CN114480394B - Sp1的反义寡核苷酸及其在制备抑制sp1阳性癌症核酸药物中的应用 - Google Patents

Sp1的反义寡核苷酸及其在制备抑制sp1阳性癌症核酸药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了SP1的反义寡核苷酸及其在制备抑制SP1阳性癌症核酸药物中的应用。用生物信息学在线工具分析SP1蛋白转录组序列信息，筛选长度在20碱基的、能够结合的反义寡核苷酸位点，同时利用分子生物学实验验证，证明反义寡核苷酸ASOSP1能够降低SP1mRNA及其蛋白在细胞内的水平。本发明为临床上治疗SP1高表达且SP1发挥重要作用的多种癌症细胞，提供了核酸药物制备的新的手段。

Description

SP1的反义寡核苷酸及其在制备抑制SP1阳性癌症核酸药物中 的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及SP1的反义寡核苷酸及其在制备抑制SP1阳性癌症核酸药物中的应用。
背景技术
2018年全球有高达18078957新增癌症病例，发病率236.9/10万，世界标准人口标化发病率197.9/10万；癌症死亡病例高达9555027例，死亡率125.2/10万，世界标准人口标化死亡率101.1/10万。全球185个国家中，有105个国家男性发病第1的癌症是前列腺癌；肺癌是37个国家男性发病的首位；肝癌和结直肠癌分别是13个和10个国家发病首位。肺癌在全球93个国家的男性中排死因第1位，46个国家的男性主要死于前列腺癌，20个国家是肝癌。此外膀胱癌的发病中，男性患者人数也四倍于女性患者。而女性死亡率分布更为复杂：103个国家乳腺癌是癌症死亡的首位，42个国家宫颈癌是首位，而男性最常见的死因—肺癌，在28个国家中的女性死因中也位居第一。由此可见，肺癌，肝癌，前列腺癌，乳腺癌，宫颈癌，膀胱癌等癌症，严重威胁着人类的生活质量与生命健康。
Sp1蛋白属于Sp/类Krtippel转录因子家族(Sp/KLF家族)，依功能不同可以分为4个部分：DNA结合区域、Spl的活化区、Btd盒以及Sp盒。Sp1在胃癌、胰腺癌、乳腺癌和甲状腺肿瘤细胞中都有高表达。Zhang等人发现，在同一患者体内，肿瘤组织中的Sp1表达水平显著高于周围正常组织；且与肿瘤的浸润程度呈正相关，Sp1高表达的患者中位生存时间显著短于低表达或不表达Sp1的胃癌患者，而下调Sp1的过表达能抑制癌细胞形成肿瘤。
反义核酸药物从1978年发现并提出理论，到世纪之交第一种药物上市、推出2代反义技术，再到后来发展遇到低谷，药品退市，人们对其理解与运用的过程经历了一种螺旋式的上升。其研发伊始就承担着攻克普通药物无法治愈的疾病(如肿瘤)的希冀。随着近年来几种治疗癌症的反义核酸药物获批进入临床试验，此类药物重新回到了生物制药研究的舞台，再次展现了这种药物在基因治疗领域的广阔前景。
关于靶向SP1反义寡核苷酸的研究还未见报道，且其抑制剂的研发尚不充分。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一是提供针对SP1的反义寡核苷酸。
本发明的目的之二是提供一种治疗SP1阳性癌症的手段。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明第一方面提供了一种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸由15-30个核苷酸组成，所述反义寡核苷酸抑制SP1的表达。
进一步，所述反义寡核苷酸由18-22个核苷酸组成。
进一步，所述反义寡核苷酸由20个核苷酸组成。
进一步，所述反义寡核苷酸的靶序列选自SEQ ID NO.1-2任一项所示的序列。
进一步，所述反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明第二方面提供了对本发明第一方面所述的反义寡核苷酸进行修饰的反义寡核苷酸。
进一步，所述修饰包括至少1个核苷间键修饰。
进一步，所述核苷间键修饰是硫代磷酸酯修饰。
进一步，所述修饰包括全链的核苷间键修饰。
进一步，所述修饰包括至少1个糖修饰。
进一步，所述糖修饰为2′-甲氧乙基修饰。
进一步，所述修饰包括至少6个糖修饰。
进一步，所述修饰包括10个糖修饰。
进一步，所述糖修饰位于反义寡核苷酸序列两侧。
进一步，所述两侧的糖修饰的数量为5。
进一步，所述反义寡核苷酸包括至少一个的核苷间键修饰和至少一个的糖修饰。
进一步，所述反义寡核苷酸包括全链的核苷间键修饰和至少1个糖修饰。
进一步，所述反义寡核苷酸包括全链的核苷间键修饰和至少6个糖修饰。
进一步，所述反义寡核苷酸包括全链的核苷间键修饰和10个糖修饰。
进一步，所述反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.13所示。
本发明第三方面提供了一种缀合物，包括本发明第一方面或本发明第二方面所述的反义寡核苷酸，以及至少一个共价连接到所述寡核苷酸的缀合物部分。
本发明第四方面提供了一种组合物，包括权本发明第一方面所述的反义寡核苷酸、本发明第二方面所述的反义寡核苷酸或本发明第三方面所述的缀合物，和药学上可接受的稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。
本发明第五方面提供了一种体内或体外用于调节表达SP1的靶细胞中SP1表达的方法，所述方法包括以有效量向所述细胞施用本发明第一方面所述的反义寡核苷酸、本发明第二方面所述的反义寡核苷酸、本发明第三方面所述的缀合物或本发明第四方面所述的组合物。
本发明第六方面提供了设计高效反义寡核苷酸的方法，包括：
设计针对靶基因的反义寡核苷酸。
对反义寡核苷酸进行糖化修饰，所述糖化修饰的数量为10。
进一步，所述糖化修饰平均分布于反义寡核苷酸序列的两侧。
进一步，所述糖化修饰为2′-甲氧乙基修饰。
进一步，所述方法还包括对反义寡核苷酸进行核苷间键修饰。
进一步，所述核苷间键修饰为全链核苷间键修饰。
进一步，所述核苷间键修饰为硫代磷酸酯修饰。
进一步，设计针对靶基因的反义寡核苷酸的方法如下：
1)分析靶基因各个转录本的mRNA结构信息，并记录其共有序列；
2)使用sfold RNA二级结构在线预测工具中，通过输入共有序列，设计合成反义寡核苷酸。
本发明第七方面提供了本发明第一方面或本发明第二方面所述的反义寡核苷酸在制备治疗SP1阳性癌症的药物组合物中的应用。
进一步，SP1阳性癌症包括胃癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、宫颈癌、膀胱癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、结肠癌、肾癌、舌鳞癌、子宫内膜癌、胆管癌、前列腺癌。
进一步，SP1阳性癌症选自前列腺癌。
进一步，所述前列腺癌选自去势抵抗性前列腺癌。
进一步，所述反义寡核苷酸抑制SP1阳性癌症细胞增殖和迁移。
本发明第八方面提供了本发明第三方面所述的缀合物在制备治疗SP1阳性癌症的药物组合物中的应用。
进一步，SP1阳性癌症包括胃癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、宫颈癌、膀胱癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、结肠癌、肾癌、舌鳞癌、子宫内膜癌、胆管癌、前列腺癌。
进一步，SP1阳性癌症选自前列腺癌。
进一步，所述前列腺癌选自去势抵抗性前列腺癌。
进一步，所述缀合物抑制SP1阳性癌症细胞增殖和迁移。
本发明第九方面提供了本发明第四方面所述的组合物在制备治疗SP1阳性癌症的药物组合物中的应用。
进一步，SP1阳性癌症包括胃癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、宫颈癌、膀胱癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、结肠癌、肾癌、舌鳞癌、子宫内膜癌、胆管癌、前列腺癌。
进一步，所述前列腺癌选自去势抵抗性前列腺癌。
进一步，所述组合物抑制SP1阳性癌症细胞增殖和迁移。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供了设计反义寡核苷酸以及进行反义寡核苷酸修饰的方法，使用该方法设计的反义寡核苷酸具有较高的敲除效率。
本发明提供了针对SP1的反义寡核苷酸药物在预防或治疗SP1阳性细胞癌中的应用，所述反义寡核苷酸能够有效的抑制癌细胞的增殖活性以及迁移侵袭能力。
附图说明
图1是SP1在不同细胞系中的表达情况图；
图2是不同修饰的反义寡核苷酸的敲除效果图；其中，2A是不同修饰方式的反义寡核苷酸敲除效果图；2B是不同修饰位点数的反义寡核苷酸敲除效果图；
图3是甲氧乙基修饰的反义寡核苷酸的敲除效果图；
图4是SP1对癌细胞增殖的影响图；
图5是SP1对癌细胞迁移侵袭的影响图；其中5A是显微镜下拍照图；5B是统计图。
具体实施方式
生物医学领域一直需要在不负面影响靶RNA中靶腺苷的编辑效率的情况下，改善编辑RNA的反义寡核苷酸(ASO)的药代动力学特性。许多化学修饰存在于ASO的产生中，其特性并不总是与实现有效RNA编辑的愿望相一致。在寻求更好的药代动力学特性的过程中，设计并研究ASO的修饰对于改善ASO的稳定性以及对靶基因的编辑能力具有重要的意义。
在本发明中，术语SP1(Gene ID:6667)包括野生型、突变型或其片段。本发明的SP1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。
寡核苷酸
如本文所用，术语“寡核苷酸”定义为如技术人员通常理解的包含两个或以上共价联接的核苷的分子。这样的共价结合的核苷也可以称为核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常是在实验室中制作，先经固相化学合成后再加以纯化和分离。当提及寡核苷酸的序列时，提及的是共价联接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本发明的寡核苷酸是人造的，并且是化学合成的，并且通常是纯化或分离的。本发明的寡核苷酸可包含一个或多个经修饰的核苷或核苷酸，诸如2'糖修饰的核苷。
靶序列
本文所用的术语“靶序列”意指存在于靶核酸中的核苷酸的序列，其包含与本发明的寡核苷酸为互补的核碱基序列。在一些实施例中，靶序列由靶核酸上具有与本发明寡核苷酸的连续核苷酸序列互补的核碱基序列的区域组成。靶核酸的这一区域可以互换地称为靶标核苷酸序列、靶序列或靶标区域。在一些实施例中，所述靶序列比单一寡核苷酸的互补序列更长，并且可以例如代表所述靶核酸的被本发明的若干寡核苷酸所靶向的优选区域。
在一些实施例中，靶序列是选自人SP1 mRNA的序列。
本发明的寡核苷酸包含与靶核酸诸如本文所述的靶序列互补或杂交的连续核苷酸序列。
反义寡核苷酸
如本文所用，术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶核酸，特别是与靶核酸上的连续序列杂交来调节靶基因的表达的寡核苷酸。
作为一种优选地实施方式，反义寡核苷酸包含至少一个化学改性或者修饰。术语“经修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与同等的DNA或RNA核苷相比，通过引入糖部分或(核)碱基部分的一种或多种修饰而被修饰的核苷。在优选的实施例中，修饰的核苷包含修饰的糖部分。
糖修饰
与DNA和RNA中发现的核糖糖部分相比时本发明的寡聚物可包含一种或多种具有修饰的糖部分(即糖部分的修饰)的核苷。
已经制备了许多具有核糖部分的修饰的核苷，主要目的是改善寡核苷酸的某些性质，诸如亲和力和/或核酸酶抗性。这样的修饰包括其中核糖环结构被修饰的那些修饰，例如，通过用己糖环(HNA)或双环替换核糖环结构来实现，其通常在核糖环(LNA)的C2和C4碳原子之间具有双基桥，或通常在C2和C3之间缺乏键的未连接核糖环(例如UNA)。其他糖修饰的核苷包括，例如，双环己糖核酸或三环核酸。经修饰的核苷还包括其中糖部分被替换为非糖部分的核苷，例如在肽核酸(PNA)或吗啉代核酸的情况下。
糖修饰还包括通过将核糖环上的取代基更改为氢以外的基团或天然存在于DNA和RNA核苷中的2'-OH基团所做出的修饰。例如，可以在2'、3'、4'或5'位置引入取代基。
2'糖修饰的核苷
2'糖修饰的核苷是一种核苷，其在2'位置具有除H或-OH以外的取代基(2'取代的核苷)或包含能够在2'碳与核糖环中的第二个碳原子之间形成桥的2'连接双基，诸如LNA(2'-4'双基桥连)核苷。2'取代的修饰的核苷的包括但不限于2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-RNA和2'-F-ANA核苷。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为7-50核苷酸，优选为10-40核苷酸，更优选为15-30核苷酸，更优选为18-25核苷酸，更优选为20核苷酸。
在优选的实施方案中，所述反义寡核苷酸由20个核苷酸组成。
在本发明的实施例中，所述反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.1-2任一项所示。
作为优选的实施方案，所述反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.1所示。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸的修饰包括至少一个核苷间键修饰。
作为一种进一步实施方案，反义寡核苷酸的修饰包括全链核苷间键修饰。
在一些实施方案中，核苷间键修饰是硫代磷酸酯修饰。
在具体实施方案中，所述反义寡核苷酸选自SEQ ID NO.5-6任一项所述的序列。
在进一步实施方案中，所述反义寡核苷酸为SEQ ID NO.5所述的序列。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸的修饰包括至少一个糖修饰。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸的修饰包括至少6个糖修饰。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸的修饰包括至少10个糖修饰。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸的糖修饰位于反义寡核苷酸序列两侧。
在一些实施方案中，两侧的糖修饰的数量为5。
作为进一步实施方案，所述糖修饰为2′-甲氧乙基修饰。
在进一步实施方案中，所述反义寡核苷酸包括至少一个的核苷间键修饰和至少一个的糖修饰。进一步，所述反义寡核苷酸包括全链的核苷间键修饰和至少一个的糖修饰。更为进一步，所述反义寡核苷酸包括全链的核苷间键修饰和至少6个的糖修饰。更为进一步，所述反义寡核苷酸包括全链的核苷间键修饰和10个糖修饰。
在优选的实施方案中，所述反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.12-15任一项所示。
在更为优选的实施方案中，所述反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.13所示。
缀合物
如本文所用，术语“缀合物”是指与非核苷酸部分(缀合物部分或区域C或第三区域)共价联接的寡核苷酸。
本发明的寡核苷酸与一个或多个非核苷酸部分的缀合可以改善该寡核苷酸的药理学，例如，通过影响寡核苷酸的活性、细胞分布、细胞吸收或稳定性实现。在一些实施例中，所述缀合物部分是通过改善寡核苷酸的细胞分布、生物利用度、新陈代谢、排泄、渗透性和/或细胞摄入来调整或增强寡核苷酸的药代动力学特性。特别地，缀合物可将寡核苷酸靶向特定的器官、组织或细胞类型，从而增强寡核苷酸在该器官、组织或细胞类型中的有效性。同时，缀合物可用于降低寡核苷酸在非靶细胞类型、组织或器官中的活性，例如脱靶活性或在非靶细胞类型、组织或器官中的活性。
在一个实施例中，非核苷酸部分(缀合物部分)选自由碳水化合物、细胞表面受体配体、药物、激素、亲脂性物质、聚合物、蛋白质、肽、毒素(例如细菌毒素)、维生素、病毒蛋白(例如衣壳)或其组合组成的组。
组合物
本发明提供了组合物，其包含任何前述反义寡核苷酸和/或反义寡核苷酸缀合物或其盐以及药用稀释剂、载体、盐和/或佐剂。药用稀释剂包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)，而药用盐包括但不限于钠盐和钾盐。在一些实施例中，药用稀释剂是无菌磷酸盐缓冲盐水。
术语“药用盐”是指那些保留游离碱或游离酸的生物学有效性和特性的盐，其并非在生物学上或其它方面所不希望的。
本发明的寡核苷酸或寡核苷酸缀合物可与药用活性或惰性物质混合，用以制备药物组合物或制剂。药物组合物的组成和配制方法取决于许多标准，包括但不限于施用途径、疾病程度或施用剂量。
这些组合物可以通过常规的灭菌技术进行灭菌，或者可以进行无菌过滤。所得的水溶液可以包装后直接使用或冻干，在施用前将冻干的制剂与无菌水性载体混合。制剂的pH通常为介于3至11之间，更优选地介于5和9之间或介于6和8之间，并且最优选地介于7和8之间，诸如7至7.5。可以将固体形式的所得组合物包装在多个单剂量单元中，每一个单元包含固定量的一种或多种上述试剂，诸如在片剂或胶囊的密封包装中。固体形式的组合物也可以灵活的量包装在容器中，诸如在设计用于局部适用的乳膏或软膏的可挤压管中。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸或寡核苷酸缀合物是前药。特别地，对于寡核苷酸缀合物，一旦前药被递送至作用位点例如靶细胞，缀合物部分就从寡核苷酸上裂解下来。
方法
本发明提供了一种体内或体外用于调节表达SP1的靶细胞中SP1表达的方法，所述方法包括以有效量向所述细胞施用前述的反义寡核苷酸、缀合物或组合物。
如本文所用，术语“表达的调节”应理解为，与施用寡核苷酸之前的SP1的量相比，寡核苷酸改变SP1量的能力的总称。备选地，表达的调节可参照对照实验进行确定。如普遍所知，对照是以盐水组合物处理的单个或靶细胞，或是以非靶向寡核苷酸(模拟品)处理的单个或靶细胞。
一种调节类型是寡核苷酸抑制、下调、降低、抑制、去除、停止、阻断、阻止、减少、减低、避免或终止SP1表达的能力，例如通过降解mRNA或阻止转录实现。本发明的反义寡核苷酸有利地能够抑制哺乳动物SP1诸如人SP1的表达。
本发明另外一方面提供了设计高效反义寡核苷酸的方法，包括：
设计针对靶基因的反义寡核苷酸。
对反义寡核苷酸进行糖化修饰，所述糖化修饰的数量为10。
在优选的实施方案中，所述糖化修饰平均分布于反义寡核苷酸序列的两侧。
在一些实施方案中，所述糖化修饰为2′-O-甲氧乙基修饰。
在一些实施方案中，所述方法还包括对反义寡核苷酸进行核苷间键修饰。
在一些实施方案中，所述核苷间键修饰为全链核苷间键修饰。
在优选的实施方案中，所述核苷间键修饰为硫代磷酸酯修饰。
在本发明的实施方案中，设计针对靶基因的反义寡核苷酸的方法如下：
1)分析靶基因各个转录本的mRNA结构信息，并记录其共有序列；
2)使用sfold RNA二级结构在线预测工具中，通过输入共有序列，设计合成反义寡核苷酸。
在进一步的实施方案中，反义寡核苷酸的长度设计为20nt。
治疗
本文所用的术语“治疗”是指既存疾病(例如本文所指的疾病或病症)的治疗或疾病的阻止即预防。因此将认识到，在一些实施例中，本文所指的治疗可以是预防性的。
在一些实施方案中，对SP1阳性的癌症患者进行治疗，所述SP1阳性癌症包括胃癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、宫颈癌、膀胱癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、结肠癌、肾癌、舌鳞癌、子宫内膜癌、胆管癌、前列腺癌。
在一些实施方案中，本发明的组合物或者反义寡核苷酸用于治疗前列腺癌尤其是去势抵抗性前列腺癌。
本发明的寡核苷酸或药物组合物可经由胃肠外方式给药(诸如静脉注射、皮下、肌内、脑内、脑室内、眼内或鞘内给药)。
在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸、反义寡核苷酸缀合物或药物组合物是用以与另一治疗剂进行结合治疗。治疗剂可以例如是上述疾病或病症的常规治疗药物。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。因此，本发明的宽度和范围不应限于任何上述的实施方案。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1SP1在前列腺癌细胞系中的表达情况
使用Western Blotting实验检测前列腺癌各个细胞系SP1的表达量，包括LNCAP，C4-2，LNCAP-AI，22RV1细胞系。具体操作如下：
将细胞培养皿/瓶或6孔板从细胞培养箱中取出，取适量RIPA溶液加入细胞中使用细胞刮将细胞与RIPA同时刮到一起，使用微量移液器将其收至标记好的EP管中，涡旋震荡后置于4℃摇床中摇匀30min，其中每10min涡旋震荡30秒。EP管中的细胞裂解液，移入4℃预冷的离心机中，设置为14000rpm，离心30min。吸取上清液移入新的EP管中，即获得细胞总蛋白。使用Bradford测量蛋白浓度，根据测得的蛋白浓度，吸取适量蛋白质至新EP管中，并且按照体积1:4加入5×Loading Buffer，震荡离心后，置于金属浴中95℃加热5min。
配置Western-blot所用的SDS-PAGE凝胶和所用三种缓冲液(电泳缓冲液，电转缓冲液，TBST缓冲液)清洗电泳槽与电泳架子，将两块凝胶以及玻璃板组装到电泳架上，将电泳架放入电泳槽中，加满1×电泳缓冲液。使用量程为10μL的微量移液器将蛋白样本加入泳道中，上样需要轻柔缓慢，防止配平好的蛋白样本因为上样不规范而损失，应当预留出泳道加入5-10μL蛋白Marker。随后盖上电泳槽的盖子。打开电源，调整电压至90V，运行90min左右。将电泳槽中电泳架取出，将其中电泳缓冲液倒出。另外取一个搪瓷方盆，在其中倒入适量的电转缓冲液，将电转夹子打开放入其中，依次放上湿润的海绵垫子、滤纸、以及从玻璃板中取出的凝胶，再将甲醇激活过的PVDF膜在电转液中浸润后，敷在凝胶之上，放上滤纸和海绵垫，将上述物品用电转夹子固定好，插入电转架子中。将电转架子放入电泳槽中，加满1×电转液。将电转槽放入装满冰水混合物的塑料盆中，正确地连上电源，设置电流恒定250mA，电转时间为2h。
电转完毕后，将PVDF膜从电转夹子中取出，放入装有TBST缓冲液的盒子中，使用TBST清洗PVDF膜。然后使用TBST配制的5％的封闭用脱脂奶粉孵育PVDF膜，室温摇床孵育1h。封闭结束后再次使用TBST将膜上附着的牛奶洗净。将膜放入提前配制好的一抗中，最后将抗体放置在4℃摇床上孵育过夜。第二天将膜从一抗中取出，并使用TBST将膜清洗三次，之后选取对应的鼠/兔二抗液，将PVDF膜浸润至二抗液中，室温摇床孵育1h，再使用TBST将膜清洗三次，然后将其放置在干净的玻璃板上，用滤纸适当吸去PVDF膜上的TBST液体，然后用提前1:1配置好的ECL化学发光显影液均匀地滴加到PVDF膜上，放入曝光机中曝光。
实验结果显示，CRPC阶段的细胞(C4-2，LNCAP-AI，22RV1)中SP1蛋白水平显著高于CSPC阶段的细胞系(LNCAP)(图1)。
实施例2SP1反义寡核苷酸的设计及检测
1、ASO序列的生物学鉴定以及修饰方案和位点的效果对比
使用NCBI中的BLAST生物串行信息一级结构在线比对工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对比分析SP1 mRNA各个转录本的mRNA结构信息，并记录其共有序列。使用sfold RNA二级结构在线预测工具中的“soligo”页面(http://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/index.pl)，输入SP1各个转录本的共有序列，oligo长度选择为20nt，提交并记录筛选结果。
从公司(生工Sagon)购得所有ASO序列(表1)并仅使用基础修饰(全链硫代磷酸修饰；表2)。
表1ASO序列
ASO序列 序列编号
AGAACAGCAACAACTCCCAG SEQ ID NO.1
TAATCCCACAGTTCCAGACC SEQ ID NO.2
TCATCATCCGGACACCAACA SEQ ID NO.3
AACACCACTCTCACACCCAT SEQ ID NO.4
表2修饰的ASO序列
编号 ASO序列 序列编号
ASO-1 A*G*A*A*C*A*G*C*A*A*C*A*A*C*T*C*C*C*A*G SEQ ID NO.5
ASO-2 T*A*A*T*C*C*C*A*C*A*G*T*T*C*C*A*G*A*C*C SEQ ID NO.6
ASO-3 T*C*A*T*C*A*T*C*C*G*G*A*C*A*C*C*A*A*C*A SEQ ID NO.7
ASO-4 A*A*C*A*C*C*A*C*T*C*T*C*A*C*A*C*C*C*A*T SEQ ID NO.8
注：*代表硫代磷酸酯修饰。
2、RT-QPCR检测反义寡核苷酸的敲除效果
体外六孔板培养LNCAP-AI细胞，细胞铺板24h后转染细胞。首先将全链硫代磷酸酯修饰的反义寡核苷酸ASOSP1与脂质体转染试剂混合均匀室温孵育20min，将混合物均匀加入培养基中。将混合物均匀加入培养基中。使得ASOSP1在培养基中的终浓度分别为200nM。于48h后，去除细胞培养基，加入Trizol试剂，提取细胞总RNA。采用Thermo RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis Kit将总RNA反转录为cDNA，采用CWBIO 2×Taq MasterMix、SP1引物和Sangon Biotech GAPDH内参引物进行RT-QPCR反应，并计算其Ct值换算，得到mRNA的相对水平数值。
SP1引物序列如下：
前引物序列：5’-TGGCAGCAGTACCAATGGC-3’(SEQ ID NO.9)，后引物序列：5’-CCAGGTAGTCCTGTCAGAACTT-3’(SEQ ID NO.10)；
结果显示，相比ASO-con组，ASO-1和ASO-2组SP1的表达水平显著下调，其中ASO-1表达水平下调更为显著，ASO-3和ASO-4则无显著变化，后续修饰与修饰位点的实验将使用ASO-1进行。
3、不同修饰方法的敲除效果检测
从公司(生工Sagon)合成以ASO-1序列为基础，不同修饰方法的序列，包括全链RNA，全链DNA，全链2-MOE以及GAPMER-2MOE的不同修饰策略。经过转染-RNA抽提-RT-qPCR实验，计算其Ct值换算，得到mRNA的相对水平数值，具体操作步骤同上。
表3不同修饰的ASO
注：*代表硫代磷酸酯修饰；i2OMe代表甲氧乙基修饰
结果显示，GAPMER-2MOE修饰的ASO在序列相同的条件下具有较强的敲除能力(图2A)。
由于GAPMER修饰策略两侧的2-MOE修饰数量并不固定。为了进一步优化敲低效率，对ASO两侧的修饰数量进行了进一步的对比(如表4所示)并从公司(生工Sagon)合成，其中ASO-1-flank5和MOE修饰的GAPMER/GAPMER-2MOE相同，并同样进行了ASO转染-RNA抽提-RT-qPCR实验的流程，具体操作步骤同上。
表4不同修饰数量的ASO
注：*代表硫代磷酸酯修饰；i2OMe代表甲氧乙基修饰
结果显示，采用GAPMER-2MOE修饰时，两侧的2MOE修饰数量分别为5时能够获得最强的敲除效果(图2B)。
实施例3甲氧乙基修饰的反义寡核苷酸ASOSP1敲除SP1的作用模式
体外六孔板培养22RV1细胞，细胞铺板24h后转染细胞。首先将甲氧乙基化修饰的反义寡核苷酸ASO-1也即ASO-1-flank5与脂质体转染试剂混合均匀室温孵育20min，将混合物均匀加入培养基中。使得ASOSP1在培养基中的终浓度为100nM，48h后去除细胞培养基，加入RIPA试剂提取细胞总蛋白。采用SP1抗体(ab205270)，GAPDH抗体，BioRad电泳槽套装以及索莱宝SDS-PAGE凝胶配制试剂盒，进行western blot实验(步骤同实施例1)，检测SP1蛋白表达水平。
结果如图3所示，转染后48h，在22RV1细胞中可见到SP1的蛋白水平降低。
实施例4SP1对细胞的影响
1、MTT实验
将22Rv1细胞铺板于96孔板(n＝5)中，每孔2000细胞，并且分别给予对照组(Vehicle)ASO-Con和实验组ASO-1-flank5。置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每隔24h取出一块96孔板。使用PBS溶液或是生理盐水做溶剂，配置四甲基偶氮唑(MTT)溶液，终浓度5mg/ml。于每一孔中加入10μl MTT溶液，再次放于37℃、5％CO2培养箱中孵育2h。两h后取出96孔板，轻轻倒扣在滤纸上，每孔中加入150μl DMSO溶液，避光于摇床上低速摇晃30min使甲臢结晶充分溶解。使用酶标仪在OD值490nm检测各孔吸光度，记录数值，之后每24h取出一个96孔板进行上述操作。
结果如图4所示，随着时间增加，实验组细胞活力明显下降，细胞增殖能力受到抑制。
2、迁移侵袭实验
(1)基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。
(2)制备细胞悬液
①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，(用PBS洗1-2遍)，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。
(3)接种细胞
①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。
②24孔板下室一般加入600μl含20％FBS的培养基。
③培养细胞：常规培养12-48h。
(4)结果统计直接计数法
取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定30min，将小室适当风干。0.1％结晶紫染色20min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。
结果显示，ASOSP1实验组细胞侵袭能力受到抑制(图5)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 天津市泌尿外科研究所
<120> SP1的反义寡核苷酸及其在制备抑制SP1阳性癌症核酸药物中的应用
<141> 2022-02-14
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agaacagcaa caactcccag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taatcccaca gttccagacc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcatcatccg gacaccaaca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aacaccactc tcacacccat 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> 硫代磷酸酯修饰
<400> 5
agaacagcaa caactcccag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> 硫代磷酸酯修饰
<400> 6
taatcccaca gttccagacc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> 硫代磷酸酯修饰
<400> 7
tcatcatccg gacaccaaca 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> 硫代磷酸酯修饰
<400> 8
aacaccactc tcacacccat 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tggcagcagt accaatggc 19
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccaggtagtc ctgtcagaac tt 22
<210> 11
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> 硫代磷酸酯修饰
<400> 11
agaacagcaa caacucccag 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> 硫代磷酸酯修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> 甲氧乙基修饰
<400> 12
agaacagcaa caacucccag 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> 硫代磷酸酯修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(5)
<223> 甲氧乙基修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (16)..(20)
<223> 甲氧乙基修饰
<400> 13
agaacagcaa caactcccag 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> 硫代磷酸酯修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 甲氧乙基修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(20)
<223> 甲氧乙基修饰
<400> 14
agaacagcaa caactcccag 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> 硫代磷酸酯修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(3)
<223> 甲氧乙基修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(20)
<223> 甲氧乙基修饰
<400> 15
agaacagcaa caactcccag 20

Claims (10)

1.一种反义寡核苷酸，其特征在于，所述反义寡核苷酸由15-30个核苷酸组成，所述反义寡核苷酸抑制SP1的表达； 所述反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.13所示。
2.一种缀合物，其特征在于，包括权利要求1所述的反义寡核苷酸，以及至少一个共价连接到所述寡核苷酸的缀合物部分。
3.一种组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的反义寡核苷酸或权利要求2的缀合物和药学上可接受的稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。
4.一种体外用于调节表达SP1的靶细胞中SP1表达的方法，所述方法包括以有效量向所述细胞施用权利要求1所述的反义寡核苷酸、权利要求2所述的缀合物或权利要求3所述的组合物。
5.权利要求1所述的反义寡核苷酸在制备治疗前列腺癌的药物组合物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述反义寡核苷酸抑制前列腺癌细胞增殖和迁移。
7.权利要求2所述的缀合物在制备治疗前列腺癌的药物组合物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，所述缀合物抑制前列腺癌细胞增殖和迁移。
9.权利要求3所述的组合物在制备治疗前列腺癌的药物组合物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述组合物抑制前列腺癌细胞增殖和迁移。
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