WO2016175164A1 - シート状小片、その小片を含む発毛促進用シート、並びに、その小片を含む美白及び皺改善剤 - Google Patents

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靖弘 山下
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Definitions

  • the present invention relates to a sheet-like piece, a sheet for promoting hair growth containing the piece, and a whitening and wrinkle improving agent. More specifically, a sheet-like piece for locally absorbing a predetermined physiologically active substance and exerting the action of the physiologically active substance, a hair growth promoting sheet containing the piece, and a whitening and wrinkle improving agent About.
  • the wig is a disposable wig (hereinafter referred to as a wig that can be used repeatedly on the head so as to cover the entire head, a base sheet in which a flocking material is planted, and an adhesive layer for attaching the base sheet to the scalp.
  • a wig that can be used repeatedly on the head so as to cover the entire head, a base sheet in which a flocking material is planted, and an adhesive layer for attaching the base sheet to the scalp.
  • partial wig sometimes referred to as “partial wig”) (see Patent Document 1).
  • Patent Document 3 hereinafter referred to as “Prior Art 2”.
  • Non-Patent Document 3 whitening cosmetics that make stains inconspicuous, wrinkle-removing cosmetics that improve wrinkles, and the like.
  • Conventional techniques 1 and 2 are excellent techniques in that, by using a wig, the state of the hair that has been thinned can be made to look like the state before thinning. However, even if the disposable wig proposed in the prior arts 1 and 2 is used, it does not return to the state before the hair becomes thin, so it must be used continuously while changing the state of the hair. There was a problem.
  • cosmetics exhibiting a whitening effect have attracted attention, and many types of cosmetics are commercially available (prior art 3), but side effects such as vitiligo have occurred and have become a major problem. It is believed that whitening effect appears when melanin synthesis in skin cells is suppressed, and tyrosinase activity inhibitor is incorporated into cosmetics.
  • cosmetics for whitening and wrinkle have problems such as discomfort such as tingling after application, and the effect can be maintained only for a short period. For this reason, social demands for cosmetics for whitening and wrinkle removal are increasing.
  • a first aspect of the present invention includes: a base sheet made of an elastic material; a plurality of microneedles containing a physiologically active substance and extending in a direction opposite to the base sheet side; A reservoir layer provided on one surface; an adhesive layer formed in a mesh shape on the surface of the reservoir layer opposite to the base sheet; and opposite to the surface on which the reservoir layer is formed An auxiliary auxiliary layer formed on the surface of the base sheet on the side so as to be peelable, and a tip portion of the microneedle protrudes from the adhesive layer.
  • the elastic material is preferably made of a translucent synthetic resin having a moisture permeability and a thickness of less than 0.1 mm.
  • the reservoir layer preferably contains a mixture of a water-soluble polymer and a monosaccharide or disaccharide, and a mixture of the physiologically active substance.
  • the water-soluble polymer is selected from the group consisting of collagen, gelatin, hyaluronic acid, dextrin, dextran, proteoglycan, sodium chondroitin sulfate, carboxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose hyaluronic acid, and physiologically acceptable salts thereof. It is preferably at least one of them.
  • the monosaccharide or disaccharide is preferably any one selected from the group consisting of glucose, fructose, sucrose, lactose, trehalose and a mixture of two or more thereof.
  • the physiologically active substance is preferably contained in the dental pulp stem cell culture supernatant, and the dental pulp stem cell culture supernatant is preferably lyophilized powder.
  • the dental pulp stem cell comprises a combination of (i) at least one gene selected from the group consisting of bmi-1, HPV-E6 and HPV-E7, and (ii) a gene of either hTERT or pTERT. It is preferably an introduced immortalized cell.
  • the dental pulp stem cells are preferably derived from humans or pigs.
  • the adhesive layer is preferably formed of a medical silicone adhesive.
  • the adhesion auxiliary layer is preferably made of a sponge-like member, and the sponge-like member is made of a material selected from the group consisting of urethane, silicon, pulp paper, styrene, vinyl, and cloth. It is preferable.
  • a holding member having a frame shape is further provided on the surface of the adhesive layer opposite to the surface on which the reservoir layer is formed, and the holding member protrudes from the adhesive layer. It is preferable to have a thickness longer than the height of the tip of the microneedle.
  • the holding member is preferably a plastic or metal sheet-like member. An aluminum member can be adopted as the metal sheet-like member.
  • Another aspect of the present invention is a hair growth promoting sheet characterized in that the hair growth promoting sheet comprises the sheet-like piece of the present invention.
  • the hair growth promoting sheet comprises the sheet-like piece of the present invention.
  • the artificial hair is fixed to the base sheet with an ultraviolet curable resin.
  • the base area of the said base sheet is an area equivalent to the surface area of a fingertip.
  • the artificial hair penetrates the adhesion auxiliary layer and is implanted in the base sheet.
  • the artificial hair penetrates the base sheet and is fixed to the base sheet on the reservoir layer side of the base sheet.
  • a frame-shaped holding member that holds the sheet-like piece and has a thickness that is longer than the height of the tip of the microneedle protruding from the adhesive layer in the sheet-like piece. It is preferable to further comprise.
  • a holding member is preferably a plastic or metal sheet-like member.
  • the metal sheet-like member is preferably made of aluminum.
  • Still another embodiment of the present invention is a whitening and wrinkle improving agent comprising the above-mentioned sheet-like piece in which the reservoir layer contains a freeze-dried culture supernatant.
  • a holding member for holding the sheet-like piece is further provided, and the holding member is preferably a plastic or metal sheet-like member.
  • the metal sheet-like member is preferably made of aluminum.
  • a sheet-shaped piece that can be applied to various parts such as the head and face in an appropriate size and can efficiently introduce a physiologically active substance is provided. be able to.
  • a hair growth promoting sheet that can promote hair growth in a portion where hair is almost eliminated or thinned, and can be promoted. Furthermore, according to the present invention, it is possible to provide a whitening and wrinkle improving agent that exhibits a whitening effect and a wrinkle improving effect of thinning a spot and wrinkles by being applied to a spotted portion or a deep wrinkled portion. Can do.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of a sheet-like piece of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the shape of the microneedle.
  • (A) is sectional drawing
  • (B) is a perspective view.
  • FIG. 3 is a view (No. 1) for explaining a production process of the sheet-like piece of FIG.
  • FIG. 4 is a diagram (No. 2) for explaining a production process of the sheet-like piece of FIG.
  • FIG. 5 is a graph showing changes over time in the number of individual doublings of immortalized stem cells that produce the culture supernatant used in the production of the hair growth promoting sheet of the present invention.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of a sheet-like piece of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the shape of the microneedle.
  • (A) is sectional drawing
  • (B) is a perspective view.
  • FIG. 3 is a view (No. 1) for explaining a production process of
  • FIG. 6 is a graph showing whether or not the expression of STRO-1 in the immortalized stem cells decreases as the number of individual doublings (PD) increases.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of hematoxylin-eosin staining when it was confirmed whether or not the bone-forming ability of the immortalized stem cells decreased as the number of individual doublings (PD) increased.
  • FIG. 8 is a graph showing changes in the individual doubling number of the immortalized stem cells and the bone mass production ability of the new bone of the culture supernatant.
  • FIG. 9 is a schematic diagram showing the structure of the hair growth promoting sheet of the present invention that also has the function of a disposable wig.
  • 10 is a cross-sectional view of the hair growth promoting sheet of FIG.
  • FIG. 11 is a diagram (part 1) for explaining a manufacturing process of the sheet-like piece of FIG.
  • FIG. 12 is a diagram (part 2) for explaining a production process of the sheet-shaped piece of FIG.
  • FIG. 13 is a figure (A) which shows a mode that artificial hair is planted on a base sheet, and the enlarged view (B) of the B section in (A).
  • FIG. 14 is a diagram (No. 3) for explaining a production step of the sheet-like piece of FIG.
  • FIG. 15 is a photograph of the hair growth promoting sheet of the present invention attached to the head.
  • FIG. 16 is an enlarged view showing the state of the scalp before applying the hair growth promoting sheet of the present invention (A), the state of the scalp after 3 days of wearing (B), and the state of hair growth of the scalp after 7 days of wearing (C). It is a photograph.
  • FIG. 17 is a photograph showing changes before and after application of the hair growth promoting sheet of the present invention to the head. (A) shows the change when affixed to the crown, and (B) shows the alopecia areata behind the ear.
  • FIG. 14 is a diagram (No. 3) for explaining a production step of the sheet-like piece of FIG.
  • FIG. 15 is a photograph of the hair growth promoting sheet of the present invention attached to the head.
  • FIG. 16 is an enlarged view showing the state of the scalp before applying
  • FIG. 18 is a schematic diagram showing variations in the shape of the whitening and wrinkle improving agent of the present invention.
  • (A) is for removing stains
  • (B) is for improving wrinkles around the eyes
  • (C) is for improving the frying lines
  • (D) is a whitening and wrinkle improving agent for wrinkle improvement of the forehead. It is a schematic diagram shown.
  • a sheet-like piece 1 includes (a) a base sheet 2 made of an elastic material; (b) a physiologically active substance and a direction opposite to the base sheet 2 side.
  • a reservoir layer 4 formed on the surface of one side (-Z direction side) of the base sheet, and a plurality of microneedles 4n extending in the (-Z direction); and (c) the base sheet side of the reservoir layer 4; Is an adhesive layer 5 formed in a mesh shape on the surface on the opposite side ( ⁇ Z direction side); (d) on the surface of the base sheet 2 on the opposite side (+ Z direction side) to the surface on which the reservoir layer is formed And an auxiliary adhesion layer 12 formed so as to be peelable.
  • the tip portion of the microneedle 4 n protrudes from the adhesive layer 5.
  • the sheet-like piece 1 is arranged to be peelable on the surface of the adhesive layer 5 on the side opposite to the surface on which the reservoir layer 4 is formed (on the ⁇ Z direction side) and has a frame shape.
  • H is further provided.
  • the holding member H has a thickness longer than the height of the tip portion of the microneedle 4 n protruding from the adhesive layer 5.
  • a plurality of sheet-like pieces 1 are placed on a metallic plate-like member or a plastic plate-like member.
  • the side surface in the ⁇ Z direction of the holding member H of the sheet-like piece 1 is firmly bonded to the plate-like member with an adhesive.
  • the sheet-like piece 1 placed on the plate-like member as described above is peeled off from the plate-like member in a state where the holding member is left on the plate-like member.
  • the holding member H is a plastic or metal sheet-like member provided with an annular member having a shape matching the sheet-like piece. It is preferable in terms of weight and cost.
  • the holding member is a metal sheet-like member, it is preferable that the holding member is made of aluminum from the viewpoint of ease of processing and the like.
  • the elastic material constituting the base sheet 2 has moisture permeability and has three characteristics of a translucent synthetic resin having a thickness of less than 0.1 mm. This is due to the following three reasons.
  • the moisture contained in the sweat will later evaporate without evaporating, which may be uncomfortable and may have an adverse effect on the skin.
  • the thickness is 0.1 mm or more, it cannot be naturally adhered to the skin, for example, when a hair growth promoting sheet is adhered to the scalp, or a whitening and wrinkle improving agent is applied to the skin. In such a case, unnaturalness remains such that it can be visually recognized that the hair growth promoting sheet is used.
  • a translucent material it is not noticeable that the hair growth promoting sheet is used regardless of the position on the skin.
  • an elastic material examples include polyurethane resin, silicon resin, nylon resin, and the like, and a silicon material can be preferably used. This is because when the thickness of the semitransparent synthetic resin having moisture permeability is about 20 to about 60 ⁇ m, it has good fit to the skin and it is not noticeable that it is stuck. In addition, when such a raw material is used for the whitening and wrinkle improving agent of the present invention, for example, after applying it to the face, it is possible to apply makeup from above.
  • the reservoir layer 4 has a plurality of microneedles 4n extending in the ⁇ Z direction.
  • the recesses for forming the microneedles 4n have a conical shape with an upper diameter o1 of about 0.1 to 0.3 mm, a bottom diameter o2 of about 0.03 to 0.05 mm, and a depth t2 of about 0.6 to 1.0 mm. It is preferable that they are arranged.
  • the number of the recesses is preferably about 50 to 100 / cm 2 .
  • the reservoir layer 4 preferably contains a mixture of a water-soluble polymer and a monosaccharide or disaccharide and a mixture of the physiologically active substances.
  • the water-soluble polymer is at least one selected from the group consisting of collagen, gelatin, hyaluronic acid, dextrin, dextran, proteoglycan, sodium chondroitin sulfate, carboxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose hyaluronic acid, and physiologically acceptable salts thereof. It is preferable that
  • microneedles 4n having an appropriate size can be formed by these components, and a bioactive substance to be described later is efficiently introduced into the skin by the formed microneedles 4n.
  • hyaluronic acid it is preferable to use hyaluronic acid.
  • the monosaccharide or disaccharide is preferably any one selected from the group consisting of glucose, fructose, sucrose, lactose, trehalose, and a mixture of two or more thereof. From the viewpoint of cost and irritation, it is preferable to use glucose.
  • the content of the monosaccharide or disaccharide in the composition of the water-soluble polymer and the monosaccharide or disaccharide is 0.2 to 4% by weight. From the viewpoint of mechanical strength. If the content of monosaccharides or disaccharides exceeds 5%, the dissolution time of the microneedles in the skin becomes too short within 30 minutes, so these contents are preferably 0.2 to 4% by weight.
  • the adhesive layer 5 is preferably formed of a medical silicone adhesive. This is because there is no problem that the skin becomes red after being applied and the skin becomes red after being peeled off. Furthermore, it is preferable that the microneedles 4n having an appropriate size protrude from the mesh of the adhesive layer 5 because the physiologically active substance can be efficiently introduced into the skin.
  • adhesion auxiliary layer 12 is preferably composed of a sponge-like member, and is a group consisting of urethane, silicon, pulp paper, styrene, vinyl, and cloth because it is inexpensive to handle, safe and low cost. It is preferable that the material is selected from.
  • the sheet-like piece 1 described above can be manufactured as follows. First, as shown in FIG. 3A, a base sheet 2, a reservoir layer 4, an adhesion auxiliary layer 12, a holding member H, and various adhesives are prepared.
  • the adhesion auxiliary layer 12 is detachably adhered to the + Z direction side surface of the base sheet 2 using a single adhesive to form the laminate 1a shown in FIG.
  • Providing the adhesion auxiliary layer 12 in this way is preferable from the viewpoint that the work can be efficiently performed in forming the subsequent reservoir layer 4 and the like.
  • the reservoir layer 4 is firmly adhered to the surface of the base sheet 2 on the ⁇ Z direction side using another adhesive to form the laminate 1b shown in FIG.
  • the adhesive layer 5 is formed by applying an adhesive in a mesh shape to the portion of the reservoir layer where the microneedles 4n are not formed on the side surface in the ⁇ Z direction, and the laminate 1c is formed as shown in FIG. Form.
  • the holding member H is bonded to the ⁇ Z direction side surface of the adhesive layer 5.
  • the sheet-like piece 1 is produced.
  • the sheet-like piece 1 produced in this way is placed on a ring-shaped sheet holder provided on a metallic plate-like member having a desired thickness and a desired size, or a plastic plate-like member, Product.
  • the physiologically active substance contained in the reservoir layer 4 can be obtained as follows. First, dental pulp stem cells used for production of a culture supernatant containing the physiologically active substance are prepared. These stem cells are obtained by introducing a combination of (i) at least one gene selected from the group consisting of bmi-1, HPV-E6 and HPV-E7 and (ii) either hTERT or pTERT gene It is. This is because when a combination of these genes is introduced, dental pulp stem cells can be passaged for more than 100 generations.
  • dental pulp stem cell refers to a kind of stem cell contained in a dental nerve having regenerative ability. Because it is protected by a hard material called teeth, it has the property that it does not transmit ultraviolet rays or radiation, and genes are not easily damaged.
  • hTERT is a gene encoding human telomere repair enzyme
  • pTERT is a gene encoding porcine telomere repair enzyme
  • bmi-1 is a gene that produces Bmi-1 (one of the proteins constituting the polycomb complex). Bmi-1 is necessary for the maintenance of hematopoietic stem cells, and hematopoietic stem cells can be increased by enhancing the activity.
  • HPV-E6 and E7 are early genes of HPV-16 or HPV-18, and are genes present in an open reading frame that encodes an early gene used by these human papillomaviruses for self-replication.
  • the fallen deciduous teeth are sterilized with, for example, chlorohexidine, the crown portion is divided, and the pulp tissue is collected with a dental reamer.
  • the collected dental pulp tissue is then subjected to a basic medium, such as Dulbecco's protein containing 5-15% bovine serum (hereinafter sometimes referred to as “CS”) and 50-150 units / mL antibiotics. It is suspended in a method Eagle medium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, hereinafter referred to as “DMEM”).
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • the cells are cultured at 37 ° C. for about 2 weeks in a 5% CO 2 incubator. After removing the culture medium, the cells are washed 1 to several times with PBS or the like. Instead of removing the culture medium and washing the cells, the adhesive dental pulp stem cells that formed colonies can also be recovered. Adherent dental pulp stem cells are detached from the dish by treatment with, for example, 0.025-0.1% trypsin and 0.3-1 mM EDTA for several minutes at 37 ° C., and the cells are then collected.
  • a culture solution for example, DMEM containing 10% FCS
  • the sorted cells are resuspended in, for example, 3 to 6 mL of the above basal medium and seeded in an adherent cell culture dish having a diameter of 4 to 8 cm.
  • the cells are cultured at 37 ° C. for about 2 weeks in a 5% CO 2 incubator. After removing the culture medium, the cells are washed 1 to several times with PBS or the like. Instead of removing the culture medium and washing the cells, the adhesive dental pulp stem cells that formed colonies can also be recovered. Adherent dental pulp stem cells are detached from the dish by treatment with, for example, 0.025-0.1% trypsin and 0.3-1 mM EDTA for several minutes at 37 ° C., and the cells are then collected.
  • a culture solution for example, DMEM containing 10% FCS
  • the adherent cells selected as described above are cultured.
  • the dental pulp stem cells obtained as described above are seeded in an adherent cell culture dish and cultured in an incubator under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C.
  • primary cultured cells (SHED-P) of human deciduous deciduous tooth stem cells can be obtained.
  • the subculture is detached and collected from the culture vessel using trypsin and EDTA as described above. Seed in a culture vessel containing
  • the sub-conflict refers to a state in which cells adhere to about 70% of the cell attachment surface in the culture vessel.
  • the subculture is performed 1 to 8 times, and the selected cells are grown to the required number of cells, for example, about 1 ⁇ 10 7 cells / mL.
  • the cells are collected and stored in liquid nitrogen.
  • Cells collected from various donors may be stored in the form of dental pulp stem cell banks.
  • a combination of at least one gene selected from the group consisting of bmi-1, HPV-E6 and HPV-E7 and (ii) either hTERT or pTERT gene is introduced as follows: can do. First, a plasmid for incorporating the above combination of genes is prepared, and this is incorporated into a shuttle vector, for example, pShuttle®2, and cloning is performed. Thereafter, Escherichia coli is transformed with pShuttle 2, and a kanamycin resistant transformant (hereinafter referred to as “Kn +”) is selected using kanamycin as a marker. This Kn + DNA is purified and the restriction enzyme site is analyzed to identify the produced recombinant.
  • Kn + kanamycin resistant transformant
  • the expression cassette is excised from the shuttle vector using, for example, PI-SceI and I-CueI, and this expression cassette is ligated to, for example, adenoviral vector DNA, and Adeno-X viral I DNA is obtain.
  • the obtained ligation product (Adeno-X viral DNA) is cleaved with, for example, Swa I, and E. coli is transformed with the cleaved product to obtain a transformant.
  • ampicillin is used to select and purify ampicillin-resistant heterogeneous transformants (hereinafter referred to as “Amp +”), and the restriction enzyme sites are analyzed to identify recombinants. To do.
  • the recombinant adenovirus is then digested with, for example, Pac I, and the resulting fragment is transfected into HEK293 cells to proliferate and collected to determine the titer of the virus.
  • the virus is purified and infected with the target cell, SHED-P.
  • the HEK293 cell group after virus infection is stained with FITC according to a conventional method, and STRO-1-positive cells are detected using a flow cytometer.
  • STRO-1 is considered as one of the markers of pluripotent mesenchymal stem cells in the bone marrow and serves as an indicator of cell immortalization.
  • the obtained immortalized stem cells are cultured for 24 to 48 hours under the conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. using the above-mentioned basic medium, for example, DMEM supplemented with 10% FBS. Get Qing.
  • the culture supernatant can be collected using, for example, a comago pipette.
  • the immortalized stem cells of the present invention are insulin-like growth factor (IGF-1), vascular endothelial growth factor (VEGF), transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), and hepatocyte growth factor HGF. At least two or more growth factors selected from the group consisting of are secreted into the culture supernatant.
  • the “growth factor” is a general term for polypeptides that promote cell division or cause morphological changes or hypertrophy. Factors vary depending on the type of cells that produce growth factors, and are roughly classified into epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), nerve growth factor (NGF), tumor growth factor (TGF), and the like.
  • receptors on the cell membrane of each cell have tyrosine kinase activity, and when a growth factor binds, the tyrosine residue of the protein is phosphorylated, causing cell proliferation and differentiation.
  • growth factors are mesoderm inducers in ontogeny.
  • mesoderm inducers in lymphokine ontogeny that regulates the immune system.
  • Such growth factors can be quantified by a known ELISA method, microarray method or the like.
  • IGF-1 is a polypeptide having a sequence highly similar to that of insulin, and induces a mitogenic reaction or the like in the same manner as insulin in cell culture. It is known to affect the growth of nerve cells.
  • VEGF is a group of glycoproteins involved in angiogenesis that forms new blood vessels where there are no blood vessels and angiogenesis that branches from existing blood vessels to form blood vessels during the embryogenesis stage. is there.
  • TGF- ⁇ is also a potent growth inhibitory factor for many cells and is closely involved in cell differentiation, migration, and adhesion, ontogeny and tissue remodeling, wound healing, inflammation / immunity, cancer invasion / It plays an important role in a wide range of areas such as metastasis.
  • HGF is versatile not only for hepatocytes but also for various cells that promote cell proliferation, promote cell motility, induce anti-apoptosis (cell death), induce morphogenesis, and regenerate and protect other tissues and organs. It has various physiological activities.
  • the culture supernatant containing the above growth factors can be obtained by culturing the various stem cells described above in, for example, DMEM supplemented with 15% FCS at 37 ° C. for a predetermined period.
  • the stem cell culture supernatant contains about 70 types of proteins in addition to IGF-1, VEGF, TGF- ⁇ , and HGF.
  • ethanol precipitation method For example, 45 mL of 100% ethanol is added to and mixed with 5 mL of the culture supernatant and left at -20 ° C. for 60 minutes. Thereafter, the supernatant is removed by centrifugation at 15,000 ⁇ g for 15 minutes at 4 ° C. Next, for example, 10 mL of 90% ethanol is added and stirred well, and again centrifuged at 15,000 ⁇ g for 5 minutes at 4 ° C. The supernatant can be removed and the resulting pellet can be dissolved, for example, in 500 ⁇ L of sterile water. After lysis, the entire amount is collected in a micro test tube and used as a concentrated stem cell culture supernatant.
  • the culture supernatant obtained as described above can be freeze-dried according to a conventional method to obtain a composition prepared at the time of use.
  • the obtained composition can be used for forming the reservoir layer 4 used in the sheet-like piece 1 of the present invention.
  • the water-soluble polymer and monosaccharide or disaccharide are mixed at a predetermined ratio, and the freeze-dried culture supernatant powder is mixed therewith to prepare a reservoir layer forming material.
  • a reservoir layer forming material For example, about 0.2 to 4% by weight of glucose or dextran is mixed with a water-soluble polymer such as hyaluronic acid or polyvinyl alcohol, and a desired amount of the lyophilized powder of the culture supernatant is mixed therewith to form a reservoir layer.
  • a water-soluble polymer such as hyaluronic acid or polyvinyl alcohol
  • a microneedle pattern having a shape as shown in FIG. Thereafter, this pattern is transferred by electroforming to manufacture a mold for forming microneedles.
  • This mold is preferably about 8 to 20 cm on a side from the viewpoint of work efficiency.
  • the recess for forming the microneedle 4n has a conical shape with an upper diameter o1 of about 0.1 to 0.3 mm, a bottom diameter o2 of about 0.03 to 0.05 mm, and a depth t2 of about 0.6 to 1.0 mm. It is preferable to arrange in a lattice pattern.
  • This recess is preferably about 50 to 100 / cm 2 (see FIG. 2 (B)).
  • the reservoir layer forming material Water is added to the reservoir layer forming material to prepare an aqueous solution containing about 5 to 20% solids, poured into the mold at room temperature, evaporated to dryness, and then peeled off from the mold As a result, the reservoir layer 4 in which the microneedles 4n are formed can be obtained.
  • the sheet-like piece 1 produced as described above can be used as an embodiment of a hair growth promoting sheet or a whitening and wrinkle improving agent by adjusting the amount of the physiologically active substance to be used. . Therefore, in the following description, the sheet-like piece 1 is also referred to as “hair growth promoting sheet 1” or “whitening and wrinkle improving agent 1” as appropriate.
  • FIG. 9 shows a structure of a hair growth promoting sheet 10 which is another embodiment of the hair growth promoting sheet.
  • the hair growth promoting sheet 10 includes the sheet-shaped piece 1 described above; and a plurality of artificial hairs 6.
  • the artificial hair 6 is implanted in the base sheet 2 at a predetermined density as shown in FIG. As shown in FIG. 10, the artificial hair 6 passes through the base sheet 2 and the adhesion assisting layer 12 and is fixed to the base sheet 2 on the ⁇ Z direction side surface of the base sheet 2.
  • the above-described hair growth promoting sheet 10 is premised on being used by adhering the whole to the scalp, so it is preferable to use a skin base. Further, the thickness of the hair growth promoting sheet 10 is preferably 20 to 60 ⁇ m from the viewpoint of the balance between good adhesiveness and durability during attachment and detachment, and more preferably 30 to 40 ⁇ m.
  • the predetermined density is appropriately determined depending on the hair growth state of the part to which the hair growth promoting sheet 10 is applied.
  • the total number of Japanese hair is said to be about 100,000, and the hair density (number per 1 cm 2 ) is 133-249 (average 199) at the top of the hair.
  • Measured values of 114-250 (average 183), 137-235 (average 172) in the occipital region, 106-217 temporal portions (average 130) in the occipital region are published. What is necessary is just to select suitably referring to these numbers.
  • the artificial hair 6 can use fibers that are generally used for the production of wigs, such as polyester fibers, vinyl chloride fibers, acrylic fibers, flame retardant polyester fibers, and the like. From the aspect, it is preferable.
  • the artificial hair 6 is preferably fixed to the base sheet 2 with an ultraviolet curable resin. This is because, by using the UV curable property, the artificial hair 6 planted can be efficiently fixed while preventing the artificial hair 6 from coming off.
  • the hair growth promoting sheet 10 described above can be produced as follows. First, as shown in FIG. 11A, a base sheet 2, a reservoir layer 4, an adhesion auxiliary layer 12, a holding member H, a plurality of artificial hairs 6 and various adhesives are prepared.
  • the adhesion auxiliary layer 12 is detachably bonded to the + Z direction side surface of the base sheet 2 using one adhesive to form the laminate 1a shown in FIG.
  • a plurality of artificial hairs 6 are implanted at a predetermined density so as to penetrate the adhesion assisting layer 12 and the base sheet 2 of the laminated body 1a, thereby producing an intermediate material 10a shown in FIG.
  • the artificial hair 6 is implanted into the laminate 1a by a V-type flocking method.
  • a pair of guides that can move the artificial hair 6 cut to a certain length in the Z-axis direction on the ⁇ Z direction side of the base sheet 2.
  • the needle 15 is locked.
  • the guide needle 15 is moved in the + Z direction while the artificial hair 6 is locked.
  • the guide needle 15 moves in the + Z direction and is pulled out while leaving the root 6a of the artificial hair 6 on the ⁇ Z direction side of the base sheet 2.
  • an ultraviolet curable adhesive is applied to the root 6a remaining on the ⁇ Z direction side of the base sheet 2 and cured by irradiating with ultraviolet rays. In this way, the artificial hair 6 is implanted into the laminate 1a.
  • the reservoir layer 4 is firmly bonded to the surface on the ⁇ Z direction side of the base sheet 2 of the intermediate member 10a using an adhesive, and the state shown in FIG. The intermediate material 10b is produced.
  • forming the reservoir layer 4 by laminating the above-described uniform layer having the microneedles 4n on the entire back surface of the base sheet 2 ensures improved adhesion and a natural appearance.
  • the thickness is about 1.5 to 2 times the thickness of the base sheet 2 (about 45 to 80 ⁇ m) to maintain the tensile strength of the hair growth promoting sheet of the present invention and the artificial hair ( It is sometimes referred to as “hair material.”) 6 is preferable because it can be stabilized.
  • the adhesive layer 5 is formed by applying a pressure-sensitive adhesive to the portion of the intermediate material 10b where the microneedles 4n are not formed on the side surface of the reservoir layer 4 in the ⁇ Z direction, and the intermediate layer shown in FIG.
  • the material 10c is produced.
  • the holding member H is bonded to the ⁇ Z direction side surface of the adhesive layer 5 of the intermediate material 10c.
  • the hair growth promoting sheet 10 is produced.
  • the hair growth promoting sheet 10 thus produced is placed on a ring-shaped sheet holder provided on a metal plate member having a desired thickness and a desired size, or a plate member made of plastic. And product.
  • the hair growth promoting sheet 10 of the present invention has the adhesive layer 5 formed in a lattice shape, it does not unnecessarily suppress the growth of hair appearing from the skin. As a result, prompt hair growth can be realized.
  • whitening and A wrinkle improving agent can be produced.
  • the produced whitening and wrinkle improving agents can be cut into various sizes depending on the application, as shown in FIGS. 18 (A) to (D), and retained as in the case of the sheet-like piece 1. It can be put on the member H to make a product.
  • E. coli competent cells Supercharge EZ10 Electrocompetent Cells, product code 636756), Swa I (product code 1111A, Smi I is equivalent), Xho I (product code 1094A), T4 DNA Ligase (product) Code 2011A), NucleoBond Xtra Midi (product code 740410.10 / .50 / .100), and NucleoSpin Plasmid (product code 740588 10/50/250) were all purchased from Takara Bio Inc. Pac I was purchased from New England Biolabs.
  • Buffer 1 25 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 10 mM EDTA and 50 mM glucose (stored at 4 ° C. after autoclaving)
  • Buffer 2 0.2M NaOH containing 1% SDS (prepared immediately before use, sealed, and stored at room temperature)
  • Buffer 3 5M KOAc (after autoclaving, store at 4 ° C)
  • Buffer 4 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 1 mM EDTA, 20 ⁇ g / mL RNase (Add RNase immediately before use. Store at -20 ° C)
  • HEK293 cells (ATCC # CRL1573) transformed with human type 5 adenovirus were used.
  • HEK293 cells were cultured in complete medium.
  • the composition of the complete medium was DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, basic medium) supplemented with 100 unit / mL penicillin G sodium, 100 ⁇ g / mL streptomycin, 4 mM L-glutamine and 10% FBS.
  • the penicillin G sodium solution was prepared at 10,000 units / mL
  • the streptomycin sulfate solution was prepared at 10,000 ⁇ g / mL and stored as a stock solution.
  • 60 mm plate, 100 mm plate, 6-well plate, T75 and T175 flasks were used.
  • Trypsin-EDTA (product code CC-5012) was purchased from Takara Bio Inc. Phosphate buffered saline (without PBS, Ca2 + and Mg2 + ) and Dulbecco's phosphate buffered saline (with DPBS, Ca2 + and Mg2 + ) were prepared. Further, a 0.33% neutral red staining solution and a 0.4% trypan blue staining solution were used.
  • X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-galactopyranoside (25 mg / mL)) dimethylformamide (DMF) solution was stored at ⁇ 20 ° C. protected from light.
  • Luminescent ⁇ -gal Detection Kit II (product code 631712, manufactured by Takara Bio Inc.) was used.
  • pShuttle2-lacZ positive control vector included in Adeno-X Expression System 1
  • Adeno-X Viral DNA PI-Sce I and I-Ceu I digested
  • a recombinant adenovirus containing lacZ was constructed according to the attached protocol.
  • the target cell, SHED was infected and assayed for ⁇ -galactosidase expression to confirm that the vector was constructed.
  • rpShuttle 2 Vector Prior to construction of recombinant pShuttle 2 Vector (hereinafter referred to as “rpShuttle 2 Vector”), DH5 ⁇ was obtained using the pShuttle 2 Vector and pShuttle 2-lacZ Vector included in the kit. E. coli was transformed. A transformant was selected on an LB agar plate (hereinafter referred to as “LB / Kan”) containing 50 ⁇ g / mL kanamycin, and the cells taken from a single colony were streaked to a new LB / Kan. Incubate overnight at ° C.
  • LB / Kan LB agar plate
  • hTERT, bmi-1, HPV-E6, and HPV-E7 were cloned into pShuttle®2 by the following procedure.
  • PShuttle-2 vector was cleaved with restriction enzymes suitable for these genes.
  • pShuttle 2 Vector Information Packet PT3416-5 attached to the above kit, a multicloning site matching the DNA to be inserted was determined.
  • the above plasmid treated with the restriction enzyme was purified by treatment with alkaline phosphatase.
  • the target DNA fragment was prepared and purified according to a conventional method.
  • the vector digested with the restriction enzyme and the gene fragment were ligated, and DH5 ⁇ cells (competent cells) were transformed with the ligation product.
  • a part of the above competent cells was taken and transformed with the control vector pShuttle2-lacZ Vector included in the kit as a positive control.
  • the mixed solution containing transformed E. coli was inoculated on an LB / Kan agar plate, and kanamycin resistant (Kanr) transformants (colony) were selected. Five to ten Kan resistant clones were selected and inoculated into a small amount of liquid medium for amplification. After confirming that these clones had rpShuttle 2 Vector, they were incubated overnight. Thereafter, the constructed plasmid DNA was purified by a conventional method using a commercially available silica adsorption column.
  • rpShuttle2 plasmid DNA Recombinant pShuttle 2 plasmid DNA
  • rpShuttle2 plasmid DNA was directly transfected into target cells, and Western blotting was performed to preliminarily check the expression of the target protein.
  • Phenol chloroform: isoamyl alcohol extraction
  • a centrifuge tube add 70 ⁇ L of 1 ⁇ TE Buffer (pH 8.0) and 100 ⁇ L of PCI mixture to the remainder of the double digestion solution (25 ⁇ l), Vortex thoroughly.
  • the mixture was centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., and the aqueous layer was transferred to a clean 1.5 mL microcentrifuge tube. 400 ⁇ L of 95% ethanol, 25 ⁇ L of 10M ammonium acetate, and 1 ⁇ L of glycogen (20 mg / mL) were added thereto, and the mixture was vortexed well.
  • the mixture was centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., and the supernatant was removed by aspiration to obtain a pellet.
  • 300 ⁇ L of 70% ethanol was added and centrifuged at 14,000 rpm for 2 minutes at room temperature. The supernatant was carefully aspirated off and the pellet was air dried at room temperature for approximately 15 minutes. After the pellets were dried, they were dissolved in 10 ⁇ L of sterilized 1 ⁇ TE Buffer (pH 8.0) and stored at ⁇ 20 ° C. until use.
  • the mixture was centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., and the supernatant was removed by aspiration to obtain a pellet.
  • the following ethanol precipitation operation was performed in the same manner as in the above (3-4). After the pellet dried, it was dissolved in 15 ⁇ L of sterile deionized water.
  • Adeno-X plasmid DNA was purified according to the mini-scale method described later.
  • the cell suspension was centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., and the clear supernatant was transferred to a clean 1.5 mL centrifuge tube.
  • 450 ⁇ L of a PCI mixed solution was added, mixed by inversion and stirred. Thereafter, the mixture was centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., and the aqueous layer was transferred to a clean 1.5 mL microcentrifuge tube.
  • the following ethanol precipitation was performed in the same manner as in (4-1) above, and the pellet solution was stored at ⁇ 20 ° C. until use.
  • the target rDNA was identified by restriction enzyme analysis and PCR described below.
  • Each culture plate is transfected with 10 ⁇ L of Pac-I-digested Adeno-X plasmid DNA, and AdEK- X DNA was introduced. From the day after transfection, it was confirmed whether CPE (cytopathic effect) occurred. One week later, the cells adhering to the bottom and sides of the culture plate were gently agitated to release them. The resulting cell suspension was transferred to a 15 mL sterilized conical centrifuge tube and centrifuged at 1,500 ⁇ g for 5 minutes at room temperature.
  • the obtained precipitate was suspended in 500 ⁇ L of sterile PBS.
  • the freeze-thaw operation of freezing in dry ice / ethanol and thawing in a constant temperature bath at 37 ° C. was repeated three times to obtain a lysate in which cells were sufficiently thawed.
  • the suspension was lightly centrifuged to remove the suspended matter, and the supernatant was transferred to another sterilized tube and used immediately.
  • the portion not used immediately was stored at -20 ° C. 250 ⁇ L of the lysate was added to cultured cells on a 60 mm plate, and the culture was continued.
  • CPE was confirmed by culturing at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 3 to 4 days.
  • a free cell suspension was prepared in the same manner as above and transferred to a 15 mL sterilized conical centrifuge tube. Freezing and thawing operations similar to the above were performed to thaw the cells.
  • a titer of 10 7 PFU / mL was obtained using the Adeno-X Rapid Titer Kit (product code 631028). Western blotting was performed to confirm that the packaged adenovirus genome has a functional copy of the transcription unit specific for the gene of interest.
  • Adenovirus infection to target cells (7-1) Infection to target cells 6-well plates were inoculated with 1 ⁇ 10 6 SHEDs 24 hours before infection. The day after inoculation, the medium was removed and 1.0 mL of medium containing virus was added to the center of each plate. This solution was spread evenly over the monolayer formed by SHED.
  • the cells were cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 4 hours, and the virus was infected with SHED. Then, a fresh medium was added and further cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 . Transgene expression was analyzed over time from 24 to 48 hours after infection.
  • the cells separated by filtration were resuspended in 4 mL of the above medium and seeded in an adherent cell culture dish having a diameter of 60 mm.
  • DMEM containing 10% FCS and (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) was added to the dish and about two weeks incubation at adjusted incubator in 5% CO 2, 37 °C.
  • the adherent cells (dental pulp stem cells) that formed colonies were treated with 0.05% trypsin / 0.2 mM EDTA for 5 minutes at 37 ° C., and the cells detached from the dish were collected.
  • adherent cells selected as described above are seeded in an adherent cell culture dish (collagen-coated dish), primary cultured in an incubator adjusted to 5% CO 2 and 37 ° C., and primary cultured. Cells were used. When the cells become sub-confluent (about 70% of the surface of the culture container) or confluent by visual observation, the cells are treated with 0.05% trypsin and 0.2 mM EDTA for 5 minutes at 37 ° C. It peeled off and collect
  • SHED was fixed with 3% paraformaldehyde, rinsed twice with PBS, and treated with 100 ⁇ M glycine for 20 minutes. These cells were then permeabilized with 0.2% Triton-X (Sigma-Aldrich) for 30 minutes and then incubated in a mixture of 5% donkey serum and 0.5% bovine serum albumin for 20 minutes.
  • the cells were incubated with a mouse anti-human STRO-1 antibody (1: 100, manufactured by R & D) for 1 hour as a primary antibody, and a goat anti-mouse immunoglobulin M-FITC antibody (1: 500, secondary antibody). Incubated with Southern Biotech) for 30 minutes and mounted using VectorShield DAPI (Vector Laboratories Inc.). Thereafter, ⁇ -MEM supplemented with 15% FBS was placed in a 6-well plate, and the sorted cells were seeded for clone preparation. Approximately 300 colonies from the expanded cells were pooled for testing.
  • SHED-T SHED-T
  • SHED-C SHED-C
  • FIG. 5 shows the doubling state of the number of individuals of SHED-T (SHED into which gene was introduced).
  • the vertical axis represents the number of individual doublings (number of cell divisions, times), and the horizontal axis represents time (culture days).
  • SHED-C stopped growing after about 30 times, and entered the aging or growth stopping stage.
  • SHED-T exceeded 250 PD and proliferated after 800 days.
  • SHED-C the proportion of STRO-1 positive cells was 27% in PD20 and decreased to 15% in PD30 (FIGS. 8A and 8B).
  • SHED-T the proportion of STRO-1 positive cells was 46% for PD20 and 41% for PD40, respectively (FIGS. 6C and 6D).
  • transplant 8 weeks after transplantation, the transplant was collected, fixed with 4% formalin, decalcified, and buffered with a PBS solution containing 10% EDTA for embedding in paraffin. Some were stored in 70% ethanol solution for plastic embedding.
  • Paraffin sections were deparaffinized, hydrated, and stained with hematoxylin and eosin (hereinafter referred to as “H & E”).
  • 7 (A) to (C) show stained images of PD0 to PD20 of SHED-T (immortalized stem cells), and (D) to (F) of PD0 to PD20 of SHED-C (normal cells). A stained image is shown.
  • a specific area was selected, and for each implant formed after SHED-T transplant or SHED-C transplant, And the amount of new bone was determined from these values.
  • New bone mass new bone area / visual field area ⁇ 100
  • FIG. 8 shows changes in the amount of new bone between SHED-T and SHED-C at each individual doubling number (doubling time).
  • ** represents p ⁇ 0.05
  • *** represents p ⁇ 0.01.
  • the amount of new bone was calculated
  • SHED-C the amount of new bone decreased as the number of individuals increased, and with PD20, it decreased to about 1/5 of PD0.
  • SHED-T the amount of new bone hardly changed until PD20, and it was shown that in PD20, SHED-T formed more than five times the bone of SHED-C.
  • SHED-C and SHED-T cells were transplanted into the subcutaneous tissue of immunocompromised mice. After the transplantation, observation was performed for 30 days or more. During this period, no tumor was formed in any mouse transplanted with the above cells. In SHED-T cells, there was no change in the morphology of all clones of 40-200 PD cultured cells. From the above, it was shown that SHED-T has no carcinogenic activity.
  • SHED-T was shown to have the ability to proliferate while maintaining differentiation ability even when exceeding 260 PD, SHED-C was aged at 30 PD or less, although it had differentiation ability. . From the above, it was shown that SHED-T is an immortalized cell and is suitable for mass production of highly active SHED culture supernatant.
  • a sheet was formed from a commercially available photosensitive resin, and a microneedle pattern having a shape as shown in FIG. 2A was produced using a photolithography method. Thereafter, this pattern was transferred by electroforming to produce a mold for forming microneedles.
  • This mold was a square of about 10 cm square on one side or a rectangle of 7 cm ⁇ 15 cm.
  • the recesses for forming the microneedles were arranged in a lattice shape so as to form a conical shape having an upper diameter of about 0.2 mm, a bottom diameter of about 0.04 mm, and a depth of about 0.8 mm.
  • the number of the concave portions was about 75 / cm 2 .
  • the hair growth promoting sheet 1 produced as described above was produced by the procedure shown in FIGS. 3 (A) to 4 (B).
  • the hair growth promoting sheet 1 prepared as described above was attached to a male head as shown in FIG. After the hair growth promoting sheet 1 was applied and adhered to the scalp, the adhesion auxiliary layer was peeled off from the base sheet.
  • the results of photographing with a digital camera using a base without a hair material implanted are shown in FIGS. 16 (A) to (C). Shown in
  • Fig. 16 (A) shows the state of the hair before application
  • Fig. 16 (B) shows the state of the hair 3 to 7 days after application
  • Fig. 16 (C) shows 1-3.
  • the hair growth promoting sheet of the present invention was applied, hair growth was observed after 3 days, and thereafter it became clear that the amount of hair growth increased over time.
  • FIGS. 16 (B) 1 to 3
  • FIGS. 16 (C) In particular, in the photograph after 7 days, it was observed that a plurality of hairs were extended from one place (see FIG. 16 (C) 3).
  • FIG. 17A shows the change in state when the hair growth promoting sheet of the present invention is applied to the part that has become gray hair.
  • the left-hand photo in (A) is the photo before the start of pasting, and the right-hand photo is a photo of about two months after the pasting was performed five times. In the part where hair loss had occurred, only white hair was applied before application, but it was confirmed that the amount of hair growth increased and black hair had grown.
  • FIG. 17 (B) shows the change in state when the hair growth promoting sheet of the present invention is applied to the hair removal portion.
  • the left-hand photo of (B) is the photo before pasting
  • the right-hand photo of (B) is the photo about two months after the pasting. In the area where hair loss had occurred, a slight amount of gray hair remained before being applied, but the amount of hair growth was clearly increased, and it was confirmed that black hair had grown.
  • the present invention is extremely useful in the field of beauty.

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Abstract

弾性材料からなるベースシートと；生理活性物質を含有し、かつ、マイクロニードルを備え、前記ベースシート上に設けられたリザーバ層と；前記リザーバ層上にメッシュ状に形成される接着層と；前記リザーバ層が形成されている面と反対側の前記ベースシートの面上に形成された接着補助層と；を備えるシート状小片を提供する。また、このシート状小片を含む発毛促進用シート、及び美白及び皺改善剤を提供する。この結果、使用することによって、薄くなってしまった頭髪の状態を薄くなる前の状態に回復させることができる発毛促進用シート、美白効果及び皺改善効果を奏する美白及び皺改善剤、並びに、これらに使用するシート状小片を提供することができる。

Description

シート状小片、その小片を含む発毛促進用シート、並びに、その小片を含む美白及び皺改善剤
　本発明は、シート状小片、その小片を含む発毛促進用シート、並びに、美白及び皺改善剤に関する。より詳細には、所定の生理活性物質を局所的に吸収させ、前記生理活性物質の作用を発揮させるためのシート状小片、及びその小片を含む発毛促進用シート、並びに、美白及び皺改善剤に関する。
　加齢や疾病等に起因して、白髪が増える、頭髪が細くなる、頭髪が抜けて全体に本数が減るといったことが起こる。さらに、円形脱毛症をはじめとする種々の疾病により、毛髪が部分的に失われることもある。また、頭髪のみならず、シミや皺といった肌の老化が進むことはよく知られている。こうした肌の老化は、加齢のみならず、日焼け等他の要因によっても、生じることがある。
　とりわけ、毛髪が抜けた後に、太い毛が生えて来ない場合には、毛髪が失われたり細くなったりしてその部分の地肌が見えるようになる。特に、毛髪の色が濃い場合には、髪が細くなったり抜けたりしていることが目立ちやすい。
　こうした場合、毛髪が抜ける前と同じ太さの毛髪の発毛を促すことは非常に難しく、かつらが使用されてきた。かつらは、頭部全体を覆うように、頭にかぶるタイプの繰り返し使用できるかつらと、植毛材を植え付けたベースシートと、このベースシートを頭皮に貼付するための粘着層とを備える使い捨てかつら（以下、「部分かつら」ということがある）とに大別される（特許文献１参照）。
　上記使い捨てかつらは、使用に際しては、外観上不自然な感じを与えないことが重要であり、このためには、頭皮への良好なフィット性が求められる。現在では、極薄シートからなるベースシートと上記ベースシートに植付けられた植毛材と上記ベースシートの裏面に設けられる粘着層とからなるかつらが提案されている（特許文献２参照。以下、「従来技術１」という。）。
　また、粘着層の粘着力を比較的低くしつつ、再利用可能な部分を使い捨ての部分から分離することによって、比較的長期間の使用に耐えることができる、再製性使い捨てかつらが提案されている（特許文献３、以下、「従来技術２」という。）
　さらに、シミを目立たなくする美白化粧品、皺を改善するしわ取り化粧品等も、様々な成分を含むものが市販されている（非特許文献１参照。以下、「従来技術３」という）。
特許第3484565号公報 特許第4009910号公報 特開2012-92464号公報
http://www.sk-ii.jp/ja/whats-new/skin-solutions/Four-Steps-To-Reducing-Spots.aspx?utm_source=yahoo&utm_medium=cpc&utm_content=pc_cpc&utm_campaign=skincare
　従来技術１及び２は、かつらを使用することで、現在薄くなってしまっている頭髪の状態を薄くなる前の状態のように見せることができるという点では優れた技術である。
　しかし、従来技術１及び２で提案されている使い捨てかつらを使用しても、頭髪が薄くなる前の状態に戻る訳ではないため、頭髪の状態の変化に合わせながら、ずっと使用し続けなければならないという問題があった。
　なお、従来技術２では、従来技術１について改善が望まれる事項のいくつかが解消されているが、依然として、利用者が自らかつらを頭部に装着することが困難であることには変わりがない。すなわち、かつらのベースシートが３０μｍ程度の極薄のシートであるため、装着の際、ベースシートが不規則に変形してしまい、利用者が自らかつらを頭部に装着することが実質的にできなかった。このため、利用者がかつらの購入店に来店し、専門家により取り付けてもらわなければならなかった。
　しかし、かつらの取り付けの際に人目に曝され、気恥ずかしさを覚えるので、利用者は来店を嫌がる傾向がある。ハゲ、特に若ハゲの場合、利用者は、かつらを装着したい願望があるものの、来店しての装着が気恥ずかしく、結局、かつらの装着を断念することが多い。この結果、利用者となるべき者の行動が消極的となったり、暗い性格となったりすることが知られている。
　また、もともと、頭髪の色が濃い場合には頭髪が薄くなったことが目立ちやすく、頭髪の状態によって年齢が高く判断されるため、若々しい感じを与えるために、頭髪を増やすことについて、強い社会的な要請があった。さらに、頭髪を増やすことができればかつらを使用することも不要になり、かつらの装着に要する時間及びコストを節約できるため、こうした面からの要請も大きい。
　さらに、近年、美白効果を示す化粧品が注目され、多くの種類の化粧品が市販されている（従来技術３）が、白斑等の副作用が発生し、大きな問題となっている。皮膚細胞内でのメラニン合成を抑制すると、美白効果が現れると考えられており、チロシナーゼの活性抑制剤等が化粧品に配合されている。
　しかし、美白や皺取り用の化粧品は、塗布後にひりひりする等の不快感が生じる、短期間しか効果を維持できないといった問題点があった。このため、美白や皺取り用の化粧品に対する、社会的要請が増大しつつある。
　本願発明は、上記のような事情のもとで完成されたものであり、使用することによって、薄くなってしまった頭髪の状態を薄くなる前の状態に回復させることができる発毛促進用シートを提供することを目的とする。
　すなわち、本願発明の第１の態様は、弾性材料からなるベースシートと；生理活性物質を含有し、かつ、前記ベースシート側とは反対方向に延びる複数のマイクロニードルが形成され、前記ベースシートの一方側の表面上に設けられたリザーバ層と；前記リザーバ層の前記ベースシート側とは反対側の表面上にメッシュ状に形成される接着層と；前記リザーバ層が形成されている面と反対側の前記ベースシートの面上に剥離可能に形成された接着補助層と；を備え、前記マイクロニードルの先端部は、前記接着層から突出している、ことを特徴とするシート状小片である。
　ここで、前記弾性材料は、透湿性を有する厚み0.1mm未満の半透明合成樹脂で構成されていることが好ましい。また、前記リザーバ層は、水溶性高分子と単糖類又は二糖類との混合物、及び、前記生理活性物質の混合物を含むことが好ましい。
　また、前記水溶性高分子は、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、デキストリン、デキストラン、プロテオグリカン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースヒアルロン酸、及びそれらの生理学的に許容される塩からなる群から選ばれる少なくともいずれかであることが好ましい。前記単糖類又は二糖類は、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、トレハロース及びこれらの２以上の混合物からなる群から選ばれるいずれかであることが好ましい。
　また、前記生理活性物質は、歯髄幹細胞の培養上清中に含まれるものであることが好ましく、前記歯髄幹細胞の培養上清は、凍結乾燥粉末であることが好ましい。そして、前記歯髄幹細胞は、（ｉ）ｂｍｉ－１、ＨＰＶ－Ｅ６及びＨＰＶ－Ｅ７からなる群から選ばれる少なくとも１種以上の遺伝子と、（ii）ｈTERT又はｐＴＥＲＴのいずれかの遺伝子との組み合わせを導入した不死化細胞であることが好ましい。さらに、前記歯髄幹細胞は、ヒト又はブタ由来であることが好ましい。
　前記接着層は、医療用シリコン系接着剤で形成されていることが好ましい。さらに、接着補助層は、スポンジ状部材で構成されていることが好ましく、前記スポンジ状部材は、ウレタン、シリコン、パルプ紙、スチロール、ビニール、及び布からなる群から選ばれる素材で構成されていることが好ましい。
　また、前記リザーバ層が形成されている面と反対側の前記接着層の面上に剥離可能に配置され、枠型形状を有する保持部材をさらに備え、前記保持部材は、前記接着層から突出しているマイクロニードルの先端部の高さよりも長い厚みを有するようにすることが好ましい。ここで、前記保持部材を、プラスチック製又は金属製シート状部材とすることが好ましい。当該金属製シート状部材としては、アルミ製部材を採用することができる。
　本発明の別の態様は、発毛促進用シートにおいて、本発明のシート状小片を備える、ことを特徴とする発毛促進用シートである。ここで、前記シート状小片が備えるベースシートに所定の密度で植え込まれた人工毛髪を更に備えるようにすることができる。ここで、前記人工毛髪が紫外線硬化性の樹脂により、前記ベースシートに固定されていることが好ましい。また、前記ベースシートの底面積が、指頭の表面積と同等の面積となっていることが好ましい。
　さらに、前記人工毛髪が、前記接着補助層を貫通して、前記ベースシートに植え込まれていることが好ましい。ここで、前記人工毛髪は、前記ベースシートを貫通し、前記ベースシートの前記リザーバ層側で、前記ベースシートに固定されていることが好ましい。
　また、本発明の発毛促進用シートでは、前記シート状小片を保持し、前記シート状小片における接着層から突出しているマイクロニードルの先端部の高さよりも長い厚みを有する枠型形状の保持部材をさらに備えることが好ましい。こうした保持部材としては、プラスチック製又は金属製シート状部材であることが好ましい。ここで、前記金属製シート状部材は、アルミ製であることが好ましい。
　本発明のさらに別の態様は、リザーバ層が凍結乾燥培養上清を含有する上記シート状小片を含む美白及び皺改善剤である。シート状小片を保持するための保持部材をさらに備えることが好ましく、前記保持部材は、プラスチック製又は金属製シート状部材であることが好ましい。ここで、前記金属製シート状部材は、アルミ製であることが好ましい。
　本発明によれば、種々の大きさに加工できるため、頭部、顔面等の様々な部位に適切な大きさで貼付することができ、生理活性物質を効率よく導入できるシート状小片を提供することができる。
　また、本発明によれば、頭髪がほぼなくなっているか又は薄くなっている部分に貼付することにより、当該部分における発毛を促進することができる発毛促進用シートを提供することができる。さらに、本発明によれば、シミのある部分や皺の深い部分に貼付することにより、シミや皺を薄くするといった美白効果や皺の改善効果を発揮する、美白及び皺改善剤を提供することができる。
図１は、本発明のシート状小片の構造を示す模式図である。 図２は、マイクロニードルの形状を示す模式図である。（Ａ）は断面図、（Ｂ）は斜視図である。 図３は、図１のシート状小片の作製工程を説明する図（その１）である。 図４は、図１のシート状小片の作製工程を説明する図（その２）である。 図５は、本願発明の発毛促進用シートの作製で使用する培養上清を産生する不死化幹細胞の個体倍加回数の経時変化を示すグラフである。 図６は、上記不死化幹細胞におけるSTRO-1の発現が、個体倍加回数（PD）の増加に従って減少するか否かを確認したときのグラフである。 図７は、上記不死化幹細胞の骨形成能が、個体倍加回数（PD）の増加に従って減少するか否かを確認したときのヘマトキシリン－エオシン染色の結果を示す図である。
図８は、上記不死化幹細胞の個体倍加数と上記培養上清の新生骨の骨量産生能の変化を示すグラフである。 図９は、使い捨てかつらの機能も有する本発明の発毛促進用シートの構造を示す模式図である。 図１０は、図９の発毛促進用シートの断面図である。 図１１は、図９のシート状小片の作製工程を説明する図（その１）である。 図１２は、図９のシート状小片の作製工程を説明する図（その２）である。 図１３は、人工毛髪をベースシートに植え付ける様子を示す図（Ａ）、及び、（Ａ）におけるＢ部の拡大図（Ｂ）である。人工毛髪の植え込みを説明するための図である。 図１４は、図９のシート状小片の作製工程を説明する図（その３）である。 図１５は、本発明の発毛促進用シートを頭部に貼付したときの写真である。 図１６は、本発明の発毛促進用シートを貼付前の頭皮の状態（Ａ）、装着３日後の頭皮の状態（Ｂ）、装着７日後の頭皮の発毛状態（Ｃ）をそれぞれ示す拡大写真である。 図１７は、本発明の発毛促進用シートの頭部への貼付前後の変化を示す写真である。（Ａ）は頭頂部、（Ｂ）は耳の後ろの円形脱毛症部分にそれぞれ貼付したときの変化を示す。 図１８は、本発明の美白及び皺改善剤の形状のバリエーションを示す模式図である。図中、（Ａ）はシミ取り用、（Ｂ）は目の周りの皺改善用、（Ｃ）はほうれい線の改善用、（Ｄ）は額の皺改善用の美白及び皺改善剤を示す模式図である。
　以下に、本願発明をさらに詳細に説明する。なお、以下の説明又は図面においては、同一又は同等の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。
　図１に示されるように、本願発明の係るシート状小片１は、（ａ）弾性材料からなるベースシート２と；（ｂ）生理活性物質を含有し、かつ、ベースシート２側とは反対方向（－Ｚ方向）に延びる複数のマイクロニードル４ｎが形成され、ベースシートの一方側（－Ｚ方向側）の表面上に設けられたリザーバ層４と；（ｃ）リザーバ層４のベースシート側とは反対側（－Ｚ方向側）の表面上にメッシュ状に形成される接着層５と；（ｄ）リザーバ層が形成されている面と反対側（＋Ｚ方向側）のベースシート２の面上に剥離可能に形成された接着補助層１２と；を備えている。ここで、マイクロニードル４ｎの先端部は、接着層５から突出している。
　また、シート状小片１は、（ｅ）リザーバ層４が形成されている面と反対側（－Ｚ方向側）の接着層５の面上に剥離可能に配置され、枠型形状を有する保持部材Ｈをさらに備えている。ここで、保持部材Ｈは、接着層５から突出しているマイクロニードル４ｎの先端部の高さよりも長い厚みを有している。
　なお、複数のシート状小片１が、金属性の板状部材、又はプラスチック製の板状部材上に載置される。ここで、当該板状部材には、シート状小片１の保持部材Ｈの－Ｚ方向側面が接着剤により強固に接着される。このように板状部材に載置されたシート状小片１は、板状部材上に保持部材を残した状態で、板状部材から剥離されるようになっている。
　保持部材Ｈは、上記シート状小片１に形成されているマイクロニードル４ｎを保護するために、シート状小片と一致した形状の環状部材を備えるプラスチック製又は金属製シート状部材であることが製品の重量及びコストの面から好ましい。前記保持部材が金属製シート状部材である場合は、アルミ製であることが加工のし易さ等の点から好ましい
　上記のベースシート２を構成する弾性材料は、透湿性を有し、厚みが0.1mm未満の、半透明の合成樹脂という３つの特徴を備えるものであることが好ましい。これは、以下の３つの理由による。
　第１に、透湿性がないと皮膚に接着した場合には、後に汗に含まれる水分が蒸発せずに蒸れてしまい、不快であるばかりでなく、皮膚にも悪影響が出ることがある。第２に、厚みが0.1 mm以上では、皮膚に自然に沿わせて接着することができず、例えば、発毛促進用シートを頭皮に接着した場合や、美白及び皺改善剤を皮膚に貼付した場合に、外観上、前記発毛促進用シートを使用していることが視認できるような不自然さが残る。第３に、半透明の素材としておくと、皮膚のどのような位置に貼付した場合でも、前記発毛促進用シートを使用していることが目立たない。
　こうした弾性素材としては、例えば、ポリウレタン樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂等を挙げることができ、シリコン素材のものを好適に使用することができる。透湿性を有する半透明合成樹脂の厚みは、約20～約60μmであると、皮膚に対するフィット性がよく、さらに貼付していることが目立たないからである。なお、こうした素材を、本発明の美白及び皺改善剤に使用した場合には、例えば、顔に貼付した後、その上から化粧をすることも可能である。
　上記のリザーバ層４は、図２に示されるように、－Ｚ方向に延びる複数のマイクロニードル４ｎが形成されている。マイクロニードル４ｎを形成するための凹部は、上部直径o1が約0.1～0.3mm、底部直径o2が約0.03～0.05mm、深さｔ２が約0.6～1.0mmの円錐形状をなしており、格子状に配列されていることが好ましい。この凹部は、約50～100個/cm2であることが好ましい。
　リザーバ層４は、水溶性高分子と単糖類又は二糖類の混合物及び前記生理活性物質の混合物を含むことが好ましい。前記水溶性高分子は、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、デキストリン、デキストラン、プロテオグリカン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースヒアルロン酸、及びそれらの生理学的に許容される塩からなる群から選ばれる少なくとも１つであることが好ましくい。
　これらの成分によって、適度な大きさのマイクロニードル４ｎを形成させることができ、形成されたマイクロニードル４ｎによって、後述する生理活性物質が効率よく皮膚に導入されるからである。これらの中でも、ヒアルロン酸を使用することが好ましい。また、前記単糖類又は二糖類は、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、トレハロース及びこれらの２以上の混合物からなる群から選ばれるいずれかであることが好ましい。コスト及び刺激性の点から、グルコースを使用することが好ましい。
　上述の水溶性高分子と単糖類又は二糖類との組成物中の上記単糖類又二糖類の含有量は、0.2～４重量％とすることが、マイクロニードル４ｎの皮膚内における溶解時間及び機械的強度の点から好ましい。単糖類又は二糖類の含有量が５％を超えるとマイクロニードルの皮膚内での溶解時間が30分以内と短くなりすぎるため、これらの含有量を0.2～４重量％とすることが好ましい。
　また、上記の接着層５は、医療用シリコン系接着剤で形成されていることが好ましい。貼付した後にかぶれる、剥がした後に皮膚が赤くなるといった問題が生じないからである。さらに、前記接着層５のメッシュから、適切な大きさのマイクロニードル４ｎが突出していることが、前記生理活性物質を効率よく皮膚に導入することができるために好ましい。
　また、上記の接着補助層１２は、スポンジ状部材で構成されていることが好ましく、取扱い安く、安全で低コストであることから、ウレタン、シリコン、パルプ紙、スチロール、ビニール、及び布からなる群から選ばれる素材であることが好ましい。
　上述したシート状小片１は、以下のようにして作製することができる。まず、図３（Ａ）に示されるように、ベースシート２、リザーバ層４、接着補助層１２、保持部材Ｈ及び各種の接着剤を準備する。
　次に、ベースシート２の＋Ｚ方向側表面に一の接着剤を用いて接着補助層１２を剥離可能に接着し、図３（Ｂ）に示される積層体１ａを形成する。こうして接着補助層１２を設けることが、この後のリザーバ層４等を形成する上で、作業を効率的に行うことができる点から好ましい。
　次いで、ベースシート２の－Ｚ方向側表面に他の接着剤を用いてリザーバ層４を強固に接着し、図３（Ｃ）に示される積層体１ｂを形成する。引き続き、リザーバ層の－Ｚ方向側面におけるマイクロニードル４ｎが形成されていない部分に、メッシュ状に粘着剤を塗布して接着層５を形成し、図４（Ａ）に示されるように積層体１ｃを形成する。
　次いで、積層体１ｃを所望の大きさにカットした後、接着層５の－Ｚ方向側表面に保持部材Ｈを接着する。この結果、図４（Ｂ）に示されるように、シート状小片１が作製される。
　こうして作製されたシート状小片１を、所望の厚みを有する所望の大きさの金属性の板状部材、又はプラスチック製の板状部材上に設けられたリング状のシートホルダー上に載置し、製品とする。
　なお、リザーバ層４に含まれる生理活性物質は、以下のようにして得ることができる。
　まず、上記生理活性物質を含む培養上清の産生に使用する歯髄幹細胞を準備する。こうした幹細胞は、(ｉ)bmi-1、HPV-E6及びHPV-E7からなる群から選ばれる少なくとも１種以上の遺伝子と、(ii)hTERT又はpTERTのいずれかの遺伝子との組み合わせを導入したものである。これらの遺伝子の組み合わせを導入すると、歯髄幹細胞を100代以上、継代することができるからである。
　上記歯髄幹細胞の作製に当たっては、まず、哺乳類の歯髄細胞を以下のようにして単離する。ここで、「歯髄幹細胞」とは、再生能を有する歯の神経に含まれる幹細胞の一種をいう。歯という硬質の材料に保護されているため紫外線や放射線を通さず、遺伝子も傷つきにくいという特性を有する。
　上記遺伝子のうち、hTERTはヒトテロメア修復酵素を、また、pTERTはブタのテロメア修復酵素をそれぞれコードする遺伝子である。bmi-1はBmi-1（ポリコーム複合体を構成するたんぱく質の１つ）を産生する遺伝子である。Bmi-1は造血幹細胞の維持に必要であり、活性増強により造血幹細胞を増やすことができる。また、HPV-E6及びE7はHPV-16又はHPV-18の初期遺伝子であり、これらのヒトパピローマウイルスが自己複製のために使用する初期遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム中に存在する遺伝子である。
　以下に、ヒトの脱落乳歯から歯髄細胞を用いた不死化幹細胞を作製する場合を例に挙げて説明する。
　まず、上記脱落乳歯を、例えば、クロロヘキシジンで消毒し、歯冠部を分割し、歯科用リーマーにて歯髄組織を回収する。次いで、採取した歯髄組織を、基本培地、例えば、５～15％のウシ血清（calf serum、以下、「CS」ということがある。）及び50～150ユニット/mLの抗生物質を含有するダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle's Medium、以下、「DMEM」という。）に懸濁する。
　ついで、１～５mg/mLのコラゲナーゼ及び１～５mg/mLのディスパーゼを用いて、37℃で、0.5～２時間処理する。酵素処理の後、３～10分間の遠心操作（3,000～7,000回転／分）を行い、歯髄細胞を回収する。必要に応じて、セルストレーナーを用いて細胞の選別を行う。選別された細胞を、例えば、３～６mLの上記基本培地で再懸濁し、直径４～８cmの付着性細胞培養用ディッシュに播種する。
　引き続き、培養液、例えば、10％FCSを含有するDMEMを添加した後、５％CO2インキュベータにて、37℃で２週間程度培養する。上記培養液を除去した後、PBS等で細胞を1～数回洗浄する。培養液の除去及び細胞の洗浄に代えて、コロニーを形成した接着性の歯髄幹細胞を回収することもできる。接着性の歯髄幹細胞は、例えば、0.025～0.1％のトリプシンと0.3～１mMのEDTAにて、数分間、37℃で処理してディッシュから剥離させ、次いで細胞を回収する。
　酵素処理の後、３～10分間の遠心操作（3,000～7,000回転／分）を行い、歯髄細胞を回収する。必要に応じて、セルストレーナーを用いて細胞の選別を行う。選別された細胞を、例えば、３～６mLの上記基本培地で再懸濁し、直径４～８cmの付着性細胞培養用ディッシュに播種する。
　次いで、培養液、例えば、10％FCSを含有するDMEMを添加した後、５％CO2インキュベータにて、37℃で２週間程度培養する。上記培養液を除去した後、PBS等で細胞を1～数回洗浄する。培養液の除去及び細胞の洗浄に代えて、コロニーを形成した接着性の歯髄幹細胞を回収することもできる。接着性の歯髄幹細胞は、例えば、0.025～0.1％のトリプシンと0.3～１mMのEDTAにて、数分間、37℃で処理してディッシュから剥離させ、次いで細胞を回収する。
　次に、上記のように選別された接着性細胞を培養する。例えば、上記のようにして得た歯髄幹細胞を付着性細胞培養用ディッシュに播種し、５％CO2、37℃の条件でインキュベータにて培養する。以上のようにして、ヒト脱落乳歯幹細胞の初代培養細胞（SHED-P）を得ることができる。
　継代培養は、例えば、肉眼で観察してサブコンフレント又はコンフレントに達したときに、上述のように、トリプシンとEDTAとを用いて細胞を培養容器から剥離させて回収し、再度、培養液を入れた培養容器に播種する。
　ここで、サブコンフレントとは、培養容器中の細胞付着面の約70％に細胞が付着した状態をいう。例えば、継代培養を１～８回行い、選別された細胞を、必要な細胞数、例えば約1×107個/mLまで増殖させる。以上のように培養した後に、細胞を回収して液体窒素中にて保存する。様々なドナーから回収した細胞を歯髄幹細胞バンクの形態で保存することにしてもよい。
　(ｉ)bmi-1、HPV-E6及びHPV-E7からなる群から選ばれる少なくとも１種以上の遺伝子と、（ii）hTERT又はpTERTのいずれかの遺伝子との組み合わせは、以下のようにして導入することができる。まず、上記の遺伝子の組み合わせを組み込むためのプラスミドを調製し、これをシャトルベクター、例えば、pShuttle 2に組み込んで、クローニングを行う。その後、pShuttle 2で大腸菌を形質転換し、カナマイシンをマーカーとして、カナマイシン耐性形質転換体（以下、「Kn+」という。）を選択する。このKn+のDNAを精製し、制限酵素部位を解析して、生成された組換え体を同定する。
　次に、例えば、PI-Sce I及びI-Cue Iを使用して発現カセットを上記のシャトルベクターから切り出し、この発現カセットを、例えば、アデノウイルスベクターのDNAにライゲーションし、Adeno-X viral DNAを得る。得られたライゲーション産物（Adeno-X viral DNA）を、例えば、Swa Iで切断し、切断産物を用いて大腸菌をトランスフォーメーションして形質転換体を得る。
　得られた形質転換体の中から、例えば、アンピシリンを用いて、アンピシリン耐性異質転換体（以下、「Amp+」という。）を選択して精製し、制限酵素部位を解析して組換え体を同定する。次いで、例えば、Pac Iで組換えアデノウイルスを消化し、得られた断片をHEK293細胞にトランスフェクトして増殖させ、これを集めて上記ウイルスの力価を測定する。常法に従って上記ウイルスを精製し、標的細胞であるSHED-Pに感染させる。
　ウイルス感染後のHEK293の細胞群を常法に従ってFITCで染色し、フローサイトメーターを用いて、STRO-1陽性細胞を検出する。ここで、STRO-1は、骨髄における多分化能を有する間葉系幹細胞のマーカーの１つとして考えられており、細胞の不死化の指標となる。以上の手順によって、歯髄由来の不死化幹細胞を得ることができる。
　次に、得られた不死化幹細胞を、上述した基本培地、例えば、10％FBSを加えたDMEMを用いて、５％CO2、37℃の条件下に、24～48時間培養し、培養上清を得る。培養上清の回収は、例えば、コマゴメピペット等を使用することができる。
　また、本発明の不死化幹細胞は、インスリン様成長因子（IGF-1）、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、トランスフォーミング増殖因子-β（TGF-β）、及び肝細胞増殖因子であるHGFからなる群から選ばれる、少なくとも２以上の成長因子を培養上清中に分泌する。ここで、「成長因子」とは、細胞分裂を促進させたり、形態の変化や肥大をもたらしたりするポリペプチドの総称である。成長因子を産生する細胞の種類によって因子は異なり、上皮成長因子(EGF)、繊維芽細胞成長因子(FGF)、神経成長因子（NGF）、腫瘍増殖因子(TGF)などに大別される。
　さらに、各細胞の細胞膜にある受容体はチロシンキナーゼ活性をもち、成長因子が結合すると、たんぱく質のチロシン残基がリン酸化され、細胞の増殖や分化を引き起こす。成長因子が個体発生において中胚葉誘導物質となっている例がいくつか知られている。また、免疫系を調節するリンホカイン個体発生において中胚葉誘導物質となっている例がいくつか知られている。こうした成長因子は、公知のELISA法、マイクロアレイ法等で定量することができる。
　上記IGF-1は、インスリンと配列が高度に類似したポリペプチドであり、細胞培養でインスリンと同様に有糸分裂誘発等の反応を引き起こす。神経細胞の成長にも影響することが知られている。また、上記VEGFは、胚の形成期に、血管がないところに新たな血管を形成する脈管形成及び既存の血管から分枝伸長して血管を形成する血管新生に関与する一群の糖タンパクである。
　上記TGF-βはまた、多くの細胞に対する強力な増殖抑制因子となり、細胞の分化・遊走・接着にも密接に関与し、個体発生や組織再構築、創傷治癒、炎症・免疫、癌の浸潤・転移などの幅広い領域に重要な役割を担っている。さらに、HGFは、肝細胞のみならず様々な細胞に対して、細胞増殖促進、細胞運動促進、抗アポトーシス（細胞死）、形態形成誘導、血管新生その他の組織・臓器の再生と保護を担う多才な生理活性を有している。
　上述した各種幹細胞を、例えば、15％FCSを添加したDMEM中で、37℃にて所定の期間、培養することにより、上記の成長因子を含む培養上清を得ることができる。なお、上記幹細胞の培養上清には、IGF-1、VEGF、TGF-β、及びHGF以外にも、約70種類のタンパクが含まれる。
　得られた培養上清のうち15mLを、Amicon Ultra Centrifugal Filter Units-10K(ミリポア社製)に入れ、4,000xgで約60分間遠心し、約200μlまで濃縮する。次いで、このチューブに培養上清と同量の滅菌PBSを投入し、再度、4,000xgで約60分間遠心し、溶媒をPBSに置換する。得られた200μLの溶液をマイクロテストチューブへ回収し、濃縮幹細胞培養上清とする。
　上記のAmiconを使用する方法に代えて、エタノール沈殿法で濃縮することもできる。例えば、５mLの培養上清に対して45mLの100％エタノールを加えて混和し、-20℃で60分間放置する。その後、15,000ｘgで15分間、４℃にて遠心して、上澄みを除去する。
　次いで、例えば、10mLの90％エタノールを加えてよく攪拌し、再び、15,000ｘgで５分間、４℃にて遠心する。上澄みを除去し、得られたペレットを、例えば、500μLの滅菌水に溶解することができる。溶解後、全量をマイクロテストチューブに回収し、濃縮幹細胞培養上清とする。
　以上のようにして得られた培養上清を常法に従って凍結乾燥し、用時調整の組成物とすることができる。得られた組成物は、本発明のシート状小片１で使用するリザーバ層４の形成に使用することができる。
　具体的には、上記の水溶性高分子と単糖類又は二糖類とを所定の割合で混合し、ここに凍結乾燥した上記培養上清粉末を混合して、リザーバ層形成用材料を調製する。例えば、ヒアルロン酸、ポリビニルアルコール等の水溶性高分子に、約0.2～４重量％のグルコース又はデキストランを混合し、ここに所望量の上記培養上清の凍結乾燥粉末を混合し、リザーバ層形成用材料とする。
　ついで、感光性樹脂でシートを形成させた後に、フォトリソグラフィ法を用いて、図２（Ａ）に示すような形状のマイクロニードルパターンを作製する。その後、電鋳加工によりこのパターンを転写して、マイクロニードル形成用の鋳型を製造する。この鋳型は、一辺を約８～20cmとすることが、作業効率の点から好ましい。また、マイクロニードル４ｎを形成するための凹部は、上部直径o1が約0.1～0.3mm、底部直径o2が約0.03～0.05mm、深さｔ２が約0.6～1.0mmの円錐形状をなしており、格子状に配列されていることが好ましい。この凹部は、約50～100個/cm2であることが好ましい（図２（Ｂ）参照）。
　上記リザーバ層形成用材料に水を加えて、約５～20％の固形分を含む水溶液を調製し、室温にて、上記の鋳型に流し込み、水分を蒸発させて乾燥させ、その後に鋳型から剥離させると、マイクロニードル４ｎが形成されたリザーバ層４を得ることができる。
　なお、以上のようにして作製されたシート状小片１は、使用する上記生理活性物質の量を調節することにより、発毛促進用シート又は美白及び皺改善剤の一態様として使用することができる。そこで、以下の説明では、シート状小片１を、適宜、「発毛促進用シート１」又は「美白及び皺改善剤１」とも記す。
　次に、発毛促進用シートの別態様について説明する。図９には、発毛促進用シートの別態様である発毛促進用シート１０の構成が示されている。図９に示されるように、発毛促進用シート１０は、上述したシート状小片１と；複数の人工毛髪６と；を備えている。
　上記の人工毛髪６は、図１０に示されるように、ベースシート２に所定の密度で植え込まれている。この図１０に示されるように、人工毛髪６は、ベースシート２及び接着補助層１２を貫通しており、ベースシート２の－Ｚ方向側表面においてベースシート２に固定されている。
　上記の発毛促進用シート１０は、全体を頭皮に接着させて使用することが前提とされるため、スキンベースを使用することが好ましい。また、発毛促進用シート１０の厚みは、20～60μmであることが接着性の良さと着脱時の丈夫さとのバランスの面で好ましく、30～40μmであることがさらに好ましい。
　ここで、所定の密度は、発毛促進用シート１０を貼付する部位の発毛状態に依存して適宜決定される。一般的には、日本人の全頭髪毛数は約10万本と言われ、頭毛密度（１cm2当たりの本数）は、髪頭頂部で133～249本（平均199本）、前頭部で114～250本（平均183本）、後頭部で137～235本（平均172本）、側頭部106～217本（平均130本）という測定値が公表されている。こうした数字を参考にして、適宜選択すればよい。
　また、人工毛髪６は、ポリエステル繊維、塩化ビニル繊維、アクリル繊維、難燃ポリエステル繊維等、かつらの作製に一般的に使用されている繊維を使用することができ、ポリエステル繊維を使用することがコスト面から好ましい。
　また、人工毛髪６は、紫外線硬化性の樹脂により、ベースシート２に固定されることが好ましい。こうして、紫外線硬化性を用いることにより、人工毛髪６の抜けを防ぎつつ、効率よく植毛した人工毛髪６を固定できるからである。
　上述した発毛促進用シート１０は、以下のようにして作製することができる。まず、図１１（Ａ）に示されるように、ベースシート２、リザーバ層４、接着補助層１２、保持部材Ｈ、複数の人工毛髪６及び各種の接着剤を準備する。
　次に、ベースシート２の＋Ｚ方向側表面に一の接着剤を用いて接着補助層１２を剥離可能に接着し、図１１（Ｂ）に示される積層体１ａを形成する。引き続き、積層体１ａの接着補助層１２及びベースシート２を貫通するように、複数の人工毛髪６を所定の密度で植え込んで、図１２（Ａ）に示される中間材１０ａを作製する。
　かかる積層体１ａへの人工毛髪６の植え込みには、例えば、Ｖ型植毛法により行われる。かかるＶ型植毛法による植毛に際しては、図１３に示されるように、一定長に切断された人工毛髪６を、ベースシート２の－Ｚ方向側において、Ｚ軸方向に移動可能な１対の案内針１５に係止させる。その状態で、人工毛髪６を係止したまま、案内針１５を＋Ｚ方向へ移動させる。この結果、案内針１５は、人工毛髪６の根部６ａをベースシート２の－Ｚ方向側に残しつつ、＋Ｚ方向へ移動して引き抜かれる。この後、ベースシート２の－Ｚ方向側に残った根部６ａに紫外線硬化接着剤を塗布し、紫外線を照射して硬化させる。こうして、積層体１ａへの人工毛髪６の植え込みが行われる。
　図１２に戻り、中間材１０ａが作製されると、中間材１０ａのベースシート２の－Ｚ方向側表面に接着剤を用いてリザーバ層４を強固に接着し、図１２（Ｂ）に示される中間材１０ｂを作製する。このとき、前記ベースシート２の裏面全面に、上述したマイクロニードル４ｎを備える厚みの均一な層を重ねてリザーバ層４を形成することが、接着性の向上と自然な外観とを確保する上で好ましい。また、上記厚みは、ベースシート２の厚みの1.5～２倍程度（約45～80μm）とすることが、本発明の発毛促進用シートの引っ張り強さを維持すること、及び上記人工毛髪（「ヘア材」ということがある。）６を安定させることができることから好ましい。
　引き続き、中間材１０ｂのリザーバ層４の－Ｚ方向側面におけるマイクロニードル４ｎが形成されていない部分に、メッシュ状に粘着剤を塗布し接着層５を形成し、図１４（Ａ）に示される中間材１０ｃを作製する。
　次いで、中間材１０ｃを所望の大きさにカットした後、中間材１０ｃの接着層５の－Ｚ方向側表面に保持部材Ｈを接着する。この結果、図１４（Ｂ）に示されるように、発毛促進用シート１０が作製される。
　こうして作製された発毛促進用シート１０を、所望の厚みを有する所望の大きさの金属性の板状部材、又はプラスチック製の板状部材上に設けられたリング状のシートホルダー上に載置し、製品とする。
　本発明の発毛促進用シート１０は接着層５が格子状に形成されているため、皮膚から現れた毛髪が伸びることを、必要以上に抑えることがない。その結果、速やかな発毛を実現することができる。
　また、上記の発毛促進用シート１０の作製の工程から、上記のベースシート２に人工毛髪６を植え込む工程を省き、使用する上記生理活性物質の量を調節することにより、本発明の美白及び皺改善剤を作製することができる。作製された美白及び皺改善剤は、図１８（Ａ）～（Ｄ）に示すように、用途に応じて種々の大きさにカットすることができ、シート状小片１の場合と同様に、保持部材Ｈ上に載せて製品とすることができる。
（不死化SHEDの作出及び培養方法）
（１）ウイルス導入用ベクターの作製
（１－１）プラスミド抽出用試薬
　カナマイシン（Kan）、アンピシリン（Amp）、LB液体培地及びLB寒天培地、グリコーゲン、アガロース、滅菌水、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム及びRNase Aを使用した。50mg/mLのカナマイシン（Kan）及びアンピシリン（Amp）を調製し、ストック溶液として－20℃で保存した。グリコーゲンは20mg/mLに調製した。10mg/mLのRNase Aを調製し－20℃で保存した。10M（飽和）酢酸アンモニウム（NH4OAc）、３Ｍの酢酸ナトリウム（NaOAc；pH5.2）を調製した。
（１－２）制限酵素等
　大腸菌コンピテントセル（Supercharge EZ10 Electrocompetent Cells、製品コード 636756）、Swa I（製品コード 1111A、Smi Iが同等品）、Xho I（製品コード 1094A）、T4 DNA Ligase（製品コード 2011A）、NucleoBond Xtra Midi（製品コード 740410.10/.50/.100）、NucleoSpin Plasmid（製品コード 740588 10/50/250）は、いずれもタカラバイオ（株）より購入した。Pac IはNew England Biolabsより購入した。
（１－３）バッファー等
　1×TE Buffer（1mMのEDTAを含む10mM Tris-HCl [pH8.0]）、100mM Tris-HCl（pH8.0）で飽和したフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：1、以下、「PCI混液」という。）を調製した。エタノールは、100％及び70％で使用した。ミニスケールでの組換えで使用するpAdeno-X プラスミドDNAの精製用に、以下のバッファー１～４を調製した。
　バッファー１：10mM EDTA及び50mM グルコースを含む25mM Tris-HCl（pH8.0）（オートクレーブ後、４℃で保存）
　バッファー２：１％SDSを含む0.2M NaOH（使用直前に用時調製、密封し、室温保存）
　バッファー３：５M KOAc（オートクレーブ後、４℃で保存）
　バッファー４：1mM EDTA、20μg/mL RNaseを含む10mM Tris-HCl（pH8.0）
　　　　　　　　（使用直前にRNaseを添加する。－20℃で保存）
（２）アデノウイルス精製及びβ-galアッセイ用試薬
　ヒト５型アデノウイルスで形質転換したヒトHEK293細胞（ATCC #CRL1573）を使用した。HEK293細胞は完全培地で培養した。完全培地の組成は、100unit/mLのペニシリンGナトリウムと100μg/mLのストレプトマイシン、4mMLのグルタミン及び10％FBSを添加したDMEM（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium、基本培地）とした。ペニシリンGナトリウム溶液は10,000units/mL、硫酸ストレプトマイシン溶液は10,000μg/mLで調製し、ストック溶液として保存した。培養には、60mmプレート、100mmプレート、6－ウェルプレート、T75及びT175フラスコを使用した。
　トリプシン-EDTA（製品コード CC-5012）はタカラバイオ（株）より購入した。リン酸緩衝生理食塩水（PBS、Ca2＋及びMg2＋不含）及びDulbecco’s リン酸緩衝生理食塩水（DPBS、Ca2＋及びMg2＋含有）を調製した。また、0.33％のニュートラルレッド染色液、0.4％トリパンブルー染色液を使用した。β-galアッセイには、X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (25mg/mL))ジメチルホルムアミド（DMF）溶液は－20℃で遮光保存した。Luminescent β-gal Detection Kit II（製品コード 631712、タカラバイオ（株）製）を使用した。
（３）予備試験
（３－１）lacZ を含む組換えアデノウイルス（pAdeno-X-lacZ）の構築
　10mLの上述した完全培地に、解凍後、DMSOを除去したHEK293細胞を再懸濁し、全量を直径100mmの培養プレートに移した。HEK293細胞が付着した後に培養液を除去し、細胞を滅菌PBSで一度洗浄し、１mLのトリプシン-EDTA溶液を加えて約２分間処理した。次に、10mLの完全培地を加えてトリプシンの反応を止め、穏やかに懸濁した。バイアブルカウントを行って、培養液10mLを入れた直径100mmのプレートに105個の細胞を移し、均一に拡げた。
　pShuttle2-lacZ（Adeno-X Expression System 1に含まれている陽性対照ベクター）とキットに含まれているAdeno-X Viral DNA（PI-Sce I及びI-Ceu I digested）とを使用し、キットに添付されているプロトコルに従って、lacZを含む組換えアデノウイルスを構築した。標的細胞であるSHEDに感染させ、β-ガラクトシダーゼの発現をアッセイし、ベクターが構築されていることを確認した。
（３－２）組換えpShuttle 2プラスミドの構築
　組換えpShuttle 2 Vector（以下、「rpShuttle 2 Vector」という。）の構築前に、キットに含まれているpShuttle 2 Vector及びpShuttle 2-lacZ VectorでDH5α大腸菌を形質転換した。50μg/mLのカナマイシンを含有するLB寒天プレート（以下、「LB/Kan」という。）上で形質転換体を選択し、単一コロニーからとった菌体を新しいLB/Kanに画線し、37℃で一晩インキュベートした。
　次いで、hTERT、bmi-1、HPV-E6、HPV-E7を、pShuttle 2へ以下の手順でクローニングした。これらの遺伝子に適した制限酵素でpShuttle 2 Vectorを切断した。次いで、上記のキットに添付されているpShuttle 2 Vector Information Packet（PT3416-5）を参照し、挿入するDNAに合致するマルチクローニングサイトを決定した。制限酵素処理済みの上記プラスミドをアルカリホスファターゼで処理して精製した。
　常法に従って、標的DNA断片を調製し精製した。上記の制限酵素で消化したベクターと上記の遺伝子断片とをライゲーションし、DH5α細胞（コンピテント細胞）を、ライゲーション産物で形質転換した。上記コンピテント細胞の一部をとり、キットに含まれている対照ベクターpShuttle2-lacZ Vectorで形質転換して陽性対照とした。
　形質転換した大腸菌を含む混合液を、LB/Kan寒天プレートに接種し、カナマイシン耐性（Kanr）の形質転換体（コロニー）を選択した。５～10個のKan耐性クローンを選択し、少量の液体培地に接種して増幅した。これらのクローンがrpShuttle 2 Vectorを有していることを確認した後に、一晩インキュベートした。その後、市販のシリカ吸着カラムを用いて、常法に従い、構築されたプラスミドDNAを精製した。
　このプラスミドDNAを制限酵素で処理して、１％アガロースゲル電気泳動を行い、目的の組換えプラスミドを同定した。シーケンシングによって、挿入した断片の方向と挿入部位を確認し、ポジティブクローンを同定した。組換えpShuttle 2プラスミドDNA（以下、「rpShuttle2プラスミドDNA」という。）をターゲット細胞に直接にトランスフェクトし、ウエスタンブロットを行って目的タンパク質の発現を予備的にチェックした。
（３－３）rpShuttle 2プラスミドDNAのPI-Sce I/I-Ceu I二重消化
　上記のようにして作製したrpShuttle 2プラスミドDNAから、導入した遺伝子の発現カセットをPI-Sce I及びI-Ceu Iで切り出した。キットに添付されたプロトコルに記載されたin vitroライゲーション法に従って、切り出した発現カセットをAdeno-X Viral DNAに組み込んだ。rpShuttle 2プラスミドDNAのPI-Sce I/I-Ceu I二重消化液を30μl調製し、下記の表1に記載した試薬を1.5mLの滅菌済みマイクロ遠心チューブに入れて混合した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　次いで、十分に混和した後にマイクロ遠心チューブに入れて軽く遠心し、その後、37℃にて３時間インキュベートした。1kbラダー（DNAサイズマーカー）と共に上記二重消化後の反応液（５μL）を１％アガロース/EtBrゲルで泳動した。
（３－４）フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール抽出
　遠心チューブに、上述した二重消化液の残り（25μl）に、70μLの1×TE Buffer（pH8.0）と100μLのPCI混液とを添加し、ボルテックスで十分に撹拌した。次いで、微量遠心機を用いて、４℃にて14,000rpmで５分間遠心し、水層を清浄な1.5mLのマイクロ遠心チューブに移した。ここに、400μLの95％エタノール、25μLの10M酢酸アンモニウム、及び1μLのグリコーゲン（20mg/mL）を添加し、ボルテックスで十分に撹拌した。
　次いで、４℃にて14,000rpmで５分間遠心し、上清を吸引して除去し、ペレットを得た。このペレットに300μLの70％エタノールを加え、室温にて14,000rpmで２分間遠心した。上清を注意深く吸引して除去し、ペレットを室温にておよそ15分間風乾した。
　ペレットが乾燥した後に、これを10μLの滅菌した1×TE Buffer（pH8.0）に溶解し、使用するまで－20℃にて保存した。
（４）組換えAdeno-X プラスミドDNAの構築
（４－１）Adeno-X ウイルスゲノムへの発現カセットのサブクローニング
　下記の表２に示す試薬を、順番通りに1.5mLの滅菌済マイクロ遠心チューブに入れ、穏やかに混和し、軽く遠心した後に、16℃にて一晩インキュベートした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　各サンプルに、90μLの1×TE Buffer（pH8.0）と100μLのPCI混液とを加えて、ボルテックスで穏やかに撹拌した。４℃にて14,000rpmで５分間遠心し、水層を清浄な1.5mLのマイクロ遠心チューブに移し、ここに400μLの95％エタノール、25μLの10M酢酸アンモニウム、及び１μLのグリコーゲン（20mg/mL）を加えて、ボルテックスで穏やかに撹拌した。
　４℃にて５分間、14,000rpmで遠心し、上清を吸引により除去してペレットを得た。以下のエタノール沈殿操作は、上記（３－４）と同様に行った。ペレットが乾燥した後に、これを15μLの滅菌脱イオン水に溶解した。
（４－２）組換えAdeno-X プラスミドDNAのSwa I消化
　下記表３に示す消化液を調製し、遠心チューブに入れた各サンプルに加えて、２時間、25℃にて、インキュベートした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　各サンプルに、80μLの1×TE Buffer（pH 8.0）と100μLのPCI混液とを加え、ボルテックスで穏やかに撹拌した。マイクロ遠心チューブ、４℃にて５分間、14,000rpmで遠心した。以下のエタノール沈殿の操作は、上記（３－４）と同様に行い、ペレットの溶解液は使用まで－20℃にて保存した。
（４－３）組換えAdeno-XプラスミドDNAによる大腸菌の形質転換の確認
　エレクトロポレーション用コンピテントセル（大腸菌）を、Supercharge EZ10Electrocompetent Cell（製品コード 636756）を使用して、上記（４－２）で得たSwa I消化産物で形質転換した。形質転換混合液を、LB培地にアンピシリン（終濃度100μg/mL）を加えた寒天プレート（以下、「LB/Amp寒天プレート」という。）に接種し、37℃で一晩インキュベートした。アンピシリン耐性（Ampr）形質転換体として、約106個のコロニーを得た。得られたコロニーを、製品に付属のAdeno-X System PCR Screening Primer Setでチェックした。
　５mLの新鮮なLB/Amp液体培地に単一のコロニーからの菌体を接種し、一晩培養した。翌日、後述するミニスケール法に従って、Adeno-X プラスミドDNAを精製した。
（４－４）組換えAdeno-XプラスミドDNAのミニスケール調製
　対数増殖にある培養液5mLを、14,000rpmで30秒間遠心し、上清を除去した。ペレットを再度10,000rpmで１分間遠心し、マイクロピペットを用いて、上清を除去した。ここに、150μLの上記バッファー１を加えて穏やかにピペッティングし、再懸濁した。この細胞懸濁液に、150μLのバッファー２を添加し、穏やかに転倒混和し、氷上に５分間放置した。冷却した細胞懸濁液に、150μLのバッファー３を加えて、再度転倒混和し、氷上に５分間放置した。
　この細胞懸濁液を、４℃にて14,000rpmで５分間遠心し、透明な上清を清浄な1.5mLの遠心チューブに移した。この上清に、450μLのPCI混液を添加し、転倒混和して撹拌した。その後、４℃にて14,000rpmで５分間遠心し、水層を清浄な1.5mLのマイクロ遠心チューブに移した。
　以下のエタノール沈殿の操作は、上記（４－１）と同様に操作を行い、ペレットの溶解液は、使用まで－20℃にて保存した。目的のrDNAは、後述する制限酵素による解析及びPCRにより同定した。
（５）得られたrAdeno-XプラスミドDNAの制限酵素部位解析
　PI-Sce I及びI-Ceu Iを用いて解析を行った。下記の表４に示す試薬を、1.5mLの滅菌済みマイクロ遠心チューブに入れ、30μLのPI-Sce I/I-Ceu I二重消化反応液を加えて、十分に撹拌し、軽く回転させて内容物を集めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　37℃にて３時間インキュベートし、制限酵素処理を行った。この処理後の反応液を１％アガロース/EtBrゲルで泳動した。
（６）組換えアデノウイルスの産生
（６－１）HEK293細胞トランスフェクト用rAdeno-XプラスミドDNAの調製
　下記表５に示す試薬等を、1.5mLの滅菌済み遠心チューブに入れて混合し、微量遠心機で軽く遠心した。その後、37℃にて２時間、インキュベートし、rAdeno-XプラスミドDNAのPac I制限酵素処理を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　60μLの1×TE Buffer（pH 8.0）と、100μLのPCI混液とを添加し、ボルテックスで穏やかに撹拌し、微量遠心機で、４℃にて５分間、14,000rpmで遠心した。水層を、清浄な1.5mLの滅菌済み遠心チューブに注意深く移した。
　以下のエタノール沈殿の操作は、上記（３－４）と同様に操作を行い、ペレットの溶解液は、使用まで－20℃にて保存した。
（６－２）Pac I消化Adeno-XプラスミドDNAのHEK293細胞へのトランスフェクション
　上記プラスミドDNAのトランスフェクションの24時間前に、直径60mmの培養プレートあたりの細胞数が1～2×106（およそ100cells/mm2）になるよう、HEK293細胞を接種し、37℃、５％CO2存在下でインキュベートした。
　各培養プレートに、Pac I消化した10μLのAdeno-XプラスミドDNAをトランスフェクトし、標準的なトランスフェクション法（CalPhos Mammalian Transfection Kit 製品コード 631312、タカラバイオ（株）製）に従って、HEK293細胞にAdeno-X DNAを導入した。トランスフェクションの翌日から、CPE（細胞変性効果）が起きているかどうかを確認した。１週間後に、培養プレートの底面や側面に付着している細胞を穏やかに撹拌して遊離させた。得られた細胞懸濁液を15mLの滅菌済みの円錐遠心チューブに移し、室温にて５分間、1,500×gで遠心した。
　得られた沈殿を、500μLの滅菌PBSに懸濁した。ドライアイス/エタノール中で凍結させ、37℃の恒温槽で融解させるという凍結融解操作を３回繰り返して、細胞を十分に融解させたライセートを得た。次いで、軽く遠心して浮遊物を除き、上清を滅菌した別のチューブに移して、直ちに使用した。直ちに使用しない分は、－20℃で保存した。60mmプレートの培養細胞に250μLの上記ライセートを加えて、培養を続けた。なお、Adeno-X Rapid Titer Kit（製品コード 631028、タカラバイオ（株）製）に含まれる抗Hexon 抗体を用いて、このキットの取扱説明書（PT3651-1）に従い、アデノウイルスの力価を測定した。
（６－３）高力価ウイルス調製のためのウイルスの増幅
　この力価測定を始める約24時間前に、HEK293細胞をT75フラスコに接種し、37℃、５％CO2存在下で一夜培養し、50～70％コンフルエントになっていることを確認した。
　翌日、ウイルスを含む新しい培地と交換し、MOI＝10で感染させた。37℃、５％CO2存在下で90分間培養した後にフラスコを取り出し、10mLの培地を加えた。
　37℃、５％CO2存在下で３～４日間培養し、CPEを確認した。50％の細胞が剥がれたところで、上記と同様にして遊離細胞懸濁液とし、15mLの滅菌済円錐遠心チューブに移した。上記と同様の凍結融解操作を行い、細胞を融解させた。Adeno-X Rapid Titer Kit（製品コード 631028）を使用し、107PFU/mLの力価を得た。ウェスタンブロッティングを行い、パッケージングされたアデノウイルスゲノムが、目的遺伝子に特異的な転写単位のコピーを、機能する形で持っているかを確認した。
（７）標的細胞へのアデノウイルス感染
（７－１）標的細胞への感染
　感染の24時間前に6－ウェルプレートに１×106個のSHEDを接種した。接種の翌日に培地を取り除き、ウイルスを含む1.0mLの培地を各プレートの中心に添加した。この溶液をSHEDが形成した単層全体に均一に広げた。
　37℃、５％ CO2存在下で４時間培養し、ウイルスをSHEDに感染させた。次いで、新鮮な培地を添加し、さらに、37℃、５％CO2存在下で培養した。感染24時間後～48時間後にかけて導入遺伝子の発現を経時的に解析した。
（７－２）感染細胞のβ--ガラクトシダーゼ発現の解析
　Adeno-X-lacZを感染させた接着性細胞におけるβ--ガラクトシダーゼの発現は、Luminescent β-galDetection Kit II（製品コード 631712、クロンテック社製）を使用してアッセイした。
（１）SHEDの作製
　10歳の健常男児から得られた脱落乳歯を使用した。この脱落乳歯をイソジン溶液で消毒した後、歯科用ダイヤモンドポイントを用いて、歯冠を水平方向に切断し、歯科用リーマーを用いて歯髄組織を回収した。得られた歯髄組織を、３mg/mLのＩ型コラゲナーゼ及び４mg/mLのディスパーゼの溶液中で37℃にて１時間消化した。ついで、この溶液を70mmの細胞ストレーナ（Falcon社製）を用いて濾過した。
　濾別した細胞を、４mLの上記培地に再懸濁し、直径60mmの付着性細胞培養用ディッシュに播種した。10％FCSを含有するDMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）をこのディッシュに添加し、５％CO2、37℃に調整したインキュベータにて２週間程度培養した。コロニーを形成した接着性細胞（歯髄幹細胞）を、0.05％トリプシン・0.2mM EDTAにて５分間、37℃で処理し、ディッシュから剥離した細胞を回収した。
　次に、上記のようにして選抜した接着性細胞を、付着性細胞培養用ディッシュ（コラーゲンコートディッシュ）に播種し、５％CO2、37℃に調整したインキュベータ中にて、一次培養し初代培養細胞とした。肉眼観察でサブコンフルエント（培養容器の表面の約70％を細胞が占める状態）又はコンフルエントになったときに、0.05％トリプシン・0.2mM EDTAにて５分間、37℃で処理して細胞を培養容器から剥離して回収した。こうして得られた細胞を、再度、上記の培地を入れたディッシュに播種し、継代培養を数回行って、約1×107個/mLまで増殖させた。得られた細胞を、液体窒素中で保存した。
　その後、一次培養細胞を上記の培地を用いて約１×104細胞/cm2濃度で継代培養した。１～３回継代した細胞を実験に用いた。ヒトBMMSC（骨髄間葉系幹細胞、Bone Marrow Mesenchymal stem cells）はロンザ社から購入し、メーカーの取扱説明書に従って培養した。以上のようにして、ヒト脱落乳歯歯髄幹細胞（SHED）を得た。得られたSHEDを、FACSTARPLUS (ベクトン・ディキンソン社製)を用いて、各試料について、約１×106個のSTRO-1陽性細胞を以下のようにしてソートした。
　ブロモデオキシウリジンBrdU染色キットのメーカー（Invitrogen社製）の取扱説明書に従いBrdUを12時間取り込ませ、SHEDの増殖速度を評価した（各群についてｎ＝３）。実験は５回繰り返した。１元配置分散分析後に、Tukey-Kramer検定を行い、統計的有意差を評価した。
　STRO-1を免疫蛍光で検出するために、SHEDを３％パラホルムアルデヒドで固定し、その後PBSで２回リンスし、100 mMのグリシンで20分間処理した。次いで、これらの細胞を0.2％のTriton-X（Sigma-Aldrich社製）で30分間透過処理し、その後、５％のロバ血清及び0.5％のウシ血清アルブミンの混合物中で20分間インキュベートした。
　次に、細胞を一次抗体のマウス抗ヒトSTRO-1抗体（1:100、R&D社製）と一緒に１時間インキュベートし、二次抗体のヤギ抗マウス免疫グロブリンM-FITC抗体（1:500、Southern Biotech社製）と一緒に30分間インキュベートし、ベクタシールドDAPI（Vector Laboratories Inc.社製）を用いてマウントした。その後、15％FBSを添加したα-MEMを6ウェルプレートに入れ、ソートした細胞をクローン作製用に播種した。増殖した細胞の中から約300コロニーを試験用にプールした。
（２）遺伝子の導入
　上述したように、bmi-1, E6, E7及びhTERTの４つの遺伝子をアデノウイルスベクターに組み込み、これらの遺伝子産物を発現するウイルスベクターを作製した。対照として、これらの遺伝子を組み込んでいない対照ベクターを作製した。
　SHEDを直径100mmのコラーゲンコートディッシュに１×106個を播種し、10％FBSを添加したDMEMを加えてサブコンフレントまで培養した。この培地を吸引除去して上記培地で希釈したウイルス溶液500μLを加え（MOI=10）、37℃にて、５％CO2インキュベータ中で１時間培養し、上記ウイルスベクターを感染させた。感染48時間後、感染細胞をピューロマイシン(１pg/mL)を加えた上記の培地中で10日間培養して選択し、500～600個の耐性クローンをプールした。３～４日ごとに約0.5×105個のSHEDを直径100mmの培養シャーレに播種し、継代した。遺伝子が導入されたSHEDをSHED-T、遺伝子が導入されないSHEDをSHED-Cとした。
（１）SHED-C及びSHED-Tの成長速度の測定
　SHED-T（遺伝子導入をしたSHED）の個体数の倍加状態を、図５に示した。図中、縦軸は個体数倍加回数（細胞分裂回数、回）、横軸は時間（培養日数）である。また、培養中のSHEDが１ヶ月間分裂しない状態を、細胞の老化の判断基準とした。SHED-Cは30回程で増殖が停止し、老化又は増殖停止段階に入った。これに対し、SHED-Tは250PDを超え、800日経過後も増殖した。
（２）フローサイトメトリー分析
　単一細胞の懸濁液を得るため、接着性の単層細胞をトリプシン／EDTAで消化した。２x105個の細胞に抗STRO-1モノクローナル抗体(1:100)を加えて放置し、FACSCaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson社製)を使用して分析した。対応するアイソタイプが同一の対照抗体と比較し、99％以上の割合で蛍光レベルが高い場合に発現が陽性とした。SHED-T及びSHED-Cともに、初期及び後期の継代細胞を固定し、FITC結合STRO-1抗体で染色した。その後、フローサイトメトリーで分析した。試験はそれぞれ二回行なった。SHED-CではSTRO-1陽性細胞の割合がPD20で27％であり、PD30では15％まで減少した（図８（Ａ）及び（Ｂ））。SHED-TではSTRO-1陽性細胞の割合が、それぞれPD20で46％、PD40で41％であった（図６（Ｃ）及び（Ｄ））。
（３）分化能の検討
　PD０、PD10及びPD20におけるSHED-C及びSHED-Tの分化能を、新生骨量の形成能及び組織染色で調べた。まず、2.0 x 106個のSHED-C又はSHED-Tを、40mgのヒドロキシアパタイト／三カルシウムリン酸（HA/TCP）セラミック粉末(オリンパス工業（株）製)に混合し、10週齢の免疫無防備状態マウス(NIH-bgnu-xid, 雌、Harlan Sprague Dawley社製)の背側表面の皮下に移植した。
　移植８週間後に移植物を回収し、４％ホルマリンで固定して脱灰した後、パラフィン包埋するため10％EDTAを含むPBS溶液でバッファリングした。一部は、プラスチック包埋するために70％エタノール溶液中に保存した。
　パラフィン切片を脱パラフィン化し、これを水和した後、ヘマトキシリン及びエオシン（以下、「H&E」という。）で染色した。図７（Ａ）～（Ｃ）は、SHED-T（不死化幹細胞）のPD０～PD20の染色像を示し、同（Ｄ）～（Ｆ）はSHED-C（正常細胞）のPD０～PD20の染色像を示す。生体内での新しい骨の形成を定量するため、特定の領域を選び、SHED-T移植後に形成された移植物又はSHED-C移植後に形成された移植物それぞれについて、新生骨面積と視野面積とを算出し、これらの数値から新生骨量を求めた。
　　　新生骨量＝新生骨面積／視野面積×100
　図８に各個体数倍加回数（倍加時間）における、SHED-TとSHED-Cとの新生骨量の変化を示した。図中、**はｐ＜0.05、***はｐ＜0.01を表す。なお、新生骨量は、以下の算出式で求めた。
　図８に示されるように、SHED-Cでは個体数倍加回数が増えるについて新生骨量が減少し、PD20ではPD０の約１/５まで低下した。これに対し、SHED-Tでは、PD20まで新生骨量はほとんど変動がなく、PD20では、SHED-TはSHED-Cの５倍以上の骨を形成したことが示された。
（４）癌化活性の評価
　SHED-C及びSHED-T細胞を、免疫無防備状態マウスの皮下組織に、１×106を個移植した。移植後、30日以上観察を行ったが、この期間中、上記の細胞を移植したいずれのマウスにおいても、腫瘍は形成されなかった。また、SHED-T細胞では、40～200PDの培養細胞のすべてのクローンの形態に変化はなかった。以上より、SHED-Tには、癌化活性はないことが示された。
（５）評価
　SHED-Tは、260PDを超えても分化能力を保ったまま増殖する能力を有していることが示されたが、SHED-Cは、分化能力を有するものの30PD以下で老化した。
　以上から、SHED-Tは不死化細胞となっており、活性の高いSHED培養上清の大量生産に適することが示された。
（１）シート状小片の作成
　ガラス容器中で、ヒアルロン酸に、約0.2～４重量％のデキストランを混合し、ここに所望量の上記培養上清の凍結乾燥粉末を混合し、リザーバ層形成用材料とした。
　ついで、市販の感光性樹脂でシートを形成させ、フォトリソグラフィ法を用いて、図２（Ａ）に示すような形状のマイクロニードルパターンを作製した。その後、電鋳加工によりこのパターンを転写して、マイクロニードル形成用の鋳型を製造した。この鋳型は、一辺を約10cm角の正方形とするか、７cmｘ15cmの矩形とした。
　また、マイクロニードルを形成するための凹部は、上部直径が約0.2mm、底部直径が約0.04mm、深さが約0.8mmの円錐形状をなすようにし、格子状に配列されるようにした。この凹部は、約75個/cm2であった。
　上記リザーバ層形成用材料に水を加えて、約10％の固形分を含む水溶液を調製し、室温にて、上記の鋳型に流し込み、水分を蒸発させて乾燥させ、その後に鋳型から剥離させて、マイクロニードルが形成されたリザーバ層を得た。
　引き続き、図３（Ｃ）～図４（Ｂ）と同様にして、シート状小片を作成した。すなわち、ベースシート２の片面に接着補助層１２を、接着剤を用いて接着させ、接着補助層１２を形成していないベースシート２の面上に、リザーバ層４を接着させた。次いで、マイクロニードル４ｎが形成されていない部分に、メッシュ状に接着層５を形成させ、極薄シートを作製した。この極薄シート上に保持部材Ｈである固定用ウレタンを重ね、図１に示すようなシート状小片とした。
　図１８（Ａ）～（Ｄ）に示すような、所望の大きさにカットして本発明のシート状小片を作製した。その後、このシート状小片を、所望の厚みを有する所望の大きさの金属性の板状部材、又はプラスチック製の板状部材上に設けられたシートホルダーに載置し、遮光性のフィルムに封入して、製品とした。これらの製品は、使用時まで冷蔵保存した。このシートホルダーは、上記のシート状小片の周辺部を約１mm幅で覆うような構造となっており、マイクロニードルの構造を維持するためのものである。
（２）発毛促進用シートの貼付
　以上のようにして作製される発毛促進用シート１を、図３（Ａ）～図４（Ｂ）に示した手順で作製した。
　以上のようにして調製した発毛促進用シート１を、図１５に示すように、男性の頭部に貼付した。上記発毛促進用シート１を貼付して頭皮に密着させた後に、接着補助層をベースシートから剥がした。本実施例では、本発明の発毛促進用シートの貼付状態を見やすくするために、ヘア材を植え込んでいないベースを使用し、デジカメで撮影を行なった結果を図１６（Ａ）～（Ｃ）に示す。
　貼付前の頭髪の状態を図１６（Ａ）の１～３に、貼付３～７日後の頭髪の状態を図１６（Ｂ）の１～３及び図１６（Ｃ）の１～３に示す。貼付前後の頭髪の状態から明らかなように、本発明の発毛促進用シートを貼付すると、３日後に発毛が観察され、その後、経時的に発毛量が増えていることが明らかになった（図１６（Ｂ）１～３の白い円内を参照されたい。）。特に、７日後の写真では、1箇所から複数の頭髪が伸びていることが観察された（図１６（Ｃ）３を参照されたい。）。
　また、白髪になってきた部分に本発明の発毛促進用シートを貼付したときの状態の変化を、図１７（Ａ）に示す。（Ａ）の左側の写真は貼付開始前、右側の写真は５回の貼付を行なった約２ヶ月弱後の写真である。脱毛していた部分には、貼付前には白髪だけであったが、発毛量の増加と、黒い髪の毛が生えてきていることが確認された。
　脱毛した部分に本発明の発毛促進用シートを貼付したときの状態の変化を、図１７（Ｂ）に示す。（Ｂ）の左側の写真は貼付前、（Ｂ）の右側の写真は５回の貼付を行なった約２ヶ月弱後の写真である。脱毛していた部分には、貼付前には白髪の毛がわずかに残っていたが、発毛量が明らかに増えており、また、黒い髪の毛が生えてきていることが確認された。
　以上より、本発明の発毛促進用シートを貼付した部位では、頭髪の正常な成長が促進されることが確認された。
　本発明は、美容の領域において極めて有用である。
　１　　シート状小片
　２　　ベースシート
　４　　　リザーバ層
　５　　　接着層
　６　　　人工毛髪（ヘア材）
　６ａ　　根部（植込部）
　６ｂ　　自由端部
　８　　　固定部
　１０　　発毛促進用シート
　１２　　接着補助層
　１５　　案内針
　Ｈ　　　保持部材

Claims (20)

  1. 　弾性材料からなるベースシートと；
    　生理活性物質を含有し、かつ、前記ベースシート側とは反対方向に延びる複数のマイクロニードルが形成され、前記ベースシートの一方側の表面上に設けられたリザーバ層と；
    　前記リザーバ層の前記ベースシート側とは反対側の表面上にメッシュ状に形成される接着層と；
    　前記リザーバ層が形成されている面と反対側の前記ベースシートの面上に剥離可能に形成された接着補助層と；を備え、
    　前記マイクロニードルの先端部は、前記接着層から突出している、
    　ことを特徴とするシート状小片。
  2. 　前記弾性材料は、透湿性を有する厚み０．１ｍｍ未満の半透明合成樹脂で構成されている、ことを特徴とする請求項１に記載のシート状小片。
  3. 　前記リザーバ層は、水溶性高分子と単糖類又は二糖類との混合物、及び、前記生理活性物質の混合物を含むことを特徴とする、請求項１に記載のシート状小片。
  4. 　前記水溶性高分子は、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、デキストリン、デキストラン、プロテオグリカン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースヒアルロン酸、及びそれらの生理学的に許容される塩からなる群から選ばれる少なくともいずれかである、ことを特徴とする請求項３に記載のシート状小片。
  5. 　前記単糖類又は二糖類は、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、トレハロース及びこれらの２以上の混合物からなる群から選ばれるいずれかである、ことを特徴とする請求項３に記載のシート状小片。
  6. 　前記生理活性物質は、歯髄幹細胞の培養上清中に含まれるものである、ことを特徴とする請求項３に記載のシート状小片。
  7. 　前記歯髄幹細胞の培養上清は凍結乾燥粉末である、ことを特徴とする請求項６に記載のシート状小片。
  8. 　前記歯髄幹細胞は、（ｉ）ｂｍｉ－１、ＨＰＶ－Ｅ６及びＨＰＶ－Ｅ７からなる群から選ばれる少なくとも１種以上の遺伝子と、（ii）ｈＴＥＲＴ又はｐＴＥＲＴのいずれかの遺伝子との組み合わせを導入した不死化細胞である、ことを特徴とする請求項６に記載のシート状小片。
  9. 　前記歯髄幹細胞は、ヒト又はブタ由来である、ことを特徴とする請求項６に記載のシート状小片。
  10. 　前記接着層は、医療用シリコン系接着剤で形成されている、ことを特徴とする請求項１に記載のシート状小片。
  11. 　前記接着補助層は、スポンジ状部材で構成されている、ことを特徴とする請求項１に記載のシート状小片。
  12. 　前記スポンジ状部材は、ウレタン、シリコン、パルプ紙、スチロール、ビニール、及び布からなる群から選ばれる素材で構成されている、ことを特徴とする請求項１１に記載のシート状小片。
  13. 　前記リザーバ層が形成されている面と反対側の前記接着層の面上に剥離可能に配置され、枠型形状を有する保持部材をさらに備え、
    　前記保持部材は、前記接着層から突出しているマイクロニードルの先端部の高さよりも長い厚みを有する、ことを特徴とする請求項１に記載のシート状小片。
  14. 　前記保持部材は、プラスチック製又は金属製シート状部材である、ことを特徴とする請求項１３に記載のシート状小片。
  15. 　前記金属製シート状部材は、アルミ製である、ことを特徴とする請求項１４に記載のシート状小片。
  16. 　発毛促進用シートにおいて、
    　請求項１～１５のいずれかに記載のシート状小片を備える、
    　ことを特徴とする発毛促進用シート。
  17. 　前記シート状小片が備えるベースシートに所定の密度で植え込まれた人工毛髪を更に備える、ことを特徴とする請求項１６に記載の発毛促進用シート。
  18. 　前記人工毛髪は、紫外線硬化性の樹脂により、前記ベースシートに固定されている、ことを特徴とする請求項１７に記載の発毛促進用シート。
  19. 　前記ベースシートの底面積が、指頭の表面積と同等の面積となっている、ことを特徴とする請求項１７に記載の発毛促進用シート。
  20. 　請求項７に記載のシート状小片を含む美白及び皺改善剤であって、
    　前記シート状小片が備えるリザーバ層が、凍結乾燥培養上清を有する、美白及び皺改善剤。
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