Sin embargo, también existe una compensación porque las altas osmololalidades pueden causar estrés osmótico y reducir la proliferación y/o viabilidad celular (ver más abajo).
[0121] Los inventores han desarrollado ensayos para optimizar el tiempo para la transducción (el "tiempo de incubación" o "tiempo de transducción" - ver abajo) y la osmolalidad del tampón (véase la Figura 10 y el Ejemplo 6). Por tanto, el experto en la materia podría utilizar estos ensayos para optimizar el tiempo de transducción y/o la osmolalidad del tampón.
Osmoprotector para transducción
[0122] La sal en el tampón de transducción aumenta la osmolalidad del tampón de transducción de manera que durante los métodos de transducción el tampón de transducción es hipertónico con respecto a la célula. Esto puede provocar estrés osmótico en las células y, en determinadas circunstancias, puede reducir la proliferación o la viabilidad celular (por ejemplo, según se mide mediante la incorporación de BrdU; consulte la sección de Ejemplos). Los inventores encontraron que la adición de osmoprotectores puede proteger contra estos efectos.
[0123] Los osmoprotectores son moléculas pequeñas que actúan como osmolitos y ayudan a proteger las células y los organismos del estrés osmótico. Químicamente, los osmoprotectores se pueden dividir en tres tipos: betaínas y compuestos afines, polioles y azúcares (por ejemplo, glicerol, manitol y trehalosa) y aminoácidos. Las betaínas son derivados metílicos de la glicina en los que el átomo de nitrógeno está completamente metilado, es decir, hay compuestos de amonio cuaternario. Otros derivados metílicos de glicina útiles en el contexto de esta invención incluyen, pero no se limitan a sarcosina y dimetilglicina. Para el experto en la materia estará claro que algunos de los compuestos de transducción descritos en el presente documento pueden, por tanto, funcionar como osmoprotectores. Un ejemplo no limitante de un compuesto de transducción que también funciona como osmoprotector es GABA. Sin embargo, no todos los osmoprotectores mejoran la transducción. De manera similar, no todos los compuestos de transducción funcionan como osmoprotectores. Por tanto, en algunas formas de realización se añade un osmoprotector al tampón de transducción además del compuesto de transducción (que puede funcionar o no como osmoprotector en este contexto).
[0124] Los inventores encontraron que un número de diferentes tipos de osmoprotectores y un número de diferentes combinaciones de osmoprotectores podrían aumentar la viabilidad celular (véase, por ejemplo, la Figura 4), cuando se utiliza en un método de transducción.
[0125] En algunas formas de realización, el agente osmoprotector es una betaína o compuesto aliado, poliol o azúcar, y/o un aminoácido, por ejemplo, seleccionado de entre glicina, histidina, alanina, isoleucina, arginina, asparagina, leucina, ácido aspártico, lisina, ácido glutámico, cisteína, metionina, fenilalanina, glutamina, treonina, triptófano, prolina, valina, ornitina, selenocisteína, serina, tirosina y prolina. En algunas formas de realización, el osmoprotector es glicina o un derivado de la misma. En algunas formas de realización, el osmoprotector es un derivado metílico de glicina tal como sarcosina, dimetilglicina o betaína.
[0126] En otras formas de realización, el agente osmoprotector se selecciona entre glicina, glicerol, taurina, glicinabetaína, mioinositol, glutamina, glutamato, arginina, manitol y trehalosa. En una realización preferida, el osmoprotector es glicina o glicerol.
[0127] En algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende más de un tipo de agente osmoprotector, por ejemplo, glicina y glicerol. La glicina y el glicerol es una combinación preferida porque proporcionó la mejor protección en las células fibroblásticas embrionarias murinas (como se muestra en la Figura 4b ), células madre embrionarias y células iPS humanas. Sin embargo, cualquier combinación de osmoprotectores puede ser adecuada para su uso en el tampón de transducción de la invención. Por ejemplo, cualquier combinación de osmoprotectores descritos en el presente documento, por ejemplo, cualquier combinación de 2, 3, 4, 5, 6, 7 o la totalidad de glicina, glicerol, taurina, glicinabetaína, mioinositol, glutamina, glutamato, arginina, manitol y trehalosa.
[0128] El tipo (o combinación de tipos) de osmoprotector seleccionado para su uso con la invención puede depender del tipo de célula que se transduce. La idoneidad de un agente osmoprotector puede ser determinada fácilmente por el experto en la materia mediante el ensayo de (IV) se describe en el Ejemplo 6.
[0129] La concentración de agente osmoprotector seleccionado para su uso con la invención puede depender del tipo de célula que será transducida pero puede ser fácilmente determinada por el experto mediante métodos bien conocidos en la técnica. En algunas formas de realización, el osmoprotector está en una concentración de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 500 mM, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 500 aproximadamente 1
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aproximadamente 400 mM, entre aproximadamente
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aproximadamente 300 aproximadamente 1 y aproximadamente 200 mM, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 aproximadamente 10 y aproximadamente 50 mM, entre aproximadamente 15 y aproximadamente 50 mM, entre aproximadamente 20 y aproximadamente 40 mM. Por ejemplo, en algunas formas de realización, el osmoprotector se usa a una concentración de aproximadamente 15 mM o aproximadamente 20 mM o aproximadamente 30 mM. En algunas formas de realización, el osmoprotector se usa a una concentración de al menos 15 mM, al menos 20 mM, al menos 30 mM, al menos 40 mM, al menos 50 mM al menos 60 mM, al menos 70 mM, al menos 80 mM, al menos 90 mM, al menos 100 mM, al menos 200 mM, al menos 300 mM, al menos 400 mM o aproximadamente 500 mM. En algunas formas de realización, el osmoprotector se usa a una concentración de 500 mM o menos, 400 mM o menos,
300 mM o menos, 200 mM o menos, 100 mM o menos, 50 mM o menos, 40 mM o menos, 30 mM o menos o 20 mM o menos. Por ejemplo, en una realización preferida, se usa glicina y/o taurina a una concentración de aproximadamente
15 mM y/o se usa glicerol a una concentración de aproximadamente 30 mM.
[0130] La invención también proporciona el uso de uno o más (p. ej. 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) osmoprotectores, tales como cualquier agente osmoprotector o combinación de osmoprotectores descritos aquí, para la transducción de una molécula en una célula. Por ejemplo, la invención proporciona el uso de glicina y/o glicerol como osmoprotectores para la transducción de moléculas en una célula.
Otros componentes del tampón de transducción
[0131] Debe entenderse que cualquiera de los componentes adicionales del tampón de transducción descritos en el presente documento puede ser parte del tampón de transducción. Alternativamente, se pueden agregar simultánea o secuencialmente a las células en cualquier combinación como un paso en el método de transducción.
[0132] El tampón de transducción puede comprender adicionalmente componentes que lo hacen particularmente adecuado para su uso con células vivas o de cultivo de células en vivo o la aplicación in vivo. Por ejemplo, en algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende uno o más de (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 o 7) de un tampón de pH biológico, un potenciador de la viscosidad y/o uno o más factores de crecimiento, sales, aminoácidos, vitaminas y nutrientes.
[0133] Un tampón de transducción de la invención normalmente se formulará en, agua destilada desionizada, aunque se pueden usar alternativas adecuadas incluyendo, pero no limitados a medios de cultivo celular o soluciones terapéuticas. Normalmente se esterilizará antes de su uso para evitar la contaminación, por ejemplo, por luz ultravioleta, calentamiento, irradiación o filtración. Puede congelarse (p. ej., entre -20°C o -80°C, por ejemplo entre -20°C o -80°C) para su almacenamiento o transporte. El tampón de transducción puede contener uno o más antibióticos, como doxiciclina o tetraciclina, para evitar la contaminación. Sin embargo, algunos antibióticos, en particular los antibióticos no permeables a las células (como la penicilina y/o la estreptomicina), pueden ser tóxicos para las células cuando se transducen al interior de las células. Por lo tanto, en algunas formas de realización, el tampón de transducción no comprende un antibiótico, por ejemplo, el tampón de transducción no comprende un antibiótico no permeable a las células. En algunas formas de realización, el tampón de transducción no comprende penicilina.
[0134] El tampón de transducción puede ser amortiguado por un tampón de pH biológico a un pH de entre aproximadamente 6 y aproximadamente 8, por ejemplo un pH de entre aproximadamente 7,2 y aproximadamente 7,6 o un pH de aproximadamente 7,4. Un pH fuera de este intervalo (es decir, superior a 8 o inferior a 6) podría ser apropiado para la administración a tejidos particulares, como lo determinaría fácilmente el experto en la técnica. Por ejemplo, el pH del estómago puede descender hasta 1 o 2. Por lo tanto, un tampón de transducción para la administración al estómago puede tener un pH de menos de 7, menos de 6, menos de 5, menos de 4, menos de 3, menos de 2, por ejemplo, un pH de 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1. Un tampón de pH biológico es un tampón de pH que es adecuado para su uso con células vivas, es decir que tiene un impacto negativo mínimo en la viabilidad celular. El tampón de pH biológico puede ser un tampón a base de carbonato o cualquier otro tampón adecuado. Se conocen varios tampones de pH biológicos en la técnica (véanse, por ejemplo, los tampones biológicos proporcionados en Plant Microtechnique and Microscopy, Oxford University Press, Steven E. Ruzin, ISBN: 0-19-508956-1; y www.sigmaaldrich.com/lifescience/core-bioreagents/biological-buffers/biologicalbuffer-products.html). Los ejemplos de tampones de pH biológicos incluyen, pero no se limitan a PBS, TES, TRIS, PIPES, MOPS, MES, tampones de Good, Trizma o HEPES. Por tanto, en algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende adicionalmente PBS, TES, TRIS, PIPES, MOPS, MES, tampones de Good, Trizma o HEPES.
[0135] Algunos de los compuestos de transducción también son excelentes compuestos tamponantes, por lo que pueden actuar como tampones en lugar de, o además de, el tampón biológico.
[0136] El tampón de transducción puede ser suplementado con factores de crecimiento purificados, semi-sintéticos recombinantes naturales y/o sintéticos (véase por ejemplo, Ejemplo 4). Puede usarse cualquier factor de crecimiento adecuado o combinación de factores de crecimiento. Los ejemplos no limitantes de factores de crecimiento adecuados incluyen EGF, FGF, HGF, PDGF, BDNF, VEGF o IGF. Puede usarse cualquier combinación de factores de crecimiento adecuados. Ejemplos no limitantes de combinaciones de factores de crecimiento incluyen cualquier uno o más (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5 o 6) de los factores de crecimiento en la lista compuesta por: EGF, FGF, HGF, PDGF, BDNF, v Eg F o IGF. Los factores de crecimiento añadidos pueden, en algunas circunstancias, depender de la célula a transducir, y se conoce en la técnica cómo seleccionar factores de crecimiento apropiados para una célula particular.
[0137] El factor de crecimiento o factores de crecimiento se añade preferiblemente a una concentración de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 500 ng/ml o de al menos 5 y no superior a 500 ng/ml. Una concentración preferida es al menos 1, 2, 5, 10, 20, 25, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 ng/ml y no superior a 600, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150 o 100 ng/ml. Una concentración más preferida es de al menos 10 ng/ml y no superior a 500 ng/ml. Una concentración incluso más preferida es aproximadamente 50 ng/ml o 50 ng/ml. El experto en la materia sabrá que la concentración óptima de un factor de crecimiento depende tanto del factor de crecimiento como de la célula a transducir. La concentración óptima puede determinarse mediante métodos conocidos en la técnica y mediante los métodos descritos en los ejemplos de este documento.
[0138] En algunas formas de realización, el tampón de la transducción se complementa con una citoquina. De manera similar, para los factores de crecimiento, diferentes citocinas son adecuadas para el cultivo de diferentes tipos de células y las citocinas adecuadas se conocen en la técnica. También se pueden añadir al tampón de transducción otros factores específicos de tipo celular conocidos en la técnica, tales como, pero sin limitarse a, LIF (para mantener el estado de células madre de las células madre embrionarias) y GM-CSF para células dendríticas.
[0139] La invención también proporciona el uso de factores de crecimiento, citoquinas y/o neurotransmisores y/o agonistas de molécula pequeña de esas vías de señalización para mejorar la transducción de una molécula de interés en la célula, preferiblemente cuando se usa en o con un tampón de transducción como se describe aquí.
[0140] En algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende adicionalmente un potenciador de la viscosidad. Esto es particularmente preferido cuando el tampón de transducción se utiliza in vivo porque evita la dispersión no deseada del tampón de transducción. Esto, por lo tanto, ayuda a mantener el tampón en contacto con las células que se transducen. En algunas formas de realización, el potenciador de la viscosidad es polivinilpirrolidona (PVP), alcohol polivinílico, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio (NaCMC), alginato de propilenglicol (PGA) o alginato de sodio (SA). Un potenciador de la viscosidad preferido no es tóxico y es adecuado para su uso con células vivas y/o in vivo.
[0141] En algunas formas de realización, la transducción de tampón comprende además un antioxidante, tal como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio, ácido ascórbico o tiourea.
[0142] En algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende adicionalmente un medio de cultivo basal. Los medios de cultivo adecuados están disponibles comercialmente e incluyen, pero no se limitan a medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), medio mínimo esencial (MEM), Knockout-DMEM (KO-DMEM), medio mínimo esencial de Glasgow (G-MEM), Basal Medium Eagle (BME), DMEM/Ham's F12, Advanced DMEM/Ham's F12, Iscove's Modified Dulbecco's Media y Minimal Essential Media (MEM), Ham's F-10, Ham's F-12, Medium 199 y RPMI 1640 Media.
[0143] En algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende adicionalmente suero. Sin embargo, en una realización preferida, el tampón de transducción no comprende un componente indefinido tal como suero fetal bovino o suero fetal bovino. Están disponibles comercialmente varias formulaciones de reemplazo de suero diferentes y son conocidas por los expertos. Cuando se usa un sustituto de suero, se puede usar, por ejemplo, entre aproximadamente el 0,1% y aproximadamente el 50% en volumen del medio, de acuerdo con técnicas convencionales.
[0144] La transducción se realiza típicamente en un medio de cultivo que es apropiado para el mantenimiento regular del tipo de célula particular. Como con cualquiera de los factores descritos en este documento, este medio de cultivo puede ser parte del tampón de transducción o puede agregarse a las células por separado en el método de transducción. En una realización preferida, no hay suero o hay una concentración reducida de suero en el medio de cultivo usado durante la transducción.
[0145] Los intervalos de concentración proporcionados para todos los componentes del tampón son concentraciones finales cuando el tampón está en uso para la transducción (p. ej., concentraciones cuando el tampón se formula en agua desionizada destilada, medio de cultivo celular o una composición terapéutica).
[0146] Las proteínas para la transducción se proporcionan típicamente en un concentrado de 5x o 10x, que cuando se añade a los medios de cultivo celular, da las concentraciones descritas en el presente documento.
Molécula de interés para la transducción
[0147] En una forma de realización preferida, se transduce más de una molécula de interés (es decir, múltiples copias de la molécula de interés) en una célula. Por ejemplo, al menos 2, al menos 10, al menos 20, al menos 50, al menos 100, al menos 500, al menos 1000, al menos 2000, al menos 5000, al menos 10.000 moléculas de interés, al menos 104, al menos 105, al menos 106, al menos 107 o más de 107 moléculas de interés se transducen en la célula.
[0148] El tampón de transducción y métodos de la invención se pueden usar para transducir muchos tipos diferentes de moléculas biológicas y sintéticas en las células. La molécula de interés es una proteína (incluidos péptidos y polipéptidos), ácido nucleico o una combinación de los mismos. También se describe (pero no se reivindica) que la molécula de interés puede ser un polisacárido (como el dextrano), una vesícula (como un exosoma), una nanopartícula, una molécula pequeña, un virus u otro organismo.
[0149] En algunas formas de realización uno o más (p. ej. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) diferentes tipos de moléculas de interés son transducidas en una célula. En algunas formas de realización, se transducen múltiples moléculas de interés al interior de la célula, por ejemplo en forma de mezclas complejas. Los ejemplos no limitantes de mezclas complejas incluyen extractos de células y/o tejidos. Por ejemplo, se ha demostrado que los extractos de células madre embrionarias murinas inician la reprogramación parcial de la línea celular 293T transformada, que se permeabilizó con estreptolisina, que crea poros grandes en la membrana celular. Si bien este método obviamente no es bien tolerado por las células, sí permite la difusión de moléculas al interior de las células. Los inventores plantean la hipótesis de que la transducción eficaz de extractos celulares o nucleares de células madre embrionarias murinas o células madre pluripotentes humanas en células somáticas tales como, por ejemplo, fibroblastos cutáneos, permitirá una reprogramación eficaz y completa de estas células en células madre pluripotentes. De manera similar, los extractos de otros tipos de células o tejidos pueden conferir la identidad o las propiedades funcionales de esas células o tejidos al tipo de célula transducida. Por consiguiente, la invención proporciona un método para reprogramar una célula, como una célula somática, en una célula pluripotente (es decir, una célula iPS). Esta también es una herramienta importante para identificar nuevas vías o factores de transcripción que median el destino o la función celular. Por tanto, en algunas formas de realización, se proporciona un método para identificar nuevas vías o factores de transcripción que median el destino o la función celular, en donde el método comprende la transducción de extractos de células y/o tejidos en una célula utilizando los métodos de transducción descritos en este documento.
[0150] En algunas formas de realización, la molécula de interés es una macromolécula.
[0151] En algunas formas de realización, la molécula de interés es una proteína. Los ejemplos no limitantes de proteínas incluyen anticuerpos monoclonales, citocinas, factores de crecimiento tisular y proteínas terapéuticas. En algunas formas de realización, la molécula de interés es un fármaco biológico (también conocido como biológico). En algunas formas de realización, la proteína es una enzima. Por ejemplo, la enzima puede ser una enzima que se dirige y modifica los ácidos nucleicos, como una enzima de restricción, una endonucleasa, Cre-recombinasa o flippasa. En algunas formas de realización, la endonucleasa es una endonucleasa modificada, tal como una nucleasa efectora de TAL (TALEN) (Boch, J "TALEs of genome targeting". Nature Biotechnology 29 (2): 135-6, 2011). Dichas endonucleasas se pueden usar para modificar ácidos nucleicos en la célula. Por ejemplo, pueden diseñarse para dirigirse a secuencias de ADN específicas para introducir mutaciones o deleciones para el silenciamiento o activación de genes (p. ej., mediante omisión de exón). Los inventores han demostrado que los TALEN se pueden transducir en células y que pueden introducir mutaciones genéticas, incluidas inserciones y deleciones. Además, los dominios de unión de TALE-ADN se pueden acoplar a otros dominios efectores, como un dominio de ADN metiltransferasa (que metilará residuos de citosina en el ADN en sitios específicos), dominios modificadores de histonas, como por ejemplo dominios de metiltransferasa o aciltransferasa, que modificar las histonas alrededor del sitio diana de TALE u otros dominios efectores de proteínas. La beta-lactamasa es otro ejemplo de una enzima que puede ser transducida por los tampones y métodos descritos en este documento. Por tanto, en algunas formas de realización, la molécula de interés es la beta-lactamasa. En algunas formas de realización, la proteína es un factor de transcripción. La transducción de factores de transcripción en células puede usarse para impulsar la expresión génica y reconectar el destino, el fenotipo o la identidad de las células. Por ejemplo, OCT2, OCT3, OCT4, SOX2, KLF4, C-MYC, N-MYC, NANOG, ESRRB y LIN28 se han utilizado para la generación de células madre pluripotentes inducidas (iPS). Normalmente, se introducen en las células mediante vectores virales. Sin embargo, el método de transducción de la invención podría reemplazar este método. Por tanto, en algunas formas de realización, la molécula de interés para la transducción es un factor de transcripción implicado en la regulación, definición o cambio en el ciclo celular y/o identidad celular. En otras formas de realización, el factor de transcripción es un factor de transcripción involucrado en el mantenimiento o diferenciación de las células madre. Por ejemplo, en algunas formas de realización, el factor de transcripción se selecciona de OCT2, OCT3, OCT4, SOX2, KLF4, C-MYC, N-MYC, NANOG, ESRRB y LIN28.
[0152] Varios factores de transcripción también están asociados con ciertas enfermedades y trastornos (ver tabla A).
Tabla A:
6­
5.
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[0153] La sustitución de factores de transcripción errantes por transducción podría ser útil para fines terapéuticos o de investigación. Por tanto, en algunas formas de realización, el factor de transcripción es un factor de transcripción asociado con una enfermedad o trastorno. En algunas formas de realización, la enfermedad o trastorno se selecciona de un cáncer, una enfermedad metabólica, una enfermedad cardiovascular, una enfermedad neurodegenerativa, una enfermedad autoinmune. En algunas formas de realización, la enfermedad o trastorno es una enfermedad hereditaria. Por ejemplo, en algunas formas de realización, el factor de transcripción se selecciona entre MECP2, HNF, IPF1/Pdx1, FOXP2, Fo XP3, p53, STAT y HOX. En algunas formas de realización, se incluyen dos o más (p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más) factores de transcripción en el tampón de transducción o en los métodos de la invención, por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7 o todos los factores de transcripción de la lista que consta de MECP2, HNF, IPF1/Pdx1, FOXP2, FOXP3, p53, STAT y HOX.
[0154] En algunas formas de realización, cuando la molécula de interés es una proteína, que es la proteína que puede modificar los ácidos nucleicos, por ejemplo parte de un sistema de edición de genes. Las proteínas que pueden modificar los ácidos nucleicos normalmente tienen actividad de enzima nucleasa, por ejemplo, actividad endonucleasa o exonucleasa. Por tanto, en algunas formas de realización, la molécula de interés tiene actividad enzimática nucleasa o es una nucleasa. La actividad nucleasa puede estar presente en la versión de tipo salvaje de la proteína o puede añadirse, por ejemplo, mediante métodos recombinantes, para generar una proteína de fusión. Por tanto, en algunas formas de realización, la molécula de interés es una proteína de fusión, por ejemplo, una proteína de fusión con actividad nucleasa, por ejemplo, un factor de transcripción fusionado a un dominio con actividad nucleasa. En algunas formas de realización, la molécula de interés es un sistema de edición de genes o es parte de un sistema de edición de genes. En algunas formas de realización, los sistemas de edición de genes comprenden una proteína que puede modificar un ácido nucleico como se discutió anteriormente y, opcionalmente, comprender moléculas adicionales, tales como moléculas guía. En algunas formas de realización, el sistema de edición de genes comprende o consta de proteínas que se dirigen a una secuencia específica, como las nucleasas con dedos de zinc (ZFN) o TALENS. En algunas formas de realización, el sistema de edición de genes comprende una proteína que es guiada a sus secuencias diana por una molécula guía (separada). Ejemplos de tales proteínas que son guiadas a su secuencia diana incluyen, pero no se limitan a nucleasa Cas9, proteínas del sistema Cascade, TtAgo y otras proteínas Argonaute, y otras proteínas asociadas a nucleasa FOKI.
[0155] En algunas formas de realización, la molécula de guía es un ácido nucleico de guía, tal como un sgARNs o gADN. Los ácidos nucleicos guía, como el sgARN o el gADN, pueden diseñarse mediante métodos conocidos en la técnica para apuntar a una secuencia específica en el ácido nucleico diana (ver, por ejemplo, Mali, P., et al., RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science, 2013. 339 (6121): p. 823-6 para sgARN; y Swarts, D. y col., DNA-guided DNA interference by a prokaryotic Argonaute. Nature, 2014. 507, 258-261 para gADN). Por tanto, en algunas formas de realización, la molécula de interés es un ácido nucleico guía, por ejemplo, un sgARN o un gADN (véanse los comentarios adicionales a continuación en relación con los ácidos nucleicos). Ejemplos de ARN guía pequeños adecuados para su uso con la invención incluyen ARNg N° 1, ARNg N° 2, ARNg N° 3, ARNg N° 4, ARNsg N° 5, ARNsg N° 6 o ARNsg N° 7 como se muestra en la Figura 19. Se demostró que que los siguientes ARN guía pequeños dan como resultado una edición de genes particularmente eficaz: sgARN N° 2, sgARN N° 3, sgARN N° 5, sgARN N° 6 y sgARN N° 7 (ver Figura 19B).
[0156] En algunas formas de realización, la proteína es una molécula de señalización. En algunas formas de realización, la proteína activa o inhibe una vía de señalización específica o una red de vías de señalización. Por ejemplo, en algunas formas de realización, la proteína activa o inhibe una vía de señalización inducida por el factor de crecimiento, una vía de señalización de citoquinas o una vía de señalización inducida por hormonas. En algunas formas de realización, la proteína activa o inhibe una vía de señalización seleccionada entre Wnt, Hedgehog, BMP, SMAD, Hippo, Notch, JAK/STAT, NF-kB, cAMP, PLC u otra vía de señalización conocida en la técnica (p. ej., Véase Cell Signaling Biology, Michael J. Berridge, Módulo 2, Cell Signalling Pathways, Portland Press Limited 2012).
[0157] En algunas formas de realización, la molécula de interés es un anticuerpo. Normalmente, los anticuerpos son moléculas extracelulares. Por lo tanto, cuando se encuentran asociados con objetivos dentro de las células, son objetivo de destrucción, junto con cualquier molécula objetivo a la que estén unidos. Por tanto, los inventores plantean la hipótesis de que dirigiendo anticuerpos a dianas intracelulares y transduciéndolos al interior de la célula usando los tampones de transducción y los métodos de la presente invención, dichas dianas intracelulares podrían dirigirse específicamente para su destrucción. Los anticuerpos que se dirigen a objetivos intracelulares a veces se denominan "intracuerpos". La internalización de anticuerpos que combaten el cáncer puede apoyar la terapia del cáncer al bloquear las interacciones proteína-proteína específicas del tumor (Bitler, BG y Schroeder, JA Recent Patents on Anti-Cancer Drug Discovery, 5: 99-108, 2010).
[0158] En algunas formas de realización, la proteína de interés es menor que 10, menos de 20, menos de 40, menos de 70, menos de 100, menos de 150, menos de 200, menos de 300, menos de 750, menos de 1000, menos de 1500, menos de 2000, menos de 5000, menos de 10.000 aminoácidos de longitud. En otras formas de realización, la proteína de interés es 5 o más, 10 o más, 20 o más, 40 o más, 70 o más, 100 o más, 150 o más, 200 o más, 300 o más, 750 o más, 1000 o más, 2000 o más, 5000 o más aminoácidos de longitud. En algunas formas de realización, la proteína de interés puede tener cualquier intervalo de longitud seleccionado de cualquiera de los valores anteriores. En algunas formas de realización, la proteína es 10-5000, 12-1800, 30-1200, 35-800, 40-500, 5-200, 5-50, 5-30, 5-20, 5-12, 2-50, 2-30, 2-20 o 2-12 aminoácidos de longitud.
[0159] En una forma de realización preferida de la invención, el compuesto de la transducción, tampón o método es adecuado para la transducción de una proteína en una célula. En una forma de realización preferida adicional, el compuesto de transducción, tampón o método es adecuado para la transducción de una proteína y ácido nucleico en una célula, ya sea de forma simultánea, secuencial o separada.
[0160] En formas de realizaciónen las que la molécula de interés es un ácido nucleico, el ácido nucleico es ADN, ADNc, ARN, miARN, ARNip o cualquier versión modificada de la misma. En alguna realización, el ácido nucleico es un oligonucleótido o un polinucleótido. En algunas formas de realización, el ácido nucleico es un oligonucleótido antisentido. En algunas formas de realización, el ácido nucleico es una estructura de ácido nucleico bidimensional o tridimensional, como una caja de ADN (p. ej., para la administración de fármacos). El ADN puede ser sintético, recombinante, extraño o nativo de la célula en donde se transduce. En algunas formas de realización, el ADN es ADN plasmídico. El ADN plasmídico suele captarse por endocitosis. Sin embargo, los inventores han demostrado sorprendentemente que, usando el tampón de transducción, pueden cambiar el mecanismo de captación de ácidos nucleicos de ser principalmente por endocitosis a principalmente por macropinocitosis. Esto significa que los ácidos nucleicos y las enzimas que se dirigen a los ácidos nucleicos para recombinación y modificación pueden transducirse en células simultáneamente para modificación genética y terapia génica. En algunas formas de realización, el ácido nucleico tiene una región de homología con una secuencia de interés con la célula, por ejemplo para permitir la recombinación homóloga. En algunas formas de realización, el ácido nucleico es un pequeño ARN guía (sgARN), por ejemplo, para usar con el sistema de edición de genes CRISPR/Cas9 u otros sistemas de edición de genes, o un pequeño ADN guía (gADN), por ejemplo, para usar con el Sistema de edición de genes TtAgo u otros sistemas de edición de genes. En algunas formas de realización, la molécula de interés no es un ácido nucleico.
[0161] En algunas formas de realización, el ácido nucleico de interés es menos de 10, menos de 20, menos de 40, menos de 70, menos de 100, menos de 150, menos de 200, menos de 300, menos de 750, menos menos de 1000, menos de 1500, menos de 2000, menos de 5000, menos de 10.000 nucleótidos, menos de 15.000 nucleótidos, menos de 20.000 nucleótidos, menos de 50.000 nucleótidos, menos de 100.000 nucleótidos, menos de 200.000 nucleótidos, menos de 250.000 nucleótidos (o bases equivalentes) de longitud. En otras formas de realización, el ácido nucleico de interés es 1 o más, 5 o más, 10 o más, 20 o más, 40 o más, 70 o más, 100 o más, 150 o más, 200 o más, 300 o más, 750 o más, 1000 o más, 2000 o más, 5000 o más, 10.000 o más, 20.000 o más, 50.000 o más, 100.000 o más, 200.000 o más, 250.000 o más nucleótidos (o bases equivalentes) de longitud. En algunas formas de realización, el ácido nucleico de interés puede tener cualquier intervalo de longitud seleccionado de cualquiera de los valores anteriores. En algunas formas de realización, el ácido nucleico tiene 10-10.000, 10-5000, 12-1800, 30-1200, 35-800, 40-500, 2-50, 5-30, 5-20 o 5-12 nucleótidos (o bases equivalentes) de longitud. En algunas formas de realización, la molécula de interés es todo o parte de un cromosoma.
[0162] En algunas formas de realización, la molécula de interés es de entre aproximadamente 30 kDa a aproximadamente 500 kDa, por ejemplo entre aproximadamente 30 kDa y aproximadamente 200 kDa. Por ejemplo, en algunas formas de realización, la molécula de interés es aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 110, aproximadamente 120, aproximadamente 130, aproximadamente 140, aproximadamente 150, aproximadamente 160, aproximadamente 170, aproximadamente 180, aproximadamente 190 o aproximadamente 200 kDa. Los inventores han demostrado que las moléculas que varían desde aproximadamente 30 kDa (p. ej., Oct-4) hasta aproximadamente 140 kDa (p. ej., una proteína TALEN) pueden transducirse en células usando el tampón y los métodos de la invención. En algunas formas de realización, la molécula de interés es más de 30, más de 40, más de 50, más de 60, más de 70, más de 80, más de 90, más de 100, más de 110, más de 120, más de 130, más de 140, más de 150, más de 160, más de 170, más de 180, más de 190 o más de 200 kDa. Estos tamaños son particularmente aplicables cuando la molécula de interés es una proteína o un péptido. Cuando la molécula de interés es una molécula de ácido nucleico, como un oligonucleótido o un polinucleótido, el tamaño se define típicamente por el número de nucleótidos. En algunas formas de realización, la molécula de interés es una molécula pequeña. Una molécula pequeña es típicamente un compuesto orgánico de bajo peso molecular (<800 Daltons) que puede servir como sustrato enzimático o regulador de procesos biológicos.
[0163] La transducción de moléculas pequeñas es útil para la administración de fármacos.
[0164] En algunas formas de realización, la molécula de interés tiene una carga neta positiva. En otra realización, la molécula de interés tiene una carga neta negativa. En algunas formas de realización, la molécula de interés es bipolar. En algunas formas de realización, la molécula de interés es polar. En otra realización, la molécula de interés es apolar. En algunas formas de realización, la molécula de interés es predominantemente hidrófoba. En otra realización, la molécula es hidrófila. En otra realización, la molécula es neutra. En algunas formas de realización, la molécula de interés es soluble a aproximadamente pH 7. La solubilidad puede mejorarse mediante el tampón de transducción.
[0165] En algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende la molécula de interés para la transducción. En otras formas de realización, el tampón de transducción comprende más de una molécula de interés para la transducción, por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o más moléculas de interés.
[0166] Cualquier combinación de moléculas de interés descritas aquí pueden incluirse en el tampón de transducción o utilizarse en los métodos para la transducción descritos en este documento. Por ejemplo, en una realización, el tampón de transducción comprende un ácido nucleico y una proteína, tal como una endonucleasa o Cre-recombinasa (p. ej., para la modificación genética de dicho ácido nucleico) como moléculas de interés para la transducción. En algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende una proteína y un polisacárido como moléculas de interés para la transducción. En algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende un ácido nucleico y un lípido como moléculas de interés para la transducción. En algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende un ácido nucleico, una proteína y un lípido como moléculas de interés para la transducción.
[0167] En algunas formas de realización, los métodos para la transducción implican los siguientes ejemplos no limitativos de combinaciones de moléculas de interés: dos o más proteínas diferentes (tales como pares TALEN), dos o más moléculas de ácido nucleico, ácido nucleico y proteína (tal como ADN y proteína), polisacáridos (como dextrano) y proteína, ácido nucleico y lípido, proteína y lípido, ácido nucleico y proteína y lípido. Los ejemplos específicos de pares de ácidos nucleicos y proteínas incluyen ácidos nucleicos guía y proteínas con actividad nucleasa, por ejemplo, sgDNA y Cas9, o gADN y TtAgo. En algunas formas de realización, el ácido nucleico y la proteína están presentes como complejos de ácido nucleico-proteína.
[0168] El mismo principio se aplica para los métodos de la invención, es decir, la célula puede ponerse en contacto con dos, tres, cuatro, cinco o más moléculas de interés. Por ejemplo, una proteína TALEN y un ácido nucleico y opcionalmente un lípido pueden transducirse en una célula simultáneamente.
[0169] La concentración de la molécula de interés para la transducción depende de la molécula de interés, la célula, y el propósito de la transducción. El experto en la materia puede determinar la concentración apropiada. En algunas formas de realización, la molécula de interés para la transducción se añade a concentraciones milimolares, micromolares o nanomolares. En algunas formas de realización, la molécula de interés se agrega al tampón de transducción a una concentración de entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 1 mM, entre aproximadamente 10 nM y aproximadamente 500 j M, entre aproximadamente 10 nM y aproximadamente 100 j M, entre aproximadamente 10 nM y aproximadamente 50 j M, entre aproximadamente 10 nM y aproximadamente 10 j M, entre aproximadamente 10 nM y aproximadamente 1 j M, entre aproximadamente 10 nM y aproximadamente 500 nM, entre aproximadamente 10 nM y aproximadamente 100 nM, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 100 nM, entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 500 nM, entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 j M, entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 5 j M, entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 10 j M, entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 50 j M, o entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 100 j M. Cuando la molécula de interés es una proteína, la concentración puede estar entre aproximadamente 10 nM y aproximadamente 1 mM, por ejemplo entre 10 nM y 100 j M, o entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 j M. En algunas formas de realización, la concentración de la molécula de interés está entre aproximadamente 1 j M y aproximadamente 5 j M, por ejemplo aproximadamente 1 j M o aproximadamente 5 j M.
[0170] En algunas formas de realización, la molécula de interés no se modifica. Por ejemplo, en algunas formas de realización, la molécula de interés no está asociada con una molécula portadora y/o no comprende una etiqueta, en donde la etiqueta facilita la transducción en la célula. Por ejemplo, en una realización, la proteína de interés no está marcada con un péptido que penetra en las células o una proteína TAT. En un ejemplo adicional, en una realización, el ácido nucleico es un ácido nucleico desnudo. Es sorprendente que usando los métodos de la invención, cualquier molécula de interés pueda transducirse en una célula sin modificación. En algunas formas de realización, la molécula de interés no forma un complejo con el compuesto de transducción. En algunas formas de realización, la molécula de interés no está ni asociada con una micela o un liposoma. En algunas formas de realización, la molécula de interés no forma un complejo con el compuesto de transducción. En algunas formas de realización, la molécula de interés no está ni asociada con un vector viral.
[0171] Los inventores han demostrado que los métodos y tampones descritos en este documento pueden utilizarse para transducir los virus en las células (p. ej., véase el Ejemplo 9). Por lo tanto, en algunas formas de realización, la divulgación proporciona un método para transducir un virus en una célula o población de células, en donde el método comprende poner en contacto una célula o población de células con un tampón de transducción y poner en contacto la célula o población de células con un virus. En una realización, la divulgación proporciona un método para transducir un virus en una célula o población de células, en donde el método comprende poner en contacto una célula o población de células con un tampón de transducción según la presente divulgación y poner en contacto las células con un virus. El tampón de transducción se puede mezclar con el virus antes de la administración a las células o se puede administrar de forma simultánea, secuencial o separada del virus.
[0172] Además, los inventores también han observado que en presencia de la transducción de tampón una población de células se encoge creando espacio entre las células y haciendo que las células sean más accesibles. Esto podría mejorar aún más la transducción de virus en células. Por tanto, en algunas formas de realización, el método de transducción de una molécula de interés en células implica la reducción del tamaño de las células y/o el aumento del espacio entre células. Sin pretender imponer ninguna teoría, los inventores plantean la hipótesis de que la contracción es el resultado de la hiperosmolalidad inducida por la sal en el tampón de transducción. Sin embargo, es probable que el mecanismo de macropinocitosis ya descrito anteriormente juegue un papel importante en la mejora de la transducción de virus en células.
Célula para transducción
[0173] El método de transducción se puede utilizar para transducir una molécula de interés en cualquier célula, incluida una célula primaria o una célula madre (incluida sus derivados, como las células progenitoras), una célula sana normal o una célula enferma.
[0174] En una forma de realización preferida, la célula implicada en el método de la transducción es una célula de mamífero. Esto se debe a que se cree que el tampón de transducción y el método son particularmente adecuados para el sistema de macropinocitosis de mamíferos (ver más abajo para más detalles). Sin embargo, también se prevé que en algunas formas de realización, los métodos podrían ser útiles para transducir moléculas en otras células animales, células vegetales, células de levadura, células de insectos o células bacterianas. Por tanto, en algunas formas de realización, la célula es una célula animal, una célula vegetal, una célula de levadura, una célula de insecto o una célula bacteriana. En algunas formas de realización, la célula no es una célula bacteriana.
[0175] En formas de realización preferidas, la célula de mamífero es un humano, primate, roedor (p. ej. ratón o rata), conejo, perro, gato, caballo, vaca o células de cerdo. Estos mamíferos son útiles para fines de investigación y/o pueden beneficiarse del tratamiento o diagnóstico que comprenden tampones de transducción y métodos de la invención. En algunas formas de realización, la célula es una célula no humana.
[0176] En algunas formas de realización de la descripción, la célula es in vivo, opcionalmente in situ. Por ejemplo, al tratar o diagnosticar una afección médica, la molécula de interés podría administrarse directa y localmente en combinación con el tampón de transducción a un organismo o tejido que lo necesite.
[0177] En el método reivindicado, la célula es in vitro. Por ejemplo, la célula puede estar en un medio de cultivo, donde el medio de cultivo opcionalmente apoya el mantenimiento, diferenciación y/o expansión de la célula.
[0178] En algunas formas de realización, la célula se deriva de una línea celular establecida, tal como una línea celular humana establecida. En algunas formas de realización, la línea celular establecida es una línea celular inmortalizada. En otras formas de realización, la línea celular es una línea celular primaria. Varios métodos de transducción de la técnica anterior no funcionan en células primarias (ver sección de antecedentes). Por tanto, es sorprendente que los tampones de transducción y los métodos de la presente invención puedan usarse para transducir moléculas en células primarias.
[0179] Los ejemplos de líneas celulares humanas establecidas adecuadas para su uso en el contexto de la invención incluyen pero no se limitan a HeLa, base de datos ESTDAB, DU145 (cáncer de próstata), Lncap (cáncer de próstata), MCF-7 (cáncer de mama), MDAMB-438 (cáncer de mama), PC3 (cáncer de próstata), T47D (cáncer de mama), THP-1 (leucemia mieloide aguda), COS7 (células CV-1 inmortalizadas de tejido renal), U87 (glioblastoma), células de neuroblastoma humano SHSY5Y, clonado de un mieloma, células Saos-2 (cáncer de hueso). La base de datos ESTDAB (www.ebi.ac.uk/ipd/estdab/directory.html) y el Instituto Nacional del Cáncer (NCI-60) proporcionan ejemplos adicionales de líneas de células cancerosas que son adecuadas para su uso con la presente invención. En algunas formas de realización, la línea celular establecida es una línea celular de primates, tal como Vero (línea celular epitelial renal de Clorocebus de mono verde africano iniciada en 1962). En algunas formas de realización, la línea celular establecida es una línea celular de roedor, como GH3 (tumor pituitario), PC12 (feocromocitoma) o MC3T3 (calvario embrionario). Otras líneas celulares de mamíferos adecuadas para su uso con el tampón de transducción y los métodos descritos en este documento incluyen la línea celular epitelial de riñón canino Madin-Darby (MDCK), la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) y las células Caco-2. En algunas formas de realización, la célula es una célula KBM7.
[0180] En algunas formas de realización, la célula es una célula primaria. Una célula o línea celular primaria se deriva de una célula extraída directamente de un organismo vivo y no ha sido inmortalizada. En otras palabras, una célula o línea celular primaria es genética y fenotípicamente estable.
[0181] En algunas formas de realización, la célula es una célula madre o una célula derivada por diferenciación de una célula madre. En algunas formas de realización, la célula madre es una célula madre pluripotente, como una célula madre embrionaria, opcionalmente una célula madre embrionaria humana. En algunas formas de realización, la célula no es una célula madre embrionaria humana. La célula madre no se obtiene mediante métodos que impliquen el uso de embriones humanos con fines comerciales o industriales. La célula madre no se obtiene mediante métodos que implican necesariamente la destrucción de un embrión humano. En algunas formas de realización, la célula madre es una célula madre embrionaria murina. En otras formas de realización, la célula madre es una célula madre adulta, tal como una célula madre neural, adiposa o hematopoyética. En algunas formas de realización, la célula es una célula madre neural, célula neuronal o célula glial murina o humana. En algunas formas de realización, la célula madre es una célula madre pluripotente inducida. En algunas formas de realización, la célula es una célula somática no humana o una célula germinal no humana.
[0182] En algunas formas de realización, la célula es una célula que pertenece al sistema inmunitario, tal como una célula T, célula B o leucocito, incluyendo pero no limitado a un fagocito (macrófagos, neutrófilos, o células dendríticas), mastocitos, eosinófilos, basófilos y células asesinas naturales. En algunas formas de realización, la célula es una célula dendrítica.
[0183] En algunas formas de realización las células para la transducción se cultivan en una atmósfera que comprende entre aproximadamente 4% y aproximadamente 10% de CO2, aproximadamente el 5% y aproximadamente el 9% de CO2, aproximadamente el 6% y aproximadamente 8% de CO2, preferiblemente de aproximadamente 5 % CO2.
[0184] En todas las realizaciones, en que la divulgación se refiere a una "célula", se refiere a una sola célula y se aplica también a una "población de células", por ejemplo de 2 o más, 10 o más, 100 o más, 1000 o más, 104 o más, 105 o más, 106 o más, 107 o más, 108 o más células.
[0185] Por lo tanto, la invención también proporciona una célula transducida o población de células obtenida u obtenible usando el tampón de transducción y/o los métodos descritos aquí. La invención proporciona una célula o población de células que comprende una molécula de interés en donde la molécula de interés se ha transducido en la célula usando el tampón de transducción y/o los métodos descritos en el presente documento.
Viabilidad celular
[0186] En una forma de realización preferida, el tampón de transducción y los métodos de la invención tienen un impacto mínimo sobre la viabilidad de las células. La viabilidad celular es importante para muchas aplicaciones de las células transducidas, que incluyen pero no se limitan al trasplante de células transducidas; el uso de células transducidas para generar embriones no humanos modificados genéticamente para modelos de investigación; y el uso de células transducidas en investigación, etc. (ver sección sobre "Usos de la invención"). Una medida de la viabilidad celular es la proliferación celular (p. ej., el ensayo de incorporación de BrdU, como se describe en el Ejemplo 5). La proliferación celular continua demuestra que el ciclo celular normal todavía está funcionando.
[0187] Los ensayos para medir la proliferación, viabilidad y citotoxicidad son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente (p. ej., de Sigma Aldrich). Dichos ensayos se pueden usar para controlar la respuesta y la salud de las células en cultivo después del tratamiento con diversos estímulos. La elección adecuada de un método de ensayo depende del número y tipo de células utilizadas, así como del resultado esperado. Los ensayos de proliferación celular pueden controlar el número de células a lo largo del tiempo, el número de divisiones celulares, la actividad metabólica o la síntesis de ADN. El recuento de células utilizando tintes de viabilidad como azul tripán o calceína-AM puede proporcionar tanto la tasa de proliferación como el porcentaje de células viables. El éster N-succinimidílico de diacetato de 5(6)-carboxifluoresceína (CFSE) es una opción popular para medir el número de divisiones celulares que ha experimentado una población. Al entrar en la célula, el CFSE es escindido por las esterasas intracelulares para formar el compuesto fluorescente y el grupo éster succinimidílico reacciona covalentemente con las aminas primarias de las proteínas intracelulares. Tras la división, la intensidad de fluorescencia de cada célula hija se reduce a la mitad, lo que permite la detección simple del número de divisiones celulares mediante citometría de flujo. Los ensayos que miden la actividad metabólica son adecuados para analizar la proliferación, viabilidad y citotoxicidad. La reducción de sales de tetrazolio como MTT y XTT a compuestos de formazán coloreados o la biorreducción de resazurina solo ocurre en células metabólicamente activas. Las células que proliferan activamente aumentan su actividad metabólica, mientras que las células expuestas a toxinas tendrán una actividad disminuida.
[0188] Un ejemplo de un ensayo que mide la proliferación es el ensayo de incorporación de BrdU, que mide la incorporación de BrdU en el ADN celular durante la proliferación celular.
[0189] En una forma de realización preferida, cuando las células se sometieron a los métodos de transducción de la invención se someten al ensayo de incorporación de BrdU, más de 50%, más del 55%, más del 60%, más del 65%, más de El 70%, más del 75%, más del 80%, más del 85%, más del 90%, más del 95%, más del 99% o todas las células demuestran la incorporación de BrdU en el ADN celular de las células.
[0190] La viabilidad de las células también puede evaluarse mediante tinción de marcadores de apoptosis (p. ej., anexina V, activadores de caspasas, etc.) o evaluando la captación de yoduro de propidio como un signo de muerte celular. Las células que no se tiñen positivamente para tales marcadores de apoptosis (p. ej., AnnexinV, activación de caspasa) o que no absorben yoduro de propidio son células viables.
[0191] En una forma de realización preferida, más del 50%, más del 55%, más del 60%, más del 65%, más del 70%, más del 75%, más del 80%, más del 85%, más del 90%, más del 95%, más del 99% o todas las células son viables después de una, dos, tres, cuatro o cinco rondas de transducción, según se evaluó mediante tinción con anexina V.
[0192] La transducción de ciertas moléculas puede desencadenar rutas de muerte celular en las células. Por ejemplo, el ADN/ARN extraño introducido en las células puede desencadenar la vía de respuesta al interferón que puede provocar la muerte celular. En algunas formas de realización, los métodos y/o el tampón de transducción de la invención usan/comprenden uno o más inhibidores de la muerte celular. Los inhibidores de la muerte celular, como los inhibidores de la vía de respuesta al interferón, pueden ayudar a prevenir la respuesta apoptótica y así mejorar la supervivencia celular. Dichos inhibidores pueden actuar en varios niveles de la vía de respuesta al interferón, por ejemplo, pueden ser inhibidores de la unión extracelular del interferón a su receptor, inhibidores de la señalización del interferón intracelular, inhibidores de los efectores posteriores de la respuesta al interferón (p. ej., RNasaL, PKR, Jak/Señalización STAT, inhibidores Mx). Otros tipos de inhibidores que pueden usarse incluyen proteínas o compuestos de moléculas pequeñas que pueden mejorar la detección de ARN/ADN extraño en la célula, como la proteína Influenza A NS1. También se puede usar una combinación de inhibidores. Se conocen en la técnica ejemplos de tales inhibidores. Los inventores, por ejemplo, utilizaron la proteína inhibidora de interferón B18R (Nat. Protocol.
2013 Mar; 8 (3): 568-82. Doi: 10,1038/nprot,2013.019. Epub 2013 Feb 21. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Mandal PK1, Rossi DJ; y Cell. 1995 19 de mayo; 81 (4): 551 - 60. El virus vaccinia codifica un receptor de interferón de tipo I soluble de estructura novedosa y amplia especificidad de especie. Symons JA1, Alcami A, Smith GL.). Por lo tanto, en algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende además uno o más inhibidores de la muerte celular, preferiblemente un inhibidor de la ruta de respuesta al interferón. En algunas formas de realización, el inhibidor se añade antes, durante y/o después de la transducción. En algunas formas de realización, el inhibidor se usa a una concentración de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 1000 ng/ml, aproximadamente 100 ng/ma aproximadamente 500 ng/ml, aproximadamente 200 ng/ml a aproximadamente 400 ng/ml, aproximadamente 200 ng/ml hasta aproximadamente 300 ng/ml, o aproximadamente 250 ng/ml. En algunas formas de realización, el inhibidor es B18R, que se usa preferiblemente a aproximadamente 250 ng/ml, antes (p. ej., 3 horas antes) de la transducción, durante la transducción y después (p. ej., 48 horas después) de la transducción. Dichos inhibidores son particularmente útiles cuando se transducen moléculas de ácido nucleico en células (p. ej., cuando se transducen pequeños ARN inhibidores (siARN) o pequeñas moléculas de ácido nucleico guía, como sgARN o gADN, en células con una nucleasa, como Cas9, en el contexto de un sistema de edición de genes) pero puede ser útil para todo tipo de moléculas de interés, particularmente aquellas que podrían activar las vías de muerte celular, particularmente a través de la vía de respuesta al interferón. Son compatibles con todos los tampones y protocolos de transducción descritos en este documento.
Eficiencia/tiempo de transducción
[0193] Para transducir una molécula de interés en una célula, la molécula de interés y la célula están en contacto durante una longitud suficiente de tiempo para que la molécula se transduzca al interior de la célula.
[0194] Generalmente, la cantidad de absorción en los correlatos celulares con la cantidad de tiempo que la célula está en contacto con el tampón de transducción y molécula de interés. Esto se conoce aquí como el "tiempo de incubación" o el "tiempo de transducción".
[0195] En una forma de realización preferida, el tiempo de incubación está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 24 horas, por ejemplo entre aproximadamente 2 y aproximadamente 12 horas o entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5 horas. En algunas formas de realización, el tiempo de incubación es de al menos 30 minutos, al menos 1 hora, al menos 2 horas, al menos 3 horas, al menos 4 horas, al menos 5 horas, al menos 6 horas, al menos 7 horas, al menos 8 horas, al menos 9 horas, al menos 10 horas, al menos 11 horas, al menos 12 horas, al menos 13 horas o más de 13 horas. En algunas formas de realización, el tiempo de incubación es menos de 48 horas, menos de 24 horas, menos de 20 horas, menos de 15 horas, menos de 13 horas, menos de 12 horas, menos de 11 horas, menos de 10 horas, menos de 9 horas. horas, menos de 8 horas, menos de 7 horas, menos de 6 horas, menos de 5 horas, menos de 4 horas, menos de 3 horas, menos de 2 horas o menos de 1 hora. En algunas formas de realización, el tiempo de transducción es de 3 horas. En algunas formas de realización, el tiempo de transducción es de 12 horas. En algunas formas de realización, el tiempo de incubación está entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 1 hora. En algunas formas de realización, el tiempo de incubación es entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 30 minutos, entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 60 minutos, entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 90 minutos, entre aproximadamente 60 minutos y aproximadamente 90 minutos, o menos de aproximadamente 90 minutos., o menos de aproximadamente 60 minutos.
[0196] La tasa de transducción dependerá del tipo de célula (y la eficiencia de los mecanismos de transducción) y la molécula de interés a ser transducidas (su tamaño, carga, hidrofobicidad, etc.). Los inventores también han demostrado que cuanto mayor es la osmolalidad del tampón de transducción, mayor es la velocidad de transducción. Por tanto, a mayor osmolalidad, la velocidad de transducción es típicamente mayor y se requieren tiempos de incubación más cortos. Por el contrario, a menor osmolalidad, la velocidad de transducción es menor y se requieren tiempos de incubación más largos para lograr niveles equivalentes de transducción.
[0197] Sin embargo, como se ha mencionado en esta descripción en otro lugar, hiperosmolaridad puede afectar negativamente a la viabilidad celular y por lo tanto, el tiempo de incubación debe ser equilibrado con la osmolalidad y la viabilidad celular. Añadiendo osmoprotectores, se protege la viabilidad celular y, por tanto, se pueden utilizar osmolalidades más altas y tiempos de incubación más cortos. El experto en la materia puede determinar la osmolalidad, el tiempo de incubación y la concentración óptimos de osmoprotectores utilizando ensayo y error y pruebas de optimización (p. ej., consulte la Figura 3). Por ejemplo, en algunas formas de realización en células MEF, usando una osmolalidad de entre 650 y 800 mOsm/kg e incluyendo glicerol y glicina en el tampón de transducción, el tiempo de incubación para la transducción de beta-lactamasa puede ser de 3 horas. En una forma de realización alternativa en células MEF, usando una osmolalidad de solo 450 a 650 mOsm/kg (es decir, una osmolalidad más baja) e incluyendo glicerol y glicina, el tiempo de incubación requerido para una transducción óptima puede ser más largo, por ejemplo, más cercano a 12 horas. De manera similar, en algunas formas de realización en células mES, usando una osmolalidad de entre 450 y 600 mOsm/kg e incluyendo glicerol y glicina en el tampón de transducción, el tiempo de incubación para la transducción óptima de beta-lactamasa puede ser de aproximadamente 12 horas.
[0198] La transducción puede detectarse cualitativa o cuantitativamente usando construcciones informadoras conocidas en la técnica y disponibles comercialmente, por ejemplo, una luciferasa o una construcción informadora de GFP, en donde los niveles de fluorescencia corresponden a los niveles de expresión (ver la sección de Ejemplos para más detalles).
[0199] En algunas formas de realización, el método comprende una ronda de transducción. Sin embargo, en otras formas de realización, pueden ser deseables múltiples rondas de transducción. Por ejemplo, en algunas formas de realización se llevan a cabo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más rondas de transducción en las mismas células. Cada ronda de transducción puede implicar la transducción de la misma molécula o de diferentes moléculas de interés.
[0200] Entre cada ronda de transducción, puede haber un "período de recuperación" de al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11 o al menos 12 horas. En algunas formas de realización, el período de recuperación es de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40 o al menos 50 minutos.
[0201] En algunas formas de realización no hay período de recuperación, o hay un período de recuperación de menos de 24 horas, menos de 12 horas, menos de 6 horas, menos de 3 horas, menos de 1 hora, menos de 30 minutos o menos de 10 minutos.
[0202] Durante los períodos de recuperación, el tampón de la transducción se elimina de las células y las células se suelen cultivar en medio de cultivo celular adecuado para el tipo de célula particular.
Ejemplos de tampones y métodos de transducción
[0203] A continuación se proporcionan ejemplos no limitantes de tampones y métodos de transducción. Debe entenderse que cualquier combinación de realizaciones compatibles descritas en el presente documento puede usarse para un tampón de transducción o un método para la transducción que comprende un tampón de transducción. A continuación se proporcionan algunos ejemplos de realizaciones combinables.
[0204] Se proporciona un método in vitro para la transducción de una molécula de interés en una célula, en donde la molécula de interés es una proteína, un ácido nucleico o una combinación de los mismos, donde el método comprende poner en contacto la célula con una molécula de interés y poner en contacto la célula con un tampón de transducción que comprende una sal seleccionada de una sal de sodio, litio, potasio, cesio o rubidio y opcionalmente glicina y/o glicerol como osmoprotectores, en donde el compuesto de transducción es un compuesto según la Fórmula I o la Fórmula II como se definió anteriormente. En algunas formas de realización, el compuesto de transducción es un compuesto de molécula pequeña y no es un detergente. En algunas formas de realización, el compuesto de transducción es un compuesto de molécula pequeña y no es un detergente y es un compuesto bipolar o no bipolar con un grupo que es bioisotérico para un grupo funcional cargado negativamente. En algunas formas de realización, el compuesto de transducción es un compuesto de molécula pequeña y no es un detergente y es un ion híbrido. En algunas formas de realización, el compuesto de transducción es un compuesto de molécula pequeña y es un compuesto bipolar o no bipolar con un grupo que es bioisotérico para un grupo funcional cargado negativamente.
[0205] En algunas formas de realización, se proporciona un método in vitro para la transducción de una molécula de interés en una célula, en donde la molécula de interés es una proteína, un ácido nucleico o una combinación de los mismos, donde el método comprende poner en contacto la célula con una molécula de interés y poner en contacto la célula con un tampón de transducción que comprende una sal seleccionada entre una sal de sodio, litio, potasio, cesio 0 rubidio, un compuesto de transducción seleccionado entre los compuestos 42, 31,45, 43, 34, 41, 40, 39, 44, 22, 20, 03, 30, 17, 15, 38, 35, 11, 10, 28, 37, 01, 25, 29, 02, 21, 36, 26, 16, 06, 04, 23, 24, 12, 14, 05, 08, 27 y 46 en la Tabla 1 y opcionalmente glicina y/o glicerol como osmoprotectores.
[0206] En algunas formas de realización, se proporciona un método in vitro para la transducción de una molécula de interés en una célula, en donde la molécula de interés es una proteína, un ácido nucleico o una combinación de los mismos, donde el método comprende poner en contacto la célula con una molécula de interés y poner en contacto la célula con un tampón de transducción que comprende una sal, en donde la sal es cloruro o gluconato de sodio, litio, potasio, cesio o rubidio, un compuesto de transducción seleccionado entre los compuestos 42, 31, 45, 43, 34, 41, 40, 39, 44, 22, 20, 03, 30, 17, 15, 38, 35, 11, 10, 28, 37, 01, 25, 29, 02, 21, 36, 26, 16, 06, 04, 23, 24, 12, 14, 05, 08, 27 y 46 en la Tabla 1, y opcionalmente glicina y/o glicerol como osmoprotectores.
[0207] En algunas formas de realización, se proporciona un método in vitro para la transducción de una molécula de interés en una célula, en donde la molécula de interés es una proteína, un ácido nucleico o una combinación de los mismos, donde el método comprende poner en contacto la célula con una molécula de interés y poner en contacto la célula con un tampón de transducción que comprende cloruro de sodio, un compuesto de transducción seleccionado entre los compuestos 42, 31, 45, 43, 34, 41, 40, 39, 44, 22, 20, 03, 30, 17, 15, 38, 35, 11, 10, 28, 37, 01, 25, 29, 02, 21, 36, 26, 16, 06, 04, 23, 24, 12, 14, 05, 08, 27 y 46 en la tabla 1, y opcionalmente glicina y/o glicerol como osmoprotectores.
[0208] En algunas formas de realización, se proporciona un método in vitro para la transducción de una molécula de interés en una célula, en donde la molécula de interés es una proteína, un ácido nucleico o una combinación de los mismos, donde el método comprende poner en contacto la célula con una molécula de interés y poner en contacto la célula con un tampón de transducción que comprende cloruro de rubidio, un compuesto de transducción seleccionado entre los compuestos 42, 31, 45, 43, 34, 41, 40, 39, 44, 22, 20, 03, 30, 17, 15, 38, 35, 11, 10, 28, 37, 01, 25, 29, 02, 21, 36, 26, 16, 06, 04, 23, 24, 12, 14, 05, 08, 27 y 46 en la tabla 1, y opcionalmente glicina y/o glicerol como osmoprotectores.
[0209] En algunas formas de realización de la descripción, se proporciona un método para la transducción de una molécula de interés en una célula, en donde la molécula de interés es una proteína, un ácido nucleico o una combinación de los mismos, en donde el método comprende poner en contacto la célula con una molécula de interés y poner en contacto la célula con un tampón de transducción que comprende una sal que se une y/o activa una proteína transportadora de sodio/hidrógeno, un compuesto de transducción según la Fórmula I o la Fórmula II y opcionalmente glicina y/o glicerol como osmoprotectores.
[0210] En algunas formas de realización, se proporciona un método in vitro para la transducción de una molécula de interés en una célula, en donde la molécula de interés es una proteína, un ácido nucleico o una combinación de los mismos, donde el método comprende poner en contacto la célula con una molécula de interés y poner en contacto la célula con un tampón de transducción que comprende una sal, en donde la sal es cloruro o gluconato de sodio, litio, potasio, cesio o rubidio, un compuesto de transducción de acuerdo con la Fórmula I o Fórmula II, y opcionalmente glicina y/o glicerol como osmoprotectores.
[0211] En algunas formas de realización, se proporciona un método in vitro para la transducción de una molécula de interés en una célula, en donde la molécula de interés es una proteína, un ácido nucleico o una combinación de los mismos, donde el método comprende poner en contacto la célula con una molécula de interés y poner en contacto la célula con un tampón de transducción que comprende cloruro de sodio, un compuesto de transducción de acuerdo con la Fórmula I o Fórmula II, y opcionalmente glicina y/o glicerol como osmoprotectores.
[0212] En algunas formas de realización, se proporciona un método in vitro para la transducción de una molécula de interés en una célula, en donde la molécula de interés es una proteína, un ácido nucleico o una combinación de los mismos, donde el método comprende poner en contacto la célula con una molécula de interés y poner en contacto la célula con un tampón de transducción que comprende una sal seleccionada de una sal de sodio, litio, potasio, cesio o rubidio, GABA como compuesto de transducción y opcionalmente glicina y/o glicerol como osmoprotectores.
[0213] En algunas formas de realización, se proporciona un método in vitro para la transducción de una molécula de interés en una célula, en donde la molécula de interés es una proteína, un ácido nucleico o una combinación de los mismos, donde el método comprende poner en contacto la célula con una molécula de interés y poner en contacto la célula con un tampón de transducción que comprende una sal, en donde la sal es cloruro o gluconato de sodio, litio, potasio, cesio o rubidio, GABA como compuesto de transducción y opcionalmente glicina y/o glicerol como osmoprotectores.
[0214] En algunas formas de realización, se proporciona un método in vitro para la transducción de una molécula de interés en una célula, en donde la molécula de interés es una proteína, un ácido nucleico o una combinación de los mismos, donde el método comprende poner en contacto la célula con una molécula de interés y poner en contacto la célula con un tampón de transducción que comprende cloruro de sodio, GABA como compuesto de transducción y opcionalmente glicina y/o glicerol como osmoprotectores.
[0215] En algunas formas de realización, el tampón de transducción tiene una osmolalidad de al menos 250 mOsm/kg, al menos 300 mOsm/kg, o al menos 700 mOsm/kg. En algunas formas de realización, el tampón de transducción tiene una osmolalidad de al menos 400 mOsm/kg. En algunas formas de realización, el tampón de transducción tiene una osmolalidad de al menos 1000 mOsm/kg. En algunas formas de realización, el método de transducción implica el paso de inducir presión osmótica a través de la membrana celular. En algunas formas de realización, el tampón de transducción es hipertónico con respecto al medio de cultivo en donde se mantuvo la célula antes de la transducción y/o con respecto al citosol celular.
[0216] En algunas formas de realización, el método de la transducción implica la activación de macropinocitosis y/o activación de la lisis endosomal. En algunas formas de realización, el método de transducción (en su conjunto) tiene 20% o más, 30% o más, 40% o más, 50% o más, 60% o más, 70% o más, 80% o más, 90% o más, 100% o más, 110% o más, 120% o más, 150% o más, 200% o más, 300% o más, 400% o más, 500% o más, 600% o más, 700% o más u 800% o más de eficacia de transducción, por ejemplo, en donde el método que implica el compuesto N° 1 como se muestra en la Tabla 1 es un control (es decir, representa el 100% de eficacia de transducción).
[0217] En una forma de realización preferida, más del 75% de las células son viables después de la transducción, tal como se evaluó mediante la tinción de anexina V.
[0218] En algunas formas de realización, la transducción de tampón comprende además uno o más de un agonista de GABA, un factor de crecimiento, un péptido de fusión Tat-HA2 y un potenciador de transportador de sodio/hidrógeno.
[0219] En algunas formas de realización, el método comprende la etapa de obtener y/o mantener las células en medio de cultivo antes de la transducción. En algunas formas de realización, el método comprende además poner en contacto la célula con un medio de cultivo durante la transducción, preferiblemente en ausencia de antibióticos.
[0220] En algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende un antibiótico de células permeable, tal como por ejemplo doxiciclina o la tetraciclina.
[0221] En algunas formas de realización, el tampón la transducción comprende adicionalmente uno o más (p. ej. 1,2, 3, 4 o 5) de un potenciador de la viscosidad, factor de crecimiento, citocina, neurotransmisor, o agonistas de los mismos, tales como un agonista de GABA.
[0222] En algunas formas de realización, el método comprende poner en contacto la célula con el tampón de transducción por un período de al menos 30 minutos, preferiblemente durante aproximadamente 12 horas. En algunas formas de realización, el método implica al menos dos rondas de transducción, es decir, la célula se pone en contacto con el tampón de transducción y la molécula de interés durante al menos dos períodos continuos de al menos 30 minutos con un período de recuperación intermedio.
[0223] En algunas formas de realización, la célula es una célula primaria.
[0224] En una realización, la transducción de tampón comprende cloruro de sodio, un compuesto de transducción seleccionado de la Tabla 1, y la glicina y/o glicerol. El compuesto seleccionado de la Tabla 1 tiene una concentración de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 mM. La glicina está en una concentración de aproximadamente 15 mM. El glicerol está en una concentración de aproximadamente 30 mM. Puede añadirse cloruro de sodio para ajustar la osmolalidad a aproximadamente 700 mOsm/kg. El volumen final se puede completar con agua o medio de cultivo, como medio DMEm . La molécula de interés para la transducción se agrega a una concentración apropiada dependiendo del tipo de molécula. En un ejemplo no limitante, la concentración de la molécula de interés puede estar entre aproximadamente 10 nM y aproximadamente 100 pM. En algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende además un péptido de fusión Tat-HA2, que puede estar en una concentración de aproximadamente 5 pM. En algunas formas de realización, el tampón comprende además un agonista de GABA. En algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende además uno o más factores de crecimiento y/o citocinas y/o neurotransmisores y/o agonistas de moléculas pequeñas de estas rutas de señalización.
[0225] En otra realización, la transducción de tampón comprende cloruro de sodio, un compuesto de transducción seleccionado de los compuestos 42, 31, 45, 43, 34, 41, 40, 39, 44, 22, 20, 03, 30, 17, 15, 38, 35, 11, 10, 28, 37, 01, 25, 29, 02, 21, 36, 26, 16, 06, 04, 23, 24, 12, 14, 05, 08, 27 y 46 en la Tabla 1 y glicina y/o glicerol. El compuesto seleccionado de la Tabla 1 tiene una concentración de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 mM. La glicina está a una concentración de aproximadamente 300 mM. El glicerol está en una concentración de aproximadamente 150 mM. Puede añadirse cloruro de sodio para ajustar la osmolalidad a aproximadamente 1000 mOsm/kg. El volumen final se puede completar con agua o medio de cultivo, como medio DMEM. La molécula de interés para la transducción se agrega a una concentración apropiada dependiendo del tipo de molécula. En un ejemplo no limitante, la concentración de la molécula de interés puede estar entre aproximadamente 10 nM y aproximadamente 100 pM. En algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende además un péptido de fusión Tat-HA2, que puede estar en una concentración de aproximadamente 5 pM. En algunas formas de realización, el tampón comprende además un agonista de GABA. En algunas formas de realización, la transducción de tampón comprende además uno o más factores de crecimiento y/o citoquinas y/o neurotransmisores y/o agonistas de molécula pequeña de estas vías de señalización.
[0226] En algunas formas de realización, el compuesto de transducción es un NDCB o un NDSB, como NDSB-201 o un compuesto seleccionado de los compuestos N° 42, N° 1, N° 45, N° 43, N° 44, N° 15, N° 10, N° 11, N° 28, N° 37 y N° 46 que se muestran en la Tabla 1.
[0227] En algunas formas de realización, el método de transducción comprende poner en contacto mESC, iPSC, células gliales derivadas de iPSC humanas o neuronas con la molécula de interés. En algunas formas de realización, la molécula de interés es una proteína a una concentración de entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 100 pM, por ejemplo aproximadamente 1 pM o aproximadamente 5 pM. En algunas formas de realización, la proteína de interés es CRE. El tampón de transducción puede comprender una sal y un compuesto de transducción, y opcionalmente comprende adicionalmente péptido de fusión Tat-HA2 5 pM y opcionalmente un osmoprotector. En una forma de realización adicional, el método implica dos rondas secuenciales de transducción, en las que las células se ponen en contacto con la proteína de interés, como CRE, durante 12 horas en cada ronda de transducción, con un período de recuperación de 12 horas entre cada ronda de transducción.
[0228] Las células madre embrionarias de ratón (mES) se pueden transducir usando el siguiente protocolo (el "protocolo de transducción" en los ejemplos): se siembran 75.000 células mES por pocillo en placas recubiertas de gelatina usando medio mES; al día siguiente, la molécula de interés (p. ej., una proteína, como la proteína Cre) en tampón de transducción 5x se diluye con medio mES (p. ej., en 1: 5); luego se agrega la mezcla completa a la célula; después de aproximadamente 12 horas, el medio de transducción se reemplaza por medio mES.
[0229] Las células madre de ratón neuronales pueden ser transducidas usando el siguiente protocolo (el "protocolo de transducción" en los ejemplos): neuroesferas se colocan en placas con medio de células madre neuronal; a continuación, se añade a las células la molécula de interés (p. ej., 20 ml de proteína, como. CRE) en tampón de transducción 5x y se mezcla cuidadosamente; aproximadamente 12 horas después, el medio de transducción se reemplaza por medio de células madre neurales frescas.
[0230] Las células iPS humanas pueden ser transducidas usando el siguiente protocolo (el "protocolo de transducción 12/500" en los ejemplos). Las células se pasan por disociación mecánica en pequeños grupos, por ejemplo, siguiendo las instrucciones del fabricante de mTeSR1 o TeSR-E8 y se siembran en una placa revestida con matrigel para alcanzar aproximadamente un 50% de confluencia. Al día siguiente, la molécula de interés (p. ej., una proteína, como la proteína CRE) en tampón de transducción 5x se diluye (p. ej., 1:5) con mTeSR1 o TeSR-E8. Luego se agrega la mezcla completa a las células. Después de 12 horas de transducción, el medio se reemplaza por medio mTeSR1 o TeSR-E8 fresco y las células se pueden incubar durante 24-48 horas.
[0231] En algunas formas de realización, el tampón de transducción se usa para transducir ADN y los lípidos en una célula (p. ej., véase el Ejemplo 7 y la Figura 11). En algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende ADN plasmídico y un lípido. Por ejemplo, la transducción de tampón comprende 100 ng de ADN plasmídico, 0,8 pL de reactivo Lipofectamine LTX de lípidos, 0,1 pL de reactivo PLUS (Life Technologies) y 20 pL de 5x tampón de la transducción. El tampón de transducción final comprende 100 pl mESC y Factor Inhibidor de Leucemia (LIF). LIF se utiliza en el contexto de las células madre embrionarias para mantener el estado de las células madre.
[0232] En algunas formas de realización, el tampón de transducción se usa para transducir ADN y la proteína en una célula (p. ej., véase el Ejemplo 8 y la Figura 12). Por ejemplo, en algunas formas de realización, la transducción de tampón comprende 100 ng de ADN plasmídico, 0,8 pl de lípidos de lipofectamina LTX, 0,1 pl de reactivo PLUS (Life Technologies) y 20 pl de proteínas CRE en 5x tampón de transducción. El tampón de transducción final comprende 100 pl de medios mESC y LIF.
[0233] En algunas formas de realización, la transducción de tampón potencia la incorporación viral en las células, tales como células iPS humanas (p. ej., véase el Ejemplo 9 y la Figura 13). Por ejemplo, en algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende adicionalmente stock viral concentrado, polibreno y medio de cultivo iPSC humano.
[0234] En algunas formas de realización, los métodos de transducción son adecuados para la transducción de proteínas con baja solubilidad (véase el Ejemplo 10). En algunas formas de realización, un tampón de transducción adecuado para transducir proteínas con baja solubilidad tiene una osmolalidad de aproximadamente 1000 mOsm/kg, comprende un compuesto de transducción a una concentración de aproximadamente 250 mM y comprende un osmoprotector a una concentración de aproximadamente 150-300 mM.
[0235] En algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende 500 mM NaCl, 250 mM NDSB-201, 300 mM glicina, 150 mM de glicerol en D-MEM n 2/B27 y LIF. Este es el tampón de transducción "2/1000". Es adecuado para la transducción de proteínas de baja solubilidad.
[0236] En una forma de realización se proporciona un método para transducir células TEr. El método para transducir células mES comprende añadir 80 pl de tampón de transducción 2/1000 a 20 pl de proteína CRE (u otra molécula de interés) en tampón de transducción 5x 12/500. Las células se incuban durante 2 horas. Después de la incubación, el tampón de transducción se reemplaza con medio mESC.
[0237] En algunas formas de realización, las células iPS humanas pueden ser transducidas con proteínas TALEN (p. ej., véase el Ejemplo 11). En algunas formas de realización, las células iPS humanas se incuban con aproximadamente 2 pM de proteína TALEN durante aproximadamente 12 h. Por ejemplo, aproximadamente 20 pL de proteína en tampón TALEN transducción 5x se mezcla con aproximadamente 80 pL de medio de células iPS humanas.
[0238] En algunas formas de realización, el tampón de transducción se puede utilizar para la transducción simultánea de las proteínas y las moléculas grandes en una célula (p. ej., véase el Ejemplo 12). Por ejemplo, en una forma de realización se proporciona un método para transducir dextrano y BSA en m Ef . El método comprende incubar las células con 5 pg/ml de Dextrano y 1 pg de BSA en medio de transducción 1x (protocolo 3/700) durante 30 min. Posteriormente, las células se lavan dos veces en tampón de transducción 1x.
[0239] En algunas formas de realización, el tampón y los métodos de transducción se pueden usar para la transducción de una proteína que es capaz de modificar un ácido nucleico o de un sistema de edición de genes en las células. En algunas formas de realización, se proporciona un método para transducir una proteína que es capaz de modificar un ácido nucleico o un sistema de edición de genes, como una nucleasa Cas9 y un sgARN, en una célula, en donde el método comprende incubar la célula con aproximadamente 250 mM de un compuesto de transducción (p. ej., compuesto N° 20) a una osmolalidad de aproximadamente 1250 mOsmol/kg, durante aproximadamente 60 minutos. En algunas formas de realización, se pueden usar dos rondas posteriores de transducción. En una forma de realización preferida, las células se incuban con aproximadamente 250 ng/ml de proteína B18R antes (p. ej., aproximadamente 3 horas antes) de la transducción y/o durante la transducción y/o después (p. ej., aproximadamente 48 horas después) de la transducción. En alguna realización, se incluyen glicina (p. ej., 15 mM) y/o glicerol (p. ej., 30 mM) como osmoprotectores. El experto en la materia comprenderá que se pueden utilizar alternativamente otros protocolos adecuados que caigan dentro del alcance de la invención.
[0240] La invención también proporciona un tampón de transducción tal como se define anteriormente para uso en un método de tratamiento de una enfermedad genética, en donde el método comprende modificar un ácido nucleico, tal como una secuencia genética, en una célula, donde el método comprende poner en contacto dicha célula con una proteína capaz de modificar un ácido nucleico y un tampón de transducción, donde el tampón de transducción comprende (i) un compuesto de transducción según la Fórmula I como se define anteriormente, (ii) una sal seleccionada entre una sal de sodio, litio, potasio, cesio o rubidio, y preferiblemente (iii) un osmoprotector. En algunas formas de realización, la proteína capaz de modificar un ácido nucleico se dirige a una secuencia diana específica, por ejemplo, en donde la proteína es una nucleasa con dedos de zinc o una TALEN, Cas9, un análogo de Cas9, una proteína asociada a la nucleasa FokI dirigida al ADN, un complejo Cascade, una proteína TtAgo u otra proteína Argonaute o sus derivados. En algunas formas de realización, la célula se pone en contacto además con una molécula guía para dirigir la proteína a una secuencia genética diana. En algunas formas de realización, la osmolalidad se ajusta entre aproximadamente 1000 mOsm/kg y aproximadamente 1.500 mOsm/kg, preferiblemente aproximadamente 1250 mOsm/kg. En algunas formas de realización, el compuesto de transducción se usa a una concentración de aproximadamente 200 nM a aproximadamente 400 nM, preferiblemente aproximadamente 250 mM. En algunas formas de realización, la transducción se lleva a cabo durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas o desde aproximadamente 1 hora a aproximadamente 12 horas. En algunas formas de realización, el tampón de transducción comprende además un inhibidor de la vía de respuesta al interferón, por ejemplo, B18R. En algunas formas de realización, la célula es una célula madre, como una célula iPS o una línea de células madre, que incluye, por ejemplo, líneas de células madre humanas. En algunas formas de realización, el osmoprotector se selecciona entre glicina, glicerol, taurina, glicinabetaína, mioinositol, glutamina, glutamato, arginina, manitol y trehalosa.
[0241] En algunas formas de realización, en el método para modificar un ácido nucleico, tal como una secuencia genética, en una célula, la proteína capaz de modificar un ácido nucleico está presente en la célula durante menos de 10 días, menos de 5 días, menos de 4 días, menos de 3 días, menos de 2 días, menos de 1 día, menos de 12 horas, menos de 6 horas o menos de 1 hora. Si la proteína capaz de modificar un ácido nucleico está presente en la célula durante demasiado tiempo, puede comenzar a tener efectos dañinos fuera del objetivo (es decir, modificar secuencias no objetivo). Esto es a menudo un problema con las formas tradicionales de transfección que implican la expresión de la proteína a partir de un plásmido de expresión durante varios días.
[0242] En algunas formas de realización de la descripción, el método para modificar un ácido nucleico, tal como una secuencia genética, en una célula, que comprende además aislar o usar la célula modificada. La divulgación también proporciona una célula modificada que se puede obtener mediante estos métodos. En algunas formas de realización, la célula modificada comprende un sistema de edición de genes transducidos. En algunas formas de realización, la célula modificada no comprende un vector viral. En algunas formas de realización, la célula modificada no comprende un portador de nanopartículas. En algunas formas de realización, la célula no comprende un péptido que penetre en la célula.
Composición farmacéutica
[0243] En algunas formas de realización, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el tampón de transducción de la invención y una molécula de interés para la transducción. En algunas formas de realización, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el tampón de transducción. En algunas formas de realización, la molécula de interés y los componentes del tampón de transducción se administran simultánea o secuencialmente.
[0244] La composición farmacéutica puede incluir otros componentes además del tampón de transducción y una molécula de interés. Por ejemplo, una composición farmacéutica incluirá normalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable, que puede ser cualquier sustancia que no induzca por sí misma la producción de anticuerpos dañinos para el paciente que recibe la composición, y que se puede administrar sin una toxicidad indebida. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados son bien conocidos en la técnica. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden incluir, por ejemplo, líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Las sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tampón del pH y similares, también pueden estar presentes en las composiciones farmacéuticas (véase Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20a edición, ISBN: 0683306472).
[0245] En algunas formas de realización, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de transducción o compuesto de transducción y una proteína capaz de modificar un ácido nucleico, tal como un sistema de edición de genes.
[0246] La composición farmacéutica puede ser estéril y/o libre de pirógenos.
[0247] La invención también proporciona un recipiente (p. ej., vial) o dispositivo de administración (p. ej., jeringa) precargado con una composición farmacéutica de la invención. La invención también proporciona un proceso para proporcionar tal recipiente o dispositivo, que comprende introducir en el recipiente o dispositivo una composición de la invención.
[0248] La dosis apropiada puede variar dependiendo de la condición de salud y física del individuo a tratar, edad, el grupo taxonómico del individuo a tratar (p. ej., humano, primate no humano, primate, etc.), el grado de transducción deseada, la formulación de la composición farmacéutica, la evaluación del médico tratante de la situación médica y otros factores relevantes. La dosis puede caer en un rango relativamente amplio que se puede determinar mediante ensayos de rutina.
[0249] Las composiciones de la invención se pueden preparar en diversas formas líquidas. Por ejemplo, las composiciones se pueden preparar como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones. Son típicos los inyectables para administración local subcutánea o intramuscular. La inyección puede ser a través de una aguja (p. ej., una aguja hipodérmica), pero alternativamente se puede usar una inyección sin aguja.
[0250] Las composiciones pueden incluir un antimicrobiano. Los antimicrobianos tales como tiomersal y 2-fenoxietanol se encuentran comúnmente en composiciones farmacéuticas, pero se prefiere usar un conservante sin mercurio o ningún conservante en absoluto.
[0251] Las composiciones pueden comprender detergente, por ejemplo, un Tween (polisorbato), tal como Tween 80. Los detergentes generalmente están presentes en niveles bajos, por ejemplo, <0,01%. En algunas formas de realización, el tampón no comprende un detergente. En algunas formas de realización, el método de transducción no implica el uso de un detergente durante la transducción.
[0252] Volúmenes de dosificación eficaces pueden establecerse de forma rutinaria, dependiendo de la finalidad de la composición. La dosis humana típica de la composición podría ser, por ejemplo, aproximadamente 0,5 ml, por ejemplo, para inyección intramuscular (p. ej., inyección local en el músculo o tejido de interés). Pueden usarse dosis similares para otras vías de administración.
[0253] La divulgación también proporciona un kit que comprende un tampón de transducción de la invención o una composición farmacéutica de la invención. El kit puede comprender adicionalmente células y/o moléculas de interés para la transducción. El kit también puede comprender instrucciones de uso. El kit puede incluir los diversos componentes del tampón de transducción en uno o más contenedores separados, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más contenedores separados. Por ejemplo, el kit puede comprender un recipiente que comprende una solución salina, un recipiente que comprende el compuesto de transducción, un recipiente que comprende la molécula de interés, un recipiente que comprende el osmoprotector y/o un recipiente que comprende un diluyente o medio. Además, el kit puede comprender uno o más de los otros componentes adicionales como se describen en el presente documento, en los que son adecuados para la administración simultánea, secuencial o separada con el tampón de transducción.
Usos de la invención
[0254] La invención proporciona el uso del tampón de transducción para transducir una molécula de interés en una célula.
[0255] La transducción de moléculas en una célula puede ser útil tanto por razones de investigación como terapéuticas.
[0256] En algunas formas de realización, los tampones de transducción y métodos de la invención se pueden utilizar para la modificación genética. Por ejemplo, en algunas formas de realización, la transducción de ciertas enzimas en células puede dar como resultado la modificación del genoma de la célula o la modificación de secuencias de ácidos nucleicos extraños. Por ejemplo, la molécula transducida (como una enzima) puede resultar en la inserción, deleción, sustitución, translocación, inversión o modificación de uno o más (p. ej., una secuencia de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 104, 105, 106, 107 o más) ácidos nucleicos. Por ejemplo, la recombinación Cre-Lox es una tecnología de recombinasa específica de sitio ampliamente utilizada para llevar a cabo deleciones, inserciones, translocaciones e inversiones en el ADN de las células (Turan, S.; Galla, M.; Ernst, E.; Qiao, J.; Voelkel, C.; Schiedlmeier, B.; Zehe, C.; Bode, J. (2011). "Recombinase-mediated cassette exchange (RMCE): traditional concepts and current challenges". J. Mol. Biol. 407 (2): 193-221). Permite que la modificación del ADN se dirija a un tipo de célula específico o se active mediante un estímulo externo específico. Se implementa tanto en sistemas eucariotas como procariotas. El sistema consta de una sola enzima, recombinasa Cre, que recombina un par de secuencias diana cortas llamadas secuencias Lox. Este sistema se puede implementar sin insertar proteínas o secuencias de soporte adicionales. La enzima Cre y el sitio Lox original llamado secuencia LoxP se derivan de un bacteriófago P1. La colocación apropiada de secuencias de Lox permitirá que los genes se activen, repriman o intercambien por otros genes. A nivel de ADN se pueden realizar muchos tipos de manipulaciones. La actividad de la enzima Cre puede controlarse para que se exprese en un tipo de célula particular o se active por un estímulo externo, como una señal química o un choque térmico. Estos cambios de ADN dirigidos son útiles en el rastreo del linaje celular y cuando los mutantes son letales si se expresan globalmente. El sistema Cre-Lox es muy similar en acción y uso al sistema de recombinación FLP-FRT, que implica la recombinación de secuencias entre sitios diana de reconocimiento de flippasa cortos (FRT) por la recombinasa (Flp) derivada del plásmido de 2 pM de Saccharomyces cerevisiae. Por tanto, en algunas formas de realización, la invención proporciona el uso del tampón de transducción en un sistema de recombinación Cre-Lox o FLP-FRT para transducir Cre recombinasa o flippasa en una célula. La invención también proporciona un método para transducir una molécula de interés en una célula, en donde la molécula de interés es recombinasa Cre o flippasa.
[0257] En algunas formas de realización, el compuesto de la transducción, tampón o método se puede utilizar para la modificación genética de secuencias de genes específicos, también denominada aquí como "edición de genes". En algunas formas de realización, la invención también proporciona un tampón de transducción como se define anteriormente para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad genética, donde dicho método comprende modificar una secuencia genética en una célula, y donde la molécula de interés es una proteína capaz de modificar un ácido nucleico, preferiblemente una secuencia genética específica, y opcionalmente es parte de un sistema de edición de genes. En los últimos años, se han desarrollado dos sistemas de edición de genes esencialmente diferentes que difieren en la forma en que encuentran su secuencia diana genómica específica. Un tipo, representado por nucleasas con dedos de zinc (ZFN) y TALEN, utiliza dominios personalizables dentro de la propia proteína nucleasa para reconocer la secuencia de ADN diana específica en el genoma. El otro tipo está representado por Cas9/CRISPR, Cascade y TtAgo y otros sistemas de proteínas Argonaute, a veces acoplados como proteína de fusión a un dominio de nucleasa, como el dominio de nucleasa FokI, que usa una proteína común (complejo) que es el mismo independientemente del sitio diana genómico, que se dirige a una diana específica por una secuencia de nucleótidos asociada (como un sgARN o gADN). Tradicionalmente, estos sistemas de edición de genes se han transfectado en células como ácidos nucleicos que codifican la maquinaria de proteína/ARN; los ácidos nucleicos transfectados se expresan luego dentro de las células. Los métodos tradicionales para la transfección de ácidos nucleicos implican vectores virales, electroporación o nanopartículas o liposomas portadores. Estos métodos dificultan las aplicaciones clínicas y son ineficaces para ciertos tipos de células, como se explica en otra parte. Los inventores han demostrado, por el contrario, que los compuestos, tampones y métodos de transducción descritos en el presente documento son capaces de suministrar proteínas y/o ácidos nucleicos directamente a las células (p. ej., como parte de sistemas de edición de genes) que permiten una edición de genes rápida, no viral y altamente eficiente. Específicamente, han demostrado que ambos "tipos" de maquinaria de edición de genes mencionados anteriormente se pueden transducir usando los compuestos de transducción, tampones y métodos de la invención. Por tanto, en algunas formas de realización, los métodos de transducción de la invención se utilizan para la modificación genética, en los que la transducción no requiere o no comprende el uso de vectores virales (en particular, no comprende el uso de vectores virales para expresar proteínas dentro de las células)., no requiere o no comprende el uso de electroporación, no requiere o no comprende el uso de nanopartículas portadoras y/o no requiere o no comprende el uso de liposomas.
[0258] En algunas formas de realización, la invención proporciona una célula obtenible u obtenida por los métodos de transducción de la presente invención, por ejemplo, en donde la célula no comprende un vector viral (p. ej., no comprende los vectores virales que codifican proteínas que pueden modificar genes), o por ejemplo, en donde la célula no comprende nanopartículas portadoras, micelas o liposomas.
[0259] En algunas formas de realización, la molécula que se transduce en una célula es una endonucleasa. Las endonucleasas son enzimas que cortan cadenas de ADN en una secuencia específica. Los efectores de tipo activador de la transcripción (TALE) son reguladores transcripcionales diseñados para unirse a una secuencia de a Dn deseada particular (Moscou, J & Bogdanove, AJ Science 326 (5959): 1501, 2009). Combinando tal TALE diseñado con un dominio de endonucleasa (que corta las cadenas de ADN), se pueden diseñar endonucleasas que son específicas para cualquier secuencia de ADN deseada. Cuando estas enzimas de restricción se introducen en las células, se pueden usar para la edición del genoma in situ, una técnica conocida como edición del genoma con nucleasas diseñadas. Las endonucleasas de tipo activador de la transcripción (TALEN) se pueden usar para editar genomas induciendo roturas de doble cadena (DSB), a las que las células responden con mecanismos de reparación (Zhang, F et. Al. Nature Biotechnology 29 (2): 149-53, 2011). Por tanto, en algunas formas de realización, la invención proporciona el uso del tampón de transducción en ingeniería genética basada en enzimas de restricción o basada en endonucleasas (tal como basada en TALEN). Por consiguiente, en algunas formas de realización, la molécula de interés que se transducirá en una célula es un TALEN. Las secuencias de ácidos nucleicos extrañas también pueden introducirse en la célula mediante métodos de la presente invención o mediante métodos de transducción alternativos. El ADN puede introducirse opcionalmente en un genoma a través de la unión de exones no homólogos en presencia de fragmentos de ADN de doble hebra exógenos. La reparación dirigida por homología también puede introducir ADN extraño en la rotura de doble hebra, ya que las secuencias de doble hebra transfectadas se utilizan como moldes para las enzimas de reparación. Por lo tanto, los TALEN se han utilizado para generar clones de células madre embrionarias humanas modificadas de forma estable y de células madre pluripotentes inducidas (células iPS), para generar C. elegans knockout, ratas knockout y pez cebra knockout. Por lo tanto, en algunas formas de realización, la modificación genética por TALEN u otras moléculas transducidas, podría usarse para reemplazar las técnicas de inyección que se usan actualmente para la modificación de embriones o blastocistos preimplantatorios para la generación de animales modificados genéticamente (p. ej., para la generación de organismos modelo que muestran rasgos o con enfermedades o trastornos genéticos particulares) (Voncken JW. Methods Mol Biol. 2011; 693: 11-36). Acoplando otros dominios en el esqueleto de TALE, también se puede modificar o regular el ADN de otras formas. Por ejemplo, la adición de un dominio de transactivación en lugar del dominio de endonucleasa, convierte un TALE en un activador transcripcional. La adición de un dominio represor da como resultado un TALE que cierra la transcripción de genes. La adición de un dominio de metilación permite la metilación del ADN en sitios específicos. De manera similar, la adición de un dominio de modificación de histonas (p. ej., histona acetilasa) permite la modificación de histonas en sitios específicos, etc. Todos estos están previstos como moléculas para usar con la invención.
[0260] En algunas formas de realización, una nucleasa de proteína y un ácido nucleico de guía (tal como un sgARN o gADN) se transducen en la célula simultáneamente o secuencialmente, usando compuestos de transducción, tampones y/o métodos de la invención. Por ejemplo, en algunas formas de realización, una nucleasa Cas9 y un sgARN se transducen en la célula de forma simultánea o secuencial. Los ARN guía pequeños y los ADN guía se pueden diseñar para apuntar a una secuencia de ADN específica y, por lo tanto, esta combinación se puede utilizar para la edición de genes específicos. Como se mencionó anteriormente, esta combinación se conoce como el sistema CRISPR/Cas9. Otros sistemas similares y alternativos a la nucleasa Cas9 incluyen proteínas del sistema Cascade, TtAgo y otras proteínas Argonaute, y otras proteínas asociadas a la nucleasa FOKI.
[0261] Así, en algunas formas de realización, la invención proporciona un método, para transducir un gen del sistema, de edición, como un sistema de TALEN, un sistema de CRISPR/Cas9 (preferiblemente incluyendo sistemas que implican análogos Cas de diferentes especies), un sistema nucleasa FokI, un sistema en cascada, un sistema TtAgo u otros sistemas de proteínas Argonaute, en una célula. Los compuestos de transducción y tampones descritos en el presente documento pueden usarse para tales métodos y pueden permitir la edición de genes en células, sin la necesidad de una transfección viral (véanse los comentarios anteriores).
[0262] En algunas formas de realización el ácido nucleico marcado como diana por el sistema de edición de gen es un ácido nucleico endógeno, por ejemplo, ADN genómico. En otras formas de realización, el ácido nucleico dirigido por el sistema de edición de genes es ácido nucleico exógeno, que puede, por ejemplo, ser transducido a la célula con el sistema de edición de genes como parte del método de transducción.
[0263] En algunas formas de realización, tales sistemas de edición de genes se pueden utilizar para generar mutaciones de genes específicos que incluyen pero no se limitan a genes knockouts monoalélicos o bialélicos. Por ejemplo, véase el Ejemplo 14 en donde los inventores demostraron una alteración del gen WDR85 bialéico. Cuando se transducen en las células usando los métodos de la invención (p. ej., en lugar de usar métodos de transfección viral de la técnica anterior), los sistemas de edición de genes dan como resultado knockouts de genes monoalélicos o bialélicos altamente eficientes. Así, en algunas formas de realización, los métodos de la invención dan como resultado al menos 1%, al menos 2%, al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60% o al menos 70% modificación genética monoalélica o bialélica (o knockout).
[0264] La edición génica también puede utilizarse para estudiar las funciones de genes en animales y para la terapia génica en animales, incluyendo seres humanos. También es útil en el campo de la biología sintética para modificar células y organismos para que realicen funciones novedosas. Además, las funciones de los genes se pueden estudiar en líneas celulares modificadas, como líneas de células madre. Por lo tanto, en algunas formas de realización, los compuestos de transducción, métodos o tampones de la invención, particularmente cuando se usan en combinación con las realizaciones de edición de genes, pueden usarse para estudiar la función génica, para terapia génica o para biología sintética.
[0265] En algunas formas de realización, en tales métodos, las enzimas tales como las descritas anteriormente son transducidas en la célula embrionaria no humana o blastocisto no humano para modificar genéticamente la célula, antes de la implantación en el animal. Por tanto, en algunas formas de realización, el tampón de transducción y los métodos de la invención podrían usarse para generar organismos modelo, tales como organismos knockout. En otras formas de realización, se contempla que el tampón de transducción y los métodos de la invención podrían usarse para tratar trastornos heredados genéticamente (p. ej., genética de preimplantación). Por tanto, la invención proporciona un método para transducir una molécula de interés en una célula en donde las moléculas de interés son ácidos nucleicos y/o enzimas que modifican los ácidos nucleicos y, opcionalmente, en donde la célula es una célula embrionaria no humana o blastocisto no humano.
[0266] En algunas formas de realización, la modificación genética consiste en la integración de ADN extraño en el genoma del huésped, en donde el ADN extraño es la molécula de interés que se transduce en una célula usando los métodos de la presente invención. Sin embargo, para evitar la integración aberrante y la alteración del genoma, en algunas formas de realización la modificación genética implica un enfoque no integrador, es decir, el ácido nucleico modificado no está integrado en el genoma.
[0267] El tampón y métodos de la invención transducción también podría utilizarse para generar células iPS, ya sea modificando genéticamente las células para expresar ciertos factores de transcripción implicados en el mantenimiento de células madre pluripotentes, o por transducción de los factores de transcripción directamente en las células. Los ejemplos de factores de transcripción implicados en la inducción de pluripotencia incluyen, entre otros, OCT2/3/4, SOX2, KLF4, C-MYC, N-MYC, NANOG, ESRRB y LIN28.
[0268] En algunas formas de realización, la invención proporciona un tampón de transducción o composición farmacéutica, para uso en terapia, profilaxis o diagnóstico.
[0269] La divulgación también proporciona procedimientos para terapia o diagnóstico que comprenden la transducción de una molécula de interés en una célula. La célula puede ser una célula in vivo, en cuyo caso el tratamiento es un tratamiento directo. Alternativamente, la célula puede transducirse in vitro, por ejemplo, para diagnóstico in vitro. Alternativamente, la célula puede transducirse in vitro antes del trasplante de la célula a un paciente. El trasplante puede ser autólogo o alogénico, es decir, la célula transducida puede trasplantarse de nuevo al mismo paciente del que se tomó (autólogo) o en una persona diferente (alogénico). En una forma de realización preferida, el trasplante es autólogo.
[0270] Fármacos biológicos (también conocidos como productos biológicos) que incluyen anticuerpos monoclonales, citoquinas, factores de crecimiento tisular y proteínas terapéuticas se están convirtiendo en alternativas cada vez más importantes a moléculas pequeñas químicas para uso en terapia. Sin embargo, existen varias dificultades asociadas con los fármacos biológicos, en particular en relación con su suministro al objetivo de interés. Los tampones de transducción y los métodos de la presente invención podrían usarse para mejorar el suministro de productos biológicos a las células. Por ejemplo, en algunas formas de realización, la molécula de interés en los métodos de la invención es un biológico, por ejemplo seleccionado de un anticuerpo monoclonal, citoquina, factor de crecimiento tisular y proteína terapéutica. La célula de interés puede transducirse in vitro y trasplantarse de nuevo al paciente.
[0271] En algunas formas de realización, se proporciona una proteína que modifica un ácido nucleico, por ejemplo, un sistema de edición de genes (como ZNF, TALEN, CRISPR/Cas9, el sistema Cascade, TtAgo y otros sistemas de Argonaute, y otras proteínas FOKInuclease asociadas), para uso en terapia. En algunas formas de realización, dicha terapia comprende un método de transducción de una molécula en una célula según la invención. Se pueden tratar una serie de enfermedades y afecciones mediante la transducción de proteínas que modifican un ácido nucleico, por ejemplo, sistemas de edición de genes, y el experto en la materia tendrá claro qué enfermedades o afecciones pueden tratarse. Las afecciones y enfermedades que se pueden tratar mediante la transducción de una proteína que modifica un ácido nucleico, por ejemplo, un sistema de edición de genes, incluyen enfermedades genéticas como, enfermedad de células falciformes, amaurosis congénita de Leber, SCID ligada al cromosoma X, ADA-SCID, adrenoleucodistrofia, leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia linfocítica aguda (LLA), mieloma múltiple, hemofilia y enfermedad de Parkinson. La terapia puede ser terapia génica de línea germinal somática o no humana, es decir, en algunas formas de realización, la célula en el método de transducción es una célula somática o una célula germinal no humana.
[0272] El tampón de transducción y métodos de la invención también se pueden utilizar para antígenos de carga en las células presentadoras de antígeno para la presentación al sistema inmune. Esto produce ventajosamente un nuevo proceso de fabricación de vacunas. Por ejemplo, los antígenos se cargaron en células dendríticas in vitro y luego se trasplantaron nuevamente al cuerpo. Sin embargo, los métodos utilizados hasta ahora han dañado las células dendríticas, por ejemplo, porque han forzado a las proteínas a entrar en las células mediante mecanismos como la endocitosis. Las células dendríticas ya tienen vías de macropinocitosis muy activas. Por lo tanto, mediante el uso de métodos de la invención, las células dendríticas podrían cargarse con antígeno a través de la ruta de macropinocitosis, con daño insignificante a la célula. Este método podría llevarse a cabo in vitro antes del trasplante de las células al paciente.
[0273] Por consiguiente, se proporciona el uso del tampón de transducción para transducir antígenos en células presentadoras de antígeno. También se proporciona un método para transducir antígenos en células presentadoras de antígenos. La invención también proporciona el uso del tampón de transducción y/o métodos de la invención para fabricar una vacuna, por ejemplo, mediante el cual la vacuna comprende células presentadoras de antígeno que han sido transducidas por los métodos de la presente invención, es decir, en las que el antígeno de interés se ha transducido a la célula. De manera similar, la divulgación proporciona un método para vacunar, tratar o prevenir a un sujeto que comprende administrar una célula al sujeto, en donde la célula ha sido transducida mediante un método de la presente invención. Asimismo, la divulgación proporciona una célula para su uso en un método de vacunación, tratamiento o prevención de un sujeto, en donde el método comprende administrar una célula al sujeto, en donde la célula ha sido transducida mediante un método de la presente invención.
[0274] En algunas formas de realización, la divulgación proporciona el uso de un tampón de transducción descrito en este documento en un método para transfección catiónica de ADN mediada por lípidos. La invención proporciona un método in vitro para la transducción de lípidos y ADN en la célula, en donde el método es como se describe en el presente documento.
General
[0275] El término "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste", por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X+Y.
[0276] La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente", por ejemplo una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede omitirse de la definición de la invención.
[0277] El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico x significa, por ejemplo, x±10%. También se refiere específicamente al valor exacto, por ejemplo, en el ejemplo anterior, exactamente al 10%. Cuando sea necesario, la palabra "aproximadamente" puede omitirse de la definición de la invención.
[0278] El término "un" o "una", a menos que se especifique lo contrario, significa "uno o más". Por ejemplo, puede significar "solo uno" o puede significar "más de uno", por ejemplo "dos, tres, cuatro, cinco o más".
[0279] A menos que se indique específicamente, un procedimiento que comprende una etapa de mezclar dos o más componentes no requiere ningún orden específico de mezcla. Por tanto, los componentes se pueden mezclar en cualquier orden. Cuando hay tres componentes, entonces se pueden combinar dos componentes entre sí, y luego la combinación se puede combinar con el tercer componente, etc.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0280]
Figura 1: Transducción de la proteína recombinasa Cre usando el método descrito por Okada, et al.
(A) Representación esquemática del reportero de recombinasa Cre. Se apuntó un reportero CMV-Lox-Stop-Lox-eGFP al locus ColA1 de las ESC 2 murinas. La CRE-recombinasa intracelular escinde el casete Stop induciendo así la expresión de eGFP.
(B) Los gráficos FACS de mESC transducidos con 5 uM de proteína CRE recombinante (panel derecho) se comparan con células no transducidas (panel izquierdo) usando el método de Okada. Se indica el porcentaje de células positivas para GFP transducidas con éxito.
Figura 2: Transducción de proteínas independiente del dom inio peptídico de transducción.
(A) Representación esquemática de proteínas recombinantes. Los dominios en las proteínas recombinantes se indican: H6: etiqueta de purificación 6xHistidina; LFn: dominio de transducción N-terminal de la proteína LF del ántrax; SUMO-1: dominio de escisión sumo; Oct4: proteína Oct4 murina (Pou5f1); VP16: dominio de transactivación VP16.
(B) Representación esquemática de las construcciones informadoras de luciferasa utilizadas en este estudio. Arriba: Reportero de Oct4 que contiene 6 repeticiones en tándem de la secuencia de reconocimiento de ADN de Oct4. Medio: construcción de control que carece de la secuencia de unión de Oct4; Abajo: construcción de control para monitorear la eficiencia de la transfección, expresando luciferasa de renilla.
(C) Representación esquemática de la línea de tiempo del ensayo de transducción de proteínas. (D) Se transfectaron células COS7 con indicadoR®xOCT4-TK-Luc seguido de transducción de proteínas. Los controles de especificidad fueron células transfectadas con indicador TK-Luc (barras negras) o 6xOct4-TK-Luc (barras grises) en combinación con lentivirus vacío o que expresaba OCT4. La actividad de luciferasa de luciérnaga se normalizó con una construcción de luciferasa de Renilla cotransfectada. PA; Antígeno protector, el cofactor necesario para la transducción mediada por LFn. (E) Representación esquemática de las proteínas recombinantes OCT4 utilizadas en este estudio. (F) Las células COS7 se transfectaron con el indicador 6xOCT4-TK-Luc y 12 h después se transdujeron con las proteínas OCT4 indicadas a una concentración creciente como se indica en la figura. La actividad de luciferasa de luciérnaga se normalizó cotransfectando la construcción de luciferasa de Renilla como en (D). Como control, las células se transdujeron con lentivirus vacío y OCT4 ("EV" y "OCT-4", respectivamente).
(G) Las células COS7 se transfectaron con el indicador OCT4-TK-Luc y se transdujeron con la proteína OCT4-VP16 (barra negra "+") o sin proteína (barra blanca "+"). Las barras AG representan células transducidas con la proteína OCT4-VP16 en medio de transducción menos un componente. La actividad de luciferasa de luciérnaga se normalizó con la construcción de luciferasa de Renilla cotransfectada.
(H) Estructura del compuesto no detergente sulfobetaína 201 (NDSB-201).
Figura 3: La transducción de proteínas depende del tiempo, la concentración de proteínas, la hipertonicidad inducida por sales y NDSB-201.
(A) Esquema esquemático del ensayo indicador de p-lactamasa. El CCF2/AM no fluorescente atraviesa la membrana celular a través de la difusión y queda atrapado en el citoplasma a través de la esterificación intracelular, que también activa las propiedades fluorescentes del ahora llamado CCF2. Cuando se sale de CCF2 a 409 nm, emite una señal fluorescente a 520 nm (señal verde). La escisión de CCF2 por la p-lactamasa intracelular da como resultado un cambio en la longitud de onda de emisión del producto de escisión restante a 447 nm (señal azul). La relación entre la señal verde y azul es una medida de la cantidad de p-lactamasa intracelular (transducida).
(B) Ensayo indicador de p-lactamasa. Fibroblastos embrionarios murinos (MEFs) fueron transducidos con 1 |jM p-lactamasa de proteína, 25 mM NDSB-201 a una osmolalidad de 700 mOsm/Kg inducida por NaCl durante el tiempo indicado (barras sólidas). Las células de control se trataron como antes, pero en medio isotónico (300 mOsm/kg, círculos abiertos).
(C) Ensayo indicador de p-lactamasa en MEF transducidos con concentraciones crecientes de proteína p-lactamasa (como se indica), NDSB-201 25 mM a 700 mOsm/kg de osmolalidad inducida por NaCl durante 3 h (barras sólidas). Las células de control se trataron como antes, pero en medio isotónico (300 mOsm/kg, círculos abiertos).
(D) Ensayo indicador de p-lactamasa en MEF transducidos con 1 j M de proteína p-lactamasa, NDSB-201 25 mM a diferentes osmolalidades (como se indica) inducidas por NaCl durante 3 h. (barras rojas). Las células de control se trataron como antes, pero en medio isotónico (300 mOsm/kg, círculos abiertos).
(E) Ensayo indicador de p-lactamasa en MEF transducidos con 1 j M de proteína p-lactamasa con diferentes concentraciones de NDSB-201 (como se indica) a 700 mOsm/kg de osmolalidad inducida por NaCI (barras sólidas). Las células de control se trataron como antes, pero en medio isotónico (300 mOsm/kg, círculos abiertos).
Figura 4: La adición de osmoprotectores al medio de transducción mejora la inhibición del ciclo celular inducida por hipertonicidad.
(A) Ensayo de p-lactamasa (barras sólidas) y ensayo de proliferación celular (incorporación de BrdU) (cuadrados blancos). MEFs fueron transducidos con o sin 1 pM p-lactamasa con 25 mM NDSB-201 en diferentes osmolalidades y puntos de tiempo (como se indica). La actividad relativa de la plactamasa de las células tratadas sin proteínas p-lactamasa a 300 mOsm/kg se estableció en 1. Para el ensayo de incorporación de BrdU, los valores relativos de incorporación de Brdu de las células no tratadas y las células tratadas con mitomicina C se establecieron en 100% y 0%, respectivamente. (B) Análisis del efecto de los osmoprotectores sobre la proliferación celular. Los MEF se transdujeron con p-lactamasa 1 pM usando medio de transducción que contenía NDSB-201 25 mM a 700 mOsm/kg ajustado con NaCl (Control, 3a barra desde la izquierda) o se transdujeron en las mismas condiciones con la adición de osmoprotectores indicados. Las células no tratadas (barra N° 1) y las células tratadas con mitomicina C (barra N° 2) se consideraron valores relativos de incorporación de Brdu de 100% y 0%, respectivamente.
(C) La adición combinada de glicerol y glicina mejora la inhibición del ciclo celular inducida por el tampón de transducción en los MEF. Los MEF se transdujeron con o sin p-lactamasa como se indica con la adicción de glicerol 30 mM y glicina 15 mM (+ 2G). La actividad relativa de la p-lactamasa de las células tratadas sin proteínas p-lactamasa a 300 mOsm/kg se estableció en 1. Para el ensayo de incorporación de BrdU, los valores relativos de incorporación de Brdu de las células no tratadas y las células tratadas con mitomicina C se establecieron en 100% y 0%, respectivamente.
(D) Se transdujeron las ESC murinas como se describe en (C).
(E) Transducción repetida de ESC murinos. mESC se transdujeron con 1 pM p-lactamasa con 25 mM NDSB-201 a 500 mOsm/Kg con la adición de 30 mM de glicerol y 15 mM de glicina para 12hs (Ronda 1) seguido de un período de recuperación de 12 horas y un segundo transducción de 12 horas. La transducción de p-lactamasa y la incorporación de BrdU se midieron después de cada ronda de transducción como se indica. La actividad relativa de p-lactamasa de células tratadas sin proteínas p-lactamasa a 300 mOsm/kg se estableció en 1. Para el ensayo de incorporación de BrdU, los valores relativos de incorporación de BrdU de las células no tratadas y las células tratadas con mitomicina C se establecieron en 100% y 0%, respectivamente.
Figura 5: La transducción de proteínas está mediada por m acropinocitosis y potenciada por inductores de m acropinocitosis y potenciadores del escape macropinosomal.
(A) Análisis de la actividad de transducción de diferentes compuestos hipertónicos. Los MEF se transdujeron durante 3 horas con proteína p-lactamasa 1 pM a una osmolalidad de 700 mOsm/kg inducida por diferentes compuestos como se indica (barras sólidas, transducción con NDSB, círculos abiertos, transducción de control en ausencia de NDSB-201) y con la adición de 30 mM de glicerol y 15 mM de glicina. La captación relativa de la proteína p-lactamasa en medios isotónicos (barra izquierda) se estableció en 1.
(B) Análisis del efecto de los inhibidores de diferentes vías endocíticas. Los MEF se transdujeron durante 3 horas con proteína p-lactamasa 1 pM a una osmolalidad ajustada por NaCl de 700 mOsm/kg en tampón de transducción que contiene 25 mM NDSB201, 30 mM de glicerol y 15 mM de glicina en presencia de inhibidores de moléculas pequeñas de endocitosis mediada por clatrina (Pitstop2 y clorpromazina), endocitosis mediada por caveolina (Dynasore y Nystatin), macropinocitosis (5-(N-etil N-isopropil)-amilorida (EIPA), o clorhidrato de 5-(N,N-dimetil) amilorida (DMA)) o polimerización de actina (CytochalasinD y Latrunculin A) como se indica. La captación relativa de la proteína p-lactamasa en medios isotónicos (barra izquierda) se estableció en 1.
(C) Papel de Nhel en la transducción de proteínas. Los MEF se aislaron de embriones de tipo salvaje, heterocigotos Nhel (+/-) y Nhel knock-out (-/-) y se transdujeron durante 3 horas con proteína plactamasa 1 pM a una osmolalidad ajustada por NaCl de 700 mOsm/kg en tampón de transducción que contiene NDSB201 25 mM, glicerol 30 mM y glicina 15 mM. La transducción relativa de células de tipo salvaje se fijó en 100% y la incorporación de p-lactamasa por células de tipo salvaje en medio isotónico (barra izquierda) se fijó en 0%.
(D) Efecto de factores de crecimiento y potenciadores de péptidos del escape de macropinosomeal sobre la transducción de proteínas de MEF. Los MEF se transdujeron durante 3 horas con proteína p-lactamasa 1 pM a una osmolalidad ajustada por NaCl de 700 mOsm/kg en tampón de transducción que contenía NDSB201 25 mM, glicerol 30 mM y glicina 15 mM en presencia del factor de crecimiento indicado (barras 3 -10 desde la izquierda) o diferentes concentraciones del péptido fusogénico dTAT-HA2 (barras 11-13 desde la izquierda). La captación relativa de la proteína plactamasa en medio isotónico (barra izquierda) se fijó en 1. Los círculos abiertos indican la incorporación relativa de BrdU por las células transducidas. La incorporación de BrdU de células no transducidas se estableció en 100% y la incorporación de BrdU de células tratadas con mitomicina C se estableció en 0%.
(E) Efecto de los factores de crecimiento y los potenciadores de péptidos del escape macropinosomeal sobre la transducción de proteínas de las ESC murinas. Los MEF se transdujeron durante 12 horas con proteína p-lactamasa 1 pM a una osmolalidad ajustada por NaCl de 500 mOsm/kg en tampón de transducción que contenía NDSB201 25 mM, glicerol 30 mM y glicina 15 mM en presencia del factor de crecimiento indicado (barras 3-8 desde la izquierda) o diferentes concentraciones del péptido fusogénico dTAT-HA2 (barras 9-11 desde la izquierda). La captación relativa de la proteína p-lactamasa en medio isotónico (barra izquierda) se fijó en 1. Los círculos abiertos indican la incorporación relativa de BrdU por las células transducidas. La incorporación de BrdU de células no transducidas se estableció en 100% y la incorporación de BrdU de células tratadas con mitomicina C se estableció en 0%.
Figura 6: Relación estructura-actividad de compuestos de transducción de proteínas.
(A) Panel superior. Estructuras químicas de compuestos de transducción probados. Panel inferior. Ensayos de incorporación de p-lactamasa y BrdU utilizando los diferentes compuestos de transducción. MEFs fueron transducidas durante 3 horas con 1 pM de proteína p-lactamasa a una osmolalidad NaCl ajustada de 700 mOsm/Kg en la transducción de tampón que contiene 30 mM de glicerol y 15 mM de glicina y 25 mM de los compuestos de transducción indicados. La incorporación de p-lactamasa del compuesto de referencia (NDSB201, N° 01) se fijó en 100%. Los círculos abiertos indican la incorporación relativa de BrdU por las células transducidas. La incorporación de BrdU de células no transducidas se estableció en 100% y la incorporación de BrdU de células tratadas con mitomicina C se estableció en 0%.
(B) Panel superior. Primera fila: ejemplos de compuestos con grupo sulfónico. Segunda fila: ejemplos de compuestos con grupo carboxi. Tercera fila: ejemplos de compuestos con grupo amida. Cuarta fila: ejemplos de compuestos con grupo amida secundario. Quinta fila: ejemplos de compuestos con grupo amida terciario. Variantes adicionales de la fila inferior que contienen una variante de bioisóstero y una variante de dímero Panel inferior. Ensayos de incorporación de plactamasa y BrdU utilizando los diferentes compuestos de transducción. MEFs fueron transducidos durante 3 horas con 1 pM de proteína de p-lactamasa a una osmolalidad de NaCl ajustada de 700 mOsm/Kg en la transducción de tampón que contiene 30 mM de glicerol y 15 mM de glicina y 25 mM de los compuestos de transducción indicados. La incorporación de p-lactamasa del compuesto de referencia (NDSB201, N° 01) se fijó en 100%. Los círculos abiertos indican la incorporación relativa de BrdU por las células transducidas. La incorporación de BrdU de células no transducidas se estableció en 100% y la incorporación de BrdU de células tratadas con mitomicina C se estableció en 0%.
(C) Panel superior. Los compuestos de las columnas de la izquierda contienen grupos amina y sulfonato o carboxi. La columna central muestra los mismos compuestos que en la izquierda sin grupo amina. Las columnas de la derecha muestran los mismos compuestos que en la izquierda sin sulfonato ni grupo carboxi. Panel inferior. Ensayos de incorporación de p-lactamasa y BrdU utilizando los diferentes compuestos de transducción. MEFs fueron transducidos durante 3 horas con 1 pM de proteína de p-lactamasa a una osmolalidad de NaCl ajustada de 700 mOsm/Kg en la transducción de tampón que contiene 30 mM de glicerol y 15 mM de glicina y 25 mM de los compuestos de transducción indicados. La incorporación de p-lactamasa del compuesto de referencia (NDSB201, N° 01) se fijó en 100%. Los círculos abiertos indican la incorporación relativa de BrdU por las células transducidas. La incorporación de BrdU de las células no transducidas se fijó en 100% y la incorporación de BrdU de células tratadas con mitomicina C se fijó en 0%.
(D) Panel superior. Análisis del papel de la longitud de la cadena de carbono. Se indican ejemplos de dos compuestos de transducción (N° 11 y N° 20, área sombreada en gris) y variaciones de longitud de la cadena de carbono de estos. Panel inferior. Ensayos de incorporación de plactamasa y BrdU utilizando los compuestos de transducción indicados en el panel superior. MEFs fueron transducidos durante 3 horas con 1 pM de proteína de p-lactamasa a una osmolalidad de NaCl ajustada de 700 mOsm/Kg en la transducción de tampón que contiene 30 mM de glicerol y 15 mM de glicina y 25 mM de los compuestos de transducción indicados. La incorporación de plactamasa del compuesto de referencia (NDSB201, N° 01) se fijó en 100%. Los círculos abiertos indican la incorporación relativa de BrdU por las células transducidas. La incorporación de BrdU de células no transducidas se estableció en 100% y la incorporación de BrdU de células tratadas con mitomicina C se estableció en 0%.
(E) La actividad de transducción e incorporación de BrdU de 45 compuestos de transducción diferentes tras la transducción de la proteína p-lactamasa en MEF. Los MEF se transdujeron durante 3 horas con proteína 1 p-lactamasa a una osmolalidad ajustada por NaCl de 700 mOsm/kg en tampón de transducción que contenía 30 mM de glicerol y 15 mM de glicina y 25 mM de los compuestos de transducción indicados. La incorporación de p-lactamasa del compuesto de referencia (NDSB201, N° 01) se fijó en 100%. Los círculos abiertos indican la incorporación relativa de BrdU por las células transducidas. La incorporación de BrdU de células no transducidas se estableció en 100% y la incorporación de BrdU de células tratadas con mitomicina C se estableció en 0%.
(F) Efecto de la combinación de diferentes compuestos de transducción sobre la actividad de transducción de proteínas totales. Los MEF se transdujeron durante 3 horas con proteína plactamasa 1 pM a una osmolalidad ajustada por NaCl de 70o mOsm/kg en tampón de transducción que contenía 30 mM de glicerol y 15 mM de glicina y cantidades equimolares de los compuestos de transducción indicados de manera que la concentración final del compuesto de transducción en el tampón fue 25 mM. La incorporación de p-lactamasa del compuesto de referencia (NDSB201, N° 01) se fijó en 100%. Los círculos abiertos indican la incorporación relativa de BrdU por las células transducidas. La incorporación de BrdU de células no transducidas se estableció en 100% y la incorporación de BrdU de células tratadas con mitomicina C se estableció en 0%.
(G) Evaluación de los agonistas del receptor GABA en la transducción de proteínas. Los MEF se transdujeron durante 3 horas con proteína p-lactamasa 1 pM a una osmolalidad ajustada por NaCl de 700 mOsm/kg en tampón de transducción que contiene 30 mM de glicerol y 15 mM de glicina y 25 mM NDSB201 más los agonistas de GABa indicados. La incorporación de p-lactamasa del compuesto de referencia (NDSB201, N° 01) se fijó en 100%. Los círculos abiertos indican la incorporación relativa de BrdU por las células transducidas. La incorporación de BrdU de células no transducidas se estableció en 100% y la incorporación de BrdU de células tratadas con mitomicina C se estableció en 0%.
Tabla 1:
Lista de compuestos de transducción, su actividad de transducción de proteínas y efecto sobre la proliferación celular en tampón de transducción. Primera columna: número de compuesto de transducción; Segunda columna: estructura química del compuesto de transducción. Tercera columna: actividad de transducción de la proteína p-lactamasa relativa; Cuarta columna: incorporación relativa de BrdU 24 horas después de la transducción de p-lactamasa. MEFs fueron transducidos durante 3 horas con 1 pM de proteína de plactamasa a una osmolalidad de NaCl ajustada de 700 mOsm/Kg en la transducción de tampón que contiene 30 mM de glicerol y 15 mM de glicina y 25 mM de los compuestos de transducción indicados. La incorporación de p-lactamasa del compuesto de referencia (NDSB201, N° 01) se fijó en 100%. Los círculos abiertos indican la incorporación relativa de BrdU por las células transducidas. La incorporación de BrdU de células no transducidas se estableció en 100% y la incorporación de BrdU de células tratadas con mitomicina C se estableció en 0%.
Figura 7: Transducción de proteína Cre en células mES.
(A) Representación esquemática del reportero de recombinasa Cre. Se apuntó un reportero CMV-Lox-Stop-Lox-eGFP al locus ColA1 de las ESC 2 murinas. La CRE-recombinasa intracelular escinde el casete Stop induciendo así la expresión de eGFP.
(B) Gráficos de densidad de FACS que muestran en la parte superior células mES transducidas con CRE a diferentes concentraciones y con múltiples rondas de transducciones. Panel inferior, muestra células mES transducidas con 5 uM de proteína CRE con diferentes concentraciones de péptidos fusogénicos. La señal del canal CFP se utilizó como control para la autofluorescencia.
(C) Imágenes de microscopía de muestras de con dos rondas de transducciones CRE como se describe en (B). La línea discontinua indica el borde de cada colonia.
(D) Curvas de proliferación celular de las muestras que se muestran en (C). Gráfico superior e inferior. Después de 2 días, se contaron las células transducidas (círculo blanco) o no transducidas (barras grises) todos los días para hacer curvas de proliferación celular.
(E) Análisis de qRT-PCR de la expresión de genes pluripotentes de células mES no transducidas y transducidas de las muestras que se muestran en (C). Se utilizó GAPDH como control de carga. (F) Para probar la pluripotencia de las mESC transducidas, se inyectaron GFP ESC transducidas doble del experimento en 7B en embriones de blastocistos hospedadores y se trasplantaron a ratones adoptivos pseudopreñados. Como se muestra en la Figura 7F, las mESC de doble transducción contribuyeron eficazmente a la formación de quimeras, tanto en la transducción sin (7F, panel superior) como con el péptido de fusión Tat-HA2 (Figura 7F, panel inferior).
Figura 8: Transducción de la proteína CRE en células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC).
(A) Representación esquemática del reportero de recombinasa CRE. La construcción EF1a-LoxdsRED-Stop-Lox-EGFP/ires-PuroR se introdujo en iPSC humanas mediante infección lentiviral y posterior selección de puromicina. Las células obtenidas contienen múltiples copias de la construcción informadora lentiviral. Las células no transducidas expresan la proteína roja fluorescente. La escisión mediada por CRE del casete dsRED-STOP flanqueado por LoxP anula la expresión de dsRed e induce la expresión de la proteína informadora de EGFP.
(B) Panel superior. Gráficos de densidad FACS de iPSC humanas transducidas con Cre. El eje x muestra la señal GFP y el eje y muestra la señal dsRED. Se transdujeron iPSC humanas con proteína CRE o con proteína CRE más péptidos fusogénicos como se indica. Los paneles de la derecha muestran múltiples rondas de transducción. El control fueron células incubadas con medio de transducción en ausencia de proteína CRE. Panel inferior. Muestra histogramas de paneles de gráficos de densidad superior. Además, se muestra la cuantificación de células positivas para GFP sobre la población celular total.
(C) Imágenes representativas de fluorescencia y contraste de fase de iPSC humanas transducidas como en (B). La fila superior y la fila media indican el canal de fluorescencia ROJO y VERDE, respectivamente. La fila inferior muestra el canal de contraste de fase.
Figura 9: Transducción de la proteína Cre en diferentes tipos de células neurales
(A) Representación esquemática del informador de recombinasa CRE. Se introdujo la construcción EF1a-Lox-dsRED-Stop-Lox-EGFP/ires-PuroR en células progenitoras neurales y iPSC humanas y sus derivados neurales derivados como se indica mediante infección lentiviral y posterior selección de puromicina. Las células obtenidas contienen múltiples copias de la construcción informadora lentiviral. Las células no transducidas expresan la proteína roja fluorescente. La escisión mediada por CRE del casete dsRED-STOP flanqueado por LoxP anula la expresión de dsRed e induce la expresión de la proteína informadora de EGFP.
(B) Imágenes fluorescentes representativas de diferentes tipos de células transducidas con proteína CRE o dejadas sin transducir.
Figura 10: Representación esquemática de la configuración de múltiples pocillos para optim izar el tiempo de transducción y la tonicidad de los medios.
Figura 11: El tampón de transducción mejora la transfección de lípidos de ADN en células mES. Análisis de citometría de flujo de la incorporación de un vector de expresión de ADN plasmídico en células madre embrionarias murinas. La proteína roja fluorescente (RFP) se expresa a partir del vector de expresión después de una incorporación exitosa. Ciertas líneas de células madre embrionarias murinas son resistentes a la transfección de plásmidos estándar con lípidos catiónicos. Panel izquierdo: mESC transfectadas con el plásmido de expresión RFP usando Lipofectamina LTX (tecnologías Life) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células se analizaron para determinar la expresión de RFP mediante citometría de flujo. Panel derecho: la adición de tampón de transducción a la mezcla de transfección de ADN plasmídico/lipofectamina LTX da como resultado una transfección eficaz del ADN indicador en las ESC murinas. El eje Y muestra la fluorescencia del canal rojo y el eje x muestra la fluorescencia del canal verde.
Figura 12: Incorporación dual de ADN y proteína usando tampón de transducción.
Análisis de citometría de flujo de la incorporación de un vector de expresión de ADN plasmídico en células madre embrionarias murinas. La proteína roja fluorescente (RFP) se expresa a partir del vector de expresión después de una incorporación exitosa. Además, la transducción de la proteína recombinasa Cre en las células ES murinas informadoras Lox-Stop-Lox-GFP da como resultado la activación del gen informador GFP. De izquierda a derecha (como se indica arriba de los paneles FACS): Control de células mES Lox-Stop-Lox-GFP en tampón de transducción incubadas durante 12 horas sin proteína recombinasa Cre o ADN plasmídico informador RFP; proteína recombinasa Cre 5uM; ADN plasmídico que contiene un gen indicador de la proteína roja fluorescente (RFP); y proteína CRE 5uM junto con complejos RFP-ADN/lípido. El eje Y muestra la fluorescencia del canal rojo y el eje x muestra la fluorescencia del canal verde.
Figura 13: El tampón de transducción mejora la incorporación viral en células iPS humanas.
Se transdujeron células iPS humanas con partículas lentivirales que expresan la proteína roja fluorescente (RFP). Los paneles FACS demuestran células iPS humanas no tratadas (control) (panel izquierdo); células transducidas durante 12 horas con partículas lentivirales que expresan proteína roja fluorescente (RFP) (panel central); y células transducidas durante 12 horas con partículas lentivirales que expresan RFP en presencia de tampón de transducción 1x (Tampón 12/500, panel derecho). El eje Y muestra la fluorescencia del canal rojo y el eje x muestra la fluorescencia del canal verde.
Figura 14: Interrupción del gen HPRT mediada por proteínas TALEN en células iPS humanas.
Se transdujeron células iPS humanas masculinas con un par de proteínas TALEN que se dirigen al gen HPRT en el cromosoma X. La secuencia de tipo salvaje (WT) se muestra en la parte superior con los medios sitios de TALEN objetivo subrayados. Tras la transducción de TALEN, se aislaron clones de iPSC resistentes a 6TG y se analizaron para detectar deleciones en el sitio diana de TALEN. Las supresiones se indican mediante rayas azules. El tamaño de las deleciones (D) se indica a la izquierda de cada sitio mutado. Las frecuencias de mutación se calculan como el número de mutantes identificados, dividido por el número total de secuencias analizadas.
Figura 15: Co-transducción de polisacárido Dextrano y proteína.
A: Para evaluar si el tampón de transducción permitiría la transducción simultánea de proteínas y moléculas grandes, analizamos la captación mediada por macropinocitosis de TMR-dextrano (rojo) y proteína BSA marcada con fluorescencia (cian) por fibroblastos embrionarios murinos que expresan GFP (MEF).
B: El inhibidor de la macropinocitosis, EIPA (etilisopropilamilorida), inhibe la captación de TMR-dextrano o proteína BSA. Los núcleos se tiñeron con Hoescht 33342 (azul).
Figura 16: Las moléculas de NDSB-201 y GABA inducen la fuga de vesículas de macropinocomas.
(A) Panel izquierdo. Representación esquemática del ensayo indicador GAL3-GFP. Tras el inicio de la transducción, la proteína aplicada extracelularmente se absorbe en macropinosomas (vesículas grises). La rotura intracelular de la membrana del macropinosoma libera el contenido del macropinosoma en el citoplasma. Al mismo tiempo, la membrana del macropinosoma comprometida ahora permite la entrada de la proteína citosólica GAL3-GFP, que se une y se acumula en los carbohidratos intra-macropinosoma dando como resultado una señal fluorescente brillante (vesículas blancas). Panel derecho. Se incubaron células GAL3-GFP con medio de transducción a 700 mOsmol/kg con o sin el inhibidor de macropinocitosis EIPA. Las células no tratadas se incluyeron como control negativo. Tenga en cuenta que en condiciones de transducción (panel central), GAL3-GFP se acumula en los macropinosomas comprometidos.
(B) Medición de la actividad de transducción de proteínas, macropinocitosis y liberación de vesículas de macropinosomas de NDSB-201 y ejemplos de compuestos derivados. Las células se incubaron con tampón de transducción a 700 mOsmol/kg con diferentes compuestos de transducción o se dejaron sin tratar, como se indica. Panel izquierdo. Incorporación relativa de proteína p-lactamasa en células MEF. La forma de señal de las células no tratadas se estableció en 1. Panel de medio. El nivel de macropinocitosis se midió mediante la incorporación de TMRdextrano en las células tratadas como antes. El nivel de macropinocitosis se determinó midiendo el área total de vesículas positivas de dextrano por célula. Panel derecho. Las células Gal3-GFP MEF se trataron como antes. Los niveles de fuga de vesículas se determinaron midiendo el área total de vesículas positivas para Gal3-GFP por célula.
Figura 17: Depresión de genes endógenos inducida por transducción de ARNip en células humanas. Las células KBM7 y MCF7 se transdujeron con 25 uM de GAPDH y ARNip mezclados o se dejaron sin tratar. Después de 3 días de transducción, se determinaron los niveles de proteína GAPDH mediante transferencia Western. El nivel de proteína tubulina se muestra como control de carga.
Figura 18: Edición de genes mediante la transducción simultánea de la proteína Cas9 recombinante y el ARN de guía corta (sgARN).
(A) Prueba de solubilidad de la proteína Cas9 recombinante a diferentes concentraciones de NaCl y NDSB-201 (compuesto N° 01) o GABA (compuesto N° 20). La agregación de proteínas se determinó mediante un ensayo turbidimétrico semicuantitativo. Las soluciones de cristal transparente (sin agregación de proteína cas9) se representan con cuadrados blancos. Las soluciones turbias causadas por agregados Cas9 se representan con cuadrados grises.
(B) La tasa de incorporación de Brdu se determinó en células KBM7 incubadas con tampón de osmocitosis con NDSB-201 o GABA en diferentes puntos de tiempo. Las células no tratadas se consideraron como 100% de incorporación de BrdU.
(C) Panel superior. Representación esquemática del reportero de recombinasa CRE. Se introdujo la construcción EFla-Lox-dsRED-Stop-Lox-EGFP/iresPuroR en células KBM7 mediante infección lentiviral y posterior selección de puromicina. Las células obtenidas contienen múltiples copias de la construcción informadora lentiviral. Las células no transducidas expresan proteína roja fluorescente. La escisión mediada por CRE del casete dsRED-STOP flanqueado por LoxP anula la expresión de dsRed e induce la expresión de la proteína informadora de EGFP. Panel inferior. Células KBM7 transducidas con proteína CRE con medio de osmocitosis a 1250 mOsmol/kg con GABA 250 mM (compuesto N° 20) durante 60 minutos. Los paneles superiores representan imágenes fluorescentes en canal verde y rojo. Los paneles inferiores representan gráficos FACS que muestran en los ejes x fluorescencia verde y en los ejes y fluorescencia roja o frecuencia de eventos. Los porcentajes de eventos se representan en el área correspondiente.
(D) Panel superior. Representación esquemática de los ARN guía pequeños transcritos in vitro que contienen 20 nnts de secuencia guía y 80 nnts de secuencia de andamio. Panel inferior. Gel proteico de proteína CAS9 purificada recombinante.
(E) Representación esquemática del sistema informador CRISPR-CAS9. Las células KBM7 se transdujeron con un vector lentiviral que contenía la secuencia diana CRISPR-CAS seguida de una secuencia fuera del marco del gen dTomato. CRISPR-CAS9 indujo la rotura de la doble hebra del ADN en la secuencia diana seguida de reparación de unión de extremos no homólogos (NHEJ), induce deleciones y/o inserciones de ADN, que restauran el marco de lectura de dTomato e inducen fluorescencia celular.
(F) Se transdujeron células KBM7 informadoras CRISPR-CAS9 con proteína CAS9 y sgARN en el objetivo o se dejaron sin tratar. Los controles de especificidad se realizaron transduciendo células con proteína CAS9 y sgARN fuera del objetivo. El porcentaje de células dTomato-positivas se determinó mediante análisis de citometría de flujo. Los paneles inferiores muestran imágenes fluorescentes y de contraste de fase para las condiciones indicadas.
Figura 19: Interrupción genética endógena inducida por transducción CRISPR-CAS9.
(A) Esquema del gen WDR85 y sitios de unión de 5 sgARN diferentes.
(B) Representación esquemática de la transducción de CAS9-sgARN y la selección de toxina diftérica. Las células KBM7 se transdujeron dos veces con CAS9-sgARN. Después de 7 días de la última ronda de transducción, las células se incubaron con componentes proteicos de la toxina diftérica (PA; antígeno protector y LFn-DTA; dominio n-terminal del factor letal fusionado con la toxina diftérica). El gráfico de barras muestra el número de células viables después de 2 días de selección de toxina diftérica.
(C) Secuencias de ADN de mutaciones inducidas por CRISPR-CAS9 en el gen WDR85 endógeno en células KBM7. La secuencia de tipo salvaje (WT) se muestra en la parte superior. El codón de inicio se indica con ATG subrayado. Las eliminaciones se indican mediante guiones e inserciones con texto subrayado. Los tamaños de las inserciones (+) o deleciones (D) se indican a la derecha de cada sitio mutado. El número de veces que se aisló cada mutante se muestra entre paréntesis. Tenga en cuenta que para varias de las secuencias diana, también identificamos deleciones y/o inserciones más grandes que se extienden más allá de las secuencias del sitio diana CRISPR/CAS9.
(D) Panel superior. Representación esquemática para cuantificar la eliminación del gen bialélico mediante la transducción de CAS9-sgARN. Las células KBM7 se transdujeron dos veces con CAS9-sgARN. Después de 3 días, las células se aislaron mediante deposición de células individuales en placas de 384 pocillos usando un citómetro de flujo. 7 días después, se contaron los clones en crecimiento y se trataron con toxina diftérica. Después de 2 días, se contaron los clones supervivientes de la toxina diftérica. La eficacia de inactivación de WDR85 se calculó como el porcentaje de clones supervivientes de la toxina diftérica con respecto al total de clones de células individuales obtenidos originalmente. Panel inferior. Secuencias de ADN de clones supervivientes de la toxina diftérica. A1 = alelo 1 y A2 = alelo2. Los tamaños de las inserciones (+) o deleciones (D) se indican a la derecha de cada sitio mutado. El número de veces que se aisló cada mutante se muestra entre paréntesis. Tenga en cuenta que para varias de las secuencias diana, también identificamos deleciones y/o inserciones más grandes que se extienden más allá de las secuencias del sitio diana CRISPR/CAS9.
EJEMPLO 1
[0281] La capacidad de introducir moléculas pequeñas o macromoléculas en las células encuentra aplicaciones importantes en la investigación y la medicina. Desafortunadamente, la membrana celular presenta un gran obstáculo para la introducción de muchas moléculas biológicamente activas. Se ha realizado un esfuerzo significativo en la introducción de nucleótidos (ADN, ARN, ARNip) y/o moléculas terapéuticas en las células, y si bien las células primarias aún representan un desafío, se han logrado avances utilizando lípidos catiónicos, nanopartículas o vectores virales como portadores transmembrana. En comparación, el desarrollo de nuevas tecnologías para la entrega intracelular de proteínas ha estado prácticamente estancado. No obstante, la capacidad de introducir proteínas en las células tendría muchas aplicaciones en el desarrollo de vacunas, la edición del genoma, la reprogramación epigenética, la diferenciación de células (madre) y la manipulación de procesos intracelulares. Por lo tanto, es muy necesario el desarrollo de mejores tecnologías para el suministro intracelular eficiente de proteínas y otras macromoléculas, particularmente en células primarias. Aquí describimos que una combinación de hipertonicidad inducida por sal, un compuesto de molécula pequeña y osmoprotectores impulsa la introducción robusta y eficiente de pequeñas moléculas y macromoléculas en las células primarias, sin afectar la viabilidad celular. Proporcionamos ejemplos de cómo se pueden introducir proteínas, nucleótidos, nanoesferas y macromoléculas en una amplia variedad de células primarias, líneas de células madre y sus derivados.
[0282] Mientras que la capacidad de introducir las proteínas en las células tiene muchas aplicaciones en la investigación y la medicina, un método fiable, no tóxico y eficaz de hacerlo es todavía insuficiente. En 1982, Okada y Rechsteiner demostraron que el tratamiento hipertónico inducido por sacarosa 0,5 M y PEG1000 al 10% seguido de un breve tratamiento hipotónico indujo la captación intracelular de macromoléculas y proteínas en líneas celulares inmortalizadas 1. Desafortunadamente, esta técnica demostró estar limitada a las líneas celulares inmortalizadas y produce eficiencias de transducción de proteínas deficientes en las células primarias. Probamos la transducción de la proteína recombinasa Cre en células madre embrionarias murinas (mESC) utilizando el método Okada. Usamos una línea transgénica mESC en donde un indicador inducible por CRE-recombinasa se integró de manera estable en el locus 2 de ColA1. Este informador engloba un promotor de CMV seguido de un Stop-casete flanqueado por LoxP y un gen informador de eGFP (Figura 1A). La expresión de eGFP se induce tras la escisión exitosa mediada por CRE-recombinasa del casete de parada (Figura 1A). Como muestra la citometría de flujo, la transducción de mESC con proteína CRE-recombinasa 5 pM produjo 6% de mESC positivas para GFP, lo que indica que el método combinado de transducción hipertónica/hipotónica descrito por Okada y sus colegas es ineficaz en la transducción de células primarias (madre) (Figura 1B).
[0283] Algunos años más tarde, los descubrimientos independientes de Green 3 y Frankel45 por primera vez demostraron que la proteína TAT del VIH puede transducir sí mismo a través de la membrana celular. La secuencia de péptidos que media esta autotransducción se identificó posteriormente y se demostró que impulsa la transducción celular cuando se fusiona químicamente con proteínas heterólogas6 Finalmente, Nagahara y sus colegas demostraron que la transducción de proteínas mediada por péptidos TAT también funcionaba cuando el péptido TAT se clonaba como una fusión en marco de la proteína "carga" de interés 7
[0284] Una ventaja clara de péptido TAT de transducción de proteínas mediada es que el método parece funcionar con todos los tipos de células, incluidas células primarias, y es generalmente no tóxico. Sin embargo, la fuerte carga positiva del péptido TAT obstaculiza gravemente la producción de proteínas de fusión TAT recombinantes nativas en E. Coli, con gran parte de la proteína recombinante terminando en cuerpos de inclusión. Además, investigaciones posteriores demostraron que algunos informes anteriores sobre proteínas autotransductoras eran de hecho el resultado de un artefacto experimental introducido durante la fijación de las células 8 Además, esta tecnología requiere que el péptido TAT se fusione con la proteína recombinante y, por lo tanto, limita el tipo y número de proteínas que se pueden transducir. El péptido TAT en sí mismo puede alterar la función o localización de la proteína recombinante dando lugar a resultados inesperados o no deseados. Finalmente, y quizás lo más importante, la eficiencia de transducción de las proteínas de fusión TAT es bastante variable y depende de la naturaleza y las propiedades físicas de la carga proteica.
Un reactivo de transducción de proteínas
[0285] Se buscó desarrollar un método más fiable y eficaz para la transducción de proteínas. Dado que las toxinas bacterianas son a menudo proteínas que se transducen con una eficacia muy alta, planteamos la hipótesis de que (partes de) dichos sistemas de toxinas podrían actuar como un sistema de transporte para la liberación de proteínas recombinantes. Para probar esta idea, analizamos si el regulador transcripcional OCT4 (POU5F1) podría transducirse en células cuando se fusiona con el dominio N-terminal del Factor letal del ántrax (LFn). Con este fin, generamos una proteína de fusión recombinante que consta de una etiqueta de purificación de His, un dominio de transducción LF, un sitio de escisión SUMO, OCT4 humano y un dominio de transactivación de VP16 (Figura 2A). Este último se añadió para potenciar aún más la actividad transcripcional del factor recombinante. Además, generamos construcciones de control que carecen del dominio de transducción LFn o el dominio de transducción LFn y el dominio de escisión SUMO (Figura 2A). Las células informadoras COS7 se generaron transfectando células COS7 con una construcción indicadora que contenía 6 repeticiones de la secuencia diana oct4 seguida de un promotor TK mínimo y el gen de luciferasa Firefly (Figura 2B). Como control, transducimos células COS7 con un vector indicador de luciferasa sin los sitios de unión de Oct4 (Figura 2B). Para controlar las variaciones en la eficacia de la transfección, cotransfectamos las células COS7 con un vector Renilla-Luciferasa expresado de forma ubicua (Figura 2B). En la Figura 2C se muestra una línea de tiempo de la transducción. La transducción de células COS7 con proteína recombinante LFn-OCT4-SUMO1-VP16 dio como resultado la activación de la actividad informadora de luciferasa (Figura 2D). Sin embargo, inesperadamente, la transducción de control de la proteína de control que carece del dominio de transducción de LFn demostró una eficiencia de transducción similar, si no ligeramente mejor (Figura 2D). Además, la proteína de control que carece del dominio de transducción LFn y el dominio de escisión SUMO demostró una transducción eficiente en las células COS7, comparable a la infección de control de las células con un vector lentiviral que expresa Oct4 (Figura 2D).
[0286] Como se mencionó anteriormente, las secuencias cortas de péptidos son capaces de mediar la transducción de proteínas recombinantes a través de la membrana celular. Dado que añadimos una etiqueta 6x Histidina (6xHis) a la proteína Oct4 recombinante para facilitar la purificación de la proteína, evaluamos si la transducción de la proteína Oct4 estaba mediada por esta etiqueta peptídica. Con este fin, hicimos varias proteínas recombinantes indicadas en la Figura 2E, que contenían una etiqueta de purificación de His (H6) y un péptido de transducción de R119, o una etiqueta de His solamente, o ninguna etiqueta de péptido (Figura 2E). Probamos la capacidad de estas proteínas recombinantes para activar el informador Oct4. Como se muestra en la Figura 2F, H6-Oct4-VP16-R11, H6-Oct4-VP16 y Oct4-VP16 mostraron una activación de reportero similar, lo que demuestra que la etiqueta de purificación 6xHis no era necesaria para la transducción de proteínas, ni aumentaba o inhibía la transducción de proteínas (Figura 2F, barras azules y rojas). Como control negativo infectamos las células informadoras con un vector de expresión lentiviral de control (Figura 2F, barra blanca). Como control positivo, infectamos las células informadoras con un vector de expresión lentiviral Oct4 (Figura 2F, barra negra).
[0287] Los resultados anteriores sugirieron que las proteínas Oct4 recombinantes se transdujeron en ausencia de secuencias de péptidos de transducción y nos llevaron a probar si uno o más componentes añadidos al sistema de cultivo eran responsables de la transducción de proteínas observada. Al omitir los componentes individuales del tampón que contiene la proteína recombinante (indicada en la leyenda de la Figura 2G), identificamos la hiperosmolaridad de NaCl y la sulfobetaína no detergente 201 (NDSB 201) como factores importantes en el proceso de transducción de proteínas (Figura 2G y 2H) Omisión de cualquiera de los factores derogó la activación del informador Oct4 por la proteína Oct4-VP16 recombinante.
El efecto del tiempo, osmolalidad, concentración de compuestos de transducción, concentración de proteínas.
[0288] Para caracterizar adicionalmente el proceso de transducción de la proteína se analizó el efecto del tiempo, osmolalidad, concentración de compuesto de transducción y la concentración de proteínas en el proceso de transducción. Con este fin, establecimos un ensayo de transducción de proteína p-lactamasa y medimos la actividad p-lactamasa intracelular utilizando CCF2-AM, un sustrato de p-lactamasa fluorescente intracelular que cambia la longitud de onda de emisión cuando se escinde por la enzima (Figura 3A). Por tanto, el cambio en la fluorescencia de emisión es una medida cuantitativa de la actividad de la p-lactamasa intracelular. Si bien usamos la línea celular COS7 inmortalizada en nuestros estudios iniciales, queríamos saber si la transducción de proteínas mediada por compuestos también permitiría la transducción de proteína en células primarias. Por lo tanto, transducimos fibroblastos embrionarios murinos (MEF) con p-lactamasa (concentración final 1 j M), utilizando medio hipertónico ajustado a NaCl (700 mOsm/kg) y NDSB201 25 mM. La actividad de p-lactamasa se fijó en 1 al comienzo del experimento y se midió la actividad de p-lactamasa intracelular relativa en función del tiempo (Figura 3B, barras). Como control, se midió la transducción de p-lactamasa en medio isotónico en presencia de NSDB201 25 mM (Figura 3B, círculos abiertos). Como se muestra en la Figura 3B, en estas condiciones se pudo observar actividad de p-lactamasa intracelular 2,5 horas después del inicio de la transducción de proteínas. Los tiempos de transducción más largos dieron como resultado un aumento en la actividad de la p-lactamasa intracelular (Figura 3B).
[0289] Para asegurar que la actividad p-lactamasa observada fue el resultado de la proteína transducida, se realizó una prueba de dosis-respuesta y se midió actividad de p-lactamasa como una función de concentración de plactamasa ya sea en medios de transducción (NDSB201 y 700mOsm 25 mM/Kg) o medio isotónico con adición de NDSB201 25 mM. Los MEF se transdujeron con proteína p-lactamasa durante 3 horas y se midió la actividad plactamasa intracelular como se describe. Como se muestra en la Figura 3C, en medios de transducción, la proteína plactamasa se transdujo de manera eficiente de una manera dependiente de la concentración. Por el contrario, no se observó actividad de p-lactamasa intracelular cuando se añadió proteína p-lactamasa en medio isotónico.
[0290] Estos resultados demuestran la precisión del ensayo de p-lactamasa y demuestran que la proteína de plactamasa se transduce en células de una manera dependiente de la concentración de proteínas.
[0291] A continuación, medimos el efecto de la tonicidad de los medios sobre el proceso de transducción. Como anteriormente, los MEF se transdujeron durante 3 horas con p-lactamasa 1 j M en medio MEF que contenía NDSB201 25 mM y tonicidad del medio creciente, ajustado con NaCl (Figura 3D). Como control, medimos la escisión del sustrato en función de la osmolalidad del medio en ausencia de proteína p-lactamasa transducida (Figura 3D, círculos abiertos) para verificar que la tonicidad del medio no afectó por sí misma al ensayo de actividad p-lactamasa. Como se muestra, el aumento de la concentración de NaCl dio como resultado un aumento de la transducción de p-lactamasa con una transducción máxima de aproximadamente 700-800 mOsm/kg. A osmolalidades superiores a 850 mOsm/kg observamos pérdida de células, presumiblemente debido a la toxicidad de la alta tonicidad del medio.
[0292] Finalmente hemos explorado el efecto de la concentración del compuesto de transducción, NDSB201, en la plactamasa de transducción. De nuevo, los MEF se transdujeron con p-lactamasa (concentración final 1 j M) durante 3 horas en medio MEF hipertónico ajustado a 700 mOsm/kg con NaCl y a concentraciones variables de NDSB201 (Figura 3E). Como control, la transducción de p-lactamasa se midió en función de la concentración variable de NDSB201 en medios isotónicos (Figura 3E, círculos abiertos) El aumento de la concentración de NSDB201 dio como resultado un aumento transitorio en la transducción de p-lactamasa con un pico de 10-25 mM de NSDB201 (Figura 3E). En condiciones hiperosmóticas, concentraciones más altas de NSDB201 dieron como resultado la pérdida de células.
[0293] Los resultados anteriores demuestran que la transducción de proteínas depende de la concentración de proteínas, el tiempo de transducción, la concentración de NDSB201 y la tonicidad del medio ajustada por NaCl.
La adición de osmoprotectores mejora el estrés hipertónico
[0294] Observamos que, si bien la combinación de hiperosmolaridad inducida por NaCl y NDSB201 permitió una transducción eficiente de proteínas, también pareció afectar la proliferación celular y la supervivencia celular, y una alta tonicidad de los medios y/o una alta concentración de NSDB201 pareció tener un efecto perjudicial sobre las células. Se ha demostrado que el estrés hiperosmótico induce la detención del ciclo celular y la apoptosis en células de mamíferos 10-13. Para explorar si las condiciones hiperosmóticas durante la transducción afectaron la proliferación celular, medimos la incorporación de BrdU en los MEF tras la transducción de proteínas durante 3 horas a 700 mOsm/kg o durante 12 horas a 500 mOsm/kg (Figura 4A). La incorporación de BrdU se midió 24 horas después del inicio de la transducción de proteínas. La incorporación de BrdU de los MEF mantenidos en condiciones isotónicas se estableció en 100% y cayó por debajo del 40% tras la adición del tampón de transducción de proteínas solo, o tampón de transducción de proteínas p-lactamasa (Figura 4A).
[0295] Estos resultados demuestran, como se sospecha, que las condiciones de transducción afectaron negativamente la proliferación celular, independiente de la proteína transducida.
[0296] Los osmoprotectores son compuestos que ayudan a las células a afrontar el estrés osmótico acumulándose en el citosol, equilibrando así la diferencia osmótica entre el entorno intra y extracelular. Probamos si la adición de osmoprotectores (indicados en la Figura 4B) al medio evitaría la detención del ciclo celular durante la transducción de proteínas. Como antes, medimos la incorporación de BrdU 24 horas después del inicio de la transducción. La proteína p-lactamasa se transdujo durante 3 horas en medio MEF ajustado con NaCl a 700 mOsm/kg y con NDSB201 25 mM con adición de osmoprotectores, solos o en combinación como se indica en la Figura 4B. Como se muestra, la adición de osmoprotectores durante la transducción de proteínas mejoró la detención del ciclo celular inducida por los medios de transducción. La combinación de glicerol y glicina pareció más eficaz para mejorar el bloqueo de la proliferación celular en MEF y fue eficaz tanto durante una transducción de 3 horas a 700 mOsm/kg como durante una transducción de 12 horas a 500 mOsm/kg (Figura 4C). A continuación, probamos si los osmoprotectores también podrían prevenir el bloqueo del ciclo celular durante la transducción de otros tipos de células. A este efecto, transducimos ESC murinas durante 3 horas a 700 mOsm/kg o durante 12 horas a 500 mOsm/kg. Si bien la combinación osmoprotectora de glicerol y glicina fue ineficaz para prevenir la reducción de la proliferación celular en mESC a 700 mOsm/kg, permitió la proliferación celular continua durante la transducción de 12 horas a 500 mOsm/kg (Figura 4D). Finalmente, probamos si la adición de osmoprotectores permitiría múltiples rondas secuenciales de transducción de la proteína mientras se previene la detención del ciclo celular. 500 mOsm/Kg con un período de recuperación intermedio de 12 horas. Como se muestra en la Figura 4E, en presencia de osmoprotectores, las mESC toleraron bien múltiples rondas de transducción, sin un impacto negativo significativo sobre la proliferación celular.
La transducción de proteínas requiere la captación celular activa a través de macropinocitosis.
[0297] Para diseccionar adicionalmente el mecanismo por el cual la hipertonicidad de los medios induce la transducción de proteínas, exploramos si el efecto era específico del NaCl utilizado para aumentar la osmolaridad de los medios. Los MEF se transdujeron con p-lactamasa durante 3 horas en presencia de NDSB201 (25 mM) y los osmoprotectores y la tonicidad del medio se ajustó a 700 mOsm/kg utilizando NaCl o sales relacionadas de acuerdo con la tabla periódica de elementos, incluidos LiCl, KCl, CsCl y RbCl. Como se muestra en la Figura 5A, todas las sales relacionadas con Na tenían actividad transductora de proteínas, demostrando Na y Rb la actividad más alta. Además, probamos si otras sales de sodio podrían inducir la absorción de proteínas. Como se muestra en la figura 5A, el gluconato de sodio mediaba eficazmente la transducción de p-lactamasa con una eficacia similar a la de NaCl y RbCl. Finalmente, probamos si el aumento de la tonicidad de los medios utilizando compuestos no relacionados también desencadenaría la transducción de proteínas. Como se muestra en la Figura 5A, la sacarosa, lactulosa, sorbitol y manitol no lograron inducir la transducción de proteínas a 700 mOsm/kg, lo que sugiere que la transducción de proteínas depende específicamente de la hipertonicidad inducida por sodio o sales relacionadas con el sodio.
[0298] Dado que las condiciones que desencadenan transducción de proteína requieren que se induce hipertonicidad específicamente por Na+ y los iones relacionados, parecía poco probable que la transducción ocurrió simplemente a través de una mayor permeabilización de la membrana plasmática. Presumimos que la transducción de proteínas implicaba un modo activo de transporte endocítico y usamos inhibidores específicos de diferentes tipos de endocitosis para explorar el mecanismo de entrada que fue aprovechado por nuestro tampón de transducción de proteínas. Como se anticipó, el tratamiento de células con citocalasina D o latrunculina A, inhibidores específicos de la polimerización de actina y transporte de vesículas, bloqueó completamente la transducción de proteínas (Figura 5B), lo que confirma que la transducción de proteínas requiere remodelación de actina. Sin embargo, los inhibidores específicos de la endocitosis, incluidos Pitstop2 y clorpromazina (inhibidores de la endocitosis mediada por clatrina), y Dynasore y Nystatin (inhibidores de la endocitosis mediada por caveolina) fueron todos ineficaces para inhibir la transducción de proteínas (Figura 5B). Estos datos sugieren que la transducción de proteínas no ocurre a través de vías endocíticas clásicas mediadas por clatrina o mediadas por caveolina. A diferencia de otros tipos de endocitosis, la macropinocitosis es excepcionalmente susceptible a los inhibidores del intercambio de Na+/H+. Curiosamente, la transducción de proteínas fue fuertemente inhibida por inhibidores específicos del intercambio de Na+/H+ como EIPA o DMA, inhibidores específicos de una familia de proteínas antiportadoras de sodio-hidrógeno (Nhe) (Figura 5B). Estos datos sugieren que el proceso de transducción de proteínas implica la captación celular activa de aplicación exógena a través de macropinocitosis.
[0299] El sodio-hidrógeno antiportador-1 (Nhel) es un factor de intercambio de Na+/H+ expresado ubicuamente que funciona para regular el volumen de células y el pH intracelular en células de vertebrados. Se activa en respuesta al estrés osmótico, lo que lleva a la extrusión de iones H+ intracelulares a cambio de Na+ extracelular. Aunque este intercambio en sí mismo es osmóticamente neutro, el H+ extruido se reemplaza de los tampones intracelulares, lo que da como resultado un aumento neto de la osmolaridad intracelular y un aumento del volumen celular por ósmosis. Además, la activación de Nhel induce la captación activa de líquido mediada por macropinocitosis desde el espacio extracelular. Si bien el vínculo molecular exacto entre la activación de Nhel y la macropinocitosis aún no está claro, la evidencia experimental sugiere que la modulación local del pH intracelular por Nhel en las proximidades de la membrana plasmática es necesaria para la polimerización de actina y la formación de macropinosomas [14]. El papel de Nhel en el manejo del estrés osmótico y la regulación de la macropinocitosis, su papel específico en el transporte de Na+ e iones relacionados, y el hecho de que la transducción de proteínas es inhibida por inhibidores del intercambio de Na+/H+, hizo de este transportador un candidato interesante como un mediador de la transducción de proteínas inducida por NaCl. Para confirmar aún más que el efecto de EIPA y DMA se debió a la inhibición de Nhel, comparamos la transducción de MEF de embriones knockout de Nhel con MEF heterocigotos y de tipo salvaje de Nhel. Como se muestra en la Figura 5C, la transducción de proteínas se derogó casi por completo en fibroblastos nulos de Nhel. Los fibroblastos de embriones heterocigotos Nhe1+/- mostraron una actividad de transducción de proteínas reducida en comparación con los compañeros de camada de tipo salvaje (Figura 5C). Estos resultados demuestran que Nhel es un mediador importante de la transducción de proteínas, pero permanece una actividad de transducción de proteínas residual en ausencia de expresión de Nhel. Nhel es un miembro de la familia de portadores de soluto de antiportadores, y es probable que un antiportador residual sea responsable de la actividad de transducción de proteína residual. Esto está respaldado por nuestro hallazgo de que EIPA, un inhibidor específico de los antiportadores NHE inhibe completamente la transducción de proteínas.
Los activadores de Nhel mejoran la transducción de proteínas
[0300] Nuestro hallazgo de que Nhe1 es un mediador importante de la transducción de proteínas nos llevó a explorar si los activadores de Nhe1 pueden mejorar el proceso de transducción de proteínas. Se ha demostrado que varios factores de crecimiento inducen macropinocitosis activando Nhe1 y mejorando el intercambio Na+/H+ 15-19. Exploramos el efecto del factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), insulina, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) y combinaciones de estos factores en la transducción de proteínas. Como se muestra en la Figura 5D, la insulina y el IGF tenían un efecto estimulante pequeño pero significativo sobre la transducción de proteínas de los MEF. Además, EGF, FGF y PDGF dieron como resultado una duplicación de la captación de p-lactamasa. Finalmente, las combinaciones de estos factores demostraron un efecto aditivo sobre el transducción de p-lactamasa (Figura 5D). La inhibición de la actividad de Nhe con EIPA bloqueó completamente la transducción de proteínas, incluso en presencia de FGF y PDGF, lo que demuestra que la transducción de proteínas mejorada inducida por estos factores de crecimiento no fue mediada por mecanismos endocíticos alternativos. Se ha demostrado que un péptido dTAT-HA2 corto mejora el escape de proteínas de los macropinosomas [20]. Probamos si la adición del péptido dTAT-HA2 podría mejorar aún más la transducción de proteínas de la proteína p-lactamasa en MEF. Con este fin, titulamos diferentes concentraciones de péptido dTAT-HA2 en el tampón de transducción. Como se muestra en la Figura 5D, la adición del péptido dTAT-HA2 tuvo un pequeño efecto potenciador sobre la transducción de proteínas. Finalmente, probamos si la estimulación del factor de crecimiento o la adición del péptido dTAT-HA2 también podría mejorar la transducción de proteínas de otras células. Transducimos ESC murinas con proteína p-lactamasa 1 pM a 500 mOsm/kg durante 12 horas en presencia de factores de crecimiento indicados o péptido de fusión dTAT-HA2. Como se muestra en la Figura 5E, la adición de factores de crecimiento tuvo un efecto menor sobre la transducción de la proteína mESC, pero la adición del péptido de fusión dTAT-HA2 dio como resultado un profundo aumento en la incorporación de p-lactamasa en las mESC.
Propiedades químicas del compuesto de transducción de proteínas
[0301] Nuestro hallazgo de que la hipertonicidad inducida por sal en combinación con NDSB201 desencadenaba una transducción de proteínas eficaz nos llevó a explorar si otras sulfobetaínas no detergentes también podrían desencadenar la transducción de proteínas. Probamos la actividad de transducción de proteínas de seis NDSB disponibles comercialmente (estructuras químicas indicadas en la Figura 6A). La Figura 6A muestra la transducción de p-lactamasa por NDSB201 (N° 01) así como 5 compuestos NDSB adicionales (N° 02-06) todos a una concentración final de 25 mM en MEFs (3 horas a 700 mOSm/kg). Los círculos abiertos indican la incorporación de BrdU medida 24 horas después del inicio de la transducción de proteínas. Estos resultados demostraron que, si bien todos los compuestos NDSB facilitaron la transducción de proteínas, varían en su eficiencia de transducción y en su efecto sobre la proliferación celular. NDSB201 (N° 01) y NDSB221 (N° 03) parecieron los más eficientes en la transducción de p-lactamasa y, por lo tanto, exploramos variaciones adicionales en estos dos compuestos.
[0302] Los NDSB consisten en un grupo bastante heterogéneo de compuestos que consisten en un esqueleto de 2-6 carbonos que separa un terminal de ácido sulfónico en un lado y un átomo de nitrógeno tetravalente en el otro. Primero exploramos si el grupo de ácido sulfónico podría ser reemplazado con otros grupos terminales sustituyendo ácido sulfónico en N° 01 y N° 03 por ácido carboxílico (produciendo compuestos N° 10 y N° 11, Figura 6B) o una amida (produciendo compuestos N° 43 y N° 03). N° 15, Figura 6B). Como se muestra en el gráfico de barras de la Figura 6B, la sustitución de ácido sulfónico no tuvo un impacto negativo sobre la eficiencia de la transducción. Sin embargo, las sustituciones redujeron aún más el efecto negativo del tampón de transducción en el ciclo celular como se muestra por una captación mejorada de BrdU (Figura 6B, círculos abiertos). Además, la estructura de los anillos de piridina o piperidina en el compuesto de transducción (compuestos N° 01 y N° 03 respectivamente) también podría sustituirse por una amina trivalente o tetravalente (compuestos N° 20 y N° 29, Figura 6B) sin un cambio significativo en la actividad de transducción. A continuación, examinamos si la capacidad de la amida para donar protones (compuestos N° 29 y N° 15) era necesaria para la actividad de transducción, sustituyendo uno o dos protones con CH3 (produciendo los compuestos N° 30, N° 31 y N° 34). Como se muestra, esta sustitución de metilo mejoró la actividad de transducción de los compuestos (Figura 6B). Finalmente, examinamos si los bioisósteros del ácido sulfónico (Compuesto N° 45) o la dimerización del compuesto de transducción (Compuesto N° 42) afectaban la actividad de transducción. Como se muestra en la Figura 6b , los compuestos N° 45 y N° 42 demostraron una alta eficiencia de transducción en comparación con el NDSB201 original (N° 01) con igual o mejor proliferación celular (Figura 6B).
[0303] Por lo tanto, las variaciones en el compuesto original de la transducción de NDSB201 (N° 01) demuestran que hay sustancial libertad química con respecto a las sustituciones del anillo de piridina y el ácido sulfónico, que puede estar sustituido por las estructuras descritas anteriormente. Ni la tetravalencia del nitrógeno y/o su incorporación en una estructura de anillo, ni las propiedades donadoras de protones del ácido sulfónico parecían importantes para la actividad de transducción. Sin embargo, todas las sustituciones activas ensayadas tenían extremos hidrófilos separados por una cadena de carbono hidrófoba. Por tanto, a continuación examinamos si la sustitución de estos grupos terminales hidrófilos por un grupo CH3 hidrófobo afectaría a la actividad de transducción. Comparamos la actividad de NDSB195 (N° 06) y dos derivados en los que el nitrógeno (N° 07) o el ácido sulfónico (N° 08) fueron reemplazados por C o CH3 respectivamente (Figura 6C). Además, exploramos el efecto de estas sustituciones en un compuesto de transducción con un extremo trivalente de nitrógeno y ácido carboxílico (Figura 6C, N° 20 y derivados N° 23 y N° 24). Como se muestra en el gráfico de la Figura 6C, la sustitución de carbono de cualquier grupo disminuyó en gran medida la actividad de transducción del compuesto. Además, los compuestos sustituidos (n° 07, N° 08, N° 23 y N° 24) mostraron una inhibición severa del ciclo celular (Figura 6C, círculos abiertos). Por tanto, aunque el compuesto de transducción permite una libertad sustancial en sus extremos, parece que se prefiere un grupo hidrófilo en cualquier extremo de la cadena carbonada.
[0304] Los extremos hidrófilos están separados por una cadena de 3 carbonos. A continuación, probamos si la longitud de la cadena de carbono era crítica para la actividad de transducción. Probamos compuestos con 1 (N° 18), 2 (N° 13 y N° 19), 3 (compuestos de referencia N° 11 y N° 20), 4 (N° 12 y N° 21) y 5 (N° 22) carbonos en la cadena. Como se muestra en la Figura 6D, la actividad de transducción fue mayor en los compuestos de referencia (cadena de 3 carbonos). El compuesto con la cadena de 5 carbonos (Figura 6D, N° 22) demostró una actividad de transducción similar pero mostró una progresión del ciclo celular reducida. A partir de nuestros resultados, parece que mientras que los compuestos con una longitud de cadena de carbono de 2-5 muestran actividad de transducción, se prefiere una cadena de 3 carbonos.
[0305] Como se demostró anteriormente, una gama inesperadamente amplia de compuestos muestran la actividad de transducción. Para diseccionar adicionalmente las propiedades químicas de los compuestos eficaces de transducción de proteína, hemos explorado la actividad de transducción de proteína de una amplia variedad de compuestos de sulfobetaína relacionada no detergente. En la Figura 6E se muestra una lista completa de compuestos probados así como un gráfico que muestra la actividad de transducción de proteínas así como su efecto sobre la proliferación celular con la leyenda adjunta en la Tabla 1. El compuesto de referencia NDSB201 (N° 01) se indica en azul. Como se muestra, los compuestos de transducción muestran una amplia gama de actividad de transducción y proliferación celular. Esto nos llevó a probar si las combinaciones de compuestos de transducción tendrían un efecto aditivo o incluso sinérgico sobre la actividad de transducción y/o la proliferación celular. La Figura 6F muestra los resultados de varias combinaciones de compuestos de transducción. La eficiencia de transducción del compuesto de referencia NDSB201 (N° 01) se estableció en 100% (Figura 6F, barra azul). La glicina (n° 18), que tiene una sola cadena de carbono, muestra una mala actividad de transducción (9% del compuesto de referencia, Figura 6F). Cuando se combina con el compuesto de transducción de referencia a una concentración equimolar (12,5 mM cada uno), la actividad de transducción fue aproximadamente del 15%, lo que sugiere que los compuestos combinados no tienen un efecto aditivo, sino que el compuesto con la actividad de transducción más baja domina la actividad total. Esto se ejemplifica aún más cuando nuestro compuesto de referencia se combinó con el compuesto N° 34, que por sí solo mostró una eficiencia de transducción del 180%. Sin embargo, combinado con el compuesto de referencia, la actividad de transducción cayó al 120%. Cuando se combinan compuestos con actividad de transducción comparable (compuesto de referencia N° 01 y compuesto N° 20), la actividad de transducción permanece prácticamente sin cambios (Figura 6F).
[0306] Uno de los derivados NDSB201 que hemos probado fue el ácido gamma-aminobutírico (GABA, el compuesto N° 20) un importante neurotransmisor en el cerebro. GABA actúa estimulando la activación de los receptores GABA, de los cuales se han identificado tres clases; GABA-A, GABA-B y GABA-C. Curiosamente, los receptores GABA son estimulados por una gama notablemente amplia de estructuras químicas que van desde estructuras simples como el etanol y el propio GABA, hasta benzodiazepinas aparentemente no relacionadas, muscimol, baclofeno y una larga lista de otros compuestos. Dado que la estructura química de los compuestos de transducción de proteínas eficaces también muestra un gran grado de libertad, exploramos si la señalización de GABA juega un papel activo en el efecto de transducción de proteínas. Probamos el efecto de agonistas de GABA específicos en la transducción de plactamasa. Los MEF se transdujeron con p-lactamasa 1 pM durante 3 horas a 700 mOsm/kg y con NDSB201 25 mM en presencia o ausencia de agonistas de GABA Muscimol y SKF-97541. Como se muestra en la Figura 6G, la adición de agonistas de GABA mejoró la transducción de proteínas aproximadamente en un 300% (Figura 6G).
Transducción de proteínas de células madre embrionarias murinas
[0307] Para explorar la transducción de proteínas de células madre embrionarias murinas con más detalle, usamos una línea mESC transgénica en donde un indicador inducible por CRE-recombinasa se integró de forma estable en el locus de ColA12. Este informador engloba un promotor de CMV seguido de un casete Stop flanqueado por LoxP y un gen informador de eGFP (Figura 7A). La expresión de eGFP se induce tras la escisión exitosa mediada por CRE-recombinasa del casete Stop. De hecho, la transducción de una concentración creciente de proteína CRE recombinante en ESC murinas da como resultado un aumento dependiente de la dosis en GFP e Sc (Figura 7B, paneles superiores, transducción de 12 horas a 500 mOsm/kg con glicerol y glicina). Dos rondas secuenciales de transducción (12 horas cada una como antes, con un período de recuperación de 12 horas en el medio) con 5 pM CRE dieron como resultado un 79% de GFP ESC (Figura 7B, paneles superiores). Además, la adición de péptido de fusión Tat-HA2 5 pM, conocido por mejorar la lisis endosomal de vesículas macropinocitóticas 20, aumentó aún más el porcentaje de células GFP al 81% después de una sola transducción y al 97% de células transducidas después de dos rondas de transducción de proteínas (Figura 7B, paneles inferiores). En la Figura 7C se muestra una imagen de microscopía de fluorescencia de las células en B. A continuación, probamos si la transducción de proteínas afectaba la proliferación de ESC. Después de dos rondas de transducción de proteína CRE, las células doblemente transducidas en 7B se tripsinizaron, se sembraron en alimentadores de MEF y se controló la proliferación celular mediante recuento celular. Se utilizaron células no transducidas como control. Como se muestra en la Figura 7D, dos rondas de transducción de la proteína CRE no afectaron a la proliferación de ESC, ni en ausencia (Figura 7D, panel superior) o presencia (Figura 7D, panel inferior) del péptido de fusión Tat-HA2. A continuación, exploramos la expresión de factores clave de pluripotencia en las mESC de doble transducción mediante qRTPCR. La Figura 7E demostró que la expresión de Oct4, Nanog, Sox2, Rex1 y FBox15 no se modificó en las mESC de doble transducción en comparación con las ESC de control no transducidas, ya sea en ausencia (Figura 7E, panel superior) o presencia (Figura 7E, panel inferior) de péptido de fusión Tat-HA2. Las ESC murinas son pluripotentes, lo que significa que tienen la capacidad de diferenciarse en tres capas germinales derivadas. Una prueba estricta de la pluripotencia del mESC es su capacidad para formar quimeras. Para probar la pluripotencia de las mESC transducidas, se inyectaron GFP ESC de doble transducción del experimento en 7B en embriones de blastocisto huésped y se trasplantaron a ratones adoptivos pseudopreñados. Como se muestra en la Figura 7F, las mESC de doble transducción contribuyeron eficazmente a la formación de quimeras, tanto en la transducción sin (7F, panel superior) como con el péptido de fusión Tat-HA2 (Figura 7F, panel inferior).
Transducción de proteínas de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC).
[0308] Para explorar si nuestro tampón de transducción permitiría la transducción de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSCs), así, se empleó una estrategia similar como se usa para los CES murinos (Figura 7) con una ligera adaptación. Transducimos ípSc humana con un informador lentiviral que, tras la transducción de proteínas de CRE-recombinasa, da como resultado la eliminación de un gen informador fluorescente dsRed expresado y la posterior activación de un gen informador eGFP (Figura 8A). Por lo tanto, la señal de fluorescencia de las hiPSC transducidas con éxito cambiaría de rojo a verde. Al igual que con las ESC murinas, la transducción de iPSC humanas con proteína CRE 5 pM dio como resultado la eliminación eficiente del indicador dsRed y el cambio a la expresión de eGFP en el 64% de las células analizadas por citometría de flujo (Figura 8B, dos paneles de la izquierda, 12 horas transducción a 500 mOsm/Kg). Tenga en cuenta que algunas células siguen siendo doblemente positivas para GFP y dsRed. Esto se debe al hecho de que hay múltiples copias de la construcción informadora lentiviral en las iPSC, y no todas las copias están sueltas. La adición del péptido de fusión Tat-HA2 aumentó aún más la eficiencia de transducción hasta un 77% (Figura 8B, panel central). La transducción de la proteína CRE doble produjo un 78% de células eGFP sin el péptido de fusión tat-HA2 añadido y un 84% de GFP hiPSC cuando se añadió el péptido de fusión Tat-HA2 5 pM. La Figura 8C muestra las imágenes de microscopía de fluorescencia de las células en (8B).
Transducción de proteínas de células madre neurales, neuronas y glía murinas y humanas.
[0309] Se utilizó una estrategia similar de cambio de indicador rojo a verde mediado por CRE-recombinasa como se describió anteriormente, para evaluar la transducción de neuronas murinas y humanas, glía y células madre neurales. La Figura 9A muestra una representación esquemática del ensayo. La transducción de la proteína CRE de neuroesferas murinas dio como resultado una activación eficiente del informador eGFP (Figura 9B, paneles de la izquierda). De manera similar, las células gliales y neuronas derivadas de iPSC humanas se transdujeron con 5 pM c Re , lo que resultó en una activación eficiente del informador eGFP. Dado que la construcción informadora fluorescente se introdujo en las neuronas y células gliales derivadas de iPSC usando infección lentiviral, las células probablemente incorporaron múltiples copias de este informador. Por tanto, mientras que la transducción de la proteína CRE dio como resultado una activación eficaz del informador eGFP, las células continuaron expresando dsRed a partir de copias adicionales del informador.
Referencias:
[0310]
1. Okada, C. Y. & Rechsteiner, M. Introduction of macromolecules into cultured mammalian cells by osmotic lysis of pinocytic vesicles. Cell 29, 33-41 (1982).
2. Beard, C., Hochedlinger, K., Plath, K., Wutz, A. & Jaenisch, R. Efficient method to generate single-copy transgenic mice by site-specific integration in embryonic stem cells. Genesis New York NY 2000 44, 23-28 (2006).3
3. Green, M. & Loewenstein, P. M. Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein. Cell 55, 1179-1188 (1988).
4. Frankel, A. D. & Pabo, C. O. Cellular uptake of thetat protein from human immunodeficiency virus. Cell 55, 1189-1193 (1988).
5. Mann, D. A. & Frankel, A. D. Endocytosis and targeting of exogenous HIV-1 Tat protein. the The European Molecular Biology Organization Journal 10, 1733-1739 (1991).
6. Fawell, S. et al. Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91,664-8 (1994).
7. Nagahara, H. et al. Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nature medicine 4,1449-52 (1998).
8. Lundberg, M. & Johansson, M. Is VP22 nuclear homing an artifact? Nature biotechnology 19, 713-4 (2001).
9. Hsieh, J.-T., Zhou, J., Gore, C. & Zimmern, P. R11, a novel cell-permeable peptide, as an intravesical delivery vehicle. BJU international 108, 1666-71 (2011).
10. Kültz, D., Madhany, S. & Burg, M. B. Hyperosmolality causes growth arrest of murine kidney cells. Induction of GADD45 and GADD153 by osmosensing via stress-activated protein kinase 2. The Journal of biological chemistry 273, 13645-51 (1998).
11. Luo, L., Li, D.-Q. & Pflugfelder, S. C. Hyperosmolarity-induced apoptosis in human corneal epithelial cells is mediated by cytochrome c and MAPK pathways. Cornea 26, 452-60 (2007).
12. Reinehr, R., Graf, D., Fischer, R., Schliess, F. & Haussinger, D. Hyperosmolarity triggers CD95 membrane trafficking and sensitizes rat hepatocytes toward CD95L-induced apoptosis. Hepatology (Baltimore, Md.) 36, 602-14 (2002).
13. Dawson, K. M. & Baltz, J. M. Organic osmolytes and embryos: substrates of the Gly and beta transport systems protect mouse zygotes against the effects of raised osmolarity. Biology of reproduction 56, 1550-8 (1997).
14. Koivusalo, M. et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. The Journal of cell biology 188, 547-63 (2010).
15. Jenkins, E. C. et al. Intracellular pH regulation by Na+/H+ exchanger-1 (NHE1) is required for growth factorinduced mammary branching morphogenesis. Developmental biology 365, 71-81 (2012).
16. Chiang, Y., Chou, C.-Y., Hsu, K.-F., Huang, Y.-F. & Shen, M.-R. EGF upregulates Na+/H+ exchanger NHE1 by post-translational regulation that is important for cervical cancer cell invasiveness. Journal of cellular physiology 214, 810-9 (2008).
17. Rigor, R. R, Damoc, C., Phinney, B. S. & Cala, P. M. Phosphorylation and activation of the plasma membrane Na+/H+ exchanger (NHE1) during osmotic cell shrinkage. PloS one 6, e29210 (2011).
18. Tattersall, A. L. & Wilkins, R. J. Modulation of Na+-H+ exchange isoforms NHE1 and NHE3 by insulin-like growth factor-1 in isolated bovine articular chondrocytes. Journal of orthopaedic research: official publication of the Orthopaedic Research Society 26, 1428-33 (2008).
19. Tattersall, A. L., Browning, J. A. & Wilkins, R. J. Modulation of H+ transport mechanisms by interleukin-1 in isolated bovine articular chondrocytes. Cellular physiology and biochemistry: international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology 16, 43-50 (2005).
20. Wadia, J. S., Stan, R. V & Dowdy, S. F. Transducible TAT-HA fusogenic peptide enhances escape of TATfusion proteins after lipid raft macropinocytosis. Nature Medicine 10, 310-315 (2004).
MATERIALES Y MÉTODOS
[0311]
DMEM que contiene 4,5 g/l de glucosa (Life Technologies, cat. 31966-021).
DMEM LIBRE DE FENOL-ROJO contiene 4,5 g/l de glucosa (Life Technologies, cat. 21063-029).
DPBS sin calcio y magnesio (Life Technologies, cat. 14190-094).
L-glutamina, 100x (tecnologías Life, cat. 25030-123).
NEAA; Solución de aminoácidos no esenciales, 100x (NEAA; Life Technologies, cat 11140-035).
Solución de 2-mercaptoetanol, 14,3 M (Sigma, cat. M3148-25 ml).
Solución de penicilina/estreptomicina, 100x (Life Technologies, cat 15140-130).
Tripsina-EDTA al 0,05% (Life Technologies, cat 25300-054).
Gelatina (Sigma, cat. N° G1890) (consulte CONFIGURACIÓN DE REACTIVOS).
Puromicina (Life Technologies, Cat A11138-03).
mTeSR1™ (tecnologías StemCell, cat 5850).
TeSR™-E8™ (tecnologías StemCell, cat. 05840).
Factor de crecim iento de Matrigel reducido (BD, Cat. 354230).
Dispasa (tecnologías StemCell, cat 7923).
Suero de fibroblastos embrionarios murinos (MEF) (Sigma, Cat F7524).
Suero de células madre embrionarias murinas (mES) (Greiner Bio-One, Cat 758073).
Tampón de transducción 5x (Ver CONFIGURACIÓN DE REACTIVOS).
Medios MEF (consulte CONFIGURACIÓN DE REACTIVOS).
Medios mES (consulte CONFIGURACIÓN DE REACTIVOS).
Medios mES de transducción (consulte CONFIGURACIÓN DE REACTIVOS).
Medios de células madre neurales (consulte CONFIGURACIÓN DE REACTIVOS).
Suplemento de N2, 100x (Life Technologies, cat. 17502-048).
Suplemento B27, 50x (Life Technologies, cat 12587-010).
Lisozima (Sigma, Cat L6876-1G).
Benzonasa Endonucleasa (Sigma, Cat. E1014-25KU).
Imidazol (Sigma, Cat I5513-5G).
NDSB-201 (Sigma, Cat 82804-50G).
NDCB-165 (SYNCOM BV, Países Bajos).
Glicerol (Sigma, Cat G2025).
Glicina (Sigma, Cat. 50046).
NaCl - cloruro de sodio (Sigma, Cat S5886).
NaH2PO4 - Fosfato de sodio monobásico (Sigma Cat, S5011).
MgCl2 - Cloruro de magnesio (Sigma, Cat M4880).
ELISA de proliferación celular, BrdU (Roche, Cat. 11669915001).
Ensayo Caspasa-Glo 3/7 (Promega, Cat, G8090).
EGF (Life Technologies, Cat PHG0311).
FGF2 (Life Technologies, Cat. 13256-029).
PDGF (Life Technologies, Cat. PMG0044).
Insulina (Sigma, Cat. I9278-5ML).
IGF (Sistemas de I D, Cat. 791-MG-050).
Péptido de fusión TAT-HA2 (Eurogentec Nederland b.v., Cat AS-64876).
Péptido de fusión INF7-TAT (Eurogentec Nederland b.v., Cat AS-64908).
Conjuntos de plásmidos de chaperona (TAKARA, cat. 3340).
Am picilina (Sigma, Cat A9518).
Cloranfenicol (Sigma, Cat C0378).
hLIF (factor inhibidor de la leucemia humana, stock 1000x; sistemas de I D, cat. 7734-LF-025). Tinción de Coomassie (Biorad, Cat 161-0786).
Kit de carga CCF2-AM (Life Technologies, Cat. K1032).
Bromhidrato de poli-D-lisina (Sigma, Cat P6407).
EQUIPO
[0312]
Columnas de superflujo de Ni-NTA (Qiagen, Cat. 30622).
Unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 (Millipore, Cat UFC903008).
Columnas de desalación Zeba Spin (Thermo Scientific, Cat. 87772).
Poliestireno TC negro de 96 pocillos con fondo plano transparente (Corning, Cat 3603).
Placa de cultivo de tejidos de 100 mm (Greiner Bio-one, Cat 664160).
Placa de cultivo de te jidos de 6 pocillos (Greiner Bio-one, cat. 657160).
Placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos (Greiner Bio-one, cat. 662160).
Placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos (Greiner Bio-one, cat. 655180).
Pipeta de plástico desechable de 2 ml (Greiner Bio-one, cat 710180).
Pipeta de plástico desechable de 5 ml (Greiner Bio-one, cat 606188).
Pipeta de plástico desechable de 10 ml (Greiner Bio-one, cat n° 607188).
Pipeta de plástico desechable de 50 ml (Greiner Bio-one, cat. 768180).
Filtro de tamaño de poro de 0,22 mm (Millex GP; Millipore, cat SLGP033RS).
Filtro de acetato de celulosa de tamaño de poro de 0,45 mm (FP30/0,45 CA-S, Schleicher & Schuell). Jeringa desechable de 10 ml (Terumo, cat SS-10ESZ).
¡Pinzas de disección! PRECAUCIÓN Esterilizar en autoclave.
¡Tijeras de disección! PRECAUCIÓN Esterilizar en autoclave.
Luminómetro (Berthold Technologies, Centro XS3 LB 960).
Fluorómetro (dispositivos moleculares, SpectraMax M5e).
Microscopio de fluorescencia (Nikon, Eclipse TS100).
Citómetro de flu jo (BD Biosciences, FACS-ARIAII).
TÉRMINOS UTILIZADOS:
[0313] Transducción: Entrega intracelular de moléculas diana (moléculas pequeñas, polímeros, péptidos, proteínas, A r N, ADN, ARNip o nanoestructuras).
Transducción diana: La molécula introducida por transducción (moléculas pequeñas, polímeros, péptidos, proteínas, ARN), ADN, ARNip o nanoestructuras)
Hipertonicidad de transducción: Hipertonicidad de los medios que induce la transducción
CONFIGURACIÓN DE REACTIVOS
5X TAMPÓN DE TRANSDUCCIÓN.
[0314] 25 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl, 75 mM glicina, 150 mM de glicerol, 250 mM NDB, 1,25 mM MgCh, 1 mM de 2-mercaptoetanol. Para preparar 500 ml de tampón de transducción 5x, mezcle 1,5 g de NaH2PO4 y 14,6 g de NACL y luego agregue miliQ H2O hasta 400 ml. Ajuste el pH usando NaOH 10 M para alcanzar un pH final de 8,0. Luego, agregue mientras mezcla 2,8 g de Glicina, 25 g de NDSB-201, 60 mg de MgCh, 5,5ml de glicerol, 7 ml de 2-mercaptoetanol. Finalmente llene hasta 500ml con miliQ H2O. Filtre esterilice usando un filtro de 0,22um. Almacene a temperatura ambiente.
1X TAMPÓN DE TRANSDUCCIÓN 500
[0315] Para hacer 1x tampón de transducción 500, combine 1 volumen de tampón de transducción 5x con la proteína de interés con 4 volúmenes de medio de cultivo celular isotónico para alcanzar una tonicidad final de 500 mOsm/kg.
1X TAMPÓN DE TRANSDUCCIÓN 700
[0316] Para hacer 1x tampón de transducción 700, combine 1 volumen de tampón de transducción 5x con la proteína de interés con 4 volúmenes de medio de cultivo celular isotónico. Finalmente, agregue la cantidad adecuada de sales de NaCl o RbCl para alcanzar una tonicidad final de 700 mOsm/Kg.
Medio MEF
[0317] DMEM que contiene FBS al 10% con 50 U/ml de penicilina y 50 mg/ml de estreptomicina. Para preparar 500 ml de medio m Ef , mezclar 50 ml de suero MEF y 2,5 ml de penicilina/estreptomicina y luego llenar hasta 500 ml con DMEM. Conservar a 4°C.
Medio de células madre neurales
[0318] DMEM/F12 que contiene 1xB27 y 10 ng/ml de EGF con 50 U de penicilina y 50 mg/ml de estreptomicina. Preparar 500 ml de medio de células madre neurales, 10 ml de B27 y 2,5 ml de penicilina estreptomicina, y luego llenar hasta 500 ml con DMEM/F12. Conservar a 4°C.
Medio mES
[0319] DMEM que contiene FBS al 15% (vol/vol), L-glutamina 2 mM, NEAA 10 mM, 2-mercaptoetanol 1x10-4 M, hLIF 20 ng/ml, penicilina 50U y estreptomicina 50 mg/ml. Para preparar 500 ml del medio, mezclar 75 ml de suero mES, 5 ml de LGlutamina, 5 ml de aminoácidos no esenciales, 3,5 pl de 2-mercaptoetanol, 2,5 ml de penicilina/estreptomicina y 500 pl de hLIF y luego llenar hasta 500 ml con DMEM. Conservar a 4°C.
Medio de transducción mES (usado para células mES)
[0320] DMEM LIBRE DE FENOL-ROJO que contiene 1xN2 y 1xB27 (vol/vol), L-glutamina 2 mM, NEAA 10 mM, 2-mercaptoetanol 1x10'4 M y 20 ng/ml de hLIF. Para preparar 500 ml del medio, mezclar 5ml de N2, 10 ml de B27, 5 ml de L-Glutamina, 5 ml de NEAA, 500 ul de hLIF y 3,5 pl de 2-mercaptoetanol y luego llenar hasta 500 ml con DMEM LIBRE DE FENOL-ROJO. Conservar a 4°C.
Recubrimiento de gelatina de recipientes de cultivo
[0321] Se disuelve 1 g de polvo de gelatina en 100 ml de agua destilada, autoclave, y se almacena a 4°C como la 10 x solución de gelatina. Para preparar 0,1% (1 x) solución de gelatina, descongelar los 10 x soluciones de gelatina en un horno de microondas y/o autoclave y, a continuación añadir 50 ml de la solución 10 x a 450 ml de agua destilada.
Filtrar la solución con una unidad de filtrado de 0,22 |jm y almacenar a 4°C. Para placas de cultivo de capa, añadir volumen apropiado de 0,1% (1 x) solución de gelatina para cubrir toda el área de la parte inferior de la placa. Por ejemplo, se utilizan 1, 3 o 5 ml de solución de gelatina para una placa de 35, 60 o 100 mm, respectivamente. Incubar las placas durante al menos 30 min a 37°C en un ambiente estéril. Antes de usar, aspire el exceso de solución de gelatina.
[0322] La solución de gelatina se prepara como 10 x soluciones de concentrado (1 % p/v).
MÉTODOS
Cultivo celular
[0323] Se obtuvieron fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) por aislamiento de embriones de ratones preñados de 13,5 días. Primero, los embriones se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se extrajeron la cabeza y los tejidos viscerales. El tejido restante se lavó en PBS frío, se trituró usando un par de tijeras y se incubó durante 20 min a 37°C en una solución de tripsina 0,1 mM/EDTA 1 mM (3 ml por embrión). Después de esta incubación, se añadieron 3 ml adicionales por embrión de solución de tripsina 0,1 mM/EDTA 1 mM y la mezcla se incubó de nuevo a 37°C durante 20 min. Después de la tripsinización, se agregaron 6 ml por embrión de medio MEF y se pipeteó hacia arriba y hacia abajo varias veces para ayudar con la disociación del tejido. Después de la incubación de la mezcla de tejido/medio durante 5 min a temperatura ambiente, el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo. Las células se recogieron por centrifugación (200 x g durante 5 min a 4°C) y se resuspendieron en medio MEF. 1x106 células (paso N° 1) se cultivaron en placas de 100 mm a 37°C con CO2 al 5% en medios MEF.
[0324] Las células MEF Lox-RFP/STOP-Lox-eGFP fueron hechas por la transducción con partículas lentivirales que contienen el vector EF1-a que dirige la expresión de casete Lox-RFP/STOP-Lox-eGFP acoplado al gen resistente de puromicina IRES. Después de 48 horas de transducción, las células se cultivaron en medio MEF con 1 jg/m l de puromicina durante 1 semana. Después de 7 días de selección, casi todas las células expresaron el marcador RFP. Las células se mantuvieron en medio MEF con 1 ug/ml de puromicina. Las células se congelaron en el paso N° 3 para experimentos futuros.
[0325] Las células mES IB10 se obtuvieron del laboratorio de Dr. Hans Clevers (Instituto Hubrecht, Países Bajos). Las células madre embrionarias V6,5 fueron un regalo del laboratorio del Dr. Rudolf Jaenisch. Las células mES Lox-Stop-Lox-GFP fueron un regalo del Dr. Konrad Hochedlinger. Todas las células mES se mantuvieron en una capa de células MEF irradiadas en medio mES.
[0326] Las células madre neurales embrionarias de ratón se obtuvieron de embriones de cabeza de los ratones embarazados de 14 días como se ha descrito antes (REF1). Las células se mantuvieron en medio de células madre neurales que contenían 10 ng/ml de EGF. Después de 2 semanas, es posible observar la formación de neuroesferas. Se generaron células madre neurales transgénicas Lox-RFP/STOP-Lox-eGFP transduciendo células con partículas lentivirales que expresan un casete Lox-RFP/STOP-Lox-eGFP acoplado a un gen resistente a IRES-puromicina. 2 días después de la transducción lentiviral de células madre neurales, se añadió puromicina al medio a una concentración de 0,75 jg/ml. Después de 10 días de selección, más del 95% de las células expresan RFP. Las células se mantuvieron en medio de células madre neurales con 0,75 jg/m l de puromicina.
[0327] Las células madre embrionarias se cultivaron en matrigel en mTeSR1 o medios mTeSR-E8 a 37°C. Los medios de cultivo fueron reemplazados todos los días. Se generaron células H1 transgénicas Lox-RFP/STOP-Lox-eGFP transduciendo células con partículas lentivirales que expresan un casete Lox-RFP/STOP-Lox-eGFP acoplado al gen resistente a IRES-puromicina. 2 días después de la transducción lentiviral de células madre embrionarias humanas, se añadió puromicina al medio mTeSR1 a una concentración de 0,75 jg/ml. Después de 10 días de selección, más del 95% de las células expresan RFP. Las células se mantuvieron en medio mTeSR1 o TeSR-E8 con 0,75 ug/ml de puromicina.
Expresión, purificación e intercambio de tampón de proteínas en tampón de transducción
[0328] Se sobreexpresaron y purificaron proteínas de la cepa de E. coli BL21 (DE3) con chaperonas junto con el plásmido de expresión pET15 con el gen de interés. Takara dispone de varios conjuntos de chaperonas y, para cada proteína, se puede determinar el conjunto de chaperonas óptimo de acuerdo con el protocolo del fabricante proporcionado con los conjuntos de plásmidos de chaperona. Se añadieron cultivos durante la noche 1:100 a x mL de medio LB que contenía 50 ug/ml de ampicilina y 20 ug/ml de cloranfenicol y se colocaron en una incubadora con agitación a 37°C. Los cultivos se cultivaron hasta que se alcanzó una DO600 de 0,75, momento en donde se incubó el cultivo con agitación a 16°C. Después de 1 hora, se añadió IPTG a 1 mM y los cultivos se incubaron con agitación a 16°C durante 16 horas. Las células se recogieron mediante centrifugación y se lisaron mediante tratamiento con lisozima (1 mg/ml) y benzonasa (1 U/ml) a 4°C durante 1 hora. Los lisados se aclararon por centrifugación y el sobrenadante se cargó en una columna de Ni-NTA. Las proteínas se eluyeron mediante un gradiente de imidazol en tampón de transducción 5x. Después de la electroforesis en gel SDS y la tinción de Coomassie de cada fracción de elución, las fracciones de proteína de alta pureza se combinaron y concentraron utilizando filtros de amicon. Para eliminar el imidazol, se utilizaron columnas de desalación Zeba Spin de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y la proteína se eluyó en tampón de transducción 5x. En este punto, la proteína puede purificarse más o dividirse en alícuotas y congelarse rápidamente en nitrógeno líquido. Se usó una pequeña fracción de solución de proteína para realizar la cuantificación de proteínas mediante el ensayo de Bradford y electroforesis en gel SDS junto con tinción de Coomassie para determinar la concentración y pureza de proteínas, respectivamente. En nuestras manos fue posible congelar y descongelar varias veces varias proteínas en tampón de transducción 5x con una pérdida mínima de actividad.
Transducción
[0329] Para establecer las condiciones óptimas de transducción, es necesario optimizar varios parámetros para cada tipo de célula específico. Específicamente, estos son; Tonicidad y tipo de sal inductora de tonicidad, tiempo de transducción, tipo y concentración de osmoprotector, tipo y concentración de compuesto de transducción. Los procedimientos específicos para la optimización de cada uno de estos parámetros se enumeran a continuación. Utilizamos principalmente dos protocolos de transducción diferentes para todas las células primarias y líneas celulares probadas hasta ahora. Utilizamos medios de cultivo sin antibióticos para la transducción. Aunque la transducción funciona en presencia de suero, hemos descubierto que es más eficaz en condiciones sin suero.
[0330] Como punto de partida para la optimización, determinamos cuál de los dos protocolos de transducción funciona mejor para el tipo de célula diana específica y la diana osmocitada. A partir de ahí, el tampón de transducción que produce los mejores resultados en términos de eficiencia de transducción, supervivencia celular, proliferación celular. y la función celular se puede optimizar aún más como se describe a continuación. En el primer protocolo la transducción se realiza durante 12 horas a una tonicidad de 500mOsm/Kg (Protocolo 12/500). En resumen, un día antes de la transducción de proteínas, las células se sembraron en el medio de cultivo apropiado sin antibióticos. Al día siguiente, prepare 1x tampón de transducción 500 con el objetivo osmocitosado. En resumen, el tampón de transducción 5x y la diana osmocitada se mezclan con medio de cultivo celular para obtener tampón de transducción 1x con una tonicidad de 500 mOsm/KG. Esta mezcla de medio/tampón de transducción/diana osmocitada se agrega a las células. Las células se incuban con proteínas en tampón de transducción durante 12 horas, después de lo cual se extrae el medio de transducción y se cambia por medio de cultivo normal.
[0331] En el segundo protocolo, la transducción de la proteína se lleva a cabo durante 3 horas a una tonicidad 700mOsm/Kg (protocolo 3/700). En resumen, 1 día antes de la transducción, las células se sembraron en el medio de cultivo apropiado sin antibióticos. Al día siguiente, prepare el tampón 500 de transducción 1x con la diana osmocitada como se describió anteriormente. Finalmente, se agrega NaCl o RbCl u otra sal inductora de hipertonicidad de transducción (ver más abajo) para ajustar la tonicidad final a 700mOsm/kg. Por ejemplo, se añaden 2 ul de NaCl 5 M a 98 ul de tampón de transducción 500 1x para obtener una tonicidad final de 700 mOsm/kg.
[0332] En los ejemplos siguientes, probamos la eficacia de los protocolos de 12/500 y 3/700 por transducción de betalactamasa o proteína Cre como se indica a continuación. Sin embargo, la eficacia y la respuesta de la célula diana al tampón de transducción se pueden medir usando otras moléculas indicadoras, que incluyen, pero no se limitan a por ejemplo, informador de ADN, ARN, siARN, circARN, moléculas pequeñas y/o sondas fluorescentes.
[0333] Se añadió la mezcla de medios/tampón de transducción/y molécula diana osmocitosada a las células. Las células se incubaron con proteínas en tampón de transducción durante 3 horas. Después de eso, se eliminó el medio de transducción y se cambió por medio de cultivo regular.
[0334] Tondas posteriores de transducción se pueden realizar con intervalos de tiempo de recuperación de típicamente 12 a 24 horas.
Medición de la transducción de p-lactamasa.
[0335] La transducción de p-lactamasa se realizó usando el protocolo 3/700 anterior en fibroblastos embrionarios murinos (MEF). Se revistió una placa negra de 96 pocillos de fondo transparente con 0,15 mg/ml de Poli-D-Lisina durante 1 hora a temperatura ambiente. Se sembraron 12.000 células MEF por pocillo en medio MEF sin antibióticos. Al día siguiente, las células se transdujeron usando el protocolo de transducción 3/700 como se describe anteriormente. La proteína p-lactamasa en tampón de transducción 5x se diluyó 1/5 en medio libre de rojo fenol DMEM sin antibióticos. Se añadió sal de Na o Rb para ajustar la tonicidad final a 700 mOsm/kg. A continuación, se añadió la mezcla completa a las células. Después de 3 horas, el medio de transducción se reemplazó por medio MEF fresco durante 30 minutos. Posteriormente, las células se lavaron una vez con DMEM sin rojo fenol. La actividad de la plactamasa se midió usando el kit CCF2-AM siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, se añadieron 120 pl de medio de carga CCF2-AM por pocillo y las células se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células se lavaron dos veces con DMEM sin fenol-rojo y se incubaron durante 30-60 min más. La emisión de fluorescencia se midió a 409 nm y 510 nm siguiendo las instrucciones del fabricante. Todas las pruebas se realizaron por triplicado.
[0336] La transducción de p-lactamasa en células mES se realizó de una manera similar usando el protocolo 12/500 (arriba). Las células mES se sembraron en placas a 75.000 células por pocilio en placas de 96 pocilios recubiertas de gelatina en medio de cultivo mES. Al día siguiente, las células se transdujeron usando el protocolo de transducción 12/500 como se describe anteriormente. Luego, la proteína p-lactamasa en tampón de transducción 5x se diluyó 1/5 con medio de transducción mES. A continuación, se añadió la mezcla completa a las células. Después de l2 h de transducción, las células se lavaron 2 veces con DMEM libre de rojo fenol. La actividad de la p-lactamasa se midió usando el kit CCF2-AM siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, se añadieron 120 ul de medio de carga CCF2-AM a cada pocillo y las células se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células se lavaron 2 veces con medio libre de rojo fenol DMEM y se incubaron durante 30-60 min adicionales. La emisión de fluorescencia se leyó a 409 nm y 510 nm y se analizó siguiendo las instrucciones del fabricante. Todas las pruebas se realizaron por triplicado.
EJEMPLO 2: Transducción de CRE y cuantificación de la incorporación de CRE
[0337] Se transdujeron MEF con CRE siguiendo el protocolo 3/700 en un formato de 96 pocillos. En resumen, se sembraron 12.000 células Lox-RFP/STOP-Lox-eGFp MEF por pocillo en placas recubiertas de gelatina utilizando medio MEF. Al día siguiente, la proteína CRE en tampón de transducción 5x se diluyó 1/5 con fenol-rojo DMEM sin antibióticos. Luego se añadió la mezcla completa a las células. Después de 3 horas. de transducción, el medio se reemplazó por medio mES reciente y se incubó durante 24-48 h. A continuación, las células se analizaron midiendo la señal verde y roja en un microscopio fluorescente o en un citómetro de flujo.
[0338] Se transdujeron células mES con CRE siguiendo el protocolo 12/500 en un formato de 96 pocillos. En resumen, células mES 75.000 Lox-RFP/STOP-Lox-eGFP se sembraron por pocillo en placas recubiertas de gelatina usando medio mES. Al día siguiente, la proteína Cre en tampón de transducción 5x se diluyó 1/5 con medio de transducción mES. A continuación, se añadió la mezcla completa a las células. Después de las 12 h, el medio de transducción se reemplazó por medio mES y las células se incubaron durante 24-48 h. A continuación, las células se analizaron midiendo la señal verde en un microscopio fluorescente o en un citómetro de flujo.
[0339] Se transdujeron células madre neurales de ratón Lox-RED/STOP-Lox-eGFP con proteína CRE siguiendo el protocolo de transducción 12/500. Las neuroesferas se transfirieron a una placa de 96 pocillos con 80 pl del medio de células madre neuronales. Inmediatamente después, se añadieron a la célula 20 ul de CRE en tampón de transducción 5x y se mezclaron cuidadosamente. 12 h más tarde, el medio de transducción se reemplazó por medio de células madre neurales fresco y las células se incubaron durante 24-48 h. A continuación, las células se analizaron midiendo la señal verde y roja en un microscopio fluorescente o en un citómetro de flujo.
[0340] Se transdujeron células ES Lox-RED/STOP-Lox-eGFP humanas con CRE siguiendo el protocolo 12/500 en un formato de 96 pozos. Las células se pasaron por disociación mecánica en pequeños grupos siguiendo las instrucciones del fabricante de mTeSR1 o TeSR-E8 y se sembraron una placa recubierta de matrigel para alcanzar una confluencia del 50%. Al día siguiente, la proteína c Re en tampón de transducción 5x se diluyó 1/5 con mTeSR1 o TeSR-E8. Luego se añadió la mezcla completa a las células. Después de las 12 h de transducción, el medio se reemplazó por medio fresco mTeSR1 o TeSR-E8 y las células se incubaron durante 24-48 h. A continuación, las células se analizaron midiendo la señal verde y roja en un microscopio fluorescente o en un citómetro de flujo.
EJEMPLO 3: Transducción de TALEN
[0341] Las proteínas TALEN se expresaron y purificaron en condiciones nativas como se describió anteriormente. Las proteínas TALEN recombinantes se purificaron en tampón de transducción 5x. Se transdujeron células madre embrionarias humanas con proteínas TALEN utilizando el protocolo de transducción 12/500. Para la alteración del gen HPRT, se utilizó un par de proteínas TALEN dirigidas al gen HPRT. 4 días después de la transducción, se añadió 2,5 pM 6-TG para seleccionar las células deficientes en HPRT. Dos semanas más tarde, los clones supervivientes se seleccionaron y expandieron para la purificación del ADN genómico y la secuenciación del gen HPRT.
[0342] Las células iPS humanas masculinas se transdujeron con la proteína 2um TALEN durante 12h. En resumen, se mezclaron 20 pl de proteínas talen de HPRT en tampón de transducción 5x con 80 pl de medio de células iPS humanas. La mezcla final se añadió a la célula durante 12 h. Después de eso, el medio se reemplazó por 150 ul de medio de cultivo de células iPS humanas. Después de 5 días, se añadió 6-TG 3 uM al medio de cultivo para seleccionar células deficientes en HPRT. Después de 10 días, se recogieron clones individuales y se cultivaron por separado. Se purificó el ADN genómico de cada clon y se realizó la secuencia del gen HPRT. Se ejecutó la alineación de blast para determinar la tasa de inserciones y deleciones en el gen HPRT causadas por las proteínas TALEN (ver Figura 14).
EJEMPLO 4: Potenciadores de la transducción
[0343] Se usaron EGF, FGF y PDGF como potenciadores de la transducción de proteínas. Los factores de crecimiento se añadieron en tampón de transducción a su concentración final activa (en el caso de los factores de crecimiento enumerados, aproximadamente 10 ng/ml cada uno). Los péptidos de fusión se usaron en tampón de transducción a una concentración que variaba de 1 a 10 uM.
EJEMPLO 5: Mediciones de BrdU y Caspasa
[0344] Se determinó la proliferación celular usando el kit Cell Proliferation Elisa, Brdu (Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante (Roche). La cuantificación de las actividades caspasa-3 y caspasa-7 se midieron usando el kit de ensayo Caspase-Glo 3/7 (Promega) siguiendo el protocolo del fabricante (Promega).
EJEMPLO 6: Ensayos para la optim ización del procedimiento de transducción y el tampón de transducción.
[0345] Es importante señalar que la tonicidad se define por la concentración de todos los solutos que no atraviesan la membrana celular. En nuestros ejemplos, usamos NaCl o RbCl normalmente a 500-700 mOsm/KG, pero la tonicidad del tampón y el tiempo de transducción deben optimizarse para una aplicación específica (objetivo de transducción y tipo de célula objetivo) como se describe a continuación (I). Además, en nuestros ejemplos usamos NDSB201 como el compuesto de transducción, pero la capacidad y eficiencia de otros compuestos para inducir o facilitar la transducción se puede determinar como se describe a continuación, y debe optimizarse para la aplicación específica (diana de transducción y tipo de célula diana) como que se describe a continuación (II). Como se indicó anteriormente, en nuestros ejemplos usamos NaCl o RbCl para inducir la hipertonicidad de la transducción, pero se pueden usar otras sales o compuestos. Hemos descrito a continuación (III) un ensayo para probar si una molécula o compuesto puede inducir eficazmente la hipertonicidad de la transducción. Las sales, moléculas o compuestos que inducen la transducción deben optimizarse aún más para el tiempo y la tonicidad del tampón como se describe en (I). En nuestros ejemplos, los osmoprotectores utilizados en nuestro tampón de transducción son glicina y glicerol, pero la eficacia de otros compuestos como osmoprotectores se puede determinar como se describe a continuación, y se debe optimizar para la aplicación específica y el tipo de célula como se describe a continuación (IV). La optimización de los parámetros anteriores requerirá ajustes iterativos de los otros componentes. Por ejemplo, después de la determinación y optimización de un nuevo compuesto de transducción, es posible que sea necesario reajustar la hipertonicidad y el tiempo de la transducción.
(I) Ensayo para optim izar la tonicidad de transducción y el tiempo de transducción.
[0346] Para optimizar el procedimiento de transducción para una aplicación específica (objetivo de transducción y objetivo tipo de célula), considere como punto de partida los protocolos 12/500 y 3/700 descritos anteriormente. Aquí, describimos cómo optimizar el protocolo de transducción con respecto a la eficiencia de la captación intracelular, la supervivencia celular y, si corresponde, la proliferación celular. En nuestro ejemplo, usamos la proteína p-lactamasa para optimizar la transducción, pero se pueden usar otras proteínas, ADN, ARN, ARNip, moléculas (pequeñas) o nanoestructuras, siempre que haya un ensayo disponible para determinar la entrega intracelular del objetivo de transducción.
[0347] Para optimizar la tonicidad de los medios de transducción y el tiempo de transducción, configure una matriz de titulación en un formato de 96 pocillos como se muestra en la Figura 10.
[0348] Prepare una solución de beta-lactamasa de al menos 80 a 100 microM en tampón de transducción 5x. Esta solución de proteína p-lactamasa se usa como un concentrado 100x para obtener una concentración final de plactamasa de 0,8 a 1 pM.
[0349] Para optimizar la tonicidad de tampón y el tiempo de transducción, las células diana se colocaron en placas en los medios de cultivo apropiados libres de fenol-rojo sin antibióticos en 3 placas de múltiples pocillos diferentes (Placa "A", para determinar actividad intracelular de p-lactamasa, placa "B" para la medición de la proliferación celular y la placa "C" para el análisis de la apoptosis).
[0350] Preparar una serie de medios de cultivo con diferentes tonicidades de 300 a 1000 mOsm/Kg, mediante la adición de 50 mM NDSB201, 15 mM de glicina y 30 mM Glicerol al medio de cultivo libre de fenol-rojo sin antibióticos y el ajuste de la tonicidad usando NaCl, RbCl o otra sal inductora de hipertonicidad por transducción (para optimizar las sales inductoras de hipertonicidad por transducción, véase (III) más adelante). Incubar las células a diferentes tonicidades durante 2-24 horas (ver la Figura 10 esquemática) y proceder a medir la actividad de la p-lactamasa en la placa A como se describe anteriormente y reemplazar el medio con medio de cultivo estándar en las placas B y C. Después de 6-8 horas, agregue BrdU en la placa B en medio de cultivo regular y mida las actividades de las caspasas 3/7 en la placa C. Incube la placa B con BrdU durante el tiempo adicional necesario para la incorporación de BrDu en las células diana en proliferación (consulte el protocolo del fabricante) y se procedió a determinar la incorporación de BrdU (Instrucciones del fabricante; ELISA de proliferación celular, BrdU, Roche, Cat 11669915001). Las condiciones óptimas serán aquellas con la mayor incorporación de proteína p-lactamasa y un efecto mínimo sobre la supervivencia celular, la proliferación celular (si corresponde) y la función celular.
(II) Ensayo para optim izar el tipo y la concentración de compuesto de transducción
[0351] En nuestros ejemplos usamos el compuesto de transducción NDSB201, pero se pueden usar diferentes compuestos de transducción dependiendo de la aplicación y el objetivo de transducción. Aquí describimos cómo probar el rendimiento de compuestos de transducción potenciales y optimizar la concentración final del compuesto de transducción. En este ejemplo usamos el protocolo de transducción 3/700 para transferir la proteína p-lactamasa en fibroblastos embrionarios murinos (MEF), pero dependiendo del tipo de célula diana, el protocolo de transducción debe ajustarse como se describe en (I). Prepare una solución madre de p-lactamasa 100x como se describe en (I). Para optimizar el compuesto de transducción, esta solución madre de p-lactamasa deberá prepararse en el compuesto de transducción de interés que se va a probar o dializarse frente a tampón de transducción 5x con 250 mM de compuesto de transducción de interés.
[0352] Preparar el medio de cultivo con la tonicidad optimizada determinada en (I). Agregue a este medio, el compuesto de transducción que se va a probar en un rango de concentración de 5 a 150 mM. Como se describe en (I), prepare placas de pocillos múltiples con células diana para probar la transferencia intracelular de la diana de transducción, la apoptosis celular y, si corresponde, la proliferación celular. Agregue medios de transducción con el objetivo de transducción (en nuestro ejemplo, p-lactamasa) y diferentes concentraciones del compuesto de transducción probado. Incubar las células en el momento determinado en (I) y medir la transducción de p-lactamasa, la apoptosis y la incorporación de BrdU como se describe en (I).
(MI) Ensayo para optim izar el tipo de sal inductora de hipertonicidad.
[0353] Varias sales son capaces de inducir la transducción de la hipertonicidad, pero como se ha demostrado en nuestros ejemplos, no todas las moléculas inductoras de hipertonicidad inducen la transducción. Aquí describimos cómo determinar si una sal específica es capaz de inducir la transducción y cómo optimizar el tipo de sal de transducción para una aplicación específica.
[0354] Se prepara una solución madre de p-lactamasa 100x como se describe en (I). Para optimizar la sal de transducción, esta solución madre de p-lactamasa deberá prepararse en la sal de transducción de interés que se va a probar o dializarse frente a tampón de transducción 5x con 250 mM de sal de transducción de interés.
[0355] Idealmente, en los siguientes pasos, medio libre de sodio se utiliza para la preparación de los medios de transducción, ya que el sodio presente en los medios de cultivo estándar puede confundir los resultados. Preparar el medio de cultivo usando una sal de transducción de control (ver ejemplos) o la(s) sal(es) que se van a probar a una tonicidad que varía de 300-1000 mOsm/kg y combinar con el objetivo de transducción (en este ejemplo, p-lactamasa). (Alternativamente, se puede realizar una prueba inicial usando la sal que se probará en los protocolos de transducción 12/500 o 3/700 para determinar la actividad de transducción de una sal o molécula específica, con la posterior optimización adicional de esta sal o molécula como se describe en (I)).
[0356] Como se describe en (I) preparar placas de múltiples pocillos con las células diana para probar la transferencia intracelular de objetivo de transducción, apoptosis de las células y, en su caso, proliferación de células. Añadir medio de transducción con diferentes concentraciones de la sal de transducción probada. Incubar las células en el tiempo de transducción óptimo determinado en (I) y medir la transducción de p-lactamasa, la apoptosis y la incorporación de BrdU como se describe en (I).
(IV) Ensayo para optim izar el tipo y la concentración de osmoprotector
[0357] En nuestros ejemplos utilizamos una combinación de glicerol y glicina como osmoprotectores, pero se pueden utilizar diferentes osmoprotectores dependiendo de la aplicación y el objetivo de transducción. Aquí describimos cómo probar el rendimiento de los posibles osmoprotectores y optimizar la concentración final de los osmoprotectores.
[0358] Se prepara una solución madre de p-lactamasa 100xcomo se describe en (I). Prepare los medios de cultivo de transducción utilizando un(os) osmoprotector(es) de control (ver ejemplos) o el (los) osmoprotector(es) que se van a analizar a una concentración que varía de 1 a 250 mM y combínelos con el objetivo de transducción (en este ejemplo, p-lactamasa). Como se describe en (I) preparar placas de múltiples pocillos con células diana para probar la transferencia intracelular de la diana de transducción, la apoptosis celular y, si corresponde, la proliferación celular. Añada medios de transducción con diferentes concentraciones del osmoprotector o osmoprotectores probados. Incube las células en el tiempo de transducción óptimo determinado en (I) y medir la transducción de p-lactamasa, la apoptosis y la incorporación de BrdU como se describe en (I).
EJEMPLO 7: El tampón de transducción mejora la transfección de lípidos de ADN en células primarias
[0359] Un día antes de la transducción, se sembraron 75.000 células ES de ratón por pocillo en una placa de 96 pocillos. Al día siguiente, las células se transfectaron con 100 pl de medios de transfección. en breve, el medio de transfección contiene 100 ng de ADN plasmídico, 0,8 pl LTX de lípidos, 0,1 pL de reactivo pLUS (Life Technologies) y 20 pl de tampón de transducción 5x. Volumen total incluyó a 100 pl de medios mESC LIF. Las células de control se transfectaron de forma similar; el tampón de transducción se reemplazó con medio mESC LIF.
[0360] Los resultados se muestran en la Figura 11. La adición de tampón de la transducción a la mezcla de transfección de a Dn de plásmido/Lipofectamina LTX da como resultado la transfección eficiente de ADN reportero en los CES murinos.
EJEMPLO 8: Incorporación intracelular dual de ADN y proteína usando tampón de transducción
[0361] Un día antes de la transducción, se sembraron en placa 75.000 células ES de ratón por pocilio de una placa de 96 pocillos. Al día siguiente, las células se incubaron con 100 j l de medio de transducción. El medio de transducción Cre se preparó combinando 20 j l de proteína CRE en tampón de transducción 5x más 80 j l adicionales de medio mESC LIF. RFP/medio de transfección de ADN en lípidos contenían 100 ng de ADN plásmido, 0,8 jL LTX de lípidos, 0,1 jL de reactivo PLUS (Life Technologies) y 20 jL de 5x tampón de la transducción. Volumen total incluyó a 100 j l mESC LIF. Los medios de transducción CRE y ADN/LIPID contienen 100 ng de ADN plasmídico, 0,8 ul de lípido LTX, 0,1 j l más reactivo (Life Technologies) y 20 j l de proteína CRE en tampón de transducción 5x. Volumen total incluyó a 100 j l mESC LIF. Las células se incubaron durante 12 horas y el medio se reemplazó con medio mESC. Las células se analizaron 32 horas después de la transducción mediante análisis FACS.
[0362] Los resultados se muestran en la Figura 12. La adición de transducción de resultados de amortiguamiento en la transfección eficiente de: proteína de recombinasa Cre; plásmido RFP-ADN; y proteína CRE junto con complejos RFP-ADN/lípido, en las ESC murinas.
EJEMPLO 9: Tampón de transducción potencia la incorporación viral en las células iPS humanas
[0363] La transducción lentiviral en células iPS humanas con una densidad celular de 75% de confluencia en transducción viral de formato de 96 pocillos constaba de 1 jL de solución viral concentrada, 4 jg/m l de polibreno, más medio de cultivo iPSC humano para un volumen final de 100 ul.
[0364] La transducción viral bajo condiciones de tampón de transducción se llevaron a cabo mediante la combinación de 1 ul de solución viral concentrada, 4 jg/m l de polibreno, 20 j l de 5x tampón de la transducción, además de medios de cultivo IPSC humanos para un volumen final de 100 jl. Las células se incubaron durante 12 horas y se cambiaron los medios por medios iPSC humanos normales. Las células se analizaron 36 horas después de la transducción. Al día siguiente, las células se transfectaron con 100 j l de medio de transfección. En resumen, el medio de transfección consistían en 100 ng de ADN plásmido, 0,8 j l LTX de lípidos, 0,1 j l de reactivo PLUS (Life Technologies) y 20 j l de 5x tampón de la transducción. El volumen total incluyó 100 ul de medio mESC LIF. Las células de control se transfectaron de forma similar; el tampón de transducción se reemplazó con medio mESC LIF.
[0365] Los resultados se muestran en la Figura 13. La adición de transducción de resultados de amortiguamiento en la transfección eficiente de partículas lentivirales en las células iPS humanas.
EJEMPLO 10: Tampón de transducción para proteína con tampón de transducción
2/1000 de baja solubilidad - composición final.
[0366] 500 mM NaCl, 250 mM NDSB-201, 300 mM glicina, 150 mM glicerol en D-MEM N2/B27 LIF.
Protocolo de tampón de transducción 2/1000.
[0367] En resumen, las células TEr se transdujeron mediante la adición de 80 j l de tampón de transducción 2/1000 20 j l de proteína CRE en 5X de transducción de tampón 500/12. Las células se incubaron durante 2 horas. Después de la incubación, el medio se reemplazó con medio mESC. Las células se analizaron mediante FACS 36 horas después de la transducción.
EJEMPLO 11: Transducción de TALEN en células iPS humanas
[0368] Se transdujeron células iPS humanas masculinas con proteína TALEN 2 jM durante 12 h. En breve, 20 j l de proteínas de HPRT TALEN en 5X tampón de la transducción se mezclaron con 80 jL de medio de células iPS humanas. La mezcla final se añadió a la célula durante 12 h. Después de eso, el medio se reemplazó por 150 j l de medio de cultivo de células iPS humanas. Después de 5 días, se añadió 6-TG 3 jM al medio de cultivo para seleccionar células deficientes en HPRT. Después de 10 días, se recogieron clones individuales y se cultivaron por separado. Se purificó el ADN genómico de cada clon y se realizó la secuencia del gen HPRT. Se ejecutó la alineación de blast para determinar la tasa de inserciones y deleciones en el gen HPRT causadas por las proteínas TALEN.
[0369] Los resultados se muestran en la Figura 14. Los resultados muestran que TALENs funcionales fueron transducidos en las células iPS porque inserciones y deleciones se generaron en el material genético dentro de la célula en el sitio diana TALEN.
EJEMPLO 12: Transducción simultánea de proteínas y moléculas grandes
[0370] Para evaluar si el tampón de transducción permitiría la transducción simultánea de proteínas y moléculas grandes, analizamos la captación mediada por macropinocitosis de TMR-dextrano (rojo) y proteína BSA marcada con fluorescencia (cian) por fibroblastos embrionarios murinos que expresan GFP (MEF). En resumen, los MEF que expresan la proteína eGFP (verde) se incubaron con 5 |jg/ml de TMR-Dextrano de alto peso molecular (rojo) y 1 |jg de BSA-Alexa-647 (rojo lejano) en medio de transducción 1x (protocolo 700/3) durante 30 min. Posteriormente, las células se lavaron dos veces en tampón de transducción 1x. Finalmente, las células se mantuvieron en tampón de transducción 1x y se analizaron inmediatamente mediante microscopía confocal. La captación de dextrano y BSA se inhibió incubando las células con etilisopropilamilorida (EIPA) 100 jM 30 minutos antes y durante el procedimiento de transducción.
[0371] Los resultados se muestran en la Figura 15. Se observó la transducción simultánea de dextrano (polisacárido) y proteína BSA en presencia de tampón de transducción. La transducción fue inhibida por el inhibidor de macropinocitosis EIPA.
EJEMPLO 13: Edición de genes por transducción
[0372] La alta eficiencia de la osmocitosis de proteínas tiene una aplicación atractiva en la edición de genes. Además del sistema de edición de genes TALEN descritos anteriormente, el sistema CRISPR-Cas9 recientemente descubierto proporciona un sistema de edición de genes adicional. CAS/CRISPR consiste en la proteína nucleasa de Streptococcus pyrogenes Cas9, que es guiada a loci genómicos específicos por un pequeño ARN guía (sgARN) [1, 2]. El atractivo del sistema CAS/CRISPR es su simplicidad en el diseño. A diferencia de los sistemas TALEN y dedo Zinc, en los que la propia proteína nucleasa debe diseñarse y modificarse para cada sitio objetivo específico, el sistema CAS/CRISPR requiere una sola proteína nucleasa (Cas9) y varía el ARN guía corto asociado para selección de destino. Tras la unión a la diana, la nucleasa Cas9 crea una ruptura de doble hebra (DSB) en el locus diana, que, cuando se repara mediante el sistema celular de reparación de DSB, crea con frecuencia una deleción de cambio de marco que da como resultado la ruptura del gen. El sistema Cas/CRISPR se introduce típicamente en las células diana utilizando vectores virales, lo que dificulta la aplicación clínica y, sin una selección adicional de fármacos de las células infectadas, es ineficaz en algunos tipos de células diana. Dada la eficiencia de nuestro sistema de osmocitosis en varias líneas celulares difíciles de infectar, incluidas las células madre humanas, exploramos si este sistema también permitiría la edición de genes mediada por proteínas.
[0373] Con este fin, primero probamos si la osmocitosis permitiría la transducción eficiente de ARN en las células. Para probar esto, realizamos una transducción de ARNip (ARN de interferencia pequeño) en células KBM7 utilizando el protocolo 700/3. Transducimos ARNip dirigido a GAPDH (Invitrogen) y medimos la caída de GAPDH mediante transferencia Western. Como se muestra en la Figura 17, la transducción de ARNip dio como resultado una eliminación eficaz del nivel de expresión de la proteína GAPDH. Los datos anteriores demuestran que nuestro sistema de osmocitosis permite la transducción eficiente de ARN pequeños como ARNip en células diana.
[0374] A continuación, optimizamos los medios de transducción para permitir la transducción de Cas9 recombinante. En nuestro primer intento de transducir la proteína Cas9 utilizando los medios 700/3 y 500/12, notamos que la proteína Cas9 era insoluble en ambas condiciones de transducción. Sin embargo, la proteína Cas9 permaneció soluble cuando se usaron concentraciones más altas de NaCl y NDSB-201 (N° 01) o GABA (N° 20) (Figura 18A). Por esta razón, desarrollamos un "protocolo de transducción adaptado a Cas9" (el "cuarto protocolo") con una osmolalidad final de 1250 mOsmol/kg y una concentración de 250 mM de NDSB-201 (compuesto de transducción N° 01) u otros compuestos de transducción seleccionados de la tabla 1. Esperábamos que osmolalidades más altas y NDSB inducirían una transducción de proteínas más rápida, pero también posiblemente podrían aumentar la toxicidad celular. Para caracterizar estas nuevas condiciones de transducción, medimos la incorporación de BrdU tras una transducción de alta osmolaridad (1250 mOsm/kg) en diferentes puntos de tiempo cortos, en células KBM7. Observamos que los diferentes compuestos de transducción mostraron tasas de supervivencia variables en comparación con NDBS-201 en KBM7, y el compuesto N° 20, por ejemplo, dio una supervivencia mucho mejor que NDSB-201 (Figura 18B).
[0375] Para más prueba de la duración de la transducción con el tampón de transducción modificado, se realizó una transducción de la proteína recombinasa Cre a 1250 mOsmol/Kg y 250 mM de GABA en diferentes puntos de tiempo y se mide el porcentaje de células con activación de reportero exitosa mediada por cre así como la incorporación de BrdU como medida de la proliferación y supervivencia celular. En estas condiciones, el tiempo de transducción óptimo basado en la supervivencia celular y la transducción de Cre fue de alrededor de 60 minutos. En esos momentos, una ronda de transducción de la proteína Cre dio un 80% de células KBM7 positivas para GFP. Y dos rondas posteriores de transducción de la proteína Cre produjeron un 94% de KBM7 positivo (Figura 18C). Una segunda ronda de transducción de proteínas no afectó la tasa de supervivencia celular. Por lo tanto, estos datos muestran la flexibilidad del método de osmocitosis y demuestran que, en función de las propiedades de la proteína a transducir, es posible ajustar las condiciones de transducción (tipo y concentración del compuesto de transducción y/o osmolalidad del tampón) para eficiencia de incorporación de proteína óptima y supervivencia celular.
[0376] Utilizando los medios de transducción adaptados a Cas9, nos propusimos transducir simultáneamente la proteína Cas9 con el sgARN correspondiente en células KMB7. Los sgARN se produjeron mediante transcripción in vitro a partir de plantillas de ADN. Los sgARN contienen una secuencia guía de 20 nts, lo que confiere su especificidad objetivo y una secuencia de andamio de 80 nts (Figura 18D, panel superior). La proteína Cas9 recombinante se expresó en E. coli (Figura 18D, panel inferior). Para controlar la introducción de CAS9-sgARN en las células, desarrollamos líneas de células indicadoras que tienen una construcción lentiviral integrada estable con 20 nnts de secuencia diana AAVS1 acoplada a un gen tdtomato silencioso fuera de marco (Figura 18E). La introducción exitosa, mediada por Cas9-sgARN, de una deleción de desplazamiento de marco en sentido ascendente del gen tdTomato restaurará el marco de lectura del informador tdTomato y permitirá el análisis de la eficacia de la focalización (Figura 18F). Las células informadoras KBM7 se transdujeron con la proteína Cas9 junto con el correspondiente ARNg de AAVS1 en el objetivo. Después de la primera ronda de transducción de Cas9-sgARN, el 30% de las células informadoras KBM7 restablecieron la expresión de la proteína tdtomato (Figura 18F, panel superior). Después de una segunda ronda de transducción de Cas9-sgARN, el 56% de las células KBM7 expresaron el informador tdtomato. Como control de especificidad, las células informadoras KMB7 se transdujeron con proteína Cas9 y sgARN fuera del objetivo con 2 sustituciones de nucleótidos en comparación con la secuencia objetivo de AAVS1 (Figura 18F, panel superior). Como se muestra en la figura 18F, los sgARN fuera del objetivo no activaron el informador tdtomato. Juntos, nuestros datos demuestran que nuestro tampón de osmocitosis permite la transducción en tándem eficiente de proteínas y ARN, y permite la edición de genes altamente eficiente y específica utilizando el sistema Cas9/CRISPR. Recientemente, se han informado varias variaciones del sistema Cas9/CRISPR, incluida una mayor especificidad mediante la introducción de nucleasas Fokl heterólogas [3, 4], análogos de Cas alternativos de diferentes especies [5] o sistemas de orientación alternativos basados en otros complejos inmunes bacterianos como el sistema de cascada [6] o proteínas de argonauta bacterianas (revisado en: [7]). Hemos demostrado que nuestro sistema de osmocitosis permite la introducción eficiente de proteínas de edición de genes o complejos de proteína-nucleótido en células de mamífero (madre), como lo demuestra nuestra transducción exitosa de proteínas TALEN recombinantes y proteína Cas9 recombinante junto con su pequeño ARN guía. Se espera que nuestro sistema de transducción también permita la introducción eficiente de otras proteínas de edición de genes o complejos de proteínas (como los mencionados anteriormente).
[0377] Puesto que se utilizó un sistema reportero lentiviral para medir la transducción CAS9/sgARN, es probable que cada célula contiene múltiples copias del reportero, que pueden distorsionar la eficacia de transducción percibida. Para obtener una estimación precisa de la eficiencia de focalización mediada por osmocitosis CRISPR-Cas9, y para demostrar que este sistema también se puede utilizar para modular genes endógenos, probamos la capacidad de nuestro sistema de transducción de proteínas de edición de genes para modificar un gen endógeno WDR85 (DPH7). Las células knockout WDR85 son resistentes a la muerte celular inducida por la toxina diftérica, lo que proporciona un ensayo simple y confiable para medir el knockout exitoso del gen bialélico. Las células diploides KBM7 se transdujeron dos veces con proteína Cas9 y 6 ARNsg diferentes contra el gen WDR85 (Figura 19A). 7 días después de la segunda transducción de proteína Cas9/sgARN (para permitir que la eliminación del gen se vuelva eficaz a nivel de proteína), las células se trataron con toxina diftérica durante 48 h. La supervivencia celular se observó solo en células transducidas con proteína Cas9 y ARNsg WDR85, mientras que no se detectaron células viables en células KBM7 de tipo salvaje tratadas con toxina diftérica o en células transducidas con proteína Cas9 con ARNsg fuera del objetivo (Figura 19b ). Los diferentes sgARN mostraron diferentes eficiencias en la eliminación de WDR85. 4 de 6 sgARN dieron tasas de supervivencia celular particularmente altas (Figura 19B, gráfico de barras). Dado que las células KBM7 utilizadas en este experimento eran diploides, esto significa que en las células supervivientes se eliminó el WDR85 endógeno en ambos alelos. El análisis de la secuencia de ADN se realizó en un conjunto de células resistentes a la toxina de la difteria transducidas con los diferentes ARNg WDR85 y la proteína CAS9. Observamos para cada sgARN de WDR85 un 100% de alteración del gen (Figura 19C), lo que confirma que las células resistentes a la toxina de la difteria eran Knockout del gen WDR85.
[0378] Para estimar con precisión la frecuencia de desactivación, transducimos células KMB7 con proteína CAS9 y los diferentes sgARN de WDR85. 4 días después, realizamos la clasificación de células individuales en placas de 384 pocillos y después de una semana identificamos los clones que sobrevivieron al procedimiento de clasificación de células individuales. A continuación, estos clones se trataron durante 48 h con toxina diftérica. Se contaron los clones restantes permitiéndonos determinar el porcentaje de clones resistentes a la toxina diftérica, en los que ambos alelos de WDR85 fueron eliminados, estimando así la eficiencia para producir células knockout WDR85. Como antes, los diferentes sgARN demostraron diferentes eficiencias en la generación de knockouts de WDR85, que van desde el 10-70% del knockout bialélico (figura 19D). Secuenciamos el sitio diana CAS/CRIPSR en 3 clones de células individuales para los cuatro sgARN que fueron altamente eficientes para confirmar que los clones supervivientes de la toxina ditheria contenían de hecho una alteración del gen WDR85 bialélico. Como se muestra en la figura 19D, los clones resistentes a la difteria demostraron de hecho una alteración del gen WDR85 bialélico. La eficiencia de generar knockouts bialélicos por osmocitosis de proteína Cas9 recombinante y sgARN es mucho mayor de lo que se informó anteriormente [2], lo que demuestra que este método permite la generación no viral altamente eficiente de mutaciones génicas dirigidas en células humanas.
[0379] En todos estos métodos de glicina 15 mM y glicerol 30 mM fueron incluidos en el tampón de transducción como osmoprotectores.
[0380] Se observó un efecto significativo de la supervivencia celular usando la proteína inhibidora de interferón "B18R" cuando transducimos ARN o ADN en las células (Nat Protoc 2013 Mar; 8 (3): 568-82 doi: 10,1038/nprot,2013.019. Epub 21 de febrero de 2013. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Mandal PK1, Rossi DJ.). En resumen, las células se incubaron con 250 ng/ml de proteína B18R 3 h antes de la transducción, durante la transducción y 48 h después de la transducción. En los últimos años, se han desarrollado dos sistemas de edición

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Un método in vitro para transducir una proteína, un ácido nucleico o una combinación de los mismos en una célula, en donde el método comprende poner en contacto dicha célula con la proteína, un ácido nucleico o una combinación de los mismos y un tampón de transducción, en donde el tampón de transducción comprende (i) un compuesto de transducción y (ii) una sal seleccionada entre una sal de sodio, litio, potasio, cesio o rubidio; en donde el compuesto de transducción
a. tiene la fórmula general:
Figure imgf000065_0001
en donde:
X se selecciona de NR1R2, NR1R2R3+, OH y COOR4;
Y se selecciona de SO3H, SO3, COO-, CONH2, COOR12, CONR5R6, tetrazol, OH, NR10 R11 y H;
n es 3, 4, 5 o 6;
R1, R2y R3, se seleccionan cada uno independientemente de H, C1-6 alquilo, C5-10 arilo, C6-15 aralquilo, COR9; C1-6 alquilo, C5-10 arilo y C6-15 aralquilo puede estar opcionalmente sustituido con RY, OH o COOH; o R1 y R2 pueden unirse con el nitrógeno al que están unidos para formar heterociclilo;
o cuando X es NR1R2R3+, R3 puede estar ausente y R1 y R2 pueden unirse con el nitrógeno al que están unidos para formar heteroarilo;
R4, R5, R6, R9, R10, R11, R12 se seleccionan independientemente entre H y C1-6 alquilo;
R7 y R8 se seleccionan independientemente entre H, C1-6 alquilo y OH;
heterociclilo es un anillo monocíclico que está saturado o parcialmente insaturado, que contiene cuando es posible 1 o 2 miembros del anillo seleccionados independientemente entre N, NR13, NR13R14+ y O, y 2 a 5 átomos de carbono;
el heterociclilo puede estar opcionalmente sustituido con C1-C6 alquilo, ácido carboxílico C1-C6 o C1-C6 alquilo sustituido con RY;
heteroarilo es un anillo aromático de 5 o 6 miembros que contiene, cuando sea posible, 1, 2 o 3 miembros del anillo seleccionados independientemente entre N, NR13, NR13R14+ y O;
el heteroarilo puede estar opcionalmente sustituido con C1-C6 alquilo, ácido carboxílico C1-C6 o C1-C6 alquilo sustituido con RY;
R13 y R14 se seleccionan independientemente de H, C1-6 alquilo, ácido carboxílico C1-C6 y C1-C6 alquilo sustituido con RY;
alquilo es un hidrocarburo saturado lineal o ramificado;
RY se selecciona de SO3H, SO3, COO, CONH2, COOR12, CONR5R6, tetrazol, OH y NR10 R11;
Ácido carboxílico C1-6 significa -COOH o una cadena de C1-5 alquilo sustituida con COOH y tautómeros, solvatos, iones híbridos y sales de los mismos; o
b. tiene la fórmula general:
Figure imgf000065_0002
en donde R1 es metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo o hexilo;
R2 es metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo o hexilo;
R3 es metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo o hexilo;
R- es SO3" o COO - o POO- y
n es 3-6, es decir, 3, 4, 5 o 6.
2. El método in vitro de la reivindicación 1, en donde el compuesto de transducción tiene la fórmula general:
Figure imgf000065_0003
en donde
X es seleccionado de NR1R 2 y NR1R2R3+;
Y se selecciona de SO3H, SO3, COO-, CONH2, COOR12 y CONR5R6;
R1, R2y R3, se seleccionan cada uno independientemente entre H y C1-6 alquilo que puede estar opcionalmente sustituido con OH o COOH; o R1 y R2 pueden unirse con el nitrógeno al que están unidos para formar heterociclilo, preferiblemente piperidina, piperazina o morfolina, que pueden estar opcionalmente sustituidos; o cuando X es NR1R2R3+, R3 puede estar ausente y R1 y R2 pueden unirse con el nitrógeno al que están unidos para formar heteroarilo, preferiblemente piridilo, que puede estar opcionalmente sustituido; y todos los demás grupos son como se definieron en la fórmula I anterior.
3. El método in vitro de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el compuesto de transducción:
(a) contiene un grupo de nitrógeno cuaternario y en donde el nitrógeno cuaternario es parte de una estructura de anillo alifático o aromático;
(b) es un compuesto de fórmula I o II en donde X es
Figure imgf000066_0001
Z se selecciona entre C(R15)2, NR13, NR13R14+ y O;
cada R15 se selecciona independientemente de H, C1-6 alquilo, ácido carboxílico C1-C6 y C1-C6 alquilo sustituido con RY;
R3 se selecciona de H, C1-6 alquilo, C5-10 arilo, C6-15 aralquilo, COR9 *; C1-6 alquilo, C5-10 arilo y C6-15 aralquilo puede estar opcionalmente sustituido con RY, OH o COOH, R preferiblemente 3 es -C H 3;
R13 y R14 se seleccionan independientemente entre H, C1-6 alquilo, ácido carboxílico C1-C6 y C1-C6 alquilo sustituido con RY; y/o
(c) se selecciona de los compuestos 01-06, 08, 10-12, 14-17, 20-31 y 34-46 en la Tabla 1.
4. El método in vitro de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el tampón de transducción comprende además un osmoprotector seleccionado de glicina, histidina, alanina, isoleucina, arginina, asparagina, leucina, ácido aspártico, lisina, ácido glutámico, cisteína, metionina, fenilalanina, glutamina, treonina, triptófano, prolina, valina, omitina, serina, tirosina y prolina.
5. El método in vitro de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde:
el tampón de transducción comprende además un osmoprotector seleccionado entre glicina y/o glicerol; el tampón de transducción comprende además un osmoprotector a una concentración de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 500 mM;
el tampón de transducción tiene una osmolalidad de al menos 300 mOsm/kg;
el compuesto de transducción está a una concentración de entre aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 500 mM; y/o
en donde la sal es cloruro de sodio.
6. El método in vitro de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el tampón de transducción comprende además: un tampón de pH biológico, tal como PBS, TES o HEPES; un potenciador de la viscosidad, como polivinilpirrolidona (PVP); un inhibidor de la vía de respuesta al interferón; y/o un factor de crecimiento, por ejemplo seleccionado entre EGF, FGF, HGF, BDNF, PDGF, VEGF o IGF, o cualquier combinación de los mismos.
7. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el tampón de transducción comprende NDSB-201 como compuesto de transducción, y preferiblemente comprende además GABA como compuesto de transducción.
8. El método in vitro de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el tampón de transducción comprende: (i) NDSB-201 y GABA como compuestos de transducción; (ii) cloruro de sodio como sal; y preferiblemente (iii) glicina y/o glicerol como osmoprotector; y en donde la osmolalidad del tampón de transducción es al menos 300 mOsm/kg.
9. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el tampón de transducción comprende además un activador/potenciador de un transportador de sodio-hidrógeno, en donde dicho activador/potenciador es un factor de crecimiento.
10. Un tampón de transducción como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad genética, donde dicho método comprende modificar un ácido nucleico, tal como una secuencia genética, en una célula, donde el método comprende poner en contacto dicha célula con una proteína capaz de modificar un ácido nucleico y el tampón de transducción.
11. El tampón de transducción para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la proteína capaz de modificar un ácido nucleico se dirige inherentemente a una secuencia diana específica, por ejemplo, en donde la proteína es una nucleasa con dedos de zinc o un TALEN, Cas9, un análogo de Cas9, una proteína asociada a nucleasa Fokl dirigida al ADN, un complejo Cascade, una proteína TtAgo u otra proteína Argonaute.
12. El tampón de transducción para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, en donde la célula se pone en contacto además con una molécula guía para dirigir la proteína a una secuencia genética diana.
13. El tampón de transducción para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde el tampón de transducción comprende además un activador/potenciador de un transportador de sodio-hidrógeno, en donde dicho activador/potenciador es un factor de crecimiento.
14. Un tampón de transducción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la osmolalidad del tampón de transducción es al menos 650 mOsm/kg.
15. Una composición farmacéutica que comprende el tampón de transducción de la reivindicación 14.
16. La composición farmacéutica de la reivindicación 15, para uso en terapia o diagnóstico.
17. Uso de glicina y/o glicerol en un método para transducir una proteína, un ácido nucleico o una combinación de los mismos en una célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
18. Uso de un compuesto de transducción seleccionado entre los compuestos 01-06, 08, 10-12, 14-17, 20-31 y 34-46 en la Tabla 1 para la transducción de una proteína, un ácido nucleico o una combinación de los mismos en una célula, en donde el método es según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
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Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3613852A3 (en) 2011-07-22 2020-04-22 President and Fellows of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US20150166985A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting von willebrand factor point mutations
CA2956224A1 (en) 2014-07-30 2016-02-11 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
CN104962523B (zh) * 2015-08-07 2018-05-25 苏州大学 一种测定非同源末端连接修复活性的方法
US20190225955A1 (en) 2015-10-23 2019-07-25 President And Fellows Of Harvard College Evolved cas9 proteins for gene editing
DK3377618T3 (da) * 2015-11-19 2020-12-21 Univ Pennsylvania Buffere til stabilisering af lentivirus-præparater
GB201521101D0 (en) 2015-11-30 2016-01-13 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Transduction buffer
EP3448407A4 (en) * 2016-04-29 2019-10-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. DIMERE PROTEINS FOR SPECIFIC TARGETING OF NUCLEIC ACID SEQUENCES
WO2018027078A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 President And Fellows Of Harard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
AU2017308889B2 (en) 2016-08-09 2023-11-09 President And Fellows Of Harvard College Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
JP6829761B2 (ja) * 2016-09-29 2021-02-10 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 遺伝子編集モジュールおよび遺伝子送達アプローチを解析および最適化するための方法
KR20240007715A (ko) 2016-10-14 2024-01-16 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵염기 에디터의 aav 전달
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
WO2018165629A1 (en) 2017-03-10 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
IL269458B2 (en) 2017-03-23 2024-02-01 Harvard College Nucleic base editors that include nucleic acid programmable DNA binding proteins
CN106967686B (zh) * 2017-03-31 2019-11-08 北昊干细胞与再生医学研究院有限公司 软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法及人源组织工程化再生软骨
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
EP3697906A1 (en) 2017-10-16 2020-08-26 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
CN107988267A (zh) * 2017-12-18 2018-05-04 赛业（苏州）生物科技有限公司 一种高通量对受精卵进行基因编辑的电转方法
AU2019270977A1 (en) * 2018-05-14 2020-12-03 Roosterbio, Inc. Methods and compositions related to extracellular material derived from hypertonic cell solutions
CN108893539B (zh) * 2018-06-08 2021-11-19 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 猪肉质性状相关的circRNA及其应用
KR20210097122A (ko) 2018-11-30 2021-08-06 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 용액을 사용한 약물 송달계
MX2021011426A (es) 2019-03-19 2022-03-11 Broad Inst Inc Metodos y composiciones para editar secuencias de nucleótidos.
GB201915346D0 (en) * 2019-06-21 2019-12-04 Lumiradx Tech Ltd Improvements in or relating to nicking enzymes
JP2023525304A (ja) 2020-05-08 2023-06-15 ザ ブロード インスティテュート，インコーポレーテッド 標的二本鎖ヌクレオチド配列の両鎖同時編集のための方法および組成物
EP4367254A1 (en) 2021-07-07 2024-05-15 Ntrans Technologies BV Transduction buffer
WO2023224112A1 (ja) * 2022-05-20 2023-11-23 株式会社ダイセル 液状医薬組成物

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5627159A (en) 1994-10-27 1997-05-06 Life Technologies, Inc. Enhancement of lipid cationic transfections in the presence of serum
FR2732895B1 (fr) 1995-04-11 1997-05-16 Pasteur Merieux Serums Vacc Utilisation d'un compose amphipathique cationique comme agent de transfection, comme adjuvant de vaccin, ou comme medicament
LV11728B (en) 1995-08-21 1997-08-20 Kalvins Ivars Pharmaceutical composition
US6258792B1 (en) 1996-04-12 2001-07-10 University Of Pittsburgh Cationic cholesteryl derivatives containing cyclic polar groups
WO1999021591A1 (en) 1997-10-28 1999-05-06 American Home Products Corporation Compositions and methods for delivery of genetic material
WO1999059571A1 (en) * 1998-05-15 1999-11-25 Neurochem, Inc. Use of amyloid inhibitors for modulating neuronal cell death
US6124207A (en) 1998-08-31 2000-09-26 Micron Technology, Inc. Slurries for mechanical or chemical-mechanical planarization of microelectronic-device substrate assemblies, and methods and apparatuses for making and using such slurries
JP2000143486A (ja) 1998-11-12 2000-05-23 Lion Corp 皮膚外用剤
EP1046394A3 (en) 1999-04-19 2001-10-10 ImaRx Pharmaceutical Corp. Novel compositions useful for delivering compounds into a cell
DE19956772A1 (de) 1999-11-25 2001-06-07 Basf Ag Verwendung von y-Butyrobetain Salzen zur Herstellung von Zubereitungen für die menschliche und tierische Ernährung
WO2001072280A2 (en) 2000-03-24 2001-10-04 Biosphere Medical Inc. Microspheres for gene therapy
AU2001259760B2 (en) * 2000-05-12 2006-10-05 Northwest Biotherapeutics, Inc. Method to increase class I presentation of exogenous antigens by human dendritic cells
SI21639A (sl) * 2003-12-23 2005-06-30 LEK farmacevtska dru�ba d.d. Farmacevtski pripravek, ki vsebuje nemicelarne sulfobetaine
JP2008535771A (ja) 2004-12-14 2008-09-04 アプレラ コーポレイション カチオン性リポソームおよびその使用方法
US8143236B2 (en) * 2005-12-13 2012-03-27 Bionumerik Pharmaceuticals, Inc. Chemoprotective methods
AU2008211854C1 (en) 2007-01-29 2014-01-23 Procell Therapeutics Inc. Novel macromolecule transduction domains and methods for identification and uses thereof
CN101889091B (zh) 2007-06-07 2014-02-19 加拿大农业及农业食品部 基于纳米载体的植物转染和转导
EP2282724B1 (en) 2008-05-23 2018-09-05 The University Of British Columbia Modified drugs for use in liposomal nanoparticles
US8381290B2 (en) 2009-07-17 2013-02-19 Exelis Inc. Intrusion detection systems and methods
CN103155270B (zh) * 2010-10-12 2014-11-12 横滨橡胶株式会社 光电转换元件用电解质以及使用该电解质的光电转换元件和染料敏化太阳能电池
CZ201181A3 (cs) 2011-02-15 2012-09-12 Ústav organické chemie a biochemie Akademie ved CR, v.v.i. Deriváty pregnanolonu substituované v poloze 3alfa kationickou skupinou, zpusob jejich výroby, jejich použití a prostredek je obsahující
WO2013000876A1 (en) * 2011-06-27 2013-01-03 Intervet International B.V. An aqueous composition comprising a biological antigen and an acrylic acid polymer
AU2012352095A1 (en) * 2011-12-15 2014-06-12 Dow Agrosciences Llc Method for improved transformation using Agrobacterium
WO2014153470A2 (en) * 2013-03-21 2014-09-25 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of t cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
US9526784B2 (en) * 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
CA2928199A1 (en) * 2013-11-05 2015-05-14 Bavarian Nordic A/S Combination therapy for treating cancer with a poxvirus expressing a tumor antigen and an antagonist and/or agonist of an immune checkpoint inhibitor
GB201521101D0 (en) 2015-11-30 2016-01-13 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Transduction buffer

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