JP6505210B2 - シート状小片、その小片を含む発毛促進用シート、並びに、その小片を含む美白及び皺改善剤 - Google Patents
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Description
しかし、従来技術1及び2で提案されている使い捨てかつらを使用しても、頭髪が薄くなる前の状態に戻る訳ではないため、頭髪の状態の変化に合わせながら、ずっと使用し続けなければならないという問題があった。
しかし、美白や皺取り用の化粧品は、塗布後にひりひりする等の不快感が生じる、短期間しか効果を維持できないといった問題点があった。このため、美白や皺取り用の化粧品に対する、社会的要請が増大しつつある。
すなわち、本願発明の第1の態様は、弾性材料からなるベースシートと;前記ベースシートの一方側の表面上に設けられ、かつ、生理活性物質を含有したリザーバ層と;前記リザーバ層の前記ベースシート側とは反対側の表面上にメッシュ状に形成される接着層と;前記リザーバ層が形成されている面と反対側の前記ベースシートの面上に剥離可能に形成された接着補助層と;を備え、前記リザーバ層は、前記ベースシート側とは反対方向に延びるように形成され、かつ、前記生理活性物質を含有した複数のマイクロニードルを備え、前記マイクロニードルの先端部は、前記接着層から突出しており、前記接着補助層は、スポンジ状部材で構成されている、ことを特徴とするシート状小片である。
また、シート状小片1は、(e)リザーバ層4が形成されている面と反対側(−Z方向側)の接着層5の面上に剥離可能に配置され、枠型形状を有する保持部材Hをさらに備えている。ここで、保持部材Hは、接着層5から突出しているマイクロニードル4nの先端部の高さよりも長い厚みを有している。
保持部材Hは、上記シート状小片1に形成されているマイクロニードル4nを保護するために、シート状小片と一致した形状の環状部材を備えるプラスチック製又は金属製シート状部材であることが製品の重量及びコストの面から好ましい。前記保持部材が金属製シート状部材である場合は、アルミ製であることが加工のし易さ等の点から好ましい
次いで、ベースシート2の−Z方向側表面に他の接着剤を用いてリザーバ層4を強固に接着し、図3(C)に示される積層体1bを形成する。引き続き、リザーバ層の−Z方向側面におけるマイクロニードル4nが形成されていない部分に、メッシュ状に粘着剤を塗布して接着層5を形成し、図4(A)に示されるように積層体1cを形成する。
こうして作製されたシート状小片1を、所望の厚みを有する所望の大きさの金属性の板状部材、又はプラスチック製の板状部材上に設けられたリング状のシートホルダー上に載置し、製品とする。
まず、上記生理活性物質を含む培養上清の産生に使用する歯髄幹細胞を準備する。こうした幹細胞は、(i)bmi-1、HPV-E6及びHPV-E7からなる群から選ばれる少なくとも1種以上の遺伝子と、(ii)hTERT又はpTERTのいずれかの遺伝子との組み合わせを導入したものである。これらの遺伝子の組み合わせを導入すると、歯髄幹細胞を100代以上、継代することができるからである。
まず、上記脱落乳歯を、例えば、クロロヘキシジンで消毒し、歯冠部を分割し、歯科用リーマーにて歯髄組織を回収する。次いで、採取した歯髄組織を、基本培地、例えば、5〜15%のウシ血清(calf serum、以下、「CS」ということがある。)及び50〜150ユニット/mLの抗生物質を含有するダルベッコ変法イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle's Medium、以下、「DMEM」という。)に懸濁する。
次いで、例えば、10mLの90%エタノールを加えてよく攪拌し、再び、15,000xgで5分間、4℃にて遠心する。上澄みを除去し、得られたペレットを、例えば、500μLの滅菌水に溶解することができる。溶解後、全量をマイクロテストチューブに回収し、濃縮幹細胞培養上清とする。
こうして作製された発毛促進用シート10を、所望の厚みを有する所望の大きさの金属性の板状部材、又はプラスチック製の板状部材上に設けられたリング状のシートホルダー上に載置し、製品とする。
(1)ウイルス導入用ベクターの作製
(1−1)プラスミド抽出用試薬
カナマイシン(Kan)、アンピシリン(Amp)、LB液体培地及びLB寒天培地、グリコーゲン、アガロース、滅菌水、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム及びRNase Aを使用した。50mg/mLのカナマイシン(Kan)及びアンピシリン(Amp)を調製し、ストック溶液として−20℃で保存した。グリコーゲンは20mg/mLに調製した。10mg/mLのRNase Aを調製し−20℃で保存した。10M(飽和)酢酸アンモニウム(NH4OAc)、3Mの酢酸ナトリウム(NaOAc;pH5.2)を調製した。
大腸菌コンピテントセル(Supercharge EZ10 Electrocompetent Cells、製品コード 636756)、Swa I(製品コード 1111A、Smi Iが同等品)、Xho I(製品コード 1094A)、T4 DNA Ligase(製品コード 2011A)、NucleoBond Xtra Midi(製品コード 740410.10/.50/.100)、NucleoSpin Plasmid(製品コード 740588 10/50/250)は、いずれもタカラバイオ(株)より購入した。Pac IはNew England Biolabsより購入した。
1×TE Buffer(1mMのEDTAを含む10mM Tris-HCl [pH8.0])、100mM Tris-HCl(pH8.0)で飽和したフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1、以下、「PCI混液」という。)を調製した。エタノールは、100%及び70%で使用した。ミニスケールでの組換えで使用するpAdeno-X プラスミドDNAの精製用に、以下のバッファー1〜4を調製した。
バッファー2:1%SDSを含む0.2M NaOH(使用直前に用時調製、密封し、室温保存)
バッファー3:5M KOAc(オートクレーブ後、4℃で保存)
バッファー4:1mM EDTA、20μg/mL RNaseを含む10mM Tris-HCl(pH8.0)
(使用直前にRNaseを添加する。−20℃で保存)
ヒト5型アデノウイルスで形質転換したヒトHEK293細胞(ATCC #CRL1573)を使用した。HEK293細胞は完全培地で培養した。完全培地の組成は、100unit/mLのペニシリンGナトリウムと100μg/mLのストレプトマイシン、4mMLのグルタミン及び10%FBSを添加したDMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium、基本培地)とした。ペニシリンGナトリウム溶液は10,000units/mL、硫酸ストレプトマイシン溶液は10,000μg/mLで調製し、ストック溶液として保存した。培養には、60mmプレート、100mmプレート、6−ウェルプレート、T75及びT175フラスコを使用した。
(3−1)lacZ を含む組換えアデノウイルス(pAdeno-X-lacZ)の構築
10mLの上述した完全培地に、解凍後、DMSOを除去したHEK293細胞を再懸濁し、全量を直径100mmの培養プレートに移した。HEK293細胞が付着した後に培養液を除去し、細胞を滅菌PBSで一度洗浄し、1mLのトリプシン-EDTA溶液を加えて約2分間処理した。次に、10mLの完全培地を加えてトリプシンの反応を止め、穏やかに懸濁した。バイアブルカウントを行って、培養液10mLを入れた直径100mmのプレートに105個の細胞を移し、均一に拡げた。
組換えpShuttle 2 Vector(以下、「rpShuttle 2 Vector」という。)の構築前に、キットに含まれているpShuttle 2 Vector及びpShuttle 2-lacZ VectorでDH5α大腸菌を形質転換した。50μg/mLのカナマイシンを含有するLB寒天プレート(以下、「LB/Kan」という。)上で形質転換体を選択し、単一コロニーからとった菌体を新しいLB/Kanに画線し、37℃で一晩インキュベートした。
上記のようにして作製したrpShuttle 2プラスミドDNAから、導入した遺伝子の発現カセットをPI-Sce I及びI-Ceu Iで切り出した。キットに添付されたプロトコルに記載されたin vitroライゲーション法に従って、切り出した発現カセットをAdeno-X Viral DNAに組み込んだ。rpShuttle 2プラスミドDNAのPI-Sce I/I-Ceu I二重消化液を30μl調製し、下記の表1に記載した試薬を1.5mLの滅菌済みマイクロ遠心チューブに入れて混合した。
遠心チューブに、上述した二重消化液の残り(25μl)に、70μLの1×TE Buffer(pH8.0)と100μLのPCI混液とを添加し、ボルテックスで十分に撹拌した。次いで、微量遠心機を用いて、4℃にて14,000rpmで5分間遠心し、水層を清浄な1.5mLのマイクロ遠心チューブに移した。ここに、400μLの95%エタノール、25μLの10M酢酸アンモニウム、及び1μLのグリコーゲン(20mg/mL)を添加し、ボルテックスで十分に撹拌した。
ペレットが乾燥した後に、これを10μLの滅菌した1×TE Buffer(pH8.0)に溶解し、使用するまで−20℃にて保存した。
(4−1)Adeno-X ウイルスゲノムへの発現カセットのサブクローニング
下記の表2に示す試薬を、順番通りに1.5mLの滅菌済マイクロ遠心チューブに入れ、穏やかに混和し、軽く遠心した後に、16℃にて一晩インキュベートした。
下記表3に示す消化液を調製し、遠心チューブに入れた各サンプルに加えて、2時間、25℃にて、インキュベートした。
エレクトロポレーション用コンピテントセル(大腸菌)を、Supercharge EZ10Electrocompetent Cell(製品コード 636756)を使用して、上記(4−2)で得たSwa I消化産物で形質転換した。形質転換混合液を、LB培地にアンピシリン(終濃度100μg/mL)を加えた寒天プレート(以下、「LB/Amp寒天プレート」という。)に接種し、37℃で一晩インキュベートした。アンピシリン耐性(Ampr)形質転換体として、約106個のコロニーを得た。得られたコロニーを、製品に付属のAdeno-X System PCR Screening Primer Setでチェックした。
対数増殖にある培養液5mLを、14,000rpmで30秒間遠心し、上清を除去した。ペレットを再度10,000rpmで1分間遠心し、マイクロピペットを用いて、上清を除去した。ここに、150μLの上記バッファー1を加えて穏やかにピペッティングし、再懸濁した。この細胞懸濁液に、150μLのバッファー2を添加し、穏やかに転倒混和し、氷上に5分間放置した。冷却した細胞懸濁液に、150μLのバッファー3を加えて、再度転倒混和し、氷上に5分間放置した。
PI-Sce I及びI-Ceu Iを用いて解析を行った。下記の表4に示す試薬を、1.5mLの滅菌済みマイクロ遠心チューブに入れ、30μLのPI-Sce I/I-Ceu I二重消化反応液を加えて、十分に撹拌し、軽く回転させて内容物を集めた。
(6−1)HEK293細胞トランスフェクト用rAdeno-XプラスミドDNAの調製
下記表5に示す試薬等を、1.5mLの滅菌済み遠心チューブに入れて混合し、微量遠心機で軽く遠心した。その後、37℃にて2時間、インキュベートし、rAdeno-XプラスミドDNAのPac I制限酵素処理を行った。
以下のエタノール沈殿の操作は、上記(3−4)と同様に操作を行い、ペレットの溶解液は、使用まで−20℃にて保存した。
上記プラスミドDNAのトランスフェクションの24時間前に、直径60mmの培養プレートあたりの細胞数が1〜2×106(およそ100cells/mm2)になるよう、HEK293細胞を接種し、37℃、5%CO2存在下でインキュベートした。
この力価測定を始める約24時間前に、HEK293細胞をT75フラスコに接種し、37℃、5%CO2存在下で一夜培養し、50〜70%コンフルエントになっていることを確認した。
翌日、ウイルスを含む新しい培地と交換し、MOI=10で感染させた。37℃、5%CO2存在下で90分間培養した後にフラスコを取り出し、10mLの培地を加えた。
(7−1)標的細胞への感染
感染の24時間前に6−ウェルプレートに1×106個のSHEDを接種した。接種の翌日に培地を取り除き、ウイルスを含む1.0mLの培地を各プレートの中心に添加した。この溶液をSHEDが形成した単層全体に均一に広げた。
Adeno-X-lacZを感染させた接着性細胞におけるβ--ガラクトシダーゼの発現は、Luminescent β-galDetection Kit II(製品コード 631712、クロンテック社製)を使用してアッセイした。
10歳の健常男児から得られた脱落乳歯を使用した。この脱落乳歯をイソジン溶液で消毒した後、歯科用ダイヤモンドポイントを用いて、歯冠を水平方向に切断し、歯科用リーマーを用いて歯髄組織を回収した。得られた歯髄組織を、3mg/mLのI型コラゲナーゼ及び4mg/mLのディスパーゼの溶液中で37℃にて1時間消化した。ついで、この溶液を70mmの細胞ストレーナ(Falcon社製)を用いて濾過した。
上述したように、bmi-1, E6, E7及びhTERTの4つの遺伝子をアデノウイルスベクターに組み込み、これらの遺伝子産物を発現するウイルスベクターを作製した。対照として、これらの遺伝子を組み込んでいない対照ベクターを作製した。
SHED-T(遺伝子導入をしたSHED)の個体数の倍加状態を、図5に示した。図中、縦軸は個体数倍加回数(細胞分裂回数、回)、横軸は時間(培養日数)である。また、培養中のSHEDが1ヶ月間分裂しない状態を、細胞の老化の判断基準とした。SHED-Cは30回程で増殖が停止し、老化又は増殖停止段階に入った。これに対し、SHED-Tは250PDを超え、800日経過後も増殖した。
単一細胞の懸濁液を得るため、接着性の単層細胞をトリプシン/EDTAで消化した。2x105個の細胞に抗STRO-1モノクローナル抗体(1:100)を加えて放置し、FACSCaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson社製)を使用して分析した。対応するアイソタイプが同一の対照抗体と比較し、99%以上の割合で蛍光レベルが高い場合に発現が陽性とした。SHED-T及びSHED-Cともに、初期及び後期の継代細胞を固定し、FITC結合STRO-1抗体で染色した。その後、フローサイトメトリーで分析した。試験はそれぞれ二回行なった。SHED-CではSTRO-1陽性細胞の割合がPD20で27%であり、PD30では15%まで減少した(図8(A)及び(B))。SHED-TではSTRO-1陽性細胞の割合が、それぞれPD20で46%、PD40で41%であった(図6(C)及び(D))。
PD0、PD10及びPD20におけるSHED-C及びSHED-Tの分化能を、新生骨量の形成能及び組織染色で調べた。まず、2.0 x 106個のSHED-C又はSHED-Tを、40mgのヒドロキシアパタイト/三カルシウムリン酸(HA/TCP)セラミック粉末(オリンパス工業(株)製)に混合し、10週齢の免疫無防備状態マウス(NIH-bgnu-xid, 雌、Harlan Sprague Dawley社製)の背側表面の皮下に移植した。
新生骨量=新生骨面積/視野面積×100
図8に示されるように、SHED-Cでは個体数倍加回数が増えるについて新生骨量が減少し、PD20ではPD0の約1/5まで低下した。これに対し、SHED-Tでは、PD20まで新生骨量はほとんど変動がなく、PD20では、SHED-TはSHED-Cの5倍以上の骨を形成したことが示された。
SHED-C及びSHED-T細胞を、免疫無防備状態マウスの皮下組織に、1×106を個移植した。移植後、30日以上観察を行ったが、この期間中、上記の細胞を移植したいずれのマウスにおいても、腫瘍は形成されなかった。また、SHED-T細胞では、40〜200PDの培養細胞のすべてのクローンの形態に変化はなかった。以上より、SHED-Tには、癌化活性はないことが示された。
SHED-Tは、260PDを超えても分化能力を保ったまま増殖する能力を有していることが示されたが、SHED-Cは、分化能力を有するものの30PD以下で老化した。
以上から、SHED-Tは不死化細胞となっており、活性の高いSHED培養上清の大量生産に適することが示された。
ガラス容器中で、ヒアルロン酸に、約0.2〜4重量%のデキストランを混合し、ここに所望量の上記培養上清の凍結乾燥粉末を混合し、リザーバ層形成用材料とした。
また、マイクロニードルを形成するための凹部は、上部直径が約0.2mm、底部直径が約0.04mm、深さが約0.8mmの円錐形状をなすようにし、格子状に配列されるようにした。この凹部は、約75個/cm2であった。
引き続き、図3(C)〜図4(B)と同様にして、シート状小片を作成した。すなわち、ベースシート2の片面に接着補助層12を、接着剤を用いて接着させ、接着補助層12を形成していないベースシート2の面上に、リザーバ層4を接着させた。次いで、マイクロニードル4nが形成されていない部分に、メッシュ状に接着層5を形成させ、極薄シートを作製した。この極薄シート上に保持部材Hである固定用ウレタンを重ね、図1に示すようなシート状小片とした。
以上のようにして作製される発毛促進用シート1を、図3(A)〜図4(B)に示した手順で作製した。
以上のようにして調製した発毛促進用シート1を、図15に示すように、男性の頭部に貼付した。上記発毛促進用シート1を貼付して頭皮に密着させた後に、接着補助層をベースシートから剥がした。本実施例では、本発明の発毛促進用シートの貼付状態を見やすくするために、ヘア材を植え込んでいないベースを使用し、デジカメで撮影を行なった結果を図16(A)〜(C)に示す。
2 ベースシート
4 リザーバ層
5 接着層
6 人工毛髪(ヘア材)
6a 根部(植込部)
6b 自由端部
8 固定部
10 発毛促進用シート
12 接着補助層
15 案内針
H 保持部材
Claims (18)
- 弾性材料からなるベースシートと;
前記ベースシートの一方側の表面上に設けられ、かつ、生理活性物質を含有したリザーバ層と;
前記リザーバ層の前記ベースシート側とは反対側の表面上にメッシュ状に形成される接着層と;
前記リザーバ層が形成されている面と反対側の前記ベースシートの面上に剥離可能に形成された接着補助層と;を備え、
前記リザーバ層は、前記ベースシート側とは反対方向に延びるように形成され、かつ、前記生理活性物質を含有した複数のマイクロニードルを備え、
前記マイクロニードルの先端部は、前記接着層から突出しており、前記接着補助層は、スポンジ状部材で構成されている、ことを特徴とするシート状小片。 - 前記弾性材料は、透湿性を有する厚み0.1mm未満の半透明合成樹脂で構成されている、ことを特徴とする請求項1に記載のシート状小片。
- 前記リザーバ層は、水溶性高分子と単糖類又は二糖類との混合物、及び、前記生理活性物質の混合物を含むことを特徴とする、請求項1に記載のシート状小片。
- 前記水溶性高分子は、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、デキストリン、デキストラン、プロテオグリカン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースヒアルロン酸、及びそれらの生理学的に許容される塩からなる群から選ばれる少なくともいずれかである、ことを特徴とする請求項3に記載のシート状小片。
- 前記単糖類又は二糖類は、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、トレハロース及びこれらの2以上の混合物からなる群から選ばれるいずれかである、ことを特徴とする請求項3に記載のシート状小片。
- 前記生理活性物質は、歯髄幹細胞の培養上清中に含まれるものである、ことを特徴とする請求項3に記載のシート状小片。
- 前記歯髄幹細胞の培養上清は凍結乾燥粉末である、ことを特徴とする請求項6に記載のシート状小片。
- 前記歯髄幹細胞は、(i)bmi−1、HPV−E6及びHPV−E7からなる群から選ばれる少なくとも1種以上の遺伝子と、(ii)hTERT又はpTERTのいずれかの遺伝子との組み合わせを導入した不死化細胞である、ことを特徴とする請求項6に記載のシート状小片。
- 前記歯髄幹細胞は、ヒト又はブタ由来である、ことを特徴とする請求項6に記載のシート状小片。
- 前記接着層は、医療用シリコン系接着剤で形成されている、ことを特徴とする請求項1に記載のシート状小片。
- 前記スポンジ状部材は、ウレタン、シリコン、パルプ紙、スチロール、ビニール、及び布からなる群から選ばれる素材で構成されている、ことを特徴とする請求項1に記載のシート状小片。
- 前記リザーバ層が形成されている面と反対側の前記接着層の面上に剥離可能に配置され、枠型形状を有する保持部材をさらに備え、
前記保持部材は、前記接着層から突出しているマイクロニードルの先端部の高さよりも長い厚みを有する、ことを特徴とする請求項1に記載のシート状小片。 - 前記保持部材は、プラスチック製又は金属製シート状部材である、ことを特徴とする請求項12に記載のシート状小片。
- 前記金属製シート状部材は、アルミ製である、ことを特徴とする請求項13に記載のシート状小片。
- 発毛促進用シートにおいて、
請求項1〜14のいずれかに記載のシート状小片を備える、
ことを特徴とする発毛促進用シート。 - 前記シート状小片が備えるベースシートに所定の密度で植え込まれた人工毛髪を更に備える、ことを特徴とする請求項15に記載の発毛促進用シート。
- 前記人工毛髪は、紫外線硬化性の樹脂により、前記ベースシートに固定されている、ことを特徴とする請求項16に記載の発毛促進用シート。
- 請求項7に記載のシート状小片を含む美白及び皺改善剤であって、
前記シート状小片が備えるリザーバ層が、凍結乾燥培養上清を有する、美白及び皺改善剤。
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