CN109734781B - 一种抗热带念珠菌肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种抗热带念珠菌肽及其制备方法和应用。抗热带念珠菌肽其序列如序列表SEQ ID No.1所示。制备方法：对APD数据库中抗真菌序列进行分析，统计出电荷、长度、氨基酸组成、疏水性比例。然后统计氨基酸组合，发现GGL、GLL、LKK、KKL组合出现频率高，同时，第1位的甘氨酸，第2位的亮氨酸，第7位与第11位的赖氨酸出现频率非常高，所以我们基于以上原则，设计出该抗菌肽。在最低抑菌浓度测试中，发现其对热带念珠菌具有良好的抗菌活性，MIC值为2μM。以上结果表明，这种设计方式在未来具备广阔的应用前景。

Description

一种抗热带念珠菌肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗热带念珠菌肽及其制备方法和应用。

背景技术

天然抗菌肽(AMPs)是重要的宿主防御分子，它们被发现于细菌，植物，和动物体内。肽的设计方式有很多种，第一种方法是通过截断或替换进行自然模板优化。第二种方法是序列重组，即改变序列中氨基酸的位置。从序列反转到重新组合，重新组合可以对所有的残基进行优化。第三种方法是序列杂化，例如早期设计的的天蚕素-蜂毒肽杂合肽。在本专利中，我们对抗菌肽肽库进行分析，利用分析结果设计抗真菌肽。

念珠菌可侵犯人类的皮肤，粘膜，也可能引起全身感染。皮肤念珠菌病通常包括念珠菌性间擦疹、念珠菌性甲沟炎、甲床炎等疾病。粘膜念珠菌病常包括鹅口疮、女阴阴道炎及龟头包皮炎以及肠念珠菌病、肺念珠菌病等。

发明内容

本发明的目的在于公开一种抗热带念珠菌肽及其制备方法和应用，实现对热带念珠菌的杀灭作用。

本发明所采用的技术如下：一种抗热带念珠菌肽，其序列如序列表SEQ ID No.1所示。

本发明还具有如下特征：

1、如上所述的一种抗热带念珠菌肽的制备方法，如下：对APD数据库中抗真菌序列进行分析，统计出电荷、长度、氨基酸组成、疏水性比例，然后统计氨基酸组合，发现GGL、GLL、LKK、KKL组合出现频率高，同时，第1位的甘氨酸，第2位的亮氨酸，第7位与第11位的赖氨酸出现频率非常高，基于以上原则，设计出该抗菌肽，其序列如序列表SEQ ID No.1所示。

2、如上所述的一种抗热带念珠菌肽在制备治疗热带念珠菌感染性疾病的药物中的应用。

本发明具有如下优点及有益效果：通过本方法制备的抗菌肽的实验技术简单，对得到的抗菌肽进行抗菌活性检测，发该抗菌肽对真菌热带念珠菌具有很强的抑菌活性，其MIC值为2μM，具有较高的应用价值。

附图说明

图1 APD肽库中含有不同电荷的抗真菌肽数量图；

图2 APD肽库中不同长度的抗真菌肽数量图；

图3 APD肽库中不同疏水性比例的抗真菌肽数量图；

图4 APD肽库中抗真菌肽的氨基酸组成图；

图5抗真菌肽的螺旋轮示意图；

图6抗真菌肽质谱报告图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述：

实施例1

该抗热带念珠菌肽的合成原理步骤如下：

(1)、我们从APD数据库中下载了对真菌具有杀灭作用的肽1083条。

(2)、分别对抗真菌肽库中肽的电荷量、长度、疏水性氨基酸比例以及氨基酸组成进行分析。分析结果分别见图1、图2、图3、图4。分析得知，在所有的抗真菌肽中，电荷出现频率最多的为+4，出现181次。为了节约成本，仅对长度小于15个氨基酸的短肽进行分析，发现出现频率最高的长度为13个氨基酸，出现49次。此外，对抗真菌肽中疏水性氨基酸比例进行了分析，发现31％-40％比例最高，出现303次。

(3)、随后分析了抗真菌肽的氨基酸组成，发现出现频率最高的三种氨基酸分别是甘氨酸(G)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L),他们所占比例分别为11.25％，10.36％，8.57％。所以我们利用这三种氨基酸组合设计抗真菌肽。我们分析了相邻氨基酸出现频次，我们发现GGL、GLL、LKK、KKL四种组合方式出现频率最高，分别出现了68，61，57，47次，因此我们使用这四种组合方式设计肽序列。

(4)、又分析了1083条抗真菌肽中每个位置氨基酸出现频次，我们发现，第1位的甘氨酸，第2位的亮氨酸，第7位与第11位的赖氨酸出现频率非常高，均高于200次，因此我们决定固定第1、2、7、11位氨基酸的条件下，使用四种组合设计肽。

(5)、采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到多肽。

(6)、经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，完成多肽的制备。结果见图6。

实施例2

抗真菌肽的设计根据计算得出抗真菌肽的长度13个氨基酸，电荷为+4，疏水性氨基酸比例为31％-40％出现频率最高，另外，氨基酸L、K、G出现频率最高。另外，GGL、GLL、LKK、KKL四种组合出现频率最高，而且第1位的甘氨酸，第2位的亮氨酸，第7位与第11位的赖氨酸出现频率非常高，所以我们利用上述条件，设计出满足条件的抗真菌肽，其中，一条肽的序列如下：GLL GGL KKL LKK G，抗菌肽的序列如表1所示：

1 5 10 13

表1肽的氨基酸序列

实施例3

固相化学合成法合成抗真菌肽

1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；

2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；

3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；

4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(如图6所示)与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。

实施例4

抗真菌肽生物学活性的测定

1、抗真菌活性的测定：利用微量稀释法测定抗真菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用倍比稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～10³个/mL)于各孔中，培养基为含有MOPS的RPMI 1640(pH＝7.0)。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。28℃恒温培养48h，用酶标仪在492nm(OD492nm)处测定光吸收值，确定最小抑菌浓度。经过三次独立重复试验结果分析得知，其对热带念珠菌cgmcc 2.1975的MIC值为2μM。

以上结果显示，设计出的抗真菌肽对热带念珠菌具有良好的抗菌活性，表明这种设计方式在未来具备广阔的应用前景。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种抗热带念珠菌肽及其制备方法和应用

<140> 2019100947907

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Leu Leu Gly Gly Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Gly-NH2

1 5 10

Claims (3)

1.一种抗热带念珠菌肽，其特征在于，其序列如序列表SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种抗热带念珠菌肽的制备方法，其特征在于，方法如下：对APD数据库中抗真菌序列进行分析，统计出电荷、长度、氨基酸组成、疏水性比例，然后统计氨基酸组合，发现GGL、GLL、LKK、KKL组合出现频率高，同时，第1位的甘氨酸，第2位的亮氨酸，第7位与第11位的赖氨酸出现频率非常高，基于以上原则，设计出该抗菌肽，其序列如序列表SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求1所述的一种抗热带念珠菌肽在制备治疗热带念珠菌感染性疾病的药物中的应用。

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