ES2864758T3 - Agentes lanzadera basados en polipéptidos para mejorar la eficiencia de transducción de cargas polipeptídicas al citosol de células eucariotas objetivo, usos de los mismos, métodos y kits relacionados con los mismos - Google Patents

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Abstract

Un agente lanzadera basado en polipéptidos que comprende un dominio de fuga endosomal (ELD) unido operativamente a un dominio de penetración celular (CPD), o un ELD unido operativamente a un dominio rico en histidina y un CPD, para su uso en un método clínico o terapéutico in vivo para aumentar la eficiencia de transducción de una carga polipeptídica independiente al citosol de células eucariotas objetivo, en donde la carga es un polipéptido biológicamente activo, y en donde el agente lanzadera basado en polipéptidos tiene una carga neta predicha de al menos +6 a pH fisiológico y se usa a una concentración suficiente para aumentar la eficacia de transducción de la carga polipeptídica independiente al citosol de la célula eucariota objetivo.

Description

DESCRIPCIÓN
Agentes lanzadera basados en polipéptidos para mejorar la eficiencia de transducción de cargas polipeptídicas al citosol de células eucariotas objetivo, usos de los mismos, métodos y kits relacionados con los mismos
La presente descripción se refiere a péptidos sintéticos y agentes lanzadera basados en polipéptidos que comprenden un dominio de fuga endosomal (ELD) unido operativamente a un dominio de penetración celular (CPD) o un ELD unido operativamente a un dominio rico en histidina y un CPD, para su uso en un método para aumentar la eficiencia de transducción de cargas polipeptídicas al citosol de células eucariotas objetivo. También se proporciona un método in vitro para aumentar la eficacia de transducción de cargas polipeptídicas al citosol de células eucariotas objetivo.
Antecedentes
Las tecnologías de suministro celular para transportar moléculas grandes al interior de las células eucariotas tienen una amplia gama de aplicaciones, particularmente en la industria biofarmacéutica. Mientras que algunas sustancias químicas solubles (por ejemplo, fármacos de moléculas pequeñas) pueden difundirse pasivamente a través de la membrana de las células eucariotas, cargas más grandes (por ejemplo, biológicos, polinucleótidos y polipéptidos) requieren la ayuda de agentes lanzadera para alcanzar sus objetivos intracelulares.
Un área que se beneficiaría enormemente de los avances en las tecnologías de suministro celular es el campo de la terapia celular, que ha dado enormes saltos en las últimas dos décadas. Descifrar los diferentes factores de crecimiento y señales moleculares que gobiernan la expansión, diferenciación y reprogramación celular abre la puerta a muchas posibilidades terapéuticas para el tratamiento de necesidades médicas insatisfechas. Por ejemplo, la inducción de células madre pluripotentes directamente a partir de células adultas, la conversión celular directa (transdiferenciación) y la edición del genoma (tecnologías de nucleasas de dedos de zinc, TALEN™ y CRISPR/Cas9) son ejemplos de métodos que se han desarrollado para maximizar el valor terapéutico de las células para aplicaciones clínicas. Actualmente, la producción de células con alta actividad terapéutica requiere generalmente manipulaciones ex vivo, logradas principalmente mediante transducción viral, lo que genera importantes preocupaciones económicas y de seguridad para aplicaciones humanas. La capacidad de suministrar directamente proteínas activas, tales como factores de transcripción o nucleasas artificiales, al interior de estas células, puede eludir de manera ventajosa las preocupaciones de seguridad y los obstáculos regulatorios asociados con métodos de transferencia de genes más riesgosos.
A este respecto, los agentes de transducción basados en polipéptidos pueden ser útiles para introducir proteínas recombinantes purificadas directamente en las células objetivo, por ejemplo, para ayudar a evitar preocupaciones de seguridad con respecto a la introducción de ADN extraño. Existen agentes de transducción basados en lípidos o polímeros catiónicos, pero introducen problemas de seguridad con respecto a la toxicidad química y la eficiencia, lo que dificulta su uso en terapia humana. Los enfoques de transducción de proteínas que implican la fusión de una carga de proteína recombinante directamente con un péptido de penetración celular (por ejemplo, proteína transactivadora TAT del VIH) requieren grandes cantidades de la proteína recombinante y, a menudo, no logran suministrar la carga a la ubicación subcelular apropiada, lo que conduce a un atrapamiento endosomal masivo y a la eventual degradación. Se han desarrollado varios péptidos disruptores de la membrana endosomal para intentar facilitar el escape de cargas atrapadas endosomalmente al citosol. Sin embargo, muchos de estos péptidos endosomolíticos están destinados a aliviar el atrapamiento endosomal de cargas que ya se han suministrado intracelularmente, y no ayudan por sí mismos en la etapa inicial de transportar las cargas intracelularmente a través de la membrana plasmática (Salomone y otros, 2012; Salomone y otros, 2013; Erazo-Oliveras y otros, 2014; Fasoli y otros, 2014). Por lo tanto, existe la necesidad de agentes lanzadera mejorados capaces de aumentar la eficacia de transducción de cargas polipeptídicas y de suministrar las cargas al citosol de las células eucariotas objetivo.
Breve resumen de la invención
La presente invención surge del sorprendente descubrimiento de que los péptidos sintéticos que comprenden un dominio de fuga endosomal (ELD) unido operativamente a un dominio de penetración celular (CPD) y, opcionalmente, a un dominio rico en histidina, tienen la capacidad de aumentar la proporción de células que pueden transducirse con una carga polipeptídica de interés, sin que el péptido sintético esté unido covalentemente a la carga polipeptídica. Tras una transducción exitosa, los péptidos sintéticos pueden facilitar la capacidad de las cargas polipeptídicas atrapadas endosomalmente para obtener acceso al citosol y, opcionalmente, dirigirse a diversos compartimentos subcelulares (por ejemplo, el núcleo).
En consecuencia, la presente invención se refiere a los siguientes aspectos:
(1)Un agente lanzadera basado en polipéptidos que comprende un dominio de fuga endosomal (ELD) unido operativamente a un dominio de penetración celular (CPD) o un ELD unido operativamente a un dominio rico en histidina y un CPD, para su uso en un método clínico o terapéutico in vivo para aumentar la eficiencia de transducción de una carga polipeptídica independiente al citosol de una célula eucariota objetivo, en donde la carga es un polipéptido biológicamente activo, y en donde el agente lanzadera basado en polipéptidos tiene una carga neta predicha de al menos 6 a pH fisiológico y se usa a una concentración suficiente para aumentar la eficiencia de transducción de la carga polipeptídica independiente en el citosol de la célula eucariota objetivo. (2) Un método in vitro para aumentar la eficiencia de transducción de una carga polipeptídica independiente al citosol de las células eucariotas objetivo, el método comprende poner en contacto las células eucariotas objetivo con un agente lanzadera basado en polipéptidos que comprende un dominio de fuga endosomal (ELD) unido operativamente a un dominio de penetración celular (CPD), o un ELD unido operativamente a un dominio rico en histidina y un CPD, en donde el agente lanzadera basado en polipéptidos tiene una carga neta predicha de 6 a pH fisiológico y se usa a una concentración suficiente para aumentar la eficiencia de transducción de la carga polipeptídica independiente al citosol de la célula eucariota objetivo.
(3) El agente lanzadera basado en polipéptidos de (1) o el método in vitro de (2), en donde el agente lanzadera basado en polipéptidos: (a) comprende una longitud mínima de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 residuos de aminoácidos y una longitud máxima de 35, 40, 45, 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 o 150 residuos de aminoácidos; (b) tiene una carga neta predicha de al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 a pH fisiológico; (c) es soluble en solución acuosa; o (d) cualquier combinación de (a) a (c).
(4) El agente lanzadera basado en polipéptidos de (1) o (3) o el método in vitro de (2), en donde: (a) el ELD es o es de: un péptido endosomolítico; un péptido antimicrobiano (AMP); un péptido antimicrobiano catiónico lineal alfa-helicoidal; un péptido híbrido Cecropina-A/Melitina (serie CM); péptido activo de membrana dependiente del pH (PAMP); un péptido anfífilo; un péptido derivado del extremo N de la subunidad HA2 de la hemaglutinina (HA) de la influenza; CM18; dominio T de la toxina diftérica (DT); GALA; PEA; INF-7; LAH4; HGP; H5WYG; HA2; EB1; VSVG; toxina de Pseudomonas; melitina; KALA; JST-1; C(LLKK)3C; G(LLKK)3G; o cualquier combinación de los mismos; (b) el CPD es o es de: un péptido de penetración celular o el dominio de transducción de proteínas de un péptido de penetración celular; TAT; PTD4; penetratina (Antennapedia); pVEC; M918; Pep-1; Pep-2; Xentry; tramo de arginina; transportano; SynB1; SynB3; o cualquier combinación de los mismos; (c) el dominio rico en histidina es un tramo de al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 6 aminoácidos que comprenden al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 % o al menos 90 % de residuos de histidina; y/o comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8 o al menos 9 residuos de histidina consecutivos; o (d) cualquier combinación de (a) a (c).
(5) El agente lanzadera basado en polipéptidos de cualquiera de (1), (3) o (4) o el método in vitro de (2) a (4), en donde el agente lanzadera basado en polipéptidos comprende: (a) un ELD que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-15, 63 o 64, o una variante o fragmento de la misma que tiene actividad endosomolítica; (b) un CPD que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 16-27 o 65, o una variante o fragmento de la misma que tiene actividad de penetración celular; (c) un dominio rico en histidina que tiene al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 6 residuos de histidina consecutivos; (d) de cualquier combinación de (a) a (c).
(6) El agente lanzadera basado en polipéptidos de cualquiera de (1) o (3) a (5), o el método in vitro de cualquiera de (2) a (5) en donde los dominios se unen operativamente mediante uno o más dominios enlazadores.
(7) El agente lanzadera basado en polipéptidos de cualquiera de (1) o (3) a (6), o el método in vitro de cualquiera de (2) a (6) en donde el agente lanzadera basado en polipéptidos comprende: (a) un ELD que es CM18, KALA o C(LLKK)3C que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 14 o 63, o una variante de la misma que tiene al menos 85 %, 90 % o 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 y que tiene actividad endosomolítica; (b) un CPD que es TAT o PTD4 que tiene la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 17 o 65, o una variante de la misma que tiene al menos 85 %, 90 % o 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 17 o 65, y que tiene actividad de penetración celular; o penetratina que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, o una variante de la misma que tiene al menos 85 %, 90 % o 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 18 y que tiene actividad de penetración celular; (c) un dominio rico en histidina que comprende al menos 6 residuos de histidina consecutivos; o (d) cualquier combinación de (a) a (c).
(8) El agente lanzadera basado en polipéptidos de cualquiera de (1) o (3) a (7) o el método in vitro de cualquiera de (2) a (7) en donde el agente lanzadera basado en polipéptidos comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 57-59, 66-73 u 82-102, o una variante funcional de la misma que tiene al menos 85 %, 90 % o 95 % de identidad con cualquiera de SEQ ID NOs: 57-59, 66-73 u 82-102.
(9) El agente lanzadera basado en polipéptidos de cualquiera de (1) o (3) a (8) o el método in vitro de cualquiera de (2) a (8), en donde la carga polipeptídica: (a) carece de un CPD o un CPD como se define en (4)(b); (b) es una proteína recombinante; (c) comprende un dominio de direccionamiento subcelular; (d) forma un complejo con una molécula de ADN y/o ARN; o (e) cualquier combinación de (a) a (d).
(10) El agente lanzadera basado en polipéptidos o método de (9), en donde el dominio de direccionamiento subcelular es: (a) una señal de localización nuclear (NLS); (b) una secuencia señal nucleolar; (c) una secuencia señal mitocondrial; o (d) una secuencia señal de peroxisoma.
(11) El agente lanzadera basado en polipéptidos o método de (10), en donde: (a) la NLS es de: E1a, T-Ag, cmyc, T-Ag, op-T-NLS, Vp3, nucleoplasmina, histona 2B, N1 de Xenopus, PARP, PdX-1, QKI-5, HCDA, H2B, v-Rel, Amida, RanBP3, Pho4p, LEF-1, TCF-1, BDV-P, TR2, SOX9 o Max; (b) la secuencia señal nucleolar es de BIRC5 o RECQL4; (c) la secuencia señal mitocondrial es de Tim9 o de la subunidad IV de la citocromo c oxidasa de levadura; o (d) la secuencia señal del peroxisoma es de PTS1.
(12) El agente lanzadera basado en polipéptidos o el método de cualquiera de (2) a (11), en donde la carga polipeptídica es un factor de transcripción, una nucleasa, una citocina, una hormona, un factor de crecimiento o un anticuerpo.
(13) El agente lanzadera basado en polipéptidos o método de (12), en donde: (a) el factor de transcripción es: HOXB4, NUP98-HOXA9, Oct3/4, Sox2, Sox9, Klf4, c-Myc, MyoD, Pdx1, Ngn3, MafA, Blimp-1, Eomes, T-bet, FOXO3A, NF-YA, SALL4, ISL1, FoxA1, Nanog, Esrrb, Lin28, HIF1-alpha, Hlf, Runx1t1, Pbx1, Lmo2, Zfp37, Prdm5, Bcl-6 o cualquier combinación de los mismos; y/o la nucleasa es: una endonucleasa guiada por ARN, una endonucleasa CRISPR, una endonucleasa CRISPR tipo I, una endonucleasa CRISPR tipo II, una endonucleasa CRISPR tipo III, una endonucleasa CRISPR tipo IV, una endonucleasa CRISPR tipo V, una endonucleasa CRISPR tipo VI, proteína 9 asociada a CRISPR (Cas9), Cpf1, una nucleasa de dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN), una endonucleasa autodirigida, una meganucleasa o cualquier combinación de las mismas.
(14) El agente lanzadera basado en polipéptidos o el método de cualquiera de (1) a (13), para aumentar la eficiencia de transducción de una carga polipeptídica al citosol de células eucariotas objetivo destinadas a su uso en terapia celular, edición del genoma, transferencia celular adoptiva, y/o medicina regenerativa.
(15) El agente lanzadera basado en polipéptidos o el método de cualquiera de (1) a (14), en donde la célula eucariota objetivo es una célula madre, una célula primaria, una célula inmunitaria, una célula T o una célula dendrítica.
(16) Un péptido sintético que comprende un dominio de fuga endosomal (ELD) unido operativamente a un dominio de penetración celular (CPD), o un ELD unido operativamente a un dominio rico en histidina y un CPD, en donde el péptido sintético es el agente lanzadera basado en polipéptidos como se define en cualquiera de (1) o (3) a (15) y en donde el CPD es o es de: PTD4, penetratina (Antennapedia); pVEC; M918; Pep-1; Pep-2; Xentry; tramo de arginina; transportano; SynB1; SynB3; o cualquier combinación de los mismos, y en donde el agente lanzadera basado en polipéptidos tiene una carga neta predicha de al menos 6 a pH fisiológico.
En la presente descripción también se describe el método descrito en los puntos 1 a 30 más abajo:
1. Un método para aumentar la eficiencia de transducción de una carga polipeptídica independiente al citosol de una célula eucariota objetivo, dicho método comprende poner en contacto dicha célula eucariota objetivo con un péptido sintético y dicha carga polipeptídica independiente, en donde dicho péptido sintético:
(a) comprende un dominio de fuga endosomal (ELD), o una variante o fragmento del mismo que tiene actividad endosomolítica, unido operativamente a un dominio de penetración celular (CPD), en donde dicho ELD comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-15, 63 o 64;
(b) no está unido covalentemente a dicha carga polipeptídica independiente;
(c) tiene una longitud total de entre 20 y 100 residuos de aminoácidos;
(d) tiene una carga neta de al menos 6 a pH fisiológico; y
(e) es soluble en solución acuosa a pH fisiológico,
en donde dicho CPD permite el suministro intracelular de dicho péptido sintético, y dicho ELD permite el escape de la carga polipeptídica independiente atrapada endosomalmente al citosol de la célula eucariota objetivo. 2. El método del punto 1, en donde dicho péptido sintético tiene una longitud total de entre 20 y 70 residuos de aminoácidos.
3. El método del punto 1, en donde dicho CPD comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 16-27 o 65, o es una variante o fragmento de la misma que tiene actividad de penetración celular.
4. El método del punto 1, en donde dicho péptido sintético comprende además un dominio rico en histidina que consiste en un tramo de al menos 6 aminoácidos que comprende al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 % o al menos 90 % de residuos de histidina; y/o comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 6 residuos de histidina consecutivos.
5. El método del punto 1, en donde dicha variante de ELD o fragmento de ELD tiene al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-15, 63 o 64.
6. El método del punto 3, en donde dicha variante de CPD o fragmento de CPD tiene al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NOs: 16-27 o 65.
7. El método del punto 1, en donde dichos ELD y CPD se unen operativamente mediante uno o más dominios enlazadores.
8. El método del punto 1, en donde dicho péptido sintético se sintetiza químicamente sin un residuo de metionina N-terminal.
9. El método del punto 1, en donde el péptido sintético comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 57-59, 66-72 u 82-102, o una variante funcional de la misma que tiene al menos 70 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de identidad con cualquiera de las SEQ ID NOs: 57-59, 66-72 u 82-102.
10. El método del punto 1, en donde dicha carga polipeptídica independiente es una proteína recombinante que carece de CPD.
11. El método del punto 1, en donde dicha carga polipeptídica independiente es un factor de transcripción, una nucleasa, una citoquina, una hormona, un factor de crecimiento o un anticuerpo.
12. El método del punto 11, en donde:
(b) dicho factor de transcripción es: HOXB4, NUP98-HOXA9, Oct3/4, Sox2, Sox9, Klf4, c-Myc, MyoD, Pdx1, Ngn3, MafA, Blimp-1, Eomes, T-bet, FOXO3A, NF-YA, SALL4, ISL1, FoxA1, Nanog, Esrrb, Lin28, HIF1-alfa, Hlf, Runx1t1, Pbx1, Lmo2, Zfp37, Prdm5, Bcl-6 o cualquier combinación de los mismos; o
(b) dicha nucleasa es una endonucleasa guiada por ARN, una endonucleasa CRISPR, una endonucleasa CRISPR tipo I, una endonucleasa CRISPR tipo II, una endonucleasa CRISPR tipo III, una endonucleasa CRISPR tipo IV, una endonucleasa CRISPR tipo V, una endonucleasa CRISPR tipo VI, proteína 9 asociada a CRISPR (Cas9), Cpf1, una nucleasa de dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN), una endonucleasa autodirigida o una meganucleasa.
13. El método del punto 11, en donde dicha nucleasa es Cas9 o Cpf1.
14. El método del punto 13, en donde dicha nucleasa comprende además un ARN guía, un ARNcr, un ARNtracr o tanto un ARNcr como un ARNtracr.
15. El método del punto 1, en donde dicha carga polipeptídica independiente comprende una señal de localización nuclear o una señal de localización nuclear adicional.
16. El método del punto 15, en donde dicha carga polipeptídica independiente es un factor de transcripción o una nucleasa.
17. El método del punto 16, en donde:
(a) dicho factor de transcripción es: HOXB4, NUP98-HOXA9, Oct3/4, Sox2, Sox9, Klf4, c-Myc, MyoD, Pdx1, Ngn3, MafA, Blimp-1, Eomes, T-bet, FOXO3A, NF-YA, SALL4, ISL1, FoxA1, Nanog, Esrrb, Lin28, HIF1-alfa, Hlf, Runx1t1, Pbx1, Lmo2, Zfp37, Prdm5, Bcl-6 o cualquier combinación de los mismos; o
(b) dicha nucleasa es una endonucleasa guiada por ARN, una endonucleasa CRISPR, una endonucleasa CRISPR tipo I, una endonucleasa CRISPR tipo Ii, una endonucleasa CRISPR tipo III, una endonucleasa CRISPR tipo IV, una endonucleasa CRISPR tipo V, una endonucleasa CRISPR tipo VI, proteína 9 asociada a CRISPR (Cas9), Cpf1, una nucleasa de dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN), una endonucleasa autodirigida o una meganucleasa.
18. El método del punto 17, en donde dicha nucleasa es Cas9 o Cpf1.
19. El método del punto 18, en donde dicha nucleasa comprende además un ARN guía.
20. El método del punto 1, en donde dicha célula es una célula madre, una célula primaria, una célula inmunitaria, una célula T o una célula dendrítica.
21. Un método para aumentar la eficiencia de transducción de una carga polipeptídica independiente al citosol de una célula eucariota objetivo, dicho método comprende poner en contacto dicha célula eucariota objetivo con un péptido sintético y dicha carga polipeptídica independiente, en donde dicho péptido sintético:
(a) comprende un dominio de fuga endosomal (ELD) unido operativamente a un dominio de penetración celular (CPD), en donde dicho ELD es un péptido endosomolítico que es o se deriva de: un péptido antimicrobiano catiónico lineal alfa-helicoidal; un péptido híbrido Cecropina-A/Melitina (serie CM); péptido activo de membrana dependiente del pH (PAMP); un péptido anfífilo; un péptido derivado del extremo N de la subunidad HA2 de la hemaglutinina (Ha ) de la influenza; CM18; dominio T de la toxina diftérica (DT); GALA; PEA; INF-7; LAH4; HGP; H5WYG; HA2; EB1; VSVG; toxina de Pseudomonas; melitina; KALA; JST-1; C(LLKK)aC; o G(LLKK)aG;
(b) no está unido covalentemente a dicha carga polipeptídica independiente;
(c) tiene una longitud total de entre 20 y 100 residuos de aminoácidos;
(d) tiene una carga neta de al menos 6 a pH fisiológico; y
(e) es soluble en solución acuosa a pH fisiológico,
en donde dicho CPD permite el suministro intracelular de dicho péptido sintético, y dicho ELD permite el escape de la carga polipeptídica independiente atrapada endosomalmente al citosol de la célula eucariota objetivo.
22. El método del punto 21, en donde dicho CPD es o se deriva de: un péptido de penetración celular o el dominio de transducción de proteínas de un péptido de penetración celular; TAT; PTD4; penetratina (Antennapedia); pVEC; M918; Pep-1; Pep-2; Xentry; tramo de arginina; transportano; SynB1; SynB3; o cualquier combinación de los mismos.
23. El método del punto 21, en donde dicho péptido sintético comprende además un dominio rico en histidina que consiste en un tramo de al menos 3 aminoácidos que comprende al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 % o al menos 90 % de residuos de histidina; y/o comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 6 residuos de histidina consecutivos.
24. El método del punto 21, en donde dichos ELD y CPD se unen operativamente mediante uno o más dominios enlazadores.
25. El método del punto 21, en donde dicha carga polipeptídica independiente es un factor de transcripción, una nucleasa, una citocina, una hormona, un factor de crecimiento o un anticuerpo.
26. El método del punto 25, en donde dicho factor de transcripción es: HOXB4, NUP98-HOXA9, Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, MyoD, Pdx1, Ngn3, MafA, Blimp-1, Eomes, T-bet, FOXO3A, NF-YA, SALL4, ISL1, FoxA1, Nanog, Esrrb, Lin28, HIF1-alpha, Hlf, Runx1t1, Pbx1, Lmo2, Zfp37, Prdm5, Bcl-6 o cualquier combinación de los mismos.
27. El método del punto 25, en donde dicha nucleasa es una endonucleasa guiada por ARN, una endonucleasa CRISPR, una endonucleasa CRISPR tipo I, una endonucleasa CRISPR tipo II, una endonucleasa CRISPR tipo III, una endonucleasa CRISPR tipo IV, una endonucleasa CRISPR tipo V, una endonucleasa CRISPR tipo V i, proteína 9 asociada a CRISPR (Cas9), Cpf1, una nucleasa de dedos de zinc (ZFN), una nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (TALEN), una endonucleasa autodirigida o una meganucleasa.
28. El método del punto 25, en donde dicha nucleasa es Cas9 o Cpf1.
29. Un método para aumentar la eficiencia de transducción de una carga polipeptídica independiente al citosol de una célula eucariota objetivo, dicho método comprende poner en contacto dicha célula eucariota objetivo con un péptido sintético y dicha carga polipeptídica independiente que no está unida covalentemente a dicho péptido sintético, en donde dicho péptido sintético comprende un dominio de fuga endosomal (ELD) unido operativamente a un dominio de penetración celular, o un ELD unido operativamente a un CPD y un dominio rico en histidina, en donde:
(a) dicho ELD comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-15, 63 o 64;
(b) dicho CPD comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 16-27 o 65; y
(c) dicho dominio rico en histidina comprende al menos dos residuos de histidina consecutivos.
30. Un método para suministrar una proteína 9 asociada a CRISPR (Cas9) al núcleo de una célula eucariota objetivo, dicho método comprende poner en contacto dicha célula eucariota con una proteína recombinante Cas9 que comprende una señal de localización nuclear y un agente lanzadera de péptido sintético separado de menos de 100 residuos de longitud y que comprende un dominio de fuga endosomal (ELD) unido operativamente a un dominio de penetración celular, o un ELD unido operativamente a un CPD y un dominio rico en histidina, en donde:
(a) dicho ELD comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-15, 63 o 64;
(b) dicho CPD comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 16-27 o 65; y
(c) dicho dominio rico en histidina comprende al menos dos residuos de histidina consecutivos.
Definiciones generales
Los encabezados y otros identificadores, por ejemplo, (a), (b), (i), (ii), etc., se presentan simplemente para facilitar la lectura de la memoria descriptiva y las reivindicaciones. El uso de encabezados u otros identificadores en la memoria descriptiva o las reivindicaciones no requiere necesariamente que las etapas o elementos se realicen en orden alfabético o numérico o en el orden en que se presentan.
El uso de la palabra "un" o "una" cuando se usa junto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva puede significar "uno" pero también es consistente con el significado de "uno o más", "al menos uno" y "uno o más de uno".
El término "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye la desviación estándar del error para el dispositivo o método que se emplea para determinar el valor. En general, la terminología "aproximadamente" está destinada a designar una posible variación de hasta el 10 %. Por lo tanto, se incluye una variación de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 % de un valor en el término "aproximadamente". A menos que se indique lo contrario, el uso del término "aproximadamente" antes de un intervalo se aplica a ambos extremos del intervalo.
Como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones, las palabras "que comprende" (y cualquier forma de que comprende, tales como "comprender" y "comprende"), "que tiene" (y cualquier forma de que tiene, tales como "tener" y "tiene"), "que incluye" (y cualquier forma de que incluye, tales como "incluye" e "incluir") o "que contiene" (y cualquier forma de que contiene, tales como "contiene" y "contener") son inclusivas o abiertas y no excluyen elementos o etapas de métodos adicionales no mencionados.
Como se usa en la presente, "proteína" o "polipéptido" significa cualquier cadena de aminoácidos unida a péptido, que puede comprender o no cualquier tipo de modificación (por ejemplo, modificaciones postraduccionales tales como acetilación, fosforilación, glicosilación, sulfatación, sumoilación, prenilación, ubiquitinación, etc.).
Como se usa en la presente, la expresión "es o es de" o "es de" comprende variantes funcionales de un dominio proteico dado (CPD o ELD), tales como sustituciones, deleciones, modificaciones conservadoras de aminoácidos, así como también variantes o derivados de funciones, que no anulan la actividad del dominio proteico. Otros objetos, ventajas y características de la presente descripción resultarán más evidentes tras la lectura de la siguiente descripción no restrictiva de modalidades específicas de la misma, dadas a modo de ejemplo únicamente con referencia a los dibujos adjuntos.
Breve descripción de los dibujos
En los dibujos adjuntos:
La Figura 1 muestra un resultado típico de un ensayo de escape endosomal de calceína en el que las células HEK293A se cargaron con el tinte fluorescente calceína ("calceína 100 |j M") y después se trataron (o no) con un agente lanzadera que facilita el escape endosomal de la calceína ("calceína 100 |j M CM18-TAT 5 |j M"). El panel A muestra los resultados de un experimento de microscopía de fluorescencia, mientras que el panel B muestra los resultados de un experimento de citometría de flujo.
La Figura 2 muestra los resultados de un ensayo de citometría de flujo de escape endosomal de calceína en el que las células HeLa se cargaron con calceína ("calceína 100 j M"), y después se trataron con concentraciones crecientes del agente lanzadera CM18-TAT-Cys (etiquetado como "CM18-TAT").
Las Figuras 3 y 4 muestran los resultados de los ensayos de citometría de flujo de escape endosomal de calceína en los que células HeLa (Figura 3) o mioblastos primarios (Figura 4) se cargaron con calceína ("calceína 100 j M") y después se trataron con 5 j M u 8 j M de los agentes lanzadera CM18-TAT-Cys o CM18-Penetratina-Cys (etiquetados como "CM18-TAT" y "CM18-Penetratin", respectivamente).
La Figura 5 muestra los resultados de un experimento de transducción de GFP visualizado mediante microscopía de fluorescencia en el que se incubó conjuntamente una proteína de carga GFP con 0, 3 o 5 j M de CM18-TAT-Cys (etiquetado como "CM18-TAT"), y después se expuso a células HeLa. Las células se observaron mediante microscopía de campo brillante (paneles superiores) y de fluorescencia (paneles inferiores).
La Figura 6 muestra los resultados de un experimento de eficiencia de transducción de GFP en el que se incubó conjuntamente proteína de carga GFP (10 j M) con diferentes concentraciones de CM18-TAT-Cys (etiquetado como "CM18-TAT"), antes de exponerse a células HeLa. Las células se evaluaron mediante citometría de flujo y el porcentaje de células fluorescentes (positivas para GFP) se muestra en el panel A, y los datos de toxicidad celular correspondientes se muestran en el panel B.
La Figura 7 muestra los resultados de un experimento de eficiencia de transducción de GFP en el que se incubaron conjuntamente diferentes concentraciones de proteína de carga de GFP (10,5 o 1 j M) con 5 j M de CM18-TAT-Cys (panel A, etiquetado como "CM18TAT") o 2,5 mM de dCM18-TAT-Cys (panel B, etiquetado como "dCM18TAT"), antes de exponerse a células HeLa. Las células se evaluaron mediante citometría de flujo y se muestran los porcentajes de células fluorescentes (positivas para GFP).
Las Figuras 8 y 9 muestran los resultados de experimentos de eficiencia de transducción de GFP en los que se incubó conjuntamente proteína de carga GFP (10 j M) con diferentes concentraciones y combinaciones de CM18-TAT-Cys (etiquetados como "CM18TAT"), CM18-Penetratina-Cys (etiquetados como "CM18penetratina") y dímeros de cada uno (dCM18-TAT-Cys (etiquetado como "dCM18TAT"), dCM18-Penetratina-Cys (etiquetado como "dCM18penetratina"), antes de exponerlos a las células HeLa. Las células se evaluaron mediante citometría de flujo y se muestran los porcentajes de células fluorescentes (positivas para GFP).
La Figura 10 muestra los resultados típicos de un experimento de transducción de TAT-GFP en el que la proteína de carga TAT-GFP (5 j M) se incubó conjuntamente con 3 j M de CM18-TAT-Cys (etiquetado como "CM18-TAT"), antes de exponerse a células HeLa. Las células y la fluorescencia de GFP se visualizaron mediante microscopía de campo brillante y de fluorescencia a aumentos de 10x y 40x. Las flechas indican el suministro endosomal de TAT-GFP en ausencia de CM18-TAT-Cys, así como también su suministro nuclear en presencia de CM18-TAT-Cys.
La Figura 11 muestra los resultados de un experimento de eficiencia de transducción de TAT-GFP en el que la proteína de carga TAT-GFP (5 j M) se incubó conjuntamente con diferentes concentraciones de CM18-TAT-Cys (etiquetado como "CM18TAT"), antes de exponerse a las células HeLa. Las células se evaluaron mediante citometría de flujo y el porcentaje de células fluorescentes (positivas para GFP) se muestra en el panel A, y los datos de toxicidad celular correspondientes se muestran en el panel B.
La Figura 12 muestra los resultados típicos de un experimento de transducción de GFP-NLS en el que la proteína de carga GFP-NLS (5 j M) se incubó conjuntamente con 5 j M de CM18-TAT-Cys (etiquetado como "CM18-TAT"), antes de exponerse a las células HeLa durante 5 minutos. Las células y la fluorescencia de GFP se visualizaron mediante microscopía de campo brillante y de fluorescencia a aumentos de 10x, 20x y 40x. Las flechas indican áreas de suministro nuclear de GFP-NLS.
La Figura 13 muestra los resultados de un experimento de eficiencia de transducción de GFP-NLS en el que se incubó conjuntamente la proteína de carga GFP-NLS (5 j M) con diferentes concentraciones de CM18-TAT-Cys (etiquetado como "CM18TAT"), antes de exponerse a las células HeLa. Las células se evaluaron mediante citometría de flujo y el porcentaje de células fluorescentes (positivas para GFP) se muestra en el panel A, y los datos de toxicidad celular correspondientes se muestran en el panel B.
Las Figuras 14 y 15 muestran los resultados de los experimentos de eficiencia de transducción de GFP-NLS en los que se incubó conjuntamente la proteína de carga GFP-NLS (5 j M) con diferentes concentraciones y combinaciones de CM18-TAT (etiquetado como "CM18TAT"), CM18-Penetratina (etiquetado como "CM18penetratina") y dímeros de cada uno (dCM18-TAT-Cys, dCM18-Penetratina-Cys; etiquetados como "dCM18TAT" y "dCM18penetratina", respectivamente), antes de exponerlos a las células HeLa. Las células se evaluaron mediante citometría de flujo y se muestran los porcentajes de células fluorescentes (positivas para GFP).
La Figura 16 muestra los resultados de un experimento de eficiencia de transducción de GFP-NLS en el que se incubó conjuntamente la proteína de carga GFP-NLS (5 j M) con CM18-TAT-Cys (3,5 j M, etiquetado como "CM18TAT") solo o con dCM18-Penetratina-Cys (1 j M, etiquetado como "dCM18pen") durante 5 minutos o 1 hora en medio DMEM simple ("DMEM") o medio DMEM que contiene FBS al 10 % ("FBS"), antes de someterse a análisis de citometría de flujo. Se muestran los porcentajes de células fluorescentes (positivas para GFP). Las células que no se trataron con agente lanzadera o GFP-NLS ("ctrl") y las células que se trataron con GFP-NLS sin agente lanzadera ("GFP-NLS 5 mM") se usaron como controles.
La Figura 17 muestra los resultados de un experimento de eficiencia de transducción de GFP-NLS en el que se incubó conjuntamente la proteína de carga GFP-NLS (5 j M) con o sin CM18-TAT-Cys 1 j M (etiquetado como "CM18TAT"), antes de exponerse a las células THP-1. Las células se evaluaron mediante citometría de flujo y el porcentaje de células fluorescentes (positivas para GFP) se muestra en el panel A, y los datos de toxicidad celular correspondientes se muestran en el panel B.
La Figura 18 muestra los resultados de un experimento de eficiencia de transducción en el que la proteína de carga, anticuerpo anti-tubulina etiquetado con FITC (0,5 j M), se incubó conjuntamente con 5 j M de CM18-TAT-Cys (etiquetado como "CM18-TAT"), antes de exponerse a las células HeLa. El suministro de anticuerpos funcionales se visualizó mediante microscopía de campo brillante (20x) y de fluorescencia (20x y 40x), en la que se visualizaron fibras de tubulina fluorescentes en el citoplasma.
La Figura 19 muestra los resultados de un experimento de eficiencia de transducción de anticuerpos anti-tubulina etiquetados con FITC en el que la proteína de carga de anticuerpo (0,5 mM) se incubó conjuntamente con 3,5 mM de CM18-TAT-Cys (etiquetado como "CM18TAT"), CM18-Penetratina -Cys (etiquetado como "CM18pen") o dCM18-Penetratina-Cys (etiquetado como "dCM18pen"), o una combinación de 3,5 mM de CM18-TAT-Cys y 0,5 mM de dCM18-Penetratina-Cys, antes de exponerse a las células HeLa. Las células se evaluaron mediante citometría de flujo y el porcentaje de células fluorescentes (positivas para FITC) se muestra en el panel A, y los datos de toxicidad celular correspondientes se muestran en el panel B.
La Figura 20 muestra los resultados del experimento de eficiencia de transfección de ADN en el que el ADN plasmídico (pEGFP) se etiquetó con un tinte Cy5™ y se incubó conjuntamente con 0, 0,05, 0,5 o 5 j M de CM18-TAT-Cys (etiquetado como "CM18-TAT "), antes de exponerse a las células HEK293A. El análisis de citometría de flujo permitió la cuantificación de la emisión de Cy5™ (correspondiente al suministro intracelular de ADN; eje y) y la emisión de GFP (correspondiente al suministro nuclear exitoso de ADN; el porcentaje se indica encima de cada barra).
La Figura 21 muestra los resultados de un experimento de eficiencia de transducción de GFP-NLS en el que la proteína de carga GFP-NLS (5 j M) se incubó conjuntamente con 1, 3 o 5 j M de CM18-TAT-Cys (etiquetado como "CM18TAT") o His-CM18-TAT (etiquetado como "His-CM18TAT"), antes de exponerse a las células HeLa. Las células se evaluaron mediante citometría de flujo y el porcentaje de células fluorescentes (positivas para GFP) se muestra en el panel A, y los datos de toxicidad celular correspondientes se muestran en el panel B.
La Figura 22 muestra los resultados de un experimento de eficiencia de transducción en el que la proteína de carga GFP-NLS se administró intracelularmente mediante el uso de la lanzadera His-CM18-PTD4 en células HeLa. La eficiencia de transducción de GFP-NLS se evaluó mediante citometría de flujo y se muestran el porcentaje de células fluorescentes de GFP ("Células pos (%)"), así como también los datos de viabilidad celular correspondientes ("viabilidad (%)"). El panel A muestra una comparación de las eficiencias de transducción de GFP-NLS mediante el uso de diferentes protocolos de transducción (Protocolo A frente a B). El panel B muestra el efecto de usar diferentes concentraciones de la lanzadera His-CM18-PTD4 cuando se usa el Protocolo B.
Las Figuras 23-26 son imágenes de microscopía que muestran los resultados de experimentos de transducción en los que GFP-NLS (Figuras 23, 24A, 24B, 25 y 26) o anticuerpo anti-tubulina etiquetado con FITC (Figura 24C y 24D) se suministró intracelularmente con la lanzadera His-CM18-PTD4 en células HeLa. Las imágenes de campo brillante y de fluorescencia de células vivas se muestran en las Figuras 23, 24 y 26. En la Figura 25, las células se fijaron, se permeabilizaron y se sometieron a inmunoetiquetado con un anticuerpo anti-GFP y un anticuerpo secundario fluorescente. Las ventanas triangulares blancas indican ejemplos de áreas de etiquetado conjunto entre las señales de núcleos (DAPI) y GFP-NLS. La Figura 26 muestra imágenes capturadas mediante microscopía confocal.
La Figura 27 muestra imágenes de microscopía de un experimento de transducción cinética (curso temporal) en células HeLa, donde se rastreó la fluorescencia de la proteína de carga GFP-NLS después de 45, 75, 100 y 120 segundos posteriores al suministro intracelular con la lanzadera His-CM18- PTD4. El patrón de fluorescencia citoplasmática difusa observado después de 45 segundos (panel A) se convierte gradualmente en un patrón nuclear más concentrado a los 120 segundos (panel D).
La Figura 28 muestra imágenes de microscopía del experimento de transducción de suministro conjunto en el que dos proteínas de carga (GFP-NLS y mCherry™-NLS) se suministran simultáneamente intracelularmente mediante la lanzadera His-CM18-PTD4 en células HeLa. Las células y las señales fluorescentes se visualizaron mediante microscopía de (A) campo brillante y de fluorescencia (BD). Las ventanas triangulares blancas indican ejemplos de áreas de etiquetado conjunto entre núcleos (DAPI) y GFP-NLS o mCherry™.
La Figura 29 muestra los resultados de los experimentos de eficiencia de transducción de GFP-NLS en células HeLa mediante el uso de diferentes agentes lanzadera o péptidos de control/dominio único. La eficiencia de transducción de GFP-NLS se evaluó mediante citometría de flujo y el porcentaje de células fluorescentes GFP ("Células pos (%)"), así como también los datos de viabilidad celular correspondientes ("viabilidad (%)") se muestran en los paneles A, B, D-G e I. En los paneles A y D-F, las células se expusieron al agente de lanzadera/carga durante 10 segundos. En el panel I, las células se expusieron al agente de lanzadera/carga durante 1 minuto. En los paneles B, C, G y H, las células se expusieron al agente de lanzadera/carga durante 1, 2 o 5 min. "Intensidad de fluorescencia relativa (FL1-A)" o "Intensidad de señal" corresponde a la media de todas las intensidades de fluorescencia a partir de cada célula con una señal fluorescente GFP después del suministro de la proteína fluorescente GFP-NLS con el agente lanzadera. El panel D muestra los resultados de un experimento de control en el que solo se usaron péptidos de dominio único (ELD o CDP) o el péptido His-PTD4 (His-CPD) para la transducción de GFP-NLS, en lugar de los agentes lanzadera multidominio.
La Figura 30 muestra imágenes microscópicas de células HeLa transducidas con GFP-NLS mediante el uso del agente lanzadera (A) TATKALA, (B) His-CM18-PTD4, (C) His-C(LLKK)aC-PTD4, (D) PTD4-KALA, (E) EB1-PTD4 y (F) His-CM18-PTD4-His. Los recuadros en los paneles de la fila inferior muestran los resultados de los análisis de citometría de flujo correspondientes, lo que indica el porcentaje de células que exhiben fluorescencia de GFP.
La Figura 31 muestra los resultados de un experimento de eficiencia de transducción en el que la proteína de carga GFP-NLS se suministró intracelularmente mediante el uso de la lanzadera His-CM18-PTD4 en células THP-1 mediante el uso de diferentes Protocolos (Protocolo A frente a C). La eficiencia de transducción de GFP-NLS se evaluó mediante citometría de flujo y se muestran el porcentaje de células fluorescentes de GFP ("Células pos (%)"), así como también los datos de viabilidad celular correspondientes ("viabilidad (%)"). "Ctrl" corresponde a células THP-1 expuestas a la proteína de carga GFP-NLS en ausencia de un agente lanzadera.
La Figura 32 muestra imágenes microscópicas de células THP-1 transducidas con proteína de carga GFP-NLS mediante el uso de la lanzadera His-CM18-PTD4. Las imágenes capturadas con aumentos de 4x, 10x y 40x se muestran en los paneles A-C, respectivamente. Las ventanas triangulares blancas en el panel C indican ejemplos de áreas de etiquetado conjunto entre células (campo brillante) y fluorescencia de GFP-NLS. El panel D muestra los resultados de los análisis de citometría de flujo correspondientes, que indican el porcentaje de células que exhiben fluorescencia de GFP.
La Figura 33 muestra imágenes de microscopía de células THP-1 transducidas con proteína de carga GFP-NLS mediante el uso de la lanzadera His-CM18-PTD4. Las ventanas triangulares blancas indican ejemplos de áreas de etiquetado conjunto entre células (campo brillante; paneles A y B) y fluorescencia de GFP-NLS (paneles C y D). La Figura 34 muestra los resultados de los experimentos de eficiencia de transducción de GFP-NLS en células THP-1 mediante el uso de la lanzadera TATKALA, His-CM18-PTD4 o His-C(LLKK)3C-PTD4. Las proteínas de carga/agentes lanzadera se expusieron a las células THP-1 durante 15, 30, 60 o 120 segundos. La eficiencia de transducción de GFP-NLS se evaluó mediante citometría de flujo y el porcentaje de células fluorescentes de GFP ("Células pos (%)"), así como también los datos de viabilidad celular correspondientes ("viabilidad (%)") se muestran en el panel A. En el panel B, "Intensidad de fluorescencia relativa (FL1-A)" corresponde a la media de todas las intensidades de fluorescencia de cada célula con una señal fluorescente de GFP después del suministro de proteína fluorescente de GFP-NLS con el agente lanzadera.
La Figura 35 muestra los resultados de los experimentos de eficiencia de transducción en los que las células THP-1 se expusieron diariamente a la carga de GFP-NLS en presencia de un agente lanzadera durante 2,5 horas. Se usó His-CM18-PTD4 en los paneles A-E, y se usó His-C(LLKK)3C-PTD4 en el panel F. La eficiencia de transducción de GFP-NLS se determinó mediante citometría de flujo en el día 1 o en el día 3, y los resultados se expresan como el porcentaje de células fluorescentes de GFP ("Células pos (%)"), así como también los datos de viabilidad celular correspondientes ("viabilidad (%)") en los paneles A-C y F. El panel D muestra el índice de actividad metabólica de las células THP-1 después de 1, 2, 4 y 24 h, y el panel E muestra el índice de actividad metabólica de las células THP-1 después de 1 a 4 días, para las células expuestas a la lanzadera His-CM18-PTD4.
La Figura 36 muestra una comparación de las eficiencias de transducción de GFP-NLS en una pluralidad de diferentes tipos de células (por ejemplo, adherentes y en suspensión, así como también líneas celulares y células primarias) mediante el uso de la lanzadera His-CM18-PTD4, medida mediante citometría de flujo. Los resultados se expresan como el porcentaje de células fluorescentes de GFP ("Células pos (%)"), así como también los datos de viabilidad celular correspondientes ("viabilidad (%)").
La Figura 37 muestra imágenes de microscopía de fluorescencia de diferentes tipos de células (AH) transducidas con carga GFP-NLS mediante el uso de la lanzadera His-CM18-PTD4. La fluorescencia de GFP se visualizó mediante microscopía de fluorescencia con un aumento de 10x. Los resultados de los experimentos de citometría de flujo paralelo también se proporcionan en los recuadros (viabilidad y porcentaje de células fluorescentes de GFP). La Figura 38 muestra imágenes de microscopía de fluorescencia de mioblastos humanos primarios transducidos con GFP-NLS mediante el uso de la lanzadera His-CM18-PTD4. Las células se fijaron y se permeabilizaron antes de inmunoetiquetar GFP-NLS con un anticuerpo anti-GFP y un anticuerpo secundario fluorescente. La GFP inmunoetiquetada se muestra en el panel A, y esta imagen se superpone con el etiquetado de núcleos (DAPI) en el panel B.
La Figura 39 muestra un diseño esquemático (A, B y C) y muestras de imágenes de fluorescencia (D y E) de un ensayo de transfección de sustituto de plásmido usado para evaluar la actividad del complejo CRISPR/Cas9-NLS suministrado intracelularmente. (A) En el día 1, las células se transfectan con un plásmido de expresión que codifica las proteínas fluorescentes mCherry™ y GFP, con un codón de parada que separa sus dos marcos abiertos de lectura. La transfección de las células con el plásmido de expresión da como resultado solo la expresión de mCherry™ (D). Un complejo CRISPR/Cas9-NLS, que se ha diseñado/programado para escindir el ADN plasmídico en el codón de parada, se suministra entonces intracelularmente a las células transfectadas que expresan mCherry™, lo que da como resultado la escisión bicatenaria del ADN plasmídico en el codón de parada (B). En una fracción de las células, se produce una reparación aleatoria del ADN no homólogo del plásmido escindido que da como resultado la eliminación del codón de parada (C) y, por lo tanto, la expresión de GFP y la fluorescencia (E). Las ventanas triangulares blancas indican ejemplos de áreas de etiquetado conjunto de mCherry™ y fluorescencia de GFP.
La Figura 40 muestra imágenes de microscopía de fluorescencia de células HeLa que expresan mCherry™ y GFP, lo que indica la escisión mediada por CRISPR/Cas9-NLS del ADN sustituto del plásmido. En los paneles Ad , las células HeLa se transfectaron conjuntamente con tres plásmidos: el sustituto del plásmido como se describe en la breve descripción de la Figura 39, y otros dos plásmidos de expresión que codifican la proteína Cas9-NLS y ARNcr/ARNtracr, respectivamente. La escisión mediada por CRISPR/Cas9 del sustituto del plásmido en el codón de parada y la subsiguiente reparación del ADN por parte de la célula permite la expresión de GFP (paneles B y D) además de mCherry™ (paneles A y C). En los paneles E-H, las células HeLa se transfectaron con el sustituto del plásmido y después se transdujeron con un complejo CRISPR/Cas9-NLS activo mediante el uso de la lanzadera His-CM18-PTD4. La escisión mediada por CRISPR/Cas9-NLS del sustituto del plásmido en el codón de parada y la subsiguiente reparación del ADN por parte de la célula permite la expresión de GFP (paneles F y H) además de mCherry™ (paneles E y G).
La Figura 41A muestra los productos de un ensayo de escisión de ADN (ensayo T7E1) separados por electroforesis en gel de agarosa, que se usa para medir la escisión mediada por CRISPR/Cas9 del ADN genómico celular. Las células HeLa se transdujeron con un complejo CRISPR-Cas9-NLS programado para escindir el gen PPIB. La presencia del producto de escisión enmarcado en los recuadros blancos 1 y 2, indica la escisión del gen PPIB por el complejo CRISPR-Cas9-NLS, que se suministró intracelularmente mediante el uso de la lanzadera His-C(LLKK)3C-PTD4 (carril B) o con un agente de transfección lipídico usado como control positivo (carril D). Este producto de escisión está ausente en los controles negativos (carriles A y C).
La Figura 41B muestra los productos de un ensayo de escisión de ADN (ensayo T7E1) separados por electroforesis en gel de agarosa, que se usa para medir la escisión mediada por CRISPR/Cas9 de ADN genómico celular (secuencias de ADN de PPIB). El panel de la izquierda muestra el producto de escisión de la secuencia de ADN de PPIB amplificada mediante el complejo CRIPR/Cas9 después del suministro del complejo con el agente lanzadera His-CM18-PTD4 en células HeLa. El panel derecho muestra la secuencia de a Dn amplificada antes del procedimiento de digestión con T7E1 como control negativo.
La Figura 41C muestra los productos de un ensayo de escisión de ADN (ensayo T7E1) separados por electroforesis en gel de agarosa, que se usa para medir la escisión mediada por CRISPR/Cas9 de ADN genómico celular (secuencias de ADN PPIB). El panel de la izquierda muestra la secuencia de ADN de PPIB amplificada después de la incubación de las células HeLa con el complejo Cas9/ARN en presencia de un agente de transfección lipídico (reactivo de transfección DharmaFect™ # T-20XX-01) (control positivo). El panel derecho muestra la secuencia de ADN amplificada antes del procedimiento de digestión con T7E1 como control negativo.
Las Figuras 42-44 muestran la actividad transcripcional de las células THP-1 que se han transducido con el factor de transcripción HOXB4 mediante el uso de diferentes concentraciones de la lanzadera His-CM18-PTD4 y diferentes tiempos de exposición carga/lanzadera. El suministro intranuclear exitoso de HOXB4 se determinó mediante el monitoreo de los niveles de ARNm de un gen objetivo mediante PCR en tiempo real, y los resultados se normalizan contra los del control negativo (HOXB4 sin agente lanzadera) y se expresan como "Veces sobre el control" (barras

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Un agente lanzadera basado en polipéptidos que comprende un dominio de fuga endosomal (ELD) unido operativamente a un dominio de penetración celular (CPD), o un ELD unido operativamente a un dominio rico en histidina y un CPD, para su uso en un método clínico o terapéutico in vivo para aumentar la eficiencia de transducción de una carga polipeptídica independiente al citosol de células eucariotas objetivo, en donde la carga es un polipéptido biológicamente activo, y en donde el agente lanzadera basado en polipéptidos tiene una carga neta predicha de al menos 6 a pH fisiológico y se usa a una concentración suficiente para aumentar la eficacia de transducción de la carga polipeptídica independiente al citosol de la célula eucariota objetivo.
  2. 2. Un método in vitro para aumentar la eficiencia de transducción de una carga polipeptídica independiente al citosol de células eucariotas objetivo, el método comprende poner en contacto las células eucariotas objetivo con un agente lanzadera basado en polipéptidos que comprende un dominio de fuga endosomal (ELD) unido operativamente a un dominio penetrante de célula (CPD), o un ELD unido operativamente a un dominio rico en histidina y un CPD, en donde el agente lanzadera basado en polipéptidos tiene una carga neta predicha de al menos 6 a pH fisiológico y se usa a una concentración suficiente para aumentar la eficiencia de transducción de la carga polipeptídica independiente al citosol de la célula eucariota objetivo.
  3. 3. El agente lanzadera basado en polipéptidos para el uso de la reivindicación 1 o el método in vitro de la reivindicación 2, en donde el agente lanzadera basado en polipéptidos:
    (a) comprende una longitud mínima de 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 residuos de aminoácidos y una longitud máxima de 35, 40, 45, 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 o 150 residuos de aminoácidos;
    (b) tiene una carga neta predicha de al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 a pH fisiológico; (c) es soluble en solución acuosa; o
    (d) cualquier combinación de (a) a (c).
  4. 4. El agente lanzadera basado en polipéptidos para el uso de la reivindicación 1 o 3 o el método in vitro de la reivindicación 2 o 3, en donde:
    (a) dicho ELD es o es de: un péptido endosomolítico; un péptido antimicrobiano (AMP); un péptido antimicrobiano catiónico lineal alfa-helicoidal; un péptido híbrido de cecropina-A/melitina (CM); péptido activo de membrana dependiente del pH (PAMP); un péptido anfífilo; un péptido derivado del extremo N de la subunidad HA2 de la hemaglutinina (HA) de la influenza; CM18; dominio T de la toxina diftérica (DT); GALA; PEA; INF-7; LAH4; HGP; H5WYG; HA2; EB1; VSVG; toxina de pseudomonas; melitina; KALA; JST-1; C(LLKK)3C; G(LLKK)3G; o cualquier combinación de los mismos;
    (b) dicho CPD es o es de: un péptido de penetración celular o el dominio de transducción de proteínas de un péptido de penetración celular; TAT; PTD4; penetratina (Antennapedia); pVEC; M918; Pep-1; Pep-2; Xentry; tramo de arginina; transportano; SynB1; SynB3; o cualquier combinación de los mismos;
    (c) dicho dominio rico en histidina es un tramo de al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 6 aminoácidos que comprende al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 % o al menos 90 % de residuos de histidina; y/o comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8 o al menos 9 residuos de histidina consecutivos; o
    (d) cualquier combinación de (a) a (c).
  5. 5. El agente lanzadera basado en polipéptidos para el uso de la reivindicación 1, 3 o 4, o el método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde el agente lanzadera basado en polipéptidos comprende: (a) un ELD que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-15, 63, 64 o una variante o fragmento de las mismas que tiene actividad endosomolítica;
    (b) un CPD que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 16-27 o 65, o una variante o fragmento de las mismas que tiene actividad de penetración celular;
    (c) un dominio rico en histidina que tiene al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 6 residuos de histidina consecutivos; o
    (d) cualquier combinación de (a) a (c).
  6. 6. El agente lanzadera basado en polipéptidos para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 5, o el método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde dichos dominios se unen operativamente mediante uno o más dominios enlazadores.
  7. 7. El agente lanzadera basado en polipéptidos para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 6, o el método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en donde el agente lanzadera basado en polipéptidos comprende:
    (a) un ELD que es CM18, KALA o C(LLKK)3C que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 14 o 63, o una variante de la misma que tiene al menos 85 %, 90 % o 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 1, 14 o 63, y que tiene actividad endosomolítica;
    (b) un CPD que es TAT o PTD4 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 o 65, o una variante de la misma que tiene al menos 85 %, 90 % o 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 17 o 65 y que tiene actividad de penetración celular; o penetratina que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 o una variante de la misma que tiene al menos 85 %, 90 % o 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 18 y tiene actividad de penetración celular;
    (c) un dominio rico en histidina que comprende al menos 6 residuos de histidina consecutivos; o
    (d) cualquier combinación de (a) a (c).
  8. 8. El agente lanzadera basado en polipéptidos para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 7, o el método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en donde el agente lanzadera basado en polipéptidos comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 57-59, 66-72 u 82-102, o una variante funcional de las mismas que tiene al menos 85 %, 90 % o 95 % de identidad con cualquiera de las SEQ ID NOs: 1057-59, 66-72 u 82-102.
  9. 9. El agente lanzadera basado en polipéptidos para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 8, o el método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en donde dicha carga polipeptídica independiente: (a) carece de un CPD o un CPD como se define en la reivindicación 4(b);
    (b) es una proteína recombinante;
    (c) comprende un dominio de direccionamiento subcelular;
    (d) forma un complejo con una molécula de ADN y/o ARN; o
    (e) cualquier combinación de (a) a (d).
  10. 10. El agente lanzadera basado en polipéptidos para el uso de la reivindicación 9 o el método in vitro de la reivindicación 9, en donde dicho dominio de direccionamiento subcelular es:
    (a) una señal de localización nuclear (NLS), opcionalmente de: Ela, T-Ag, c-myc, T-Ag, op-T-NLS, Vp3, nucleoplasmina, histona 2B, N1 de Xenopus, Pa RP, PDX-1, QKI-5, HCDA, H2B, v-Rel, Amida, RanBP3, Pho4p, LEF-1, TCF-1, BDV-P, TR2, SOX9 o Max;
    (b) una secuencia señal nucleolar, opcionalmente de BIRC5 o RECQL4;
    (c) una secuencia señal mitocondrial, opcionalmente de Tim9 o subunidad IV de la citocromo c oxidasa de levadura; o
    (d) una secuencia señal de peroxisoma, opcionalmente de PTS1.
  11. 11. El agente lanzadera basado en polipéptidos para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 10, o el método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en donde dicha carga polipeptídica es un factor de transcripción, una nucleasa, una citocina, una hormona, un factor de crecimiento o un anticuerpo.
  12. 12. El agente lanzadera basado en polipéptidos para el uso de la reivindicación 11 o el método in vitro de la reivindicación 11, en donde:
    (a) dicho factor de transcripción es: HOXB4, NUP98-HOXA9, Oct3/4, Sox2, Sox9, Klf4, c-Myc, MyoD, Pdxl, Ngn3, MafA, Blimp-1, Eomes, T-bet, FOXO3A, NF-YA, SALL4, ISL1, FoxA1, Nanog, Esrrb, Lin28, HIF1-alfa, Hlf, Runxltl, Pbx1, Lmo2, Zfp37, Prdm5, Bcl-6 o cualquier combinación de los mismos; y/o (b) dicha nucleasa es: una endonucleasa guiada por ARN, una endonucleasa CRISPR, una endonucleasa CRISPR tipo I, una endonucleasa CRISPR tipo II, una endonucleasa CRISPR tipo III, una endonucleasa CRISPR tipo IV, una endonucleasa CRISPR tipo V, una endonucleasa CRISPR tipo VI, proteína 9 asociada a CRISPR (Cas9), Cpfl, una nucleasa de dedos de zinc (ZFN), una nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (TALEN), una endonucleasa autodirigida, una meganucleasa o cualquier combinación de las mismas.
  13. 13. El agente lanzadera basado en polipéptidos para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 12, o el método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12, para aumentar la eficiencia de transducción de una carga polipeptídica al citosol de células eucariotas objetivo diseñado para su uso en terapia celular, edición del genoma, transferencia celular adoptiva y/o medicina regenerativa.
  14. 14. El agente lanzadera basado en polipéptidos para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 13, o el método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13, en donde dichas células eucariotas objetivo son células animales, células de mamíferos, células humanas, células madre, células primarias, células inmunitarias, células T o células dendríticas.
  15. 15. Un péptido sintético que comprende un dominio de fuga endosomal (ELD) unido operativamente a un dominio de penetración celular (CPD), o un ELD unido operativamente a un dominio rico en histidina y un CPD, en donde el péptido sintético es el agente lanzadera basado en polipéptidos como se define en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, y en donde el CPD es o es de: PTD4; penetratina (Antennapedia); pVEC; M918; Pep-1; Pep-2; Xentry; tramo de arginina; transportano; SynB1; SynB3; o cualquier combinación de los mismos, y en donde el agente lanzadera basado en polipéptidos tiene una carga neta predicha de al menos 6 a pH fisiológico.
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