WO2023190271A1 - ｍｉＲ－１４０を含む医薬組成物及びその製造方法 - Google Patents

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auricular
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exosomes
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博子 矢永
博道 仁科
茄津 矢永
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株式会社リジェネシスサイエンス
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition containing miR-140 and a method for producing the same.
  • Japanese Patent No. 6726726 describes a pharmaceutical composition (claim 2) having an exosome containing miR-140-3p.
  • the exosomes in this publication are collected from cardiomyocyte-derived cells (CDC).
  • Pharmaceutical compositions containing miR-140 are also described in Japanese Patent No. 6035010 and Japanese Patent No. 5395439.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition containing exosomes containing miR-140 as an active ingredient, and a method for producing a pharmaceutical composition containing exosomes containing miR-140.
  • the first invention relates to a pharmaceutical composition containing exosomes derived from auricular chondrocytes.
  • the exosome contains miR-140.
  • the following invention relates to a method for manufacturing the above pharmaceutical composition.
  • This method includes an exosome obtaining step of obtaining exosomes from auricular chondrocytes.
  • a pharmaceutical composition containing exosomes containing many miR-140 as an active ingredient and a method for producing the same can be provided.
  • the first invention relates to a pharmaceutical composition containing exosomes derived from auricular chondrocytes.
  • the exosome contains miR-140.
  • Auricular Cartilage Cells A method for collecting auricular cartilage cells is known, for example, as described in Japanese Patent No. 5320526.
  • As the auricular chondrocytes auricular chondrocytes derived from women are preferred.
  • Exosomes are lipid bilayer particles without a nucleus that are released from cells. Exosomes contain nucleic acid substances including mRNA and miRNA.
  • Japanese Patent No. 6524162 describes a pharmaceutical composition containing mesenchymal stem cell exosomes as an active ingredient. In this way, exosomes are used as active ingredients in therapeutic or preventive compositions for various diseases.
  • miR-140 miRNA is a type of small RNA of 18-22 bases, which binds to mRNA in cells and controls its transcription.
  • miR-140 (including miR-140-3p and miR-140-5p) is a known miR.
  • miR-140 is described in Japanese Patent No. 6948059, Japanese Patent No. 6726726, and Japanese Patent No. 6800470.
  • pharmaceutical compositions containing miRNA are known, for example, as described in Japanese Patent No. 6,651,061.
  • Target diseases for pharmaceutical compositions are solid cancers and tumors, as introduced in the above-mentioned patent documents.
  • Examples include brain tumor, pharyngeal cancer, maxillary cancer, oral cavity cancer, tongue cancer, lip cancer, thyroid cancer, lung cancer, breast cancer, esophageal cancer, stomach cancer, colorectal cancer, hepatocellular carcinoma, biliary tract cancer, pancreatic cancer, renal cell cancer, Bladder cancer, cervical cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, skin cancer, malignant melanoma, bone marrow tumor, osteosarcoma, soft tissue tumor, angiosarcoma, and pediatric solid tumor.
  • the pharmaceutical composition is also believed to be effective in treating osteoarthritis.
  • compositions may include known carriers (eg, water, saline, creams, excipients). Furthermore, the pharmaceutical composition may appropriately contain known materials. Also, for example, the pharmaceutical composition may contain a known anticancer agent. A pharmaceutical composition can be obtained by appropriately mixing the active ingredient with a carrier.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition of the present invention is not limited, and may be administered systemically or locally.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention may be appropriately determined depending on the administration route, and includes, but is not limited to, injections, drips, tablets, capsules, fine granules, powders, liquids, syrups, etc. Examples include liquid solutions, patches, suppositories, etc.
  • the subject to which the pharmaceutical composition of the present invention is administered is not limited, and for example, the present invention can be used in mammals (humans, pigs, cows, monkeys, baboons, dogs, cats, rats, mice, etc.).
  • the method of administering the pharmaceutical composition of the present invention to a subject is not limited, and includes the subject's health condition, degree of disease, and types of drugs used concomitantly.
  • a person skilled in the art for example, a doctor
  • An example of the dosage of miR-140 is 1 ⁇ g or more and 1 mg or less per day.
  • the following invention relates to a method for producing the above pharmaceutical composition.
  • This method includes an exosome obtaining step of obtaining exosomes from auricular chondrocytes.
  • a preferred example of the exosome acquisition step includes an auricular chondrocyte culturing step and an exosome collection step.
  • the auricular chondrocyte culturing process is a process for culturing auricular chondrocytes and obtaining cultured chondrocytes.
  • the medium for culturing auricular chondrocytes contains estrogen.
  • the estrogen contains estradiol.
  • Auricular chondrocytes can be obtained, for example, by removing the skin, connective tissue, and perichondrium from auricles obtained from humans, animals, etc., cutting them into small pieces of approximately 5 mm x 5 mm, and then treating them with collagenase.
  • Auricular chondrocytes can be isolated. Isolated auricular chondrocytes may be used as they are, or may be used in pharmaceutical compositions after being appropriately cultured.
  • Culture Auricular chondrocytes may be cultured using a known medium and under known culture conditions. However, it is preferable to add estrogen (particularly estradiol) to the culture system.
  • the exosome collection step is a step for collecting exosomes from cultured chondrocytes cultured in the auricular chondrocyte culture step.
  • the exosome collection step preferably includes a step of collecting exosomes from cultured chondrocytes using monensin or a salt of monensin.
  • Exosomes may be collected, for example, according to the method described in Japanese Patent No. 6524162.
  • Monensin Monensin is a polyether antibiotic isolated in bacteria from the genus Streptomyces. This molecule is very widely used as an additive in ruminant feed (trademark Rumensin®) to prevent coccidial infections. Examples of salts of monensin are the sodium and potassium salts.
  • exosome acquisition step includes the auricular chondrocyte culturing step, the immortalization step, and the exosome collection step.
  • the immortalization step is a step for immortalizing the cultured chondrocytes cultured in the auricular chondrocyte culture step to obtain immortalized cells.
  • the immortalization step preferably includes a step of immortalizing cultured chondrocytes using SV40 or hTERT. Immortalization using lentivirus is described in, for example, Japanese Patent No. 6302356 and Japanese Patent No. 6868565. Cultured chondrocytes may be immortalized by referring to the descriptions in these patent documents and examples.
  • the exosome collection step is a step for collecting exosomes from immortalized cells.
  • the exosome collection step preferably includes a step of collecting exosomes from immortalized cells using monensin or a salt of monensin.
  • This specification also provides a method for treating or preventing a target disease, which includes the step of administering the above-described pharmaceutical composition to a human (eg, a patient).
  • SV40 Forward Primer 5'GACTCAGGGCATGAAACAGG3', (SEQ ID NO: 1)
  • SV40 Reverse Primer 5' ACTGAGGGGCCTGAAATGA 3' (SEQ ID NO: 2)
  • the above cDNA was detected by qRT-PCR.
  • the gene was not introduced into uninfected cells, but was introduced into infected cells.
  • the cell morphology of infected cells was not significantly different from that of uninfected cells.
  • the uninfected cells stopped growing after the 15th passage, but the infected cells remained viable even after the 25th passage. Based on the above, it was concluded that the infection was successful.
  • the immortalized chondrocytes at the 5th passage were subcultured into 75 cm 2 flasks at a ratio of 1.5 x 10 6 cells per flask. Seed in several flasks. 10 nM estradiol (estradiol) was added to three of these, and culture was started without adding it to one. On the fourth day of culture, 10uM Monensin, 20nM Aplimod, and 10uM D609 were added to each flask as an exosome secretion promoter to the flasks to which estradiol had been added, and flasks to which estradiol had not been added were used as controls.
  • cDNA Synthesis from Sample Extracted Nucleic Acid Based on the extracted RNA cDNA synthesis was performed under the following conditions using miScript II RT Kit (Cat. No. 218160; Qiagen).
  • miR-140 expression by real-time PCR Based on the cDNA synthesized above, it was transferred to a real-time PCR device (LightCycler480: Roche) under the following conditions using miScript SYBR Green PCR Kit (Cat. No. 218073, Qiagen). A real-time PCR reaction was performed. As the primer for miR-140 measurement at that time, Hs_miR-140_1 miScript Primer Assay (Cat No. MS00003500; has-miR-140-5p: MIMAT0000431) was used.
  • the monensin-treated group contained nearly twice as much miR-140 as the others.
  • a low Cp value means that it was detected early and contains a lot of miR-140.
  • micro-RNAs have been found to suppress the transcription and translation of various proteins.
  • This miR is secreted from cells in the form of exosomes, and its contents are taken up by surrounding cells without being degraded even in the blood, and in the taken up cells, biosynthesis of proteins under its control is stopped.
  • the protein is necessary for cancer growth, the cancer cells that have taken it will stop growing, which will eventually lead to cancer treatment.
  • exosomes can pass through the blood-brain barrier, they can be effectively used for brain-related tumors.
  • brain tumor pharyngeal cancer, maxillary cancer, oral cavity cancer, tongue cancer, lip cancer, thyroid cancer, lung cancer, breast cancer, and esophagus cancer.
  • Gastric cancer Colorectal cancer, Hepatocellular carcinoma, Biliary tract cancer, Pancreatic cancer, Renal cell cancer, Bladder cancer, Cervical cancer, Endometrial cancer, Ovarian cancer, Skin cancer, Malignant melanoma, Bone marrow tumor.
  • - Reported to be effective against a wide range of cancers including osteosarcoma, soft tissue tumors, angiosarcoma, and pediatric solid tumors.
  • the cancer target molecules are Muc1, Flap, CTSB, Yes, Wnt-1, Glut1, THY1, GRN, TGFBR, IGF1R, CeMP, Six1, Tripartivemotif28, ORC1, TRPM2, Brd9, cMet, CADM3, PD-L1, Z EB1,
  • Examples include mTor, VEGF-A, MMP2, Pin1, HMGN, IL6, ADAMSTS5, IGFBP5, IGF2BP, IP3K, ADAM9, Sox4, Septin2, iASP, ADAM10, ATP8A, PDGFRA, MMO, and FGF9.
  • PD-L1 and VEGF have already been used as antibody cancer drugs, but it is estimated that there will be a dramatic difference in effectiveness between suppressing the molecule's action with an antibody and suppressing the biosynthesis of that molecule. be done. Moreover, even for these two target molecules, two types of expensive antibody drugs are required. Furthermore, antibody drugs have a serious drawback in that antibodies can only be produced against molecules located outside cells or molecules located on the cell surface. On the other hand, this miR/Exosome drug can suppress proteins such as enzymes, transcription factors, and signal factors that govern various cancer action points within cells.
  • treatment for osteoarthritis which increases with aging, is a symptomatic treatment that mainly uses analgesics to stop the pain, and no drug has yet been developed to treat the cause.
  • miR-140 is decreased in osteoarthritis.
  • administration of exosome containing miR-140 is effective in recovering symptoms of osteoarthritis. In this administration method for osteoarthritis, administration into the joint cavity is considered preferable in order to increase the local concentration.
  • the problem is where to regularly obtain exosomes containing miR-140.
  • articular cartilage produces miR-140
  • administering exosomes containing this miR to osteoarthritis has a significant healing effect. Therefore, the inventor decided to collect miR-140-containing exosomes from human auricular chondrocytes, for which expression of miR-140 has not yet been reported. Furthermore, since it has been reported that production of miR-140 is increased by Estradiol (female hormone), female-derived chondrocytes were used as the starting chondrocytes.
  • Exosome of miR-140 obtained from the above has the advantage of being effective as a drug because it can be frozen for a long period of time.
  • This invention makes it possible to provide an exosome anti-cancer preparation that is effective against many types of cancer with a single drug, and the first joint cavity injection type exosome preparation that has cartilage cell regeneration ability for osteochondrosis (OA). .
  • This invention can be used in the pharmaceutical industry.

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Abstract

【解決課題】　多くのｍｉＲ－１４０を含むエキソソームを有効成分として含む医薬組成物やその製造方法を提供する。 【解決手段】　耳介軟骨細胞由来のエキソソームを含み，エキソソームがｍｉＲ－１４０を含む，医薬組成物や，耳介軟骨細胞からエキソソームを得るエキソソーム取得工程を含む医薬組成物の製造方法。エキソソーム取得工程は，耳介軟骨細胞を培養し，培養軟骨細胞を得る耳介軟骨細胞の培養工程と，耳介軟骨細胞の培養工程で培養された培養軟骨細胞からエキソソームを採取するエキソソーム採取工程とを含み，耳介軟骨細胞の培養工程は，耳介軟骨細胞を培養する培地にエストロゲンを含む。

Description

ｍｉＲ－１４０を含む医薬組成物及びその製造方法
　この発明は，ｍｉＲ－１４０を含む医薬組成物及びその製造方法に関する。
　特許６７２６７２６号公報には，ｍｉＲ－１４０－３ｐを含むエキソソームを有する医薬組成物（請求項２）が記載されている。この公報のエキソソームは，心筋球由来細胞（ＣＤＣ）から回収されたものである。特許第６０３５０１０号公報や特許第５３９５４３９号公報にもｍｉＲ－１４０を含む医薬組成物が記載されている。
特許６７２６７２６号公報 特許第６０３５０１０号公報 特許第５３９５４３９号公報
　この発明は，ｍｉＲ－１４０を含むエキソソームを有効成分として含む医薬組成物や多くｍｉＲ－１４０を含むエキソソームを医薬組成物の製造方法を提供することを目的とする。
　最初の発明は，耳介軟骨細胞由来のエキソソームを含む医薬組成物に関する。そのエキソソームはｍｉＲ－１４０を含む。
　次の発明は，上記の医薬組成物を製造する方法に関する。
　この方法は，耳介軟骨細胞からエキソソームを得るエキソソーム取得工程を含む。
　多くのｍｉＲ－１４０を含むエキソソームを有効成分として含む医薬組成物やその製造方法を提供できる。
　以下，本発明を実施するための形態について説明する。本発明は，以下に説明する形態に限定されるものではなく，以下の形態から当業者が自明な範囲で適宜修正したものも含む。
　最初の発明は，耳介軟骨細胞由来のエキソソームを含む医薬組成物に関する。そのエキソソームはｍｉＲ－１４０を含む。
　耳介軟骨細胞
　耳介軟骨細胞の採取方法は，例えば特許第５３２０５２６号公報に記載される通り公知である。耳介軟骨細胞として，女性由来のもの耳介軟骨細胞が好ましい。
　エキソソームを含む医薬組成物
　エキソソームは，エクソソームともよばれる。エキソソームは細胞から放出される核を持たない脂質二重膜粒子である。エキソソームは，ｍＲＮＡやｍｉＲＮＡを含む核酸物質を内包する。例えば，特許第６５２４１６２号公報には，間葉系幹細胞エキソソームを有効成分とする医薬組成物が記載されている。このようにエキソソームは各種疾患の治療用又は予防用組成物の有効成分として利用されている。
　ｍｉＲ－１４０
　ｍｉＲＮＡは１８－２２塩基の小分子ＲＮＡの一種であり，細胞内でｍＲＮＡと結合してその転写を制御する。ｍｉＲ－１４０（ｍｉＲ－１４０－３ｐ，ｍｉＲ－１４０－５ｐを含む）は，公知のｍｉＲである。例えば，特許第６９４８０５９号公報，特許第６７２６７２６号公報，特許第６８００４７０号公報には，ｍｉＲ－１４０が記載されている。また，ｍｉＲＮＡを含む医薬組成物は，例えば特許第６６５１０６１号公報に記載される通り公知である。
　医薬組成物の対象疾患
　医薬組成物の対象疾患の例は，上記の特許文献において紹介される通り，固形癌や腫瘍である。その例は，脳腫瘍・咽頭癌・上顎癌・口腔癌・舌癌・口唇癌・甲状腺癌・肺癌・乳癌・食道癌・胃癌・大腸癌・肝細胞癌・胆道癌・膵臓癌・腎細胞癌・膀胱癌・子宮頸癌・子宮体癌・卵巣癌・皮膚癌・悪性黒色腫・骨髄腫瘍・骨肉腫・軟部腫瘍・血管肉腫・小児固形腫瘍」である。医薬組成物は，変形性関節症の治療にも有効であると考えられる。
　医薬組成物の成分
　医薬組成物は公知の担体（例えば，水，生理食塩水，クリーム，賦形剤）を含んでもよい。また，医薬組成物は，公知の材料を適宜含んでもよい。また，例えば，医薬組成物は，公知の抗がん剤を含んでもよい。有効成分を適宜担体と混合することで医薬組成物を得ることができる。
　　本発明の用医薬組成物の投与経路は限定されず、全身投与であっても、局所投与であってもよい。
　本発明の用医薬組成物の剤型は、前記投与経路に応じて適宜決定してよく、限定はされないが、注射剤、点滴剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、散剤、液剤、シロップ等に溶解した水剤、貼付剤、座薬剤等を挙げることができる。
　　本発明の医薬組成物を投与する対象は限定されず、例えば、哺乳動物（ヒト、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、イヌ、ネコ、ラット、マウス等）に対して本発明を用いることができる。
　　本発明の医薬組成物の対象への投与方法（投与経路、投与量、１日の投与回数、投与のタイミング、等）は限定されず、対象の健康状態、疾患の程度、併用する薬剤の種類等に応じて、当業者（例えば、医師）が適宜決定することができる。ｍｉＲ－１４０の投与量の例は１μｇ以上１ｍｇ以下／日である。
　次の発明は，上記の医薬組成物を製造する方法に関する。この方法は，耳介軟骨細胞からエキソソームを得るエキソソーム取得工程を含む。
　エキソソーム取得工程の好ましい例は，耳介軟骨細胞の培養工程と，エキソソーム採取工程とを含む。
　耳介軟骨細胞の培養工程は，耳介軟骨細胞を培養し，培養軟骨細胞を得るための工程である。耳介軟骨細胞を培養する培地にエストロゲンを含むことが好ましい。エストロゲンは，エストラジオールを含むものが好ましい。耳介軟骨細胞は、例えば、人や動物等から得た耳介から、皮膚、結合織、軟骨膜を除去したうえで、５ｍｍ×５ｍｍ程度の小片に細切した後、コラゲナーゼ処理することにより、耳介軟骨細胞を単離することができる。単離した耳介軟骨細胞をそのまま用いてもよいし、適宜培養した後に医薬組成物に用いてもよい。
　培養
　公知の培地を用いて，公知の培養条件により耳介軟骨細胞を培養すればよい。もっとも培養系にエストロゲン（特にエストラジオール）を添加することが好ましい。
　エキソソーム採取工程は，耳介軟骨細胞の培養工程で培養された培養軟骨細胞からエキソソームを採取するための工程である。エキソソーム採取工程は，モネンシン又はモネンシンの塩を用いて培養軟骨細胞からエキソソームを採取する工程を含むものが好ましい。
　エキソソームの採取
　エキソソームは，例えば特許第６５２４１６２号公報に記載された方法に従って採取すればよい。
　モネンシン
　　モネンシンは、ストレプトマイセス属（ｇｅｎｕｓ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）からバクテリアで単離されたポリエーテル系抗生物質である。この分子は、コクシジウム型感染症を予防するために、反芻動物飼料（商標Ｒｕｍｅｎｓｉｎ（登録商標））の添加物として非常に広く使用されている。モネンシンの塩の例は，ナトリウム塩，カリウム塩である。
　エキソソーム取得工程の好ましい上記とは別の例は，耳介軟骨細胞の培養工程と，不死化工程と，エキソソーム採取工程とを含む。
　不死化工程は，耳介軟骨細胞の培養工程で培養された培養軟骨細胞を不死化し不死化細胞を得るための工程である。
　不死化工程
　培養軟骨細胞を不死化するためには，レンチウイルス感染を引き起こせばよい。例えば，不死化工程は，ＳＶ４０又はｈＴＥＲＴを用いて培養軟骨細胞を不死化する工程を含むものが好ましい。レンチウイルスを用いた不死化は，例えば特許第６３０２３５６号公報，及び特許第６８６８５６５号公報に記載されている。これらの特許文献や実施例の記載を参考にして，培養軟骨細胞を不死化すればよい。
　この例では，エキソソーム採取工程は，不死化細胞からエキソソームを採取するための工程である。エキソソーム採取工程は，モネンシン又はモネンシンの塩を用いて不死化細胞からエキソソームを採取する工程を含むものが好ましい。
　この明細書は，ヒト（例えば患者）に上記した医薬組成物を投与する工程を含む，対象疾患の治療方法や予防方法をも提供する。
　ヒト耳介軟骨細胞の不死化
　レンチウイルス感染（Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）
　正常女性耳介軟骨細胞を感染２４時間前に３０－４０％　コンフルエントの状態に６－ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに播種した。
　翌日に、細胞をＬｅｎｔｉ－ＳＶ４０　（ＬＶ６１３）とＬｅｎｔｉ－ｈＴＥＲＴ　（ＬＶ６１５）のレンチウイルスでＭＯＩ　５の条件で感染させた。
　７２時間後に、細胞を継代しｑＲＴ－ＰＣＲで遺伝子の導入をチェックした。
　感染及び非感染細胞から５Ｘ　Ａｌｌ－Ｉｎ－Ｏｎｅ　ＭａｓｔｅｒｍｉｘとＥＸＣｅｌｌｅｎｔＣＴ　Ｌｙｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｇ９１６）を用いてＲＮＡを抽出して、そこからｃＤＮＡを合成した。
　遺伝子導入の可否は、
ＳＶ４０　Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ：
５’ＧＡＣＴＣＡＧＧＧＣＡＴＧＡＡＡＣＡＧＧ３’，（配列番号１）
ＳＶ４０　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ：
５’　ＡＣＴＧＡＧＧＧＧＣＣＴＧＡＡＡＴＧＡ　３’（配列番号２）
を用いて上記のｃＤＮＡをｑＲＴ－ＰＣＲで検出した。
その結果、非感染細胞には遺伝子の導入はなく、感染細胞には導入されていた。感染細胞の細胞形態は非感染細胞とあまり変わらなかった。しかし、継代培養を続けると、感染させなかった細胞は１５継代で増殖が止まったが、感染させた細胞は２５継代を過ぎても生きてた。以上から、感染は成功したと結論された。
　不死化軟骨細胞への各種エキソソーム放出増加剤添加及び培養上清の処理
　５継代目の不死化軟骨細胞を継代し、７５ｃｍ２フラスコに１フラスコ当たり１．５ｘ１０６　個の細胞の割合で、４個のフラスコに播種した。このうち３個には１０ｎＭ　エストラジオール（エストラジオール）を添加し、１個には添加せずに培養を開始した。培養４日目に、エストラジオールを添加しているフラスコにエキソソーム分泌促進剤として各フラスコに１０ｕＭ　モネンシン（Ｍｏｎｅｎｓｉｎ），　２０ｎＭ　アプリモド（Ａｐｌｉｍｏｄ），　１０ｕＭ　Ｄ６０９を添加し、エストラジオールを添加していないフラスコをコントロールとして翌日まで培養を行った。翌日に各フラスコから培地を採取し、次に１，５００ｒｐｍ，　５分遠心した。この上清を更に０．２２ｕｍの濾過フィルターで濾過し、エキソソーム画分としてｍｉＲの分析まで－８０°Ｃで保存した。
　サンプルからのｍｉＲ抽出及び抽出核酸の確認
　実施例２のエキソソーム画分からｅｘｏＲＮＡｅａｓｙ　Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ　（キアゲン）を用いてｍｉｃｒｏＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡのＡ２６０／Ａ２８０及びＡ２６０／Ａ２３０を分光光度計Ｎａｎｏ　Ｄｒｏｐ　Ｏｎｅ　（サーモフィッシャーサイエンス社）を用いて測定し、このサンプルには蛋白及び塩の夾雑物がないことが判明した。さらにＡｇｉｌｅｎｔ　２１００　Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ　（Ａｌｉｇｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でサンプルの電気泳動を行い、ターゲットの核酸のみが含まれていることを確認した。以下の表のように、採取された核酸量はモネンシン処理が一番多くなることが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　サンプル抽出核酸からのｃＤＮＡ合成
　抽出したＲＮＡをもとに、ｍｉＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＲＴ　Ｋｉｔ　（カタログ番号：２１８１６０；キアゲン社）を使用して下記の条件でｃＤＮＡ合成を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　リアルタイムＰＣＲによるｍｉＲ－１４０発現の検討
　上記で合成されたｃＤＮＡをもとに、ｍｉＳｃｒｉｐｔ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　Ｋｉｔ　（カタログ番号２１８０７３　キアゲン社）を使用して下記の条件でリアルタイムＰＣＲ装置（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０：ロシュ社）にてリアルタイムＰＣＲ反応を行った。その時のｍｉＲ－１４０測定のためのプライマーはＨｓ＿ｍｉＲ－１４０＿１　ｍｉＳｃｒｉｐｔ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａｓｓａｙ（Ｃａｔ　Ｎｏ．ＭＳ００００３５００；　ｈａｓ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ：　ＭＩＭＡＴ００００４３１）を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　その結果、下記の値を得た。したがって、モネンシン処理群が他より２倍近くのｍｉＲ－１４０を含んでいることが判明した。Ｃｐ値が低いことは、早く検出されたことを意味し、多くのｍｉＲ－１４０を含んでいることを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　考察
　従来の抗癌剤は１種で１つの標的分子を抑制することでその抗癌作用が現われていた。一方、１つの分子で多種類の標的分子種に作用するという新しい生体内物質が見出され始めた。この中で、ｍｉｃｒｏ－ＲＮＡ（ｍｉＲ）は種々の蛋白質の転写や翻訳を抑制することが分かってきたが、その中で癌に増殖抑制に有効なデータが実験的に示されているｍｉＲがｍｉＲ－１４０である。このｍｉＲは細胞からＥｘｏｓｏｍｅの形で分泌され、その内容物は血中でも分解されることなく周囲の細胞に取りこまれ、取り込んだ細胞では、その支配下にある蛋白質の生合成が停止する。その結果、その蛋白質が癌の増殖に必要なものであれば、取り込んだ癌細胞は増殖を止めることとなり、結果として癌治療に繋がる。また、Ｅｘｏｓｏｍｅは血液脳関門を通過できるので脳関連の腫瘍にも有効に使用できる。
　種々の癌細胞にｍｉＲ－１４０を増加させた場合、現在までに実験的に脳腫瘍・咽頭がん・上顎がん・口腔がん・舌癌・口唇癌・甲状腺がん・肺がん・乳がん・食道がん・胃がん・大腸がん・肝細胞癌・胆道癌・膵臓癌・腎細胞がん・膀胱がん・子宮頸がん・子宮体癌・卵巣がん・皮膚がん・悪性黒色腫・骨髄腫瘍・骨肉腫・軟部腫瘍・血管肉腫・小児固形腫瘍等の幅広い癌に有効と報告されている。ここに作用するｍｉＲ－１４０の癌標的分子は、４２種類が報告されている。その癌標的分子は、Ｍｕｃ１，Ｆｌａｐ，ＣＴＳＢ，Ｙｅｓ，Ｗｎｔ－１，Ｇｌｕｔ１，ＴＨＹ１，ＧＲＮ，ＴＧＦＢＲ，ＩＧＦ１Ｒ，ＣｅＭＰ，Ｓｉｘ１，Ｔｒｉｐａｒｔｉｖｅｍｏｔｉｆ２８，ＯＲＣ１，ＴＲＰＭ２，Ｂｒｄ９，ｃＭｅｔ，ＣＡＤＭ３，ＰＤ－Ｌ１，ＺＥＢ１，ｍＴｏｒ，ＶＥＧＦ－Ａ，ＭＭＰ２，Ｐｉｎ１，ＨＭＧＮ，ＩＬ６，ＡＤＡＭＳＴＳ５，ＩＧＦＢＰ５，ＩＧＦ２ＢＰ，ＩＰ３Ｋ，ＡＤＡＭ９，Ｓｏｘ４，Ｓｅｐｔｉｎ２，ｉＡＳＰ，ＡＤＡＭ１０，ＡＴＰ８Ａ，ＰＤＧＦＲＡ，ＭＭＯ，ＦＧＦ９等が挙げられている。この中のＰＤ－Ｌ１とかＶＥＧＦは既に抗体癌医薬として使用されているが、分子作用を抗体で抑えることと、その分子の生合成を抑制することは効果に劇的な隔たりが生ずるものと推定される。しかも、この２つの標的分子でも高価な抗体医薬が２種類も必要となる。また、抗体医薬では細胞外にある分子か、または細胞表面にある分子に対してしか抗体を造ることができない重大な欠点を持つ。一方、このｍｉＲ／Ｅｘｏｓｏｍｅ薬は細胞内の種々の癌作用点を司る酵素・転写因子・シグナル因子等の蛋白質を抑制することができる。
　　さて、癌の増殖・転移・生存に必要なこれらの標的分子を一度に抑制することは、今までの一点にのみ効果がある分子標的薬とは抗癌効果が明らかに向上する可能性が高く、また標的癌の種類も多種に及ぶこと、及び血液脳関門も通過するｍｉＲ－１４０含有Ｅｘｏｓｏｍｅは標的器官に着くまでは分解されないので極めて有効な癌治療薬と成り得る。この時は２種類の投与法が考えられる。１つは静脈注射であるが、その場合は体内全般には行き渡るが、患部である関節内への移行率は低いと考えられる。癌治療の場合、特に既に全身に転移している場合は脳への転移も考えて静脈注射が相応しい。しかし、未だ転移していない場合は患部局所への投与が好ましい。
　一方、老化に伴って増加する変形関節症の治療は鎮痛薬を使用して、その痛みを止めることを主とする対症療法であり、原因を治す薬は未だ開発されていない。しかし最近、変形関節症ではｍｉＲ－１４０の減少が起こっていることが報告され始めた。更に、ｍｉＲ－１４０を含有するＥｘｏｓｏｍｅの投与は変形関節症の症状回復に有効であることが報告されている。この変形性関節症での投与法は、関節腔内への投与が局所濃度をあげるためにも好ましいと考えられている。
　　問題は、このｍｉＲ－１４０を含むＥｘｏｓｏｍｅを何処から定常的に得るかということである。まず、第一に関節軟骨がｍｉＲ－１４０を産生していることが報告されており、しかも、このｍｉＲを含有するＥｘｏｓｏｍｅを変形関節症に投与すると治癒効果が大きいことが報告されている。そこで、発明者は未だｍｉＲ－１４０の発現が報告されていないヒト耳介軟骨細胞からｍｉＲ－１４０含有Ｅｘｏｓｏｍｅを採取することとした。また、ｍｉＲ－１４０はＥｓｔｒａｄｉｏｌ（女性ホルモン）によって産生を上げることが報告されていることから、出発の軟骨細胞は女性由来のものを用いた。この事により、女性ホルモン受容体を持つ細胞を得ることとなり、培養系にＥｓｔｒａｄｉｏｌを添加することによりｍｉＲ－１４０の産生を増やすことを可能とした。次に定常的にこの細胞からＥｘｏｓｏｍｅを採取するために、この細胞をＬｅｎｔｉ－ＳＶ４０およびＬｅｎｔｉ－ｈＴＥＲＴを用いて不死化した。最終的にこの細胞からＥｘｏｓｏｍｅを多量に採取するために、３種のＥｘｏｓｏｍｅ放出促進剤を添加してＥｘｏｓｏｍｅの採取を行い、そこからのｍｉＲ－１４０の存在量を定量した。その結果、今までに報告のない耳介軟骨細胞にｍｉＲ－１４０が多量に且つ安定的に発現する方法を決定できた。以上から得られるｍｉＲ－１４０をＥｘｏｓｏｍｅは冷凍で長期間保存できるので薬物として有効な長所を有する。
　この発明は、１剤で多種の癌種に効果を及ぼすＥｘｏｓｏｍｅ抗癌製剤の提供及び変形性軟骨症（ＯＡ）に対し軟骨細胞再生力を持つ初の関節腔注入型Ｅｘｏｓｏｍｅ製剤を提供できることとなる。
　この発明は医薬産業において利用されうる。

Claims (8)

  1. 　　耳介軟骨細胞由来のエキソソームを含み，
    　前記エキソソームがｍｉＲ－１４０を含む，医薬組成物。
  2. 　ｍｉＲ－１４０を含むエキソソームを有する医薬組成物の製造方法であって，
    　耳介軟骨細胞から前記エキソソームを得るエキソソーム取得工程を含む医薬組成物の製造方法。
  3. 　請求項２に記載の医薬組成物の製造方法であって，
    　前記エキソソーム取得工程は，
    　耳介軟骨細胞を培養し，培養軟骨細胞を得る耳介軟骨細胞の培養工程と，
    　前記耳介軟骨細胞の培養工程で培養された前記培養軟骨細胞からエキソソームを採取するエキソソーム採取工程とを含み，
    　前記耳介軟骨細胞の培養工程は，耳介軟骨細胞を培養する培地にエストロゲンを含む，
    　医薬組成物の製造方法。
  4. 　請求項３に記載の医薬組成物の製造方法であって，
    　前記エストロゲンは，エストラジオールを含む，医薬組成物の製造方法。
  5. 　請求項３に記載の医薬組成物の製造方法であって
    　前記エキソソーム採取工程は，モネンシン又はモネンシンの塩を用いて前記培養軟骨細胞からエキソソームを採取する工程を含む，医薬組成物の製造方法。
  6. 　請求項２に記載の医薬組成物の製造方法であって，
    　前記エキソソーム取得工程は，
    　耳介軟骨細胞を培養し，培養軟骨細胞を得る耳介軟骨細胞の培養工程と，
    　前記耳介軟骨細胞の培養工程で培養された前記培養軟骨細胞を不死化し不死化細胞を得る不死化工程と，
    　前記不死化細胞からエキソソームを採取するエキソソーム採取工程とを含む，医薬組成物の製造方法。
  7. 　請求項６に記載の医薬組成物の製造方法であって，　
    　前記不死化工程は，ＳＶ４０又はｈＴＥＲＴを用いて前記培養軟骨細胞を不死化し不死化細胞を得る工程を含む，医薬組成物の製造方法。
  8. 　請求項６に記載の医薬組成物の製造方法であって
    　前記エキソソーム採取工程は，モネンシン又はモネンシンの塩を用いて前記不死化細胞からエキソソームを採取する工程を含む，医薬組成物の製造方法。

     
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